IMPORTANCIA DEL ÁCIDO JASMÓNICO EN LA SÍNTESIS DE ISOFLAVONOIDES DE DEFENSA CONTRA EL ATAQUE DE CHINCHE (Piezodorus guildinii W.) EN SEMILLAS DE SOJA (Glycine max L.). L. G. Barriga*, J. A. Barneto, H. D. Chludil, E. Pagano, J. A. Zavala CONICET, Cátedras de Bioquímica y Biomoléculas de la Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires, Av. San Martín 4453 - C1417DSE – CABA, Argentina. Tel. 4524-8000. Universidad Católica Argentina. *barriga@agro.uba.ar Introducción El cultivo de soja (Glycine max L.) en los últimos años se ha convertido en uno de las más importantes en Argentina. Una de las plagas más comunes es la chinche Piezodorus guildinii W. (Heteroptera: Pentatomidae), que se alimenta de las semillas en formación, aprovechando su alto contenido proteico y lipídico. El daño que producen estos insectos genera pérdidas de rendimiento al cultivo y disminuye la calidad de las semillas. Sin embargo, las plantas no actúan como víctimas indefensas, sino que responden a la agresión produciendo compuestos tóxicos que suelen detener o reducir el ataque de los insectos. En las plantas de soja, uno de los mecanismos de defensas químicas más estudiados es la síntesis de isoflavonoides. Estos metabolitos están comúnmente presentes en la familia de las Fabaceas (leguminosas) y fueron identificados en diferentes órganos de la planta (raíces, hojas, cotiledones, vainas y semillas). La síntesis de isoflavonoides en plantas de soja es constitutiva y sus concentraciones varían según el genotipo, pero también se inducen en respuesta a factores bióticos y abióticos del ambiente (Carrão-Panizzi et al., 1995). Daidzina y genistina, los 7-O-glucósidos de daidzeína y genisteína respectivamente, son los isoflavonoides glicosilados más comunes en soja como respuesta al ataque de chinches (Piubelli et al., 2003). Las defensas inducidas de las plantas son activadas por señales específicas producidas en el tejido dañado, que rápidamente activa la expresión de los genes que codifican la síntesis de metabolitos defensivos (Howe, 2004). La hormona vegetal ácido jasmónico (AJ) y su éster metílico: jasmonato de metilo (JAMe), son señales comúnmente encontradas en tejidos sanos y dañados, responsables de la activación de respuestas defensivas ante la mayoría de los insectos herbívoros (Howe, 2008). El papel defensivo del AJ fue observado en tabaco (Nicotiana tabacum L.), tomate (Solanum lycopersicum L.) y alfalfa (Medicago sativa L.) cuando fue aplicado sobre la superficie de las hojas, que activó la síntesis de inhibidores de proteasas, defensa química de estas especies contra el ataque de insectos. Un efecto similar de la hormona se midió en frutos cosechados de Myrica rubra (Seib, Zucc), los cuales al ser tratados externamente con JAMe incrementaron la concentración de compuestos fenólicos, antocianinas y flavonoides totales (Kaituo et al., 2009). La síntesis del AJ proviene de la denominada vía de los octadecanoides (ácidos grasos de 18 átomos de carbono). Unas de las enzimas que sintetizan AJ dentro del cloroplasto son las lipooxigenasas (LOX) (Weiler, 1997). La utilización de cv de mutantes de soja que no expresen LOX es ideal para determinar la función de defensa del AJ y la regulación que este posee sobre ciertos metabolitos secundarios. El objetivo del presente trabajo fue determinar si el AJ regula la síntesis de daidzeína, genisteína y sus glicósidos, en semillas de soja. Se utilizó un cultivar de soja Williams y un mutante que no acumula AJ en las semillas en formación. Se analizó el efecto del daño mecánico y del daño ocasionado por la chinche Piezodorus guildinii W. sobre la síntesis de isoflavonoides en semillas de soja. -1Producción Vegetal: Insectos Materiales Y Métodos Se utilizaron el cv Williams y el mutante BRM 926600 que no sintetiza las lipooxigenasas LOX 1, LOX 2 y LOX 3 (enzimas intervinientes en la producción de AJ en semillas de soja). Las plantas fueron sembradas en macetas de 10 L en el campo de la Facultad de Agronomía de la UBA hasta el crecimiento de vainas (estado R5-R6, (Fehr 1977)). Adultos de P. guildinii W. fueron alimentados y cuidados en laboratorio. Se realizaron 4 tratamientos en semillas de soja en formación (estado R5 – R6): i) control, sin daño, ii) semillas dañadas mecánicamente (DM) con una aguja, iii) semillas atacadas por chinche (P. guildinii W.) y, iv) semillas a las que se les aplicó jasmonato de metilo (50 µM de JAMe en agua destilada, aplicado sobre la vaina). A las 72 h luego de realizados los tratamientos, las vainas junto con semillas fueron cosechadas y congeladas en nitrógeno líquido. Posteriormente, se separaron las semillas de la vaina y los compuestos fueron analizados solo en semillas. Para la extracción, identificación y análisis de los isoflavonoides, se utilizó ciclo hexano y metanol, luego la fracción con isoflavonoides se concentró y, por último, se analizó mediante CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución). La fase móvil consistió en un gradiente de acetonitrilo-agua, acidulados con 0,1% de ácido acético (pH 4). La detección se realizó a una longitud de onda de 280 nm y la concentración de cada compuesto de interés fue calculada por correlación con las absorbancias correspondientes a patrones comerciales de daidzina, genistina, daidzeína, y genisteína (patrones Sigma - Aldrich). Resultados Las semillas correspondientes a los tratamientos de DM, ataque de chinche y JAMe, tuvieron menor contenido de daidzina y genistina que las semillas control (P< 0.05; Figs 1 y 2). Mientras que en las semillas control del cv Williams los niveles de daidzina fueron 40,3 µg/g y genistina 86 µg/g, las semillas atacadas por chinche tuvieron 17,8 µg/g y 35,7 µg/g de daidzina y genistina, respectivamente (P< 0.05; Figuras 1 y 2). Los contenidos de daidzina y genistina de las semillas del cv mutante BRM, que no expresa los genes lox en semillas, fueron en promedio de 3 µg/g y de 5 µg/g respectivamente, sin mostrar diferencias significativas entre tratamientos (P> 0.05; Figuras 1 y 2). -2Producción Vegetal: Insectos A diferencia de los glicósidos daidzina y genistina, la concentración de las agliconas daidzeína y genisteína aumentó 72 h después de realizados los tratamientos en semillas del cv Williams. En este cultivar, las mayores concentraciones de daidzeína se observaron en los tratamientos de ataque de chinche (119 µg/g) y con aplicación de JAMe (129 µg/g), que fueron superiores al control (75 µg/g) y al DM (79 µg/g) (P<0,0001; Figura 3). La concentración de genisteína se indujo significativamente también en el cv Williams en los tratamientos DM (94 µg/g), Chinche (100 µg/g) y MeAJ (101 µg/g), por encima del control (52 µg/g) (P= 0,003; Figura 4). En las semillas del mutante BRM, los niveles de daidzeína y genisteína fueron significativamente menores que en las del cv Williams y los tratamientos no indujeron la síntesis de estas dos agliconas (P> 0.05; Figuras 3 y 4). -3Producción Vegetal: Insectos Conclusión Tanto los niveles constitutivos, como los inducibles de los isoflavonoides daidzeína, genisteína y sus glicósidos daidzina y genistina en las semillas del mutante BRM fueron menores que en las semillas del cv Williams. El ataque de Piezodorus guildinii W. y la aplicación de JAMe no modificaron la síntesis de isoflavonoides en el mutante BRM, sin embargo estos mismos tratamientos indujeron la síntesis de daidzeína y genisteína y disminuyeron la de daidzina y genistina en el cv Williams. La incapacidad de las semillas del mutante BRM de producir cambios en la síntesis de isoflavonoides en comparación con el cv Williams, que tiene el paso metabólico intacto para la producción de AJ, demuestra que los isoflavonoides estudiados están regulados por el AJ. La inducción de daidzeína y genisteína y la disminución de la síntesis de los glicósidos daidzina y genistina en respuesta al daño por herbivoría y a la aplicación de JAMe, sugiere, que los glicósidos se podrían estar utilizando como sustrato para la síntesis de las agliconas. Bibliografía CARRÃO-PANIZZI M. C., 1995. Isoflavone content in Brazilian soybean cultivars. Breeding. Science. 45: 295-300. FEHR W.R., CAVINESS C.E., 1977. Stages of soybean development. Special report 80. Iowa State University, Ames, Iowa. Pág. 11. HOWE G.A., 2004. Jasmonates as Signals in the wound response. Journal Plant Growth Regulation. 23:223–237 HOWE G.A., JANDER G. 2008. Plant immunity to insect herbivores. Annual rewiew of plant biology , 41-66. KAITUO WANG, JIN PENG, CAO SHIFENG, SHANG HAITAO, YANG ZHENFENG, ZHENG YONGHUA., 2009. Methyl Jasmonate reduces decay and enhances antioxidant capacity in Chinese Bayberries. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57, 5809–5815. LEICACH S. 2006. Alelopatía: Interacciones químicas en la comunicación y defensa de las plantas. Eudeba. Bs. As. PIUBELLI GIORLA C., HOFFMANN-CAMPO Clara B., de Arruda Iara C., Franchini J. C., Lara Fernando M., 2003. Flavonoid increase in soybean as a response to Nezara viridula inyury and its effect on insect-feeding preference. Journal of Chemical Ecology, Vol. 29, No. 5. WEILER E.W., 1997. Octadecanoid mediated signal transduction in higher plants. Naturwissenschaften 84, 340–349. -4Producción Vegetal: Insectos