Rev Hematol Mex 2011;12(1):32-38 Artículo de revisión Factor Steel: lecciones de supervivencia celular Julio Roberto Cáceres-Cortés* RESUMEN Los ratones portadores de mutaciones en cualquiera de los loci dominant white spotting (W) y Steel (Sl), tienen defectos serios en el desarrollo de tres diferentes linajes celulares con actividad migratoria: melanocitos, gametos y células hematopoyéticas. El análisis genético ha revelado que el locus Sl codifica para el factor Steel, que es el ligando del receptor de tipo tirosina cinasa c-Kit que es producto del locus W. El factor Steel juega un papel decisivo en la formación de células hematopoyéticas. Recientemente se pudo establecer que regula el autorrenuevo, la diferenciación y muerte celular durante la generación de células hematopoyéticas, actúa como un factor de supervivencia. Entender cómo las células primitivas hematopoyéticas sufren una restricción progresiva en su potencial de diferenciación y adquieren características de células maduras bajo el efecto del factor Steel, representa un reto importante en biología celular. El patrón en la expresión genética en una célula está establecido por factores de transcripción que regulan procesos antagónicos como la supervivencia y la muerte celular. Aquí se explica que el efecto de supervivencia del factor Steel está modulado por el factor de transcripción de tipo básico hélice-asa-hélice SCL. Las propiedades mostradas por el factor Steel indican que juega un papel decisivo en la potenciación de la proliferación y supervivencia celular durante el desarrollo de los progenitores hematopoyéticos y no hematopoyéticos. Palabras clave: factor Steel, SCL, factores de transcripción. ABSTRACT Mice bearing mutations at either of two loci, dominant White spotting (W) or Steel (Sl), exhibit development defects in hematopoietic, melanocytic and gametes. Genetics studies have shown that the SI locus encodes the Steel factor (SF), which is the ligand for the tyrosine kinase receptor c-kit, the product of the W locus. The SF factor plays an essential role during the formation of hematopoietic cells. Recently, it has been established that it regulates selfrenewal, differentiation, cell death and cell survival. Understanding how the hematopoietic stem cells undergo a progressive cell restriction in their differentiation potential and acquire new mature features under the control of SF, is a challenge in cell biology. The genetic expression pattern in a cell is established by transcription factors that regulate antagonic processes like survival and cell death. Here I explain that the survival effect of SF is modulated by the basic helix-loop-helix SCL transcription factor. The properties shown by SF indicate that not only SF maintains cells alive, but also potentiates proliferation of hematopoietic and non-hematopoietic progenitors. Key words: Steel factor, SCL, transcription factors. E l receptor c-Kit, y su ligando el factor Steel, activan una vía esencial de señalamiento en la hematopoyesis del ratón.1 La mutación W se ha demostrado que es alélica con el proto-oncogen c-kit que codifica para * Sección de Estudios de Posgrado e Investigación. Escuela Superior de Medicina. Instituto Politécnico Nacional. Correspondencia: Dr. Julio Roberto Cáceres Cortés. Plan de San Luis y Díaz Mirón s/n, colonia Casco de Santo Tomas, México 11340, DF. Correo electrónico: jcacortes@gmail.com Recibido: noviembre, 2010. Aceptado: diciembre, 2010. Este artículo debe citarse como: Cáceres-Cortés JR. Factor Steel: lecciones de supervivencia celular. Rev Hematol Mex 2010;12(1):32-38. www.nietoeditores.com.mx 32 un receptor de tipo tirosina cinasa,2 mientras que la mutación Steel afecta un gen que codifica para el factor Steel (Steel factor, SF), también llamado factor de crecimiento de la célula madre (stem cell factor, SCF), ligando de Kit (Kit ligand, KL),3 o factor de crecimiento del mastocito (mast cell growth factor, MCGF).4 Las características más sobresalientes del fenotipo de los ratones mutantes W o Sl son los defectos en la fertilidad, la pigmentación y la hematopoyesis. El aislamiento del ADN complementario que codifica para el factor Steel permitió la demostración formal de que el factor Steel era el ligando del producto del protooncogen c-kit.5 Posteriormente se demostró que el factor Steel era el producto del locus Steel sobre el cromosoma 10 del ratón.6 La caracterización de las mutaciones W y Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Factor Steel: lecciones de supervivencia celular Sl en estudios de trasplantes intergenotípicos condujo a la demostración de que estos loci codificaban para productos de genes interactuantes. De estas observaciones se concluyó que los ratones Steel no pueden ser curados de sus problemas hematológicos mediante trasplante de médula ósea proveniente de ratones W o de tipo silvestre. Sin embargo, la trasplantación de ratones W con médula ósea de ratones Steel o de tipo silvestre resultó en su reconstitución hematológica. Así, los defectos de los ratones W son inherentes a las células hematopoyéticas y el defecto en los ratones Sl está en el microambiente medular donde se desarrollan las células hematopoyéticas.4 La caracterización del factor Steel y de su receptor c-Kit ha revelado el mecanismo de la deficiencia estromal en el ratón Sl convirtiéndose éste en un modelo clásico de la deficiencia microambiental. Las mutaciones W y Sl en el ratón son mutaciones que generan el mismo fenotipo: son anémicos, estériles y de color blanco. La hematopoyesis importantemente disminuida y la letalidad en el estado homocigótico en los ratones Sl indican la importancia del factor Steel en la hematopoyesis. El factor SF y su receptor c-Kit juegan un papel decisivo en el desarrollo de las células hematopoyéticas a través de la inhibición de la apoptosis o muerte celular programada,7 aunque el mecanismo por el que lo hace aún no está completamente entendido. Sin embargo, puede estar relacionado con la activación persistente de distintas vías de señalización esenciales, de tal manera que el estudio del factor Steel ha alcanzado el tema del origen del cáncer. Hace poco se estudió ampliamente la transformación maligna de células progenitoras adultas en células madre cancerosas. Estas últimas pueden ser generadas por alteraciones genéticas o epigenéticas, y también por cambios en el microambiente local, incluidas las células estromales. Las células iniciadoras de tumores estromales típicamente expresan varios marcadores de células madre entre los que podemos encontrar, además del factor Steel, a la telomerasa, la aldehído deshidrogenasa (ALDH), CD133, CD44, CXC4, transportadores de drogas y factores de transcripción, como OCT-3/4, Nanog y SOX2.8 El factor de transcripción SCL: componente esencial de la ruta de c-Kit Durante el desarrollo del embrión humano la hematopoyesis ocurre en etapas migratorias, las primeras células madre hematopoyéticas son generadas en el saco vitelino, luego migran al hígado y de ahí a la médula ósea por el Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 torrente circulatorio. La migración es una propiedad de estas células mediada por factores quimioatractantes presentes en los sitios de destino. En los mamíferos, las células rojas embrionarias son producidas en el saco vitelino, mientras que las células de otros linajes aparecen en el hígado fetal junto con las células rojas definitivas. Un problema central en biología es la identificación de los genes que participan en la diferenciación y formación del sistema hematopoyético. Hace poco recibió apoyo científico la indagación sobre el papel que juega SCL (stem cell leukemia) en el surgimiento de las células madre hematopoyéticas.9 Krosl y sus colaboradores demostraron con anterioridad la implicación del factor de transcripción SCL en la supervivencia mediada por el factor Steel en células hematopoyéticas CD34+.10 El factor de transcripción SCL ha emergido como un candidato en la regulación de la hematopoyesis temprana.11,12 Luego de su descubrimiento a través de una translocación en el locus del receptor de la célula T en pacientes con leucemia linfoblástica aguda (ALL), el SCL se catalogó como miembro de la familia de los factores de tipo hélice-asa-hélice básico (bHLH) Figura 1.13,14 El factor de transcripción SCL es decisivo para el desarrollo de la hematopoyesis in vivo como lo demuestra el estado homocigoto scl-/- en embriones de ratón.15 En ausencia de SCL durante la hematopoyesis no se detecta la generación de células rojas, mieloides, megacariocitos, células mast, y linfocitos T y B.16 Sin embargo, la función de SCL requiere más demostraciones. Por lo tanto, Hoang Figura 1. Relación de secuencia de aminoácidos (código en letra sencilla) entre SCL y algunas proteínas. Parte del SCL muestra homología estrecha con el dominio de unión al ADN de varias proteínas con genes importantes en la neurogénesis, desarrollo de la capa germinal y determinación del sexo en Drosophila; con Lyl-1 en leucemia linfoblástica aguda; con MyoD importante en la miogénesis; con incrementadores de inmunoglobulinas; y con la familia myc. 33 Cáceres-Cortés JR T y colaboradores10 buscaron modular negativamente la función de SCL en células TF-1 CD34+ que requieren factor Steel, interleucina-3 (IL-3) o factor estimulante a la formación de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) para sobrevivir. La expresión ectópica de una forma dominante negativa de SCL (dnSCL) carente del dominio básico, o el ADNc antisentido de SCL (SCL-as), redujo significativamente la unión al ADN medido en los ensayos de retardo de la movilidad electroforética. Cuando se compararon con las células parentales o los controles expresando el vector solo, la respuesta de supervivencia al factor Steel por estas células transfectadas se vio reducida mientras que la respuesta a GM-CSF o IL-3 no se vio afectada, lo que indica una especificidad distinta para la vía activada por SF/c-Kit. La expresión ectópica de bcl-2 humano, un proto-oncogen que confiere supervivencia celular, transferido en un gen retroviral, bloqueó la muerte por apoptosis inducida por dnSCL o SCL-as. En células CD34+ primarias, la población sin estimular por factores de crecimiento es de casi 70% SCL+. Después de 10 días de cultivo en presencia de factor Steel el nivel de SCL era elevado pero indetectable ante GM-CSF. Estos resultados indican que SCL es esencial en la vía del factor Steel pero no en la vía dependiente de GM-CSF y que las funciones de SCL se encuentran río arriba de los miembros de la familia de bcl-2. La deficiencia estromal de factor Steel en el ratón Sl y la ausencia o alteración del receptor c-Kit en el ratón W podría llevar a alteraciones en los niveles de SCL. Sería interesante tomar como objeto de estudio a los ratones W y Sl en cuanto a la presencia e influencia de SCL en la hematopoyesis. El factor Steel y su receptor c-Kit han sido implicados en el control de múltiples procesos biológicos que incluyen: supervivencia, proliferación, diferenciación y migración de cuatro tipos diferentes de células: hematopoyéticas, mastocitos, melanocitos y gametocitos. Más aún, como inhibidor de la apoptosis el oncogen c-kit es una vía para la expansión celular en varios tipos de cáncer. Un importante hallazgo ha sido comprobar la existencia del oncogen c-kit en el genoma de cánceres de diversa índole, como el de testículo, de la célula pequeña de pulmón y el cérvico uterino. Existe la posibilidad de reducir la expansión de células cancerosas primarias reduciendo la función de SCL y, por lo tanto, el suministro o fuente de energía de la vía de c-Kit. Se ha comprobado que en tejidos no hematopoyéticos SCL está expresado, por ejemplo, en progenitores 34 de células endoteliales y endotelios de otros órganos17,18 y ciertas áreas del cerebro en desarrollo.19 Existe evidencia considerable que sugiere que el factor Steel y su receptor c-Kit están involucrados en la patogénesis de tumores de origen no hematológico. Como podría esperarse a partir de los estudios sobre el desarrollo, c-kit está sobre-expresado en tumores de células germinales de testículo20 y en melanomas.21 En los tumores ginecológicos,22,23 líneas celulares de cáncer del colon,24 y el cáncer de la célula pequeña de pulmón25,26 se ha demostrado la co-expresión de c-kit y de factor Steel. La mayoría de los especímenes de cáncer de mama y líneas celulares derivadas de éste co-expresan c-Kit y el factor Steel, lo que resulta en una ventaja de crecimiento para las células tumorales con este origen.27 ¿SCL se expresa cuando las células pueden activarse con la vía factor Steel/c-Kit? ¿Cuál es el papel de SCL donde factor Steel está implicado en la estimulación autocrina? Para el caso del cáncer cérvico uterino: a) en la activación constitutiva de factor Steel/c-Kit ¿SCL juega un papel crítico en la carcinogénesis? b) ¿el papiloma virus humano HPV, implicado en la iniciación de la transformación maligna en cáncer cérvico uterino, necesita de SCL para replicarse? En leucemia linfocítica aguda se ha visto que los oncogenes SCL y LMO1 colaboran en la expansión de progenitores de timocitos e inhiben las etapas tardías de la diferenciación.28 Cuando hace años se comenzó a estudiar la estimulación autocrina como un mecanismo en el desarrollo del tumor, el proyecto parecía utópico y reduccionista para muchos. Los recientes estudios abren nuevas posibilidades en el estudio del cáncer, como la inducción de la apoptosis que ataca vías de autoestimulación receptor/ligando y factores de transcripción. El compromiso de linaje Un proceso biológico importante en la generación de las células hematopoyéticas, es el compromiso de linaje que puede ocurrir concomitantemente con la supervivencia y la proliferación. La exposición de células primarias CD34+ al GM-CSF ha demostrado resultar en diferenciación granulomonocítica,29,30,31 mientras que la eritropoyetina (Epo) y las bajas concentraciones de interleucina-3 (IL-3) favorecen la diferenciación eritroide.30 Se han propuesto dos modelos para explicar el efecto de los factores de crecimiento hematopoyéticos: el modelo estocástico32,33 y el modelo instructivo/inductivo.34 Para apoyar el último Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Factor Steel: lecciones de supervivencia celular modelo se han reportado factores estimulantes de colonias que modulan la diferenciación35 ejemplificados por la expresión ectópica de c-fms, el gen que codifica el receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF o CSF-1), en una línea celular pre-B y que resulta en la diferenciación irreversible hacia macrófagos en presencia de CSF-1, pero no de IL-7.36 De manera similar, la expresión ectópica de GM-CSF en una línea celular multipotente dependiente de IL-3, FDCP-Mix, resulta en la diferenciación sincrónica de macrófagos y granulocitos.37 Más aún, la diferenciación de macrófagos o eritrocitos en la línea FDCP-Mix ocurre en ausencia de señales inductivas,38 lo que sugiere que el compromiso de linaje es estocástico y probablemente no influido por citocinas o receptores de citocinas que están constitutivamente activados.39,40 Estos datos indican que las decisiones entre los tipos de división pueden no ser controlados por moléculas reguladoras extrínsecas sino más bien por mecanismos intrínsecos. Sin embargo, usando células purificadas CD34-KLS41 de ratón se ha demostrado que en cultivos con factor Steel y IL3, que inducen un gran nivel de diferenciación lleva a divisiones asimétricas (52%–62%), mientras que el cultivo con factor Steel y Tpo tienden a preservar indiferenciadas a las células y a divisiones asimétricas en solo 17% de éstas.42 Los precursores en un medio ambiente prodiferenciador prefieren dividirse asimétricamente, mientras que las que están en un medio de prorrenuevo se dividen simétricamente.43 Ampliando esto, la inducción a la diferenciación mielocítica por CSF-1 en la línea mieloide 32D transfectada con c-fms se ha demostrado que es reversible,44 a diferencia de lo visto en células pre-B,36 otra vez sugiriendo que el papel de CSF-1 en este modelo puede ser permisivo más que determinístico. Al parecer, hay un periodo transitorio en estas células donde las características anteriores aún no han desaparecido, y las nuevas aún no han surgido, donde es fácil el retroceso. Recientemente se propuso otro modelo que comulga ambas teorías de compromiso instructivas y estocásticas. Esta nueva teoría sostiene que los destinos celulares están dirigidos por factores de transcripción linaje específicos, pero las citocinas pueden dirigir el compromiso de linaje regulando el “ruido inherente” con complejas acciones, como la ultrasensibilidad mediada por el ligando y una robusta multiestabilidad. Las simulaciones sugieren que las cinéticas de diferenciación dependen del estado inicial del progenitor y de la ruta de compromiso que escoge.45 Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 El papel biológico del factor Steel parece ser el de mantener a las células en un estado indiferenciado.7,42,46,47 Un aspecto importante en trasplante autólogo de médula ósea es la conservación del valor hematopoyético de los injertos. El factor Steel puede utilizarse durante la purga de médula ósea de células cancerosas (tumores sólidos c-Kit-) al ser un factor determinante en la conservación y mantenimiento de las células hematopoyéticas sin afectar su diferenciación.46,48 Nosotros hemos encontrado que los progenitores de macrófagos y granulocitos (CFU-GM) superviven durante siete días en presencia de factor Steel, y no se obtienen granulocitos ni macrófagos. La transferencia de estas células a cultivos que contienen GM-CSF, que favorece la emergencia de macrófagos y granulocitos, provoca la proliferación y diferenciación terminal de ellas. Nuestros datos indican que el factor Steel induce la supervivencia de progenitores hematopoyéticos y, en especial, favorece la de progenitores de granulocitos sobre la de progenitores de monocitos.47 El diagrama de equilibrio triangular para tres componentes obtenidos: blastos (células inmaduras), macrófagos y granulocitos, revela que el sistema se desplaza hacia granulocitos en células de médula ósea mantenidas con factor Steel (Figura 2). La identificación de genes que participan en las decisiones de diferenciación y durante el desarrollo del sistema hematopoyético, ha sido decisiva en el entendimiento de la regulación de la producción de los Figura 2. Diagrama de equilibrio para un sistema de tres componentes. Los vértices del triángulo representan A: blastos, B: granulocitos y C: macrófagos. Las células hematopoyéticas son puestas en cultivo in vitro en presencia de factor Steel durante siete días, y la diferenciación terminal se logra en cultivos secundarios ante GM-CSF a los tiempos indicados. 35 Cáceres-Cortés JR diferentes tipos de células. Hemos visto que con factor Steel las células son conducidas hacia la supervivencia (mediada por SCL) principalmente de precursores de granulocitos, mientras que con GM-CSF las células se diferencian. Lo anterior sugiere que este modelo celular in vitro se comporta determinísticamente o según el modelo inductivo. De la Figura 3 se obtiene que en ausencia de factores tardíos, como el GM-CSF, las células que evolucionan más allá del estadio CFU-GM pierden la expresión de c-Kit y mueren. El factor Steel y GM-CSF permite la continua supervivencia y expansión de los progenitores hematopoyéticos en cultivo y su posterior diferenciación en macrófagos y granulocitos. También puede observarse que las células que expresan c-Kit son susceptibles al estímulo con factor Steel. La diferenciación gránulo-monocítica se acompaña de una pérdida en la expresión de c-Kit y la aparición concomitante del receptor para GM-CSF. Las células RGM-CSF +/c-Kit son capaces de sufrir una diferenciación terminal total en presencia de GM-CSF pero mueren en su ausencia. Estos datos sugieren que las señales de supervivencia son decisivas durante el proceso de diferenciación. Reuniendo todos los datos, en el ámbito molecular y como mecanismo de acción, el factor de transcripción SCL es un componente de la ruta de c-Kit implicado en la supervivencia celular. Agradecimientos Al CONACYT (52682), al Ing. Andrés Ayala Pimentel y al químico Louis Robichaud por el apoyo otorgado para la realización del presente trabajo. La habilidosa asistencia técnica de AA. Cáceres Pérez es muy apreciada. Progenitores comprometidos Progenitores pluripotentes CFU- Células Maduras M RGMmadre Mult Gran CFU-GM CFUc- + : sobrevivencia expresión de SCL PM RGM- Figura 3. Diagrama esquemático de la supervivencia otorgada por el factor Steel. Mult=célula multipotente; Gran/Ma = precursor de granulocitos y macrófagos; CFU-GM=unidad formadora de colonias de macrófagos y granulocitos; CFU-M=unidad formadora de colonias de macrófagos; CFU-G=unidad formadora de colonias de granulocitos; MO=macrófagos; PMN=polimorfonucleares; RGM-CSF+=célula que expresa el receptor para GM-CSF. 36 Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Factor Steel: lecciones de supervivencia celular REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Russell, E.S. Hereditary anemias of the mouse: a review for geneticists. Advances in Genetics 1979;20:357-359. Chabot, B. Stephenson, D.A., Chapman, V.M., Besmer, P. Bernstein, A. 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Muchos estudios han demostrado la participación de los miRNAs en el cáncer, por una variedad de mecanismos, como: la amplificación, deleción, mutaciones y factores epigenéticos. Esta revisión resalta su importancia, diferencias y mecanismos de validación. Palabras clave: RNA, microRNA, biogénesis, funciones y objetivos de identificación, cáncer, genes supresores tumorales, oncogenes, regulación genética. ABSTRACT MicroRNAs are non-coding 20-30 nucleotide single stranded RNA molecules that are capable of regulating gene expression in eukaryotic organisms. Several studies have shown the involvement of miRNAs in cancer by a variety of mechanisms such as amplification, deletion, mutations and epigenetic factors. This review outline their importance, differences and validation mechanisms. Key words: RNA, microRNA, biogénesis, funciones y objetivos de identificación, cancer, tumor suppressor genes, oncogenes, gene regulation T he study of small RNA molecules such as microRNA (miRNA), short interfering RNA (siRNA) and the process known as interference RNA (RNAi) started with the identification and interaction of lin-4, a small non-coding 22nt length RNA and its major target lin-14 as an endogenous gene regulator in C. elegans.1,2 Alongside this discovery, the finding of double-stranded RNA molecules with gene silencing effects continue to expand the research in molecular biology with still upcoming new applications in diverse areas related to eukaryotic organisms.3 Both miRNA and siRNA have similar characteristics involving their molecular structure, formation and effect pathways. However, they have important differences, * Institute of Medical Microbiology & Immunology Faculty of Health Sciences, Aarhus University Correspondencia: Wilhelm Meyers Allé 4, Edificio 1240, 4o piso, oficina 443, Aarhus 8000, Dinamarca. Correo electrónico: evazquez@immunologi.au.dk Recibido: diciembre, 2010. Aceptado: enero, 2011. Este artículo debe citarse como: Vázquez-Garza E. MicroRNA: biogenesis, functions and objetives identification. Rev Hematol Mex 2011;12(1):39-46. www.nietoeditores.com.mx Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 miRNAs were seen as endogenous post-transcriptional mechanisms of an organism genome, while siRNA were proposed to have an exogenous origin, also differing in their target recognition and silencing mechanisms.4-7 Up to date, miRNAs and their regulation effects have been identified in plants, flies, worms and their counterparts in 6,8-10 mammals. Due to their special location inside or close to fragile sites, of loss of heterozigosity and minimal regions of amplification11, miRNAs are constantly studied as targets in cancer research. Also, they are involved in other biological processes such as metabolism and disease due to their regulatory effect in almost up to 30% of human 6,12,1314-17 genes in apoptosis, differentiation and cell proliferation. This review focuses on the structural differences between miRNA and siRNA, their biological functions, examples of them as models of oncogenes or tumor suppressor genes and finally their validation tests to confirm new miRNAs prospects. Biogenesis and structure of miRNA The first step in the biogenesis of microRNA is primiRNA, and comes mediated by a RNA polymerase II transcription with a double stranded stem of 33bp, a 39 Vázquez Garza E terminal loop and two single-stranded segments18. After transcription, the pri-miRNA is cleaved by the microprocessor complex into a 70 nt length hairpin-like precursor of miRNA (premiRNA). The microprocessor consists of a RNase III enzyme Drosha and a binding19,20 protein DGCR8/Parsha.This protein binds to the hairpin structure base, the stem, and positions the enzyme Drosha that cleaves the stem of the pri-miRNA from the two single stranded segments.21 Other proteins involved in this process are p68, p7222 and a Drosha independent pathway has also been described.23 Pre-miRNA is then exported to the cytoplasm from the nucleus by Exportin-5 and the RanGTP hydrolization to RanGDP6.24 Once the pre-miRNA is in the cytoplasm a RNase III enzyme with endonuclease activity called Dicer, dices the pre-miRNA into short RNA duplexes.25 Mature RNA duplexes consist of a mature miRNA strand and a complementary miRNA strand depicted as miRNA* that undergoes degradation.26 Mature miRNA binds to an Argonaute (Ago) protein forming the so called RNAinduced silencing complex, RISC. 27 The Argonaute superfamily can be divided in diverse subgroups: Piwi, that binds to piRNAs, a nematode specific clade and the Ago clade that associates with miRNAs and siRNAs,28 they have 4 characteristic domains:29,30 a Dicer shared PAZ domain, PIWI, N and Mid. MiRNAs mediate target recognition in different patterns, while there is almost a perfect complementarity in plants, in most animals there is multiple imperfect pairing.31 Recent experiments have determined that the most important factor in target RNA recognition by a miRNA is perfect to almost perfect pairing of the 5’ region consisting of 2-8 nucleotides of the32,33 mi-RNA and the mRNA, this region is called seed or nucleus. Between the theories explaining the mechanisms by which miRNAs mediate gene silencing three will be discussed in this review: miRNA mediated translational repression, miRNA-mediated degradation, and P-bodies. MiRNA-mediated translational repression is a posttranscriptional mechanism of gene silencing in which miRNA targets exhibit significant down-regulation at the protein level.34 MiRNA mediated mRNA degradation occurs by deadenylation and/or decapping through recruitment of GW182 via Ago-mediated interaction.35 The segregation of miRNA function into cytoplasmatic 40 foci containing a number of molecular machinery involved in mRNA degradation pathways is the basis of the P-body or GW-body theory,36 still, the formation of P-bodies does not always precede silencing and there is still debate about this mechanism of repression.37 Biogenesis of siRNA SiRNA starts as a long linear, perfectly based paired dsRNA; these structures are then processed by DICER like miRNA biogenesis, into siRNAs. Although single stranded siRNA can load into Ago proteins, the human dsRNA depend of mechanisms to attach to it. SiRNA were thought to have an exogenous origin, since they were seen in transgene and virus induced silencing in plants3 however they also have endogenous sources like convergent mRNA transcripts, hairpinRNA (hpRNA) and sense antisense, pairs.38,39 RISC assembly has been characterized in Drosophila, and appears to be biochemically simpler in humans and is mediated by the involvement of three proteins: DICER, TRBP, and Ago220, even additional proteins are associated with Ago complexes in human cells but does not seem to be essential for RISC loading or target cleavage.40 There are different RISC assembly pathways that dictate thus, different categories of siRNAs, this finding applies depending the endogenous or exogenous nature of the siRNas.38,39,41,42 RNA degradation is induced by the PIWI domain of the Ago protein, with a precise cut in the phosphodiester links of the targeted nucleotides, resulting in products with 5’ monophosphate and 3’ hydroxyl termini,39 this process is then finished by cellular exonucleases that degrade the resulting fragments.43 As with miRNAs, the effector phases in siRNAs occur mainly in cytoplasmatic locations known as P-bodies (GWbodies) that exhibit high amounts of mRNA factors.44 A noteworthy effect of siRNA is its ability to amplify its effects, causing a striking response that may lead to systemic silencing spreading through an organism3,40. Interestingly also is the fact that siRNA is involved into inducing heterochromatin formation in S. pombe.45,46 One of the key differences between miRNAs and most siRNAs is the precision of their ending sequences, while miRNA have highly exact ends while siRNA are more heterogeneous, this gives higher specificity to miRNAs on substrate.21 Oncologic associated studies involving miRNAs are based on their profile expression between normal cells and cancer cells; this expression is highly specific for cell-type and differentiation status. However, care must Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 MicroRNA: biogénesis, funciones y objetivos de identificación Figure 1. Simplified biogenesis of mi-RNA Small Interfering RNA (siRNA) Figure 2. Simplified biogenesis of siRNA and its effects. be taken since tumors may arise the formation of aberrant miRNA expression as a consequence of the malignant transformation / mutations involved in the cell. Evidence that miRNA can have tumor suppressor or oncogenic activity should be related to: 1) Data demonstrating widespread dysregulation in diverse cancers, 2) Gain Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 or loss of miRNA function in tumors owing to deletion, amplification or mutation, 3) Direct documentation of tumor-suppressing or tumor-promoting activity using animal models and 4) Identification and verification of cancer-relevant targets that clarifies mechanisms through which the miRNA is involved in the oncogenesis.47 41 Vázquez Garza E Oncogenic MicroRNA examples MicroRNAs whose expression is increased in tumors may be considered oncogenes (oncomirs) and have the ability to promote tumor development by inhibiting tumor suppressor genes, genes that control apoptosis or genes involved in controlling cell differentiation. Some examples that will be discussed are mir-17-92, BIC/mir-155, mir-21 and mir-372/373. Mir-17 cluster involves six human miRNAs (mir-175p, mir-18a, mir-19a, mir-20a, mir-19b1 and mir-19b2) located in chromosome 13q31-32, this genomic locus is highly expressed in solid tumors and hematological malignancies such as large B cell lymphoma, mantle cell lymphoma, primary cutaneous B cell lymphoma, colon, lung,48-52prostate, breast, stomach and pancreatic cancers. The expression of the mir-17 cluster oncomirs is related to the consecutive expression of the c-Myc gene, which regulates the expression of E2F1 gene involved in cell cycle. Mir-17-5p and mir-20a repress E2F1 translation, mutants of mir-20a causes a four-fold increase E2F1, thus the regulation of c-myc by mir-17-92 modulates the expression of E2F1 affecting cell52,53 death via the ARE-p53 pathway. This came as evidence by in vivo using E•-myc in transgenic mice. Hematopoietic stem cells from E•-myc animals formed B cell lymphomas when introduced to lethally irradiated recipient animals,54 this alongside another study demonstrating that expression of the mir-17 cluster increased the proliferation of lung cell cancer in vitro.49 Mir-155 is embedded in the B cell integration cluster (BIC) located in chromosome 21q23, and is highly expressed in pediatric Burkitt lymphoma, Hodgkin disease, primary mediastinal non-Hodgkin lymphoma, CLL, AML, lung cancer and breast cancer.50,55-59 Coexpression of BIC and c-myc is related to cause growth enhancement of cells,57,60,61 in AML is correlated with higher counts and tandem mutations and in early leukemogenesis it showed polyclonal preleukemic pre-B cell proliferation followed by malignancy transformation in a mouse model with a B cell– overexpression of mir-155.60,62 Mir-21 functions as an oncomir in glioblastoma, it was discovered while screening with expression arrays and northern blot showing its abnormal miRNA expression. It is upregulated in human glioblastoma tissues, primary tumors, and glioblastoma cell lines related to adult and fetal brain tissue and astrocytes. Studies show that mir-21 42 may promote tumorigenesis by inhibiting apoptosis via inactivation of caspases.63 Besides its involvement in glioblastoma, mir-21 has been found upregulated in hematological malignancies and solid tumors and has been shown to inhibit cell growth in cultured liver and breast cells.65 Mir-372 and mir-373 participate in the oncogenesis of human testicular germ cell tumors; this was assessed after monitoring CDK2 activity in miRNA expressing cell lines.66 Induction of p21 following Ras activation did not inhibit CDK2 in the presence of activated Ras when mir-372 and mir-373 was expressed. The microarray analysis revealed down regulation of large tumor suppressor homolog 2 (LATS2)67, which acts as an inhibitor of CDK2, relieving CDK2 from repression and promoting proliferation in the presence of activated Ras.66 Table 1. Examples of Oncogene activity of miRNAs MicroRNA Disease involved Effects Mir-155 CLL, DLBCL, AML, BL, lung and breast cancers Induces lymphoproliferation. Mir-17-92 Breast, lung, colon, stomach, pancreatic tumors and lymphomas. Induces lymphoma and lymphoproliferative disorders Mir-21 Breast, colon, pancreas, prostate, lung, liver, glioblastoma. Induces apoptosis and decreases of tumor formation Mir-372/373 Testicular tumors Promotes tumorigenesis alongside with RAS MicroRNAs as tumor suppressor genes. MiRNAs whose expression is decreased in cancer cells and usually prevent tumor development by negatively inhibiting oncogenes or the malignant transformation of cells, are regarded as tumor suppressor genes. This loss of function can be due to several mechanisms such as genomic deletion, mutations, epigenetic silencing and miRNA processing alterations.68,69 B cell lymphocytic leukemia is the most common leukemia in adults in the western world, is characterized as a monoclonal disorder with progressive accumulation of incompetent lymphocytes. The cells of origin in the majority of patients with chronic lymphocytic leukemia (chronic lymphoid leukemia, CLL) are clonal B cells arrested in the B-cell differentiation pathway, intermediate between pre-B cells and mature B cells. Morphologically in the peripheral blood, these cells resemble mature lymphocytes.68 An abnormal karyotype is observed in the Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 MicroRNA: biogénesis, funciones y objetivos de identificación majority of patients with chronic lymphocytic leukemia (chronic lymphoid leukemia, CLL). The most common abnormality is deletion of 13q, which occurs in more than 50% of patients. Individuals showing 13q14 abnormalities have a relatively benign disease that usually manifests as stable or slowly progressive isolated lymphocytosis.70,71 Until recently, a cluster of miRNAs, mir-15a and mir-16-1, was discovered in the 13q14.2 region. This cluster was shown to be deleted or down regulated when compared to normal CD5+ lymphocytes from normal donors. The tumor suppressor role in this cluster was made by the discovery of the upregulation of the antiapoptotic bcl2 gene. Deletions of miRNA15a and miRNA16-1 lead to overexpression of bcl2 through loss of down regulating miRNAs. 72,73 miRNA16-1 also plays a critical role in the recognition and rapid degradation of transcripts containing AU-rich elements, although its pathologic relevance still needs further research.74,76 Let-7 was originally identified in C. elegans, and its loss of function prevents the transition from the fourth larval phase to adult cell fates in the worm.17 This gene is highly conserved in vertebrate organisms from worms to humans.77-79 Loss of expression of let-7 results in loss of differentiation, and members of this gene functionally inhibit the miRNAs of genes such as Ras family genes, HMGA2and c-myc81, inducing programmed cell death when is over expressed in lung cancer,79,81 colon cancer and Burkitt lymphoma cell linesThe mir-29 family includes three isoforms in two clusters: mir-29b-1/mir-29a and mir-29b-2/mir-29c, it has a tumor suppressor effect by targeting MCL-1 and TCL-1 which is an oncogene, and are downregulated in CLL, lung cancer, invasive breast cancer, AML, cholangiocarcinoma, and lung cell cancer lines.82,83 Finding targets of animal organisms miRNAs using genome sequences is not as easy as is in plants. While in plants many targets are predicted because of its extreme complementarity84, in animal even though complementarity occurs, is highly unusual.85 Several target prediction software is available to simplify the look for target genes for miRNAs, nevertheless, lists of possible genes vary according to which program is used86. So, since this approach is not that feasible, there are other approaches to determine targets such as: Up regulation of miRNAs, downregulation of miRNAs, combining Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Table 2. Examples of Tumor Suppressor activity of miRNAs MicroRNA Disease involved Effects Mir-15a Mir-16-1 CLL Induces apoptosis and decreases tumor formation. Let-7 Lung and breast cancers. Induces apoptosis Mir-29 CLL, AML, Lung and breast cancers, cholangiocarcinoma. Induces apoptosis and decreases of tumor formation Mir-34 Pancreatic, colon and breast cancers. Induces apoptosis Genome Scanning candidate’s validations expression, Northern blot analysis, RT-PCR, microarray analysis and RISC purification. For the up or downregulation of miRNA candidates there are some possible approaches: use of antisense inhibitors, transgenics, specific promoters, and point mutants. Antisense inhibitors (antagomirs or antimirs) blocks the target miRNA function by binding to the mature miRNA and preventing its binding to the to the targeted gene.87,88 Antagomirs are 2-O- methyloligoribonucleotides and antimirs are 89-91 locked nucleic acid nucleotides containing oligodeoxyribonucleotides. Knocking down the miRNA gene can suppress the miRNA activity and then checking the miRNA profiles to find the specific genes92. Combining overexpression and downregulation of miRNAs is also an approach that has been used in studying mir-14093. The use of point mutants involves changes in the “seed” sequence, which is of vital importance to identify gene targets, increasing the mismatch of this region by changing one or two nucleotides of it, decreases the gene regulation function of miRNAs.94 Northern blot analysis is a technique used to study gene expression by detecting RNA or mRNA in a sample.95 It is reliable enough to study the expression of miRNA in cancers, 49 however it has strong limitations such as unequal hybridization efficiency of individual probes and difficulty in detection of simultaneous miRNAs.96 Real Time PCR also called quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/ qPCR) or kinetic polymerase chain reaction, which is used to amplify and simultaneously quantify a targeted DNA molecule,97 can be used for quantification miRNA profiles, it's a fast procedure and can detect primiRNA expression, nevertheless it can not correlate between the mRNA expression levels and the up or downregulation of certain miRNAs as the cause of the disease.98 43 Vázquez Garza E DNA microarray is a multiplex technology consisting of an arrayed series of thousands of microscopic spots of DNA oligonucleotides containing picomoles of a specific DNA sequence.99 It has become a comprehensive technology for comparing normal and tumoral tissues and the miRNA expression between them.56 Finally, after biochemical purification of RISCs by anti-Ago2 proteins, miRNA targets can be identified since all RISCs are purified by the antibody using microarray hybridization and sequencing.93,100 REFERENCES 1. 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La revisión del artículo la realizó Juan Manuel Mejía Aranguré, investigador titular en la Unidad de Investigación Médica en Epidemiología Clínica del Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. El Dr. Mejía Aranguré es miembro del Sistema Nacional de Investigadores, de la Academia Nacional de Pediatría y de la Sociedad Americana de Hematología. TRABAJO CLÁSICO Lobato-Mendizabal E, Ruiz-Argüelles GJ, Marín-López A. Leukaemia and nutrition I: malnutrition is an adverse prognostic factor in the outcome of treatment of patients with standard-risk acute lymphoblastic leukaemia. Leukemia Research 1989;13:899-906. RESUMEN DEL TRABAJO El objetivo del estudio fue evaluar la respuesta al tratamiento de un grupo de pacientes con leucemia aguda linfoblástica de riesgo habitual. Se evaluaron ocho variables dependientes de la enfermedad: edad, sexo, cuenta leucocitaria en sangre periférica, morfología FAB, fenotipo inmunológico de los blastos, ganglios linfáticos, hepatomegalia y esplenomegalia. Además de dos variables independientes de la biología de la enfermedad: sitio de tratamiento: (Hospital Civil de Puebla versus práctica privada) y la desnutrición (que fue medida con el índice www.nietoeditores.com.mx Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 peso/talla). Se incluyeron todos los pacientes pediátricos menores de 15 años con diagnóstico de leucemia aguda linfoblástica que fueron estudiados y tratados en el Centro de Hematología y Medicina Interna de Puebla (práctica privada) o en el Hospital Universitario de Puebla (Hospital Civil), entre marzo de 1983 y abril de 1988. Del Hospital Civil fueron 23 pacientes y 27 pacientes, del total, estaban desnutridos al diagnóstico (63%). Ninguna de las variables biológicas influyó en el pronóstico de la leucemia aguda linfoblástica. Si bien la remisión completa fue similar en el grupo de bien nutridos y el grupo con desnutrición (98 vs 94%; p>0.05), la supervivencia a cinco años fue de 83% para los bien nutridos y de 26% para los desnutridos (p<0.001). La desnutrición influyó, también, en las recaídas porque 75% de los pacientes desnutridos recayeron mientras que sólo 18% de los bien nutridos (p<0.0005). Las recaídas aisladas en médula ósea ocurrieron en 25% de los desnutridos y en 7% de los bien nutridos. La dosis de quimioterapia tuvo que ser reducida en 68% de los pacientes desnutridos y en los bien nutridos en 10% (p<0.005). Las conclusiones de este estudio fueron que la desnutrición es una variable independiente en el pronóstico de pacientes con leucemia aguda linfoblástica de riesgo habitual. La desnutrición se asoció con una supervivencia corta en los pacientes debido a recaídas en la médula ósea. La desnutrición fue la razón para administrar dosis subóptimas de quimioterapia durante la fase de mantenimiento. La recomendación es que la desnutrición debe incluirse como un factor pronóstico adverso en la respuesta terapéutica de niños con leucemia aguda linfoblástica de riesgo habitual. En los países donde la desnutrición es un problema de salud, estas observaciones son más sobresalientes. Quizá sea útil administrar la quimioterapia 47 Lobato-Mendizábal E y col. antileucémica simultáneamente con un esquema nutricional para mejorar la tolerancia al tratamiento.1 Comentario del revisor En uno de los libros más importantes en oncología pediátrica2 se señala que el estado nutricional es un factor pronóstico significativo en las leucemias agudas linfoblásticas.2 No obstante, en el decenio de 1980 la desnutrición estaba lejos de ser considerada un factor pronóstico en niños con leucemia aguda linfoblástica. Las revisiones más importantes de aquel entonces señalaban que la leucemia aguda linfoblástica era un enfermedad con pocas alteraciones nutricionales3,4,5 y, por consiguiente, era difícil creer que en este tipo de padecimientos la desnutrición pudiera influir en la respuesta de los niños al tratamiento.3,4 LobatoMendizabal, Ruiz-Argüelles y Marín-López muestran, a través de este artículo, su compromiso con la salud de sus pacientes, ya que al ver que la evolución de los niños latinoamericanos no era la misma que la de los niños de países desarrollados, a pesar de llevar rigurosos esquemas de tratamiento, se dedicaron a buscar una respuesta para ello. Su interacción con otros colegas del Continente los llevó a plantearse una de las preguntas más sobresalientes que ha aportado el mundo hispano al pronóstico de los niños con leucemia aguda linfoblástica. Es verdad que al principio se pensó que la desnutrición podría afectar, fundamentalmente, a niños de Latinoamérica o África; no obstante, pronto la desnutrición en niños con leucemia aguda linfoblástica acapararía la atención de varios investigadores en diferentes partes del mundo. Un estudio del Royal Hospital for Sick Children de Glasgow6 confirmó más tarde el hallazgo reportado por Lobato-Mendizabal y su grupo. Los ejemplos en países latinoamericanos no se hicieron esperar.7,8,9 Todo esto abrió una nueva línea de investigación en el mundo a la que muchos nos fuimos integrando: reuniones internacionales para evaluar el efecto de la desnutrición en el pronóstico de los niños con leucemia10 y revisiones en las revistas sobre cáncer más importantes del mundo11 fueron la señal de la importancia que acaparó esta línea de investigación. Se desprendieron, además, nuevas rutas de estudio, como evaluar el efecto de la disminución de la quimioterapia que sufren estos pacientes,12 porque la desnutrición está fuertemente relacionada con el nivel educativo de los padres y su nivel socioeconómico. Estas situaciones se han evaluado, y se ha encontrado la importancia de los 48 mismos en la evolución de la leucemia.7,9,13,14 No obstante, ahí no se detuvo todo, se realizaron estudios para evaluar si la desnutrición influia en la mortalidad temprana de los niños con leucemia aguda linfoblástica,15 que en algunos centros de nuestro Continente llega a ser muy alta, hasta de 15%.16,17 Se estudiaron los efectos del tratamiento en el estado nutricional de estos niños18 así como los cambios en el estado nutricional que pudieran repercutir en su respuesta al tratamiento.19 Estos son algunos de los ejemplos donde el artículo de Lobato-Mendizabal y colaboradores ha repercutido. Prácticamente en todos esos estudios se hace referencia a su trabajo como la justificación de los mismos. La investigación sigue en esta área. El problema de la desnutrición está muy extendido en todo el mundo20,21,22 y aún la leucemia aguda linfoblástica no puede prevenirse.23 Estos eventos seguirán interactuando y afectando la mortalidad de los niños en el mundo.24,25 Debemos seguir estudiando en este campo y debemos seguir el ejemplo de los doctores Lobato-Mendizabal, Ruiz-Argüelles y Marín-López que, como ha sido reportado como una de las claves para hacer medicina traslacional, debe tenerse firmemente el objetivo de producir un beneficio a los pacientes cuando se planea hacer investigación.26,27 Nuestra población infantil que padece leucemia aguda linfoblástica es distinta a la de otros países, sobre todo de los caucásicos. La experiencia de este artículo enriquece enormemente a una generación de nuevos investigadores, de no vivir esperando de otras partes del mundo lo que debemos estudiar en México. Ejemplos como este seguirán enriqueciendo la hematología y, en general, la ciencia de México. REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. Lobato-Mendizabal E, Ruiz-Argüelles GJ, Marín-López. Leukaemia and nutrition I: malnutrition is an adverse prognostic factor in the outcome of treatment of patients with standard-risk acute lymphoblastic leukaemia. Leuk Res 1989;13:899-906. Margolin JF, Steuber CP, Poplack DG. Acute lymphoblastic leukemia. Pizzo PA, Poplack DG. Principles and practice of pediatric oncology. 4ta edición. Lippincott Williams & Wilkins:Philadelphia. 2006:538-90. Van Eys J. Effect of nutritional status on response to therapy. Cancer Res 1982; 42(Supl.):747-53. Rickard KA, Grosfeld JL, Coates TD, Weetman R, Baehner RL. 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Las células linaje negativas se marcaron con un anticuerpo monoclonal anti-CD34 (My-10, ATCC) y, subsecuentemente, incubadas con las Dynabeads. Finalmente, las células CD34+ fueron liberadas de las partículas magnéticas por una incubación nocturna a 37ºC en medio Iscove modificado por Dulbecco (IMDM) suplementado con 10% de suero fetal de bovino ([FCS], GIBCO (Grand Island, NJ). * Sección de Estudios de Posgrado e Investigación. Escuela Superior de Medicina. Instituto Politécnico Nacional. Correspondencia: Dr. Julio Roberto Cáceres-Cortés. Plan de San Luis y Díaz Mirón s/n, colonia Casco de Santo Tomás, México 11340, DF.Correo electrónico: jcacortes@gmail.com Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Condiciones de cultivo Las células primarias CD34+ se sembraron en micropozos de fondo plano (Linbro; Flow Laboratories, McLean, VA) en 100 µL de medio de cultivo Iscove modificado por Dulbecco (IMDM) (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero fetal de bovino ([FCS] (Gibco), viscificado con 1% de metilcelulosa, albúmina de suero bovina (20 mg/mL; Sigma, St. Louis, MO), transferrina saturada en hierro (30 µg/mL; Hoechst), insulina (1.7 µM; Upstate Biotechnology Institute, Lake Placid, NY), GM-CSF (6 ng/mL) e incubadas a 37ºC, 5% CO2 a 95% de humedad durante 14 días. Las colonias CFU-GM que contenían más de 40 células se contaron utilizando un microscopio invertido. Recibido: noviembre, 2010. Aceptado: enero, 2011. Este artículo debe citarse como: Cáceres-Cortés JR. La colonia Poodle. Rev Hematol Mex 2011;12(1):51. www.nietoeditores.com.mx 51 Rev Hematol Mex 2011;12(1):52 Carta al editor Sobre el Grupo CLAHT Carlos Martínez-Murillo,*,*** Arlette Ruiz de Saez,**,*** Carmen Luisa Arocha Piñango*** Al Editor: En el número 3 (julio-septiembre) del volumen 11 de la Revista de Hematología de México apareció el artículo “Historia del Grupo CLAHT”, donde se hace referencia a su fundación, su consolidación y las perspectivas del Grupo. Sin embargo, los autores de dicho artículo tenemos algunas aclaraciones y aportaciones importantes que agregar a la historia del CLAHT y que a continuación se mencionan: 1. Representantes actuales por países Alicia Blanco Joao Carlos De Campos Guerra Jaime Pereira Garcés Maria Nelly de Arboleda Rafael Jiménez Bonilla Delfina Almagro Mercy Maldonado Ana Gladis Mancia de Reyes Jaime García Chávez Bélgica Moreno Paula A. Amante de Guggiari Saúl Mendoza Ordoñez Rosa Nieves Paulino Cecilia Carrizo Apsara Boadas de Sánchez Argentina Brasil Chile Colombia Costa Rica Cuba Ecuador El Salvador México Panamá Paraguay Perú República Dominicana Uruguay Venezuela ccarrizo@arnet.com.uy apsarabsanchez@yahoo.es Servicio de Hematología del Hospital General de México. Ciudad de México. ** Banco Municipal de Sangre. Caracas, Venezuela. *** Grupo Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela. www.nietoeditores.com.mx 52 3. Nexos con Sociedades Médicas: ISTH: Este programa está coordinado por el doctor Raúl Altman y el Comité Educacional de la ISTH. Se han efectuado actividades educacionales en: Costa Rica, Bolivia-Paraguay, Cuba, República Dominicana, Guatemala, Venezuela, Argentina, Chile y por efectuarse en Perú, Panamá, El Salvador, México y Brasil. blanco@hematologia.anm.edu.ar jcdcg@uol.com.br jpereira@med.puc.cl mnarboleda@hotmail.commailto:facevedo@cable.net.co rafael_jimenezb@yahoo.com.mx dalmagro@infomed.sld.cu dramercymaldonadom@hotmail.com anagreyes@hotmail.com jaimegch@prodigy.net.mx belgica_moreno@hotmail.com paguggiar@tigo.com.pymailto:gguggiar@pla.net.py clahtperu@yahoo.com.mx / smendoza@clahtperu.org / maxmendo@hotmail.com rosa_nieves@hotmail.com 2. Ediciones de libros Manual de Hemostasia y Trombosis, segunda edición de 1990. Se hizo con la colaboración del Comité de Redacción de Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana y un comité editorial * conformado por los doctores: Lucía Kordich, Julio César Sánchez Ávalos, Héctor Vidal y Celso de Campos Guerra. 4. Capacitación de profesionales Programa de becas dirigido a profesionales universitarios. El Grupo CLAHT ofrece un programa de becas de iniciación o perfeccionamiento en el área de hemostasia y trombosis. Coordinación: doctora Lucía Kordich (Secretaria Científica). La información de los requisitos para optar a las becas se encuentra en: www.claht.org.ve Además, los doctores Norma de Bosch y Federico Fernández-Palazzi, ambos miembros del Grupo CLAHT, han sido merecedores de premios que la Federación Mundial de Hemofilia otorga a los profesionales de la salud. Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Rev Hematol Mex 2011;12(1):53-54 In memoriam Santiago Pavlovsky Tatiana Pavlovsky, Nadine Pavlovsky, Florencia Pavlovsky, Astrid Pavlovsky,* Nicolás Pavlovsky H abiendo transcurrido más de un mes de la partida de Papá, quisimos aprovechar la oportunidad para compartir algunos recuerdos, reflexiones y sentimientos que surgen de esa perspectiva privilegiada con la cual fuimos bendecidos: la de ser su familia. Papá fue para nosotros, además de un ejemplo de vida, un gran padre y marido. En su vida familiar, como en todas sus actividades, fue fiel a su esencia. Con más acciones que palabras y una infinita generosidad, nos supo transmitir sus valores de vida: el respeto y amor por el prójimo, la honestidad, la inquebrantable ética de trabajo y un profundo sentido de propósito en la vida. Con su gran coherencia, estos son los mismos valores que plasmó en todo aquello que construyó. Él tenía tres grandes amores: su familia, su profesión y los caballos. La pasión con la que se empeñó en concretar sus sueños en estas tres áreas era contagiosa. Junto a mamá formó una familia con 4 hijos y 16 nietos que disfrutábamos de su compañía. Con él aprendimos a esquiar, a andar a caballo, a jugar al tenis, hicimos cam* FUNDALEU. Pte. José E, Uriburu 1520 1114 Buenos Aires, Argentina astridp@intramed.net www.nietoeditores.com.mx Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 ping, picnics, viajamos en casas rodantes, nos reíamos de sus chistes repetitivos, lo buscábamos para consejos, pero sobre todo queríamos mucho a esa persona simple que siempre nos dio, lo que él pensaba era lo mejor para nosotros. Con su presencia, su esencia y mucha libertad nos brindó las herramientas necesarias para poder desarrollarnos cada uno en su camino. Sin duda su faceta más conocida fue su profesión como médico y aquella a la cual dedicó la mayor parte de su vida. Aunque heredó la profesión de su padre siempre consideró que más que una dinastía era su destino, y volcó toda su energía en hacer de su profesión un ámbito de excelencia tanto en lo profesional como en lo humano. Y en este camino de superación, no pretendía erigirse por encima del resto, sino que siempre buscó llevar al mismo nivel de excelencia a aquellos con los que trabajaba. Construyó mucho en sus 68 años, y es mucho más el legado que ha dejado. Dejó el GATLA, como guía para todos los hematólogos argentinos y FUNDALEU, lo que siempre fue su gran orgullo. Para él no había mejores médicos, enfermeras y profesionales que en FUNDALEU, el centro que él lideró y donde terminó sus días. El prestigio y reputación de FUNDALEU lo trascenderán, ya que ha podido formar a un grupo excepcional de profesionales que siguen su sueño de ser “un centro de excelencia médica único en el país”. Desde su partida hemos recibido centenares de cartas, e- mails, etc., que mencionan el lado humano de nuestro Santiago: Su contención, la seguridad que transmitía y la paz que emanaba su presencia son temas recurrentes en los mensajes de sus pacientes, más allá de su labor médica. 53 Pavlovsky T y col. La tristeza profunda de no tenerlo más entre nosotros disminuirá con el tiempo y dejará lugar al recuerdo de un hombre maravilloso que disfrutó plenamente su vida con gran dedicación y alegría en todo lo que hacía. Con una profunda humildad construyó y dejó una enorme labor clínica, un gran aporte científico, y una liadísima familia que lo acompañó unida hasta el último momento. Queremos terminar con unas palabras inspiradas en una oración de la Madre Teresa, a quién él tanto 54 admiraba: “confiamos en que está exactamente donde tiene que estar, que su vida fue coherente con sus pensamientos y sentimientos y que utilizó todos los dones que recibió y supo compartirlos con mucho amor con sus semejantes”. ¡Sin duda se hizo querer mucho por todos los que lo rodeaban y nos ha dejado una gran enseñanza y ejemplo de cómo vivir la vida! Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Rev Hematol Mex 2011;12(1):1-4 Editorial Algunas observaciones sobre el rezago en la práctica de los trasplantes hematopoyéticos en México Guillermo J Ruiz-Argüelles, Yael Cazares-Ordoñez, Guillermo J Ruiz-Delgado* E l trasplante de células progenitoras hematopoyéticas se ha convertido en un recurso terapéutico imprescindible en la práctica moderna de la medicina. Por diversas razones, la práctica de esta modalidad terapéutica ha tenido poco desarrollo en nuestro país. De acuerdo con el número de habitantes y de trasplantes hematopoyéticos realizados en México y en otros países desarollados, como España, es posible calcular que en nuestro país se están realizado sólo 10% de los trasplantes hematopoyéticos que debieran efectuarse en condiciones óptimas, lo que significa que en la República Mexicana se está negando este tratamiento a 90% de los pacientes que lo requieren. Las causas de este alarmante rezago son varias. En 1980 se efectuó el primer trasplante de células progenitoras hematopoyéticas en México por el Dr. Ricardo Sosa y sus colaboradores en el Instituto Nacional de la Nutrición en la Ciudad de México.1 El Dr. Sosa, recientemente fallecido, acababa de llegar de su adiestramiento en la práctica del trasplante de células progenitoras hematopoyéticas en Seattle, con el Dr. E. Donnall Thomas, quien en 1990 fue merecedor del Premio Nobel de Medicina por sus contribuciones en esta área de la medicina. Después de este trasplante se hicieron algunos otros aislados en el Centro Médico Nacional, en el Hospital Universitario de Monterrey, en el propio Instituto Nacional de la Nu- * Centro de Hematología y Medicina Interna de Puebla. Clínica Ruiz. Correspondencia: Dr. Guillermo J Ruiz-Argüelles, 8B Sur 3710, colonia Anzures. Puebla 72530, Pue. Correo electrónico: gruiz1@clinicaruiz.com Este artículo debe citarse como: Ruiz-Argüelles GJ, Cazares-Ordoñez Y, Ruiz-Delgado GJ. Algunas observaciones sobre el rezago en la práctica de los trasplantes hematopoyéticos en México. Rev Hematol Mex 2011;12(1):1-4. www.nietoeditores.com.mx Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 trición y en otros sitios, con resultados pobres; esto dio como resultado que en varias instituciones médicas del país se suspendieran de manera transitoria los programas de trasplante de células progenitoras hematopoyéticas, mientras que en Estados Unidos y en otros países desarrollados la actividad de los programas crecía de manera exponencial. En México, la práctica de trasplantes de células progenitoras hematopoyéticas fue casi anecdótica hasta antes de 1995.2 La segunda etapa de la historia de los trasplantes de células progenitoras hematopoyéticas se inició a partir de 1995, con la llegada de algunos médicos adiestrados en la práctica de estos procedimientos, lo que reactivó algunos de los programas de trasplante de células progenitoras hematopoyéticas en el país e inició otros.2 Otras causas por las que se reactivaron en algunas instituciones y se inició en otras la actividad más intensa de los programas de trasplante fueron la evolución de los conocimientos en esta área: a) se comenzaron a usar CPH de sangre periférica en vez de médula ósea, b) se hicieron simplificaciones de los métodos para llevar a cabo los trasplantes, y c) se inició la práctica de los alotrasplantes con esquemas de acondicionamiento no mieloablativo. En el año de 1993, en las ciudades de Monterrey y Puebla, se iniciaron sendos programas de trasplante de células progenitoras hematopoyéticas con modificaciones sustanciales en los métodos para hacerlos más sencillos y accesibles, tanto técnica como económicamente.3 Las modificaciones se hicieron en los métodos para efectuar los trasplantes hematopoyéticos autólogos y alogénicos. En el caso de los trasplantes de CPH autólogas, la preservación de las mismas sin necesidad de congelarlas y la conducción extrahospitalaria simplificaron el método, en tanto que en el caso de los trasplantes de CPH alogénicas, el empleo de esquemas de acondicionamiento de intensidad reducida, el uso de CPH de sangre periférica y la conducción extrahospitalaria han hecho que este recurso terapéutico sea más accesible a mayor número de pacientes mexicanos. 1 Ruiz-Argüelles GJ y col Autólogo 350 300 250 150 111 100 97 82 Hospital Universitario de Nuevo León INNSZ CHMI Puebla IMSS Puebla Centro Médico La Raza 0 Centro Médico ABC 35 50 7 Hospital General de Culiacán 145 Figura 1. Trasplantes de células hematopoyéticas autólogas llevados a cabo en México. CHMI = Centro de Hematología y Medicina Interna de Puebla. INNSZ = Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutricion Salvador Zubirán 2 450 400 385 350 305 300 250 200 151 123 150 100 92 86 INNSZ Instituto Nacional de Pediatría IMSS Puebla CHMI Puebla Hospital Universitario de Nuevo León 0 Centro Médico ABC 47 50 Figura 2. Trasplantes de células hematopoyéticas autólogas llevados a cabo en México. CHMI = Centro de Hematología y Medicina Interna de Puebla. INNSZ = Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutricion Salvador Zubirán 304 200 Alogénico Centro Médico La Raza La institución de salud mexicana que más trasplantes de células progenitoras hematopoyéticas ha hecho es el Centro Médico La Raza, del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), donde se han realizado 385 trasplantes alogénicos y 304 trasplantes autólogos. En la experiencia combinada del Hospital Universitario de Nuevo León y la Clínica Ruiz de Puebla, se han hecho 456 trasplantes alogénicos (305 en Monterrey y 151 en Puebla) y 193 trasplantes autólogos (82 en Monterrey y 111 en Puebla). Otras instituciones de salud que han efectuado de manera regular el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas son: el Centro Médico Nacional (CMN) Manuel Ávila Camacho del IMSS en Puebla (ha realizado 123 alogénicos y 145 autólogos), el Centro Médico ABC en la Ciudad de México (47 alogénicos y 35 autólogos), y otras instituciones (Hospital 20 de Noviembre, IMSS de Monterrey, IMSS de Guadalajara, Hospital de Oncología del CMN Siglo XXI, Instituto Nacional de Cancerología, Hospital de Pediatría del CMN Siglo XXI, Instituto Nacional de Pediatría y otros), de las cuales no pudo obtenerse información actualizada. Las Figuras 1 y 2 resumen los datos obtenidos. Estas cifras son, aproximadamente, diez veces menores que las que debiera haber idealmente en países desarollados. Las razones por las que existe este rezago son varias, algunas de ellas conocidas y otras desconocidas. En el caso de los trasplantes autólogos, tanto en nuestro país como en otros sitios del mundo, ha quedado claro que no es necesario contar con unidades de criopreservación de las células para realizarlos, porque las células hematopoyéticas pueden mantenerse hasta por 96 horas en buenas condiciones para trasplantarse en refrigeradores convencionales de bancos de sangre.4 Para poder aprovechar esta observación trascendente es menester emplear esquemas de acondicionamiento “cortos”.5 Por ello, la falta de disponibilidad en el país de melfalán endovenoso, que se emplea en una sola dosis es, sin duda, un obstáculo grave para que se hagan más trasplantes autólogos.5,6,7 Aún cuando pueden hacerse los trasplantes de células hematopoyéticas autólogas con melfalán oral6 o con otros esquemas “cortos”,8 los resultados son menos buenos que Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 El hematólogo clínico y el profesional del laboratorio cuando se aplica melfalán endovenoso,6,7 sobre todo en pacientes con mieloma múltiple, que son la indicación más frecuente de trasplante autólogo en la actualidad. Es claro que en nuestro país los pacientes con mieloma múltiple o con linfomas debieran considerarse aptos para recibir el beneficio del trasplante de células hematopoyéticas autólogas con mayor frecuencia; no ofrecerles este recurso terapéutico equivale a negarles una buena opción terapéutica. Es lamentable que el desconocimiento de las ventajas de los trasplantes autólogos en estas enfermedades sea una causa por la que no hacemos en México el número adecuado de autotrasplantes. En el caso de los trasplantes alogénicos, la situación es aún más compleja. En diversas publicaciones se han mostrado los resultados de los trasplantes de células hematopoyéticas alogénicas empleando esquemas de acondicionamiento de intensidad reducida.9-12 Los resultados halagüeños obtenidos en México con ese esquema de acondicionamiento se han podido reproducir en otros países de Latinoamérica.12 El “método mexicano” para realizar trasplantes de células hematopoyéticas alogénicas se ha practicado, principalmente, en el Hospital Universitario de Nuevo León y en la Clínica Ruiz de Puebla, donde, hasta noviembre de 2010, se habían efectuado 456 trasplantes alogénicos (305 en Monterrey y 151 en Puebla), cifra que constituye la experiencia más grande de trasplantes alogénicos en el país. La práctica de los trasplantes alogénicos con esquemas de acondicionamiento de intensidad reducida ha sido criticada negativamente por numerosos médicos mexicanos, quienes argumentan, entre otras cosas, que los esquemas de intensidad reducida se asocian con supervivencias menores a largo plazo de los pacientes trasplantados. La experiencia en otros países indica que los resultados a largo plazo de los pacientes trasplantados con esquemas de intensidad reducida son similares a los obtenidos con esquemas de acondicionamiento ablativo tradicionales,13,14 y que los costos de los trasplantes de los trasplantes de intensidad reducida son menores que los de los trasplantes convencionales.13 Aún cuando no se han hecho estudios comparativos en México con el empleo de esquemas de acondicionamiento convencionales o de intensidad reducida, hay ya algunos datos publicados que permiten establecer estas comparaciones y concluir información que no apoya la postura de quienes intentan denostar la utiidad de los esquemas de acondicionamiento de intensidad reducida. Al hacer la comparación de la expeRevista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 riencia conjunta del Hospital Universitario de Nuevo León y la Clínica Ruiz de Puebla en un grupo de 357 sujetos trasplantados con esquemas de intensidad reducida,15 con la experiencia del IMSS de Puebla en la que la mayoría de los pacientes se trasplantaron con esquemas de acondicionamiento mieloablativo convencionales, se encontró que la prevalencia de las formas aguda y crónica de la enfermedad de injerto contra huésped es considerablemente menor con el “método mexicano” de acondicionamiento de intensidad reducida, en tanto que la supervivencia a largo plazo es similar con los dos esquemas (Cuadro 1). Estas observaciones permiten concluir que los resultados a largo plazo de los trasplantes hematopoyéticos en nuestro país son similares a los obtenidos en países industrializados8-15 y que el uso de esquemas de intensidad reducida, como el “método mexicano”, producen a largo plazo y en circunstancias socioeconómicas similares, resultados comparables. En virtud de que los trasplantes con esquemas de intensidad reducida pueden hacerse de manera extrahospitalaria, con fármacos no costosos, de que son más baratos y causan menos complicaciones infecciosas y de injerto contra huésped, es complicado hacer un análisis de las causas por las que no se llevan a cabo en México más trasplantes con estos esquemas. Una causa es el “efecto Mateo”:16 “Si mis compañeros hematólogos en México demuestran que el esquema es adecuado, yo, hematólogo mexicano, debo denostarlo ... debo intentar quitarle al esquema las ventajas que tiene”. Una razón más es la creación y acondicionamiento de unidades de trasplante de médula ósea en algunos hospitales del país. Si ya se han construido estas unidades hay que usarlas, hay que amortizarlas –lo que supone dicotomía–,17 aún cuando en la actualidad ha quedado claro que ya no se necesitan para realizar trasplantes hematopoyéticos. Una razón más ruin Cuadro 1. Comparación de algunos datos de pacientes trasplantados en México con células hematopoyéticas alogénicas con esquemas de acondicionamiento de intensidad reducida o esquemas convencionales. HUNL = Hospital Universitario de Nuevo León. CHMI = Centro de Hematología y Medicina Inerna de Puebla. IMSS = Instituto Mexicano del Seguro Social. EICH = enfermedad de injerto contra huésped. Pacientes Sitio Intensidad reducida EICH aguda EICH crónica Supervivencia Referencias 357 HUNL + CHMI 100% 22% 17% 48% a 8 años (15) 123 IMSS Puebla 13% 41% 45% 51% a 6.5 años (8) 3 Ruiz-Argüelles GJ y col es el cobro que se hace por realizar estos procedimientos. El costo promedio de un trasplante de células hematopoyéticas alogénicas con el acondicionamiento “mexicano” de intensidad reducida es de 20 mil dólares estadounidenses,7,9-12 en tanto que en varias instituciones de salud del país el costo de un trasplante alogénico es mayor de 100 mil dólares estadounidenses. El propio Seguro Popular contempla una cifra mucho mayor que la real en relación con el costo de los trasplantes de células hematopoyéticas alogénicas. Otro obstáculo para llevar a cabo trasplantes hematopoyéticos en el país es la falta de legislación precisa sobre los requerimientos para realizar esos procedimientos, para autorizar a las unidades de trasplante hematopoyético y para ingresar al país células hematopoyéticas placentarias o de donadores adultos. Ante la falta de legislación suficiente sobre estos puntos, la aplicación absolutamente discrecional de los criterios para tomar estas decisiones por parte de entidades gubernamentales, como la Comisión Federal para Prevención de Riesgos Sanitarios (COFEPRIS), el Centro Nacional de Trasplantes (CENATRA) y otras se han erigido como grandes obstáculos para realizar trasplantes hematopoyéticos en nuestro país. Los cobros exagerados derivados de la avaricia de algunos colegas limitan la oferta de este procedimiento terapéutico. Así las cosas, es lamentable que en nuestro país la avaricia de algunas personas y la conducta de despreciar lo propio por admirar lo ajeno (el “malinchismo”),17 además de la ignorancia de las indicaciones del trasplante de células hematopoyéticas alogénicas, sean, por lo menos en parte, responsables de que a 90% de los pacientes mexicanos se les niegue la oportunidad de someterse a un trasplante de células hematopoyéticas. La ignorancia puede superarse con el estudio; es más complejo superar la avaricia, porque como lo señaló Dante Alighieri: “la avaricia es de naturaleza tan ruin y perversa que nunca consigue calmar su afán: después de comer tiene más hambre”. REFERENCIAS 1. Sosa-Sánchez R, Córdova MS, Labardini JR, Chávez-Peón F. Trasplante de médula ósea en anemia aplástica. Reporte del primer caso en México. Rev Invest Clín Méx 1980;32:49-55. 2. Ruiz-Argüelles GJ. Historia del trasplante de médula ósea en México. Rev Hematol Méx 2004;5:80-85. 3. Ruiz-Argüelles GJ, Gómez-Almaguer D. Making allogeneic bone marrow transplantation available to patients in developing countries: The Mexican Experience. Open Hematol J 2008;2:30-36. 4 4. Ruiz-Argüelles GJ, Ruiz-Argüelles A, Pérez-Romano B, MarínLópez A, Larregina-Díez A, Apreza-Molina MG. Filgrastim-mobilized peripheral-blood stem cells can be stored at 4 degrees and used in autografts to rescue high-dose chemotherapy. Am J Hematol 1995;48:100-103. 5. López-Otero A, Ruiz-Delgado GJ, Ruiz-Argüelles GJ. A simplified method for stem cell autografting in multiple myeloma: A single institution experience. Bone Marrow Transplant 2009; 44:715-719. 6. Vela-Ojeda J, García-Ruiz-Esparza MA, Padilla-Gonzalez Y, Gomez-Almaguer D, Gutierrez-Aguirre CH, Gomez-Rangel D, Morales-Toquero A, Ruiz-Delgado GJ, Delgado-Lamas JL, Ruiz-Arguelles GJ. Autologous peripheral blood stem cell transplantation in multiple myeloma using oral versus IV melphalan. Ann Hematol 2007;86:277-282. 7. Ruiz-Arguelles GJ. Whither the bone marrow transplant. Hematology 2010;15:1-3 8. Limón-Flores JA, Pérez-Lozano Uendy, Solís-Poblano JC, Rodríguez-Castillo P, Zagoya-Martínez P. El programa de trasplante hematopoyético del Hospital de Especialidades del IMSS de Puebla: Experiencia de 15 años. Rev Hematol Méx 2010;11(4):179-184. 9. Gómez-Almaguer D, Ruiz-Argüelles GJ, Ruiz-Argüelles A, González-Llano O, Cantú OE, Hernández NE. Hematopoietic stem cell allografts using a non-myeloablative conditioning regimen can be safely performed on an outpatient basis. Bone Marrow Transpl 2000; 25:131-133. 10. Ruiz-Argüelles GJ. Allogeneic stem cell transplantation using non-myeloablative conditioning regimens: Results of the Mexican approach. Int J Hematol 2002;76 (Suppl 1): 376-379. 11. Ruiz-Argüelles GJ, Gómez-Almaguer D. Breaking dogmata to help patients: Non-myeloablative hematopoietic stem cell transplantation. Expert Opin Biol Ther 2004;4:1693-1699. 12. Ruiz-Argüelles GJ, Gómez-Almaguer D, Morales-Toquero A, Gutiérrez-Aguirre CH, Vela-Ojeda J, García-Ruiz-Esparza MA, Manzano C, Karduss A, Sumoza A, de-Souza C, Miranda E, Giralt S; Latin American Cooperative OncoHematology Group. The early referral for reduced-intensity stem cell transplantation in patients with Ph1 (+) chronic myelogenous leukemia in chronic phase in the imatinib era: Results of the Latin American Cooperative OncoHematology Group (LACOHG) prospective, multicenter study. Bone Marrow Transplant 2005;36:1043-1047. 13. Saito AM, Zahrich D, Cutler C, Ho VT, Antin JH, et al. Lower costs associated with hematopoietic cell transplantation using reduced intensity vs high-dose regimens for hematological malignancy. Bone Marrow Transplant 2007;40:209-217. 14. Diaconescu R, Flowers CR, Storer B, Sorror ML, Maris MB, et al. Morbidity and mortality with nonmyeloablative compared with myeloablative conditioning before hematopoietic cell transplantation from HLA-matched related donors. Blood 2004;104:1550-1558. 15. Cantú OG, Gutiérrez H, Ruiz-Argüelles GJ, López A, Mancías C, Martínez S, González O, Jaime J, Gómez D. Incidence of graft versus host disease (GVHD) in patients with allogeneic peripheral hematopoietic stem cell transplantation after a nonmyeloablative conditioning. Haematologica 2010: 95(s2):653. 16. Ruiz-Argüelles GJ, Gómez-Almaguer D. El efecto Mateo en la medicina mexicana. Bol Méd Hosp Inf Méx 2003;60:452-453. 17. Ruiz-Argüelles GJ. Editorial: ¿Malinchismo o dicotomía? Algunas reflexiones. Rev Hematol Méx 2010;11:127-128. Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Rev Hematol Mex 2011;12(1):5-6 Editorial A 50 años del descubrimiento de las células troncales hematopoyéticas Héctor Mayani D esde los primeros años del siglo XX, médicos y científicos de diversos países buscaron descifrar los secretos del origen de las células sanguíneas. En ese entonces era bien sabido que la sangre se producía en el interior de los huesos, en la médula ósea; sin embargo, se desconocía la manera como se producían las células sanguíneas. Basados en estudios morfológicos, los grandes patólogos de la época, como Sabin, Ferrata y Maximow –entre otros– propusieron la existencia de una célula precursora, común para los eritrocitos, leucocitos y trombocitos, a la que se le denominó hemocitoblasto; sin embargo, no había prueba alguna de que esa célula realmente existiera. Fue hasta febrero de 1961, justo hace 50 años, cuando la revista Radiation Research publicó un artículo que demostraría sin lugar a dudas, la existencia de dicha célula precursora; un artículo que cambiaría diametralmente el estudio de la hematopoyesis.1 Los autores del trabajo eran dos jóvenes científicos canadienses, desconocidos hasta ese entonces: Ernest McCulloch y su alumno de posgrado, James Till. El artículo describía una serie de experimentos encaminados a demostrar la presencia –en la médula ósea de ratones– de células hematopoyéticas muy inmaduras, capaces de reconstituir el sistema hematopoyético de ratones que habían sido previamente irradiados. Debido a su capacidad para inducir la formación de colonias hematopoyéticas en el bazo de los ratones trasplantados, dichas células recibieron el nombre de Unidades Forma- Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología, Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. Este artículo debe citarse como: Mayani H. A 50 años del descubrimiento de las células troncales hematopoyéticas. Rev Hematol Mex 2011;12(1):5-6. www.nietoeditores.com.mx Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 doras de Colonias en el Bazo (CFU-S, por sus siglas en inglés). Till y McCulloch encontraron que la frecuencia de las CFU-S en la médula ósea era muy baja (<0.5% del total de células en el tejido hematopoyético), demostraron que cada CFU-S era capaz de generar nuevas CFU-S (podían autorreplicarse), y que podían generar células de distintos linajes sanguíneos (eran multipotenciales). Esas tres características constituyeron la base funcional para definir a las células troncales del sistema hematopoyético. Unos años después, a mediados del decenio de 1960, Leo Sachs, en Israel, y Don Metcalf, en Australia, establecieron las bases para el cultivo, en agar, de células hematopoyéticas de ratón, lo cual permitió llevar a cabo una caracterización más detallada de dichas células. Ellos, además, fueron los primeros en identificar y caracterizar diversas moléculas reguladoras de la mielopoyesis, conocidas más tarde como Factores Estimuladores de Colonias de Monocitos y Granulocitos. A partir de esos estudios, el campo de la hematopoyesis emergió como una disciplina de gran trascendencia, acaparando el interés de hematólogos clínicos y científicos básicos por igual. En el decenio de 1970 se desarrollaron mejores sistemas para cultivar in vitro células progenitoras hematopoyéticas, que permitieron identificar nuevas poblaciones celulares. Mike Dexter describió un sistema in vitro en el que se podía estudiar la interacción entre células hematopoyéticas y el estroma medular. Eugene Goldwasser purificó la eritropoyetina y varios grupos empezaron a emplear nuevas estrategias, como la citometría de flujo, para purificar a las células troncales y progenitoras hematopoyéticas. En la década de 1980 se identificó el antígeno CD34 como un excelente marcador de células hematopoyéticas primitivas. Se clonaron los genes de diversas proteínas reguladoras de la hematopoyesis y se empezaron a tratar pacientes citopénicos con factores hematopoyéticos recombinantes. Se describió la movilización de células hematopoyéticas a partir de la 5 Mayani H administración de algunos de esos factores. Se purificaron, por vez primera, células troncales hematopoyéticas de ratones y se hizo el primer trasplante hematopoyético con células de la sangre de cordón umbilical. En el decenio de 1990 se desarrollaron modelos animales para estudio de la hematopoyesis humana (xenotrasplantes); se describieron nuevos marcadores de CTH humanas, como CD90, CD117 y CD133. Se identificaron las células hematopoyéticas humanas capaces de iniciar y sostener la hematopoyesis leucémica (en un modelo animal de LMA). Se crearon los primeros bancos de células de sangre de cordón umbilical. Se extendió el uso de factores recombinantes y de sangre periférica movilizada y se realizaron los primeros ensayos de terapia génica con células hematopoyéticas. Durante los últimos once años se han logrado grandes avances en el entendimiento de las vías de señalización intracelular en células del sistema hematopoyético. Hemos presenciado el surgimiento de fármacos generados por diseño que han revolucionado el tratamiento de diversas enfermedades hematológicas, como la leucemia mieloide crónica. El trasplante de células hematopoyéticas ha alcanzado dimensiones extraordinarias, pues solo en 2008 se realizaron más de 56,000 procedimientos en todo el mundo. En los últimos años se han presentado evidencias que indican que las CTH tienen una plasticidad de diferenciación que excede al sistema hematopoyético, que puede generar células neurales y hepáticas, entre otras. Los avances alcanzados a lo largo de todos estos años en el campo de la hematopoyesis han sido sorprendentes; el conocimiento actual acerca del origen de las células sanguíneas, aún cuando no es definitivo, es muy completo y, sin lugar a dudas, la influencia que ha tenido este campo de investigación en la clínica, ha sido muy relevante. 6 En la actualidad, el sistema experimental descrito por Till y McCulloch, hace 50 años, sigue empleándose y los conceptos establecidos por ellos siguen vigentes. Para los que gustan de los números y las estadísticas, resultará interesante que el artículo publicado en Radiation Research en febrero de 1961 ha sido citado en más de 10,000 ocasiones en la bibliografía científica mundial. Los que trabajamos en el campo de la hematopoyesis tratando de entender el funcionamiento de las células troncales y progenitoras, los que diariamente atienden a pacientes hematológicos, buscando encontrar nuevos y mejores tratamientos, y los numerosos pacientes afectados con alguna enfermedad del sistema hematopoyético, como una leucemia, alguna variedad de síndrome mielodisplásico o alguna forma de falla medular, de una manera o de otra, hemos recibido la influencia del trabajo precursor de James Till y su maestro Ernest McCulloch. Si el campo de la hematopoyesis pudiera verse como el sistema hematopoyético, el trabajo inicial de Till y McCulloch sería la célula troncal de la que se derivaron todos los demás estudios. El pasado miércoles 19 de enero del presente año, Ernest McCulloch murió, a los 84 años de edad, en Toronto, Canadá. Además de familiares y amigos, asistieron a su funeral numerosos colegas, estudiantes y discípulos. Entre todos ellos destacó la figura de su gran colaborador, Jim Till. Sirva esta pequeña nota editorial como un humilde tributo a esos dos extraordinarios científicos canadienses. REFERENCIA 1. Till JE & McCulloch EA. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Rad Res 1961;14:213-222 Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Rev Hematol Mex 2011;12(1):7-10 Artículo original Impacto de la insuficiencia renal al momento del diagnóstico en pacientes adultos con leucemia linfoide aguda: experiencia en una institución de la Ciudad de México Christian Ramos-Peñafiel, * Carlos Martínez-Murillo,** Humberto Castellanos-Sinco,*** Efreen Montaño Figueroa,*Juan Collazo Jaloma RESUMEN Antecedentes: la leucemia linfoide aguda es una neoplasia linfoproliferativa caracterizada por proliferación descontrolada de células linfoides inmaduras. La insuficiencia renal puede manifestarse al diagnóstico o deberse al tratamiento con medicamentos citostáticos. La infiltración renal por células tumorales es baja y se ha asociado con causas como la hiponatremia e hipocalcemia. Material y método: estudio retrospectivo realizado en 165 pacientes adultos con diagnóstico de leucemia linfoide aguda, que iniciaron tratamiento con el protocolo institucional HGMLAL07/09 entre diciembre de 2007 y junio de 2010. La insuficiencia renal se definió como la creatinina sérica mayor de 1.5 veces el valor normal establecido. Se realizó un análisis multivariado para determinar si las variables edad, sexo, cuenta de leucocitos inicial, visceromegalias o inmunofenotipo muestran una relación estadísticamente significativa con la frecuencia de insuficiencia renal al momento del diagnóstico. Resultados: la mediana de edad fue de 33 años, 50.9% correspondieron al sexo masculino. Alrededor de 19.3% cursó con hepatomegalia (n=32), 18.1% con esplenomegalia (n=30) y 29% con crecimientos ganglionares (n=48). El 70.4% (n=116) se consideró riesgo alto. La mediana de leucocitos fue de 56.7 x 103/L (rango de 1-190 x 103/L. Cerca de 16.3% (n=27) de los pacientes tenía insuficiencia renal al diagnóstico y solo en 11% (n=3) se asoció con un síndrome de lisis tumoral espontáneo. La insuficiencia renal tuvo una relación estadísticamente significativa con el tipo de riesgo (p=0.26), las visceromegalias (p=0.006) y la hiperleucocitosis (p=0.003). Alrededor del 62.8% de los pacientes integraron remisión completa, sin presentarse una relación estadística entre la insuficiencia renal y la insuficiencia en el tratamiento (p=0.765). Conclusiones: es necesario identificar los diversos factores que pueden precipitar insuficiencia renal previa posterior al tratamiento y considerar diversas estrategias para limitar su progresión a insuficiencia renal crónica. Palabras clave: insuficiencia renal, leucemia linfoide aguda, síndrome de lisis tumoral. ABSTRACT Background: The acute lymphoid leukemia (ALL) is a lymphoproliferative neoplasm characterized by an uncontrolled proliferation of immature lymphoid cells. The renal failure may be present at diagnosis and also may be secondary to the use of chemotherapy. The renal infiltration by tumor cells is uncommon and has been linked to causes such as hyponatremia and hypocalcemia. Material and Methods: We studied 165 patients with ALL who started treatment with the institutional protocol HGMLAL07/09 between December 2007 to june 2010. Results: The median age was 33 years, 50.9% were male. About 19.3% (n=32) had hepatomegaly, 18.1% ( n=30) had splenomegaly and 29% (n=48) had lymph node enlargement. The 70.4% (n=116) were considered high risk. The median of WBC was 56.7 x 103/l (range 1-190 x 103/l). About 16.3% (n=27) of the patients had renal failure at diagnosis and only in a 11% (n=3) was associated with a tumor lysis syndrome. The renal failure are statistically associated with the risk (p=0.26), the visceromegalies (p=0.006) and hyperleukocytosis (p=0.003). The complete remission rate was 62.8% but the renal failure showed no impact on treatment failure (p=0.765). Conclusion: In conclusion is necessary to identify all the factors that can precipitate a renal failure both pre and post-treatment, as well as consider various strategies to limit the progression of chronic renal failure. Key words: Renal failure, Acute lymphoid leukemia, Tumor lysis Syndrome * ** *** Servicio de Hematología. Hospital General de México, SS. División de Excelencia Clínica, Coordinación de la Unidad Médica de Alta Especialidad, IMSS. Hospital General de Zona número 48, Instituto Mexicano del Seguro Social, San Pedro Xalpa, Atzcapotzalco. Correspondencia: Christian Omar Ramos Peñafiel. Dr. Balmis 148, colonia Doctores, México, DF. Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Correo electrónico: leukemiachop@hotmail.com Este artículo debe citarse como: Ramos-Peñafiel C, Martínez-Murillo C, Castellanos-Sinco H, Montaño FE, Collazo JJ. Impacto de la insuficiencia renal al momento del diagnóstico en pacientes adultos con leucemia linfoide aguda. Rev Hematol Mex 2011;12(1):7-10. www.nietoeditores.com.mx 7 Ramos-Peñafiel C y col. L a leucemia linfoide aguda es una neoplasia linfoproliferativa caracterizada por la proliferación descontrolada de células linfoides inmaduras. La insuficiencia renal aparece cuando se diagnostica la leucemia o después del tratamiento citostático, o prolongado de medicamentos nefrotóxicos y, en gran medida, como parte del síndrome de lisis tumoral.1 La infiltración renal por células tumorales al diagnóstico es baja; se registra solo en 1% de los pacientes con leucemia linfoide aguda.2 La incidencia de insuficiencia renal en pacientes adultos con leucemia linfoide aguda aún no se determina. En una serie pediátrica Olgar y sus colaboradores registraron, mediante ultrasonido, daño renal en 32 de 116 pacientes con leucemia linfoide aguda, principalmente asociado con hipocalcemia e hiponatremia.3 En esa misma serie Yetgin y su grupo reportaron que las anormalidades en el filtrado glomerular fueron más frecuentes en pacientes menores de dos años y mayor reabsorción de fósforo en los pacientes no tratados con factor estimulante de colonias de granulocitos. Las anormalidades renales se registraron más frecuentemente en pacientes con hemoglobina menor de 10 g/dL, infiltración renal, hipertensión al diagnóstico y en quienes recibieron metotrexato durante el seguimiento. Kopecna y su grupo, en una pequeña serie de pacientes, determinaron que al final del tratamiento citostático 19 de 36 niños con leucemia linfoide aguda tuvieron proteinuria (52.8%). La reducción del filtrado glomerular se registró en 5 de 36 pacientes (13.9%); es un riesgo a largo plazo de llegar a padecer insuficiencia renal crónica.4 Ésta también es un componente asociado con el síndrome de lisis tumoral. La insuficiencia renal se ha asociado con la liberación rápida de metabolitos intracelulares (ácidos nucleicos, proteínas, fósforo, potasio) y se manifiesta clínicamente por: hiperuricemia, hipercaliemia, hiperfosfatemia con o sin hipocalcemia, insuficiencia renal, arritmias y convulsiones.5,6 La frecuencia y la repercusión de la insuficiencia renal al diagnóstico en pacientes adultos con leucemia linfoide aguda aún no se determinan. A partir del mes de diciembre de 2007, en nuestra institución se estableció el protocolo HGMLAL07/09 para el tratamiento de la leucemia linfoide del adulto. El objetivo principal de este estudio es determinar la frecuencia de la insuficiencia renal al diagnóstico, su relación con las diferentes variables pronósticas y su repercusión en la respuesta al tratamiento de inducción. 8 MATERIAL Y MÉTODO Estudio retrospectivo realizado entre diciembre de 2007 y junio de 2010 en el Hospital General de México en donde se aplicó el protocolo de tratamiento HGMLAL07/09 basado en un ciclo de pre-tratamiento con dosis progresivas de esteroides y terapia de inducción a la remisión: daunorrubicina, vincristina y esteroides. El protocolo de inducción a la remisión se describe en el Cuadro 1. De marzo de 2009 a enero de 2010 se realizó una modificación al esquema de inducción: se acortó el intervalo de administración de las antraciclinas (días 1, 2, 3 de tratamiento). Criterios de inclusión: se incluyeron todos los pacientes con diagnóstico de leucemia linfoide aguda realizado en el departamento de Hematología del Hospital General de México. Se realizó inmunofenotipo para determinar la estirpe de las células linfoides. Al momento del diagnóstico se hizo un perfil bioquímico completo. Se excluyeron los pacientes sin perfil bioquímico completo previo a la terapia citostática. Criterios diagnósticos: la insuficiencia renal se definió como la coexistencia de creatinina sérica mayor de 1.5 veces el valor normal establecido. El síndrome de lisis tumoral espontáneo se diagnosticó de acuerdo con los criterios establecidos por Cairo-Bishop: determinación de ácido úrico ≥8 mg/dL, potasio sérico ≥ 6 mg/dL, fósforo ≥ Cuadro 1. Esquema de inducción a la remisión. Protocolo institucional HGMLAL07/09 Dosis (m2/SC) Días Pre-tratamiento Prednisona Prednisona Prednisona Prednisona Inducción a la remisión Vincristina Prednisona Daunorrubicina Metotrexato Citarabina Dexametasona 25 mg 50 mg 75 mg 60 mg 1.5 mg/m2 60 mg/m2 60 mg/m2 15 mg 40 mg 8 mg VO VO VO VO IV VO IV IT IT IT -7 , -6 -5 , -4 -3 , -2 -1 1,8,15,22 1-28 1,8,15 1,8,15,22 1,8,15,22 1,8,15,22 *De marzo de 2009 a enero de 2010 se realizó una modificación al esquema de tratamiento con la administración de daunorrubicina a dosis de 60 mg/m2 los días 1, 2, 3 de tratamiento. IV: intravenoso, IT: intratecal, VO: vía oral Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Impacto de la insuficiencia renal al momento del diagnóstico en pacientes adultos con leucemia linfoide aguda de 2.1 mmol/L en pacientes pediátricos o ≥ a 1.45 mmol/L en adultos y calcio sérico ≤ 1.75 mmol/L o si existe una modificación de 25% de los valores entre los tres días previos y siete posteriores al tratamiento.7 La remisión completa se estableció cuando los blastos linfoides en la médula ósea eran menores de 5% al final de la terapia de inducción a la remisión y la biometría hemática estaba normal (Hb>10 g/dL, neutrófilos > 1.5 x 103/L, plaquetas > 100 x 103/L). Análisis estadístico: para determinar si las variables: edad, sexo, cuenta de leucocitos inicial, visceromegalias o inmunofenotipo tenían una relación estadísticamente significativa en la frecuencia de insuficiencia renal al momento del diagnóstico se realizó un análisis multivariado. También se hizo otro análisis estadístico para determinar si la insuficiencia renal influyó en el resultado de la inducción a la remisión. Se consideró estadísticamente significativo cuando la p fue <0.05 (IC 95%). RESULTADOS Se estudiaron 165 pacientes adultos con leucemia linfoide aguda de novo diagnosticados en el departamento de Hematología del Hospital General de México entre diciembre de 2007 y junio de 2010. Todos los pacientes contaron con consentimiento informado de la institución. La mediana de edad fue de 33 años (límites 16 y 60 años). El 50.9% correspondió al sexo masculino (n=84) y 49.1% (n=79) al femenino. El tiempo promedio de aparición de los síntomas fue de seis semanas. El síndrome anémico fue la principal manifestación (82%), seguido del síndrome hemorrágico. El 19.3% de los pacientes (n=32) cursó con hepatomegalia, 18.1% (n=30) con esplenomegalia y 29% (n=48) con crecimientos ganglionares al momento del diagnóstico. Acorde con el tipo de riesgo, 29.6% de los pacientes (n=49) se clasificó como riesgo habitual y 70.4% (n=116) como riesgo alto. En cuanto a los estudios al diagnóstico, la mediana de leucocitos al diagnóstico fue de 56.7 x 103/L (límites 1 y 190 x 103/L). Cerca de 75.7% de los pacientes (n=125) tenía resultado de inmunofenotipo de médula ósea para determinar la estirpe histológica. El 95.2% de los casos (n=119) correspondió a una estirpe B y 4.8% (n=6) a estirpe T. En cuanto a las pruebas de funcionamiento renal, alrededor de 16.3% (n=27) de los pacientes tenía alteración Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 en las pruebas de funcionamiento renal (creatinina mayor de 1.5 veces el valor normal) y solo en 11% de todos los casos (n=3) la insuficiencia renal se asoció con síndrome de lisis tumoral espontáneo. Resultados de la inducción a la remisión De los 165 pacientes, en nueve no se logró corroborar la respuesta al tratamiento inicial. El 62.8% (n=98) de los pacientes tuvo remisión completa, 24.3% (n=38) fallecieron durante la inducción a la remisión. Las principales causas de muerte fueron: sepsis por germen no aislado seguida de hemorragias (sistema nervioso central y pulmonar). El 12.9% (n=20) padeció leucemia resistente. Relación de la insuficiencia renal y las variables en estudio Para determinar la relación entre las diferentes variables en estudio (edad, visceromegalias, tipo de riesgo, inmunofenotipo, cuenta de leucocitos al diagnóstico) y la insuficiencia renal al diagnóstico, se realizó un análisis estadístico. Se registró una relación estadísticamente significativa entre insuficiencia renal y cuenta de leucocitos al diagnóstico por encima de 30 x 103/L (p = 0.003), el tipo de riesgo (p = 0.26) y las visceromegalias (hepatomegalia; p= 0.002, esplenomegalia; p=0.006). No se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre la edad (p = 0.508), el inmunofenotipo (p = 0.785) y las linfadenopatías (p =0.347). Impacto de la insuficiencia renal y el resultado de inducción No se registró una diferencia estadísticamente significativa entre la aparición de la insuficiencia renal y la respuesta favorable al tratamiento de inducción a la remisión (p = 0.765) DISCUSIÓN La leucemia linfoide aguda es una de las neoplasias linfoproliferativas más frecuentes en nuestro país. Su mortalidad es congruente con la del Registro Histopatológico de Neoplasias Malignas del 2002, que fue de 32.9%.8 Entre las principales causas de muerte están los procesos infecciosos asociados con la neutropenia febril y las hemorragias.9 Factores como la insuficiencia a la respuesta a la inducción, la hiperleucocitosis y el 9 Ramos-Peñafiel C y col. inmunofenotipo T se han asociado con un pronóstico desfavorable.10 La hiperleucocitosis se ha relacionado con diversas complicaciones. Lowe y sus colaboradores describieron en población pediátrica la relación entre la hiperleucocitosis y las alteraciones neurológicas (9% de los casos) y pulmonares (6% de los casos).11 En nuestro estudio la hiperleucocitosis, al igual que una elevada carga tumoral (hepatomegalia, esplenomegalia) mostraron una relación estadísticamente significativa con la insuficiencia renal. Entre las principales causas de insuficiencia renal al diagnóstico están: síndrome de lisis tumoral, que puede ser secundario al tratamiento con esteroides, quimioterapia, anticuerpos monoclonales o en condiciones espontáneas por fiebre y deshidratación.12,13,14 Por lo que se refiere a la mortalidad, Darmon y sus colaboradores compararon la supervivencia de 63 pacientes con diagnóstico de síndrome de lisis tumoral (28 de ellos con leucemia aguda) y encontraron que los pacientes con insuficiencia renal al diagnóstico tuvieron una mortalidad más elevada (21 vs 7%).15 En nuestra serie solo tres pacientes tuvieron síndrome de lisis tumoral espontáneo e insuficiencia renal, pero sin repercusión en la mortalidad. En conclusión, la insuficiencia renal en pacientes con leucemia linfoide aguda es poco frecuente. Deben considerarse diversas causas congruentes con la edad, desde enfermedades congénitas en población pediátrica, como causas crónicas (nefropatía diabética, nefropatía hipertensiva o por uratos) en población adulta. También pueden considerarse causas previas al tratamiento, como las asociadas (tratamiento prolongado con antibióticos)16 o complicaciones como sepsis, en especial en pacientes con sepsis.17,18 Es necesario seguir identificando todos los factores de riesgo que puedan incrementar la mortalidad durante el tratamiento y las diversas medidas que puedan limitar el daño renal. REFERENCIAS 1. 10 Fisher BT, Zaoutis LE, Leckerman KH, Localio R, Aplenc R. Risk factors for renal failure in pediatric patients with acute myeloid leukemia: a retrospective cohort study. Pediatr Blood Cancer 2010;55(4):655-661. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Bunchman TE, Gale GB, O´Connor DM, Salinas-Madrigal L, Chu YL. Renal biopsy diagnosis of acute lymphocytic leukemia. Clin Nephrol 1992;38(3):142-144. Olgar S, Yetgin S, Cetin M, Aras T, Akhan O. Electrolyte abnormalities at diagnosis of acute lymphocytic leukemia may be a clue for renal damage in long-term period. J Pediatr Hematol Oncol 2005;27(4):202-206. Kopecna L. Late effects of anticancer therapy on kidney function in children with acute lymphoblastic leukemia. Bratisi Lek Listy 2010;102(8):357-360. Cairo M, Coiffier B, Reiter A, Younes A. Recommendations for the evaluation of risk and prophylaxis of tumor lysis syndrome (TLS) in adults and children with malignant diseases: an expert TLS panel consensus. Br J Haematol 2010;149(4):578-586. Hsu HH, Chan YL, Huang CC. Acute spontaneous tumor lysis presenting with hyperuricemic acute renal failure: clinical features and therapeutic approach. J Nephrol 2004;17(1):50-56. Coiffier B, Altman A, Pui CH, Younes A, Cairo M. Guidelines for the Management of Pediatric and Adult Tumor Lysis Syndrome: An Evidence-Based Review. 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Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Rev Hematol Mex 2011;12(1):11-16 Artículo original Diez años de seguimiento y monitoreo de 87 pacientes con leucemia mieloide crónica tratados con inhibidores de cinasa de tirosina: experiencia en FUNDALEU, Buenos Aires, Argentina Carolina Pavlovsky, Isolda Fernández, Miguel A Pavlovsky, Federico Sackmann, Guillermina Remaggi, Santiago Pavlovsky* En memoria del Dr. Santiago Pavlovsky RESUMEN Antecedentes: el pronóstico de los pacientes con leucemia mieloide crónica ha cambiado de manera muy significativa desde la introducción de los inhibidores de cinasa de tirosina. El monitoreo de la enfermedad mínima residual por PCR en tiempo real (RQ-PCR) es hoy una herramienta indispensable para el seguimiento de los pacientes. Objetivo: evaluar el seguimiento de pacientes con leucemia mieloide crónica tratados con inhibidores de cinasa de tirosina en un centro especializado. El objetivo secundario fue evaluar la enfermedad mínima residual por el método de PCR en tiempo real en pacientes en remisión citogenética completa en fase crónica, en tratamiento con inhibidores de cinasa de tirosina analizando diferentes variables con repercusión en el sostenimiento de la respuesta molecular mayor. Material y método: estudio retrospectivo y transversal efectuado con base en el análisis de los pacientes con leucemia mieloide crónica tratados en el FUNDALEU-Centro de Hematología Pavlovsky con la intención de evaluar los resultados del seguimiento y el monitoreo de la enfermedad. La mediana de edad de todos los pacientes incluidos fue de 50 años. 87 pacientes recibieron imatinib, 60 (69%) como primera línea de manera continua y 27 (31%) secundario a interferón. Resultados: de los 87 pacientes en seguimiento, 86 (99%) alcanzaron remisión citogenética completa. Setenta y tres (84%) continúan en tratamiento con imatinib, 12 (14%) cambiaron a un inhibidor de cinasa de tirosina de segunda generación y dos suspendieron el tratamiento. De los pacientes en remisión citogenética completa 63/86 (73%) alcanzaron una respuesta molecular mayor o estable (BCR-ABL[IS] <0.1%). No alcanzar una respuesta molecular mayor a la estable determina mayor riesgo de recaída citogenética (4% sin respuesta molecular mayor vs 0% en respuesta molecular mayor). Los pacientes con respuesta molecular mayor sostenida tuvieron una supervivencia libre de recaída citogenética a diez años significativamente más prolongada (100% vs 65% , P=0.002) sin repercusión en la supervivencia global. Obtener una respuesta molecular mayor sostenida en el tiempo se considera un factor pronóstico de protección de recaída citogenética. La supervivencia libre de recaída citogenética fue de 95% a 10 años. Conclusiones: en la actualidad, el monitoreo molecular por PCR en tiempo real es indispensable para el seguimiento de pacientes con leucemia mieloide crónica en remisión citogenética completa. El 95% de los pacientes tratados con imatinib continúan en remisión citogenética completa. Conseguir una respuesta molecular mayor estable es un predictor importante de durabilidad de la remisión citogenética completa. Palabras clave: leucemia mieloide crónica, inhibidores de cinasa de tirosina, FUNDALEU, enfermedad mínima residual, PCR en tiempo real. ABSTRACT Background: The prognostic of chronic myeloid leukemia (CML) patients has dramatically changed since the introduction of tirosine kinase inhibitors (TKI). Miniminal residual disease (MRD) monitoring by Real Time quantitative PCR (RQ-PCR) is at present a usefull tool for monitoring patients in the TKI Era. Objetives: to evaluate CML patients follow-up under treatment with TKI in a specialized center. Evaluate MRD by RQ-PCR in complete cytogenetic remission patients (CCR) in chronic phase analyzing different variables with impact in the maintenance of mayor molecular response (MMR). Material and Methods: CML patients treated in FUNDALEU were analyzed with the intention to evaluate follow-up and molecular monitoring results. Median age was 50 years, 87 patients received imatinib treatment, 60 (69%) as 1st lineand 27 (31%) 2ary to Interferon. Results: From 87 patients followed, 86 (99%) obtained CCR. Seventy three (84%) continue under imatinib treatment, 12 (14%) changed to a 2nd generation TKI and 2 interrupted treatment. Patients in CCR 63/86 (73%) obtained stable MMR (BCR-ABL[IS] <0.1%). Not reaching a stable MMR determined a major risk for cytogenetic relapse (4% with no MMR vs 0% in MMR). Patients with sustained MMR showed a significative longer cytogenetic relapse free survival at 10 years (100% vs 65%, P=0.002) with no impact on overall survival. Obtaining a stable MMR through time is considered a prognostic factor that protects against cytogenetic relapse. Our population showed a cytogenetic relapse free survival of 95% at 10 years. Conclusion: Molecular monitoring by RQ-PCR is at present the most important tool for CML patients follow-up that had obtained CCR. The 95% of the patients treated with imatinib continue in CCR. Obtaining a stable and sustained MMR showed to be a predictor for CCR durability. Key words: Chronic myeloid leukemia, Tirosine kinase inhibitors, FUNDALEU, Minimmal residual disease, RQ-PCR. Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 11 Pavlovsky C y col. E l notable avance que se produjo con la introducción de los inhibidores de cinasa de tirosina, que se inició con el imatinib en el año 2001, se acompañó de importantes progresos en el monitoreo exacto y sensibilidad de la respuesta al tratamiento. En alrededor de 75% de los pacientes, a los dos años de tratamiento se logra la remisión citogenética completa, lo que implica ausencia en la detección del cromosoma Ph1ladelPh1a.1 El objetivo principal es alcanzar la remisión citogenética completa porque se ha demostrando su repercusión en la supervivencia.1 Una vez que se consigue es imprescindible detectar la enfermedad mínima residual mediante el monitoreo molecular cuantitativo en tiempo real para identificar tempranamente a los pacientes con riesgo de recaída citogenética. La ELN 20092 considera que no alcanzar una respuesta molecular mayor a 18 meses implica una respuesta subóptima al tratamiento y que continuar con el tratamiento elegido, subir la dosis o cambiar a otro inhibidor de cinasa de tirosina es una de las opciones sugeridas porque la falla, y no la respuesta subóptima hasta ahora han demostrado su efecto en la supervivencia. Sin embargo, la respuesta óptima al tratamiento con inhibidores de cinasa de tirosina no solo se debe al excelente resultado del fármaco en sí, sino a diversos factores que rodean al paciente, como: el apego al tratamiento, óptimo seguimiento mediante técnicas citogenéticas y moleculares para adaptar el cambio de tratamiento en tiempos adecuados, trabajo del hematólogo especialista con equipos multidisciplinarios y seguimiento de guías de tratamiento, que en la actualidad son puntos indispensables aplicables en la nueva era de los inhibidores de cinasa de tirosina. En * FUNDALEU, Centro de Internación e Investigación Clínica Angélica Ocampo. Buenos Aires, Argentina. Recibido: noviembre, 2010. Aceptado: diciembre, 2010. Correspondencia: Dra. Carolina Pavlovsky. Centro de Internación e Investigación Clínica Angélica Ocampo. José E. Uriburu 1450 / 1520 - C1114AAN, Buenos Aires, Argentina. Correo electrónico: cpavlovsky@fundaleu.org.ar Este artículo debe citarse como: Pavlovsky C, Fernández I, Pavlovsky MA, Sackmann F, Remaggi G, Pavlovsky S. Diez años de seguimiento y monitoreo de 87 pacientes con leucemia mieloide crónica tratados con inhibidores de cinasa de tirosina: experiencia en FUNDALEU, Buenos Aires, Argentina. Rev Hematol Mex 2011;12(1):11-16. www.nietoeditores.com.mx 12 esta descripción se detallan los resultados del seguimiento y monitoreo molecular de pacientes con diagnóstico de leucemia mieloide crónica Ph1 (+) en fase crónica tratados en nuestra institución con inhibidores de cinasa de tirosina. MATERIAL Y MÉTODO Estudio retrospectivo y transversal efectuado de diciembre de 1999 a septiembre de 2010 en pacientes tratados con inhibidores de cinasa de tirosina (87) con diagnóstico de leucemia mieloide crónica Ph1 (+) en fase crónica. Los estudios citogenéticos y moleculares se centralizaron en FUNDALEU. Veintisiete pacientes (31%) se trataron previamente con interferón antes de recibir imatinib y 60 (69%) recibieron imatinib como primera línea. El 55% de los pacientes tuvo al diagnóstico un puntaje de Sokal de riesgo bajo. En el Cuadro 1 se describen las características de los pacientes. Todos los pacientes se encontraban en fase crónica, definida según los criterios convencionales.1 Todos los Cuadro 1. Características de los pacientes Característica Mediana de edad Sexo masculino Sokal Alto Intermedio Bajo Antecedentes de Tratamiento con imatinib Primera línea IM post IFN Tratamiento actual Imatinib Desatinib segunda línea Nilotinib segunda línea Sin tratamiento Tratamiento de inducción LMA (CB) IFN Mediana de tiempo desde el inicio de imatinib hasta el presente (meses) Mediana de tiempo desde el inicio de imatinib hasta la remisión citogenética completa n=87 % 50 (15 - 78) 43 49% 13 26 48 15% 30% 60 27 69% 31% 73 7 3 2 1 1 62 (14-98) 9 (3-24) (meses) Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Diez años de seguimiento pacientes iniciaron su tratamiento con imatinib a una dosis de 400 mg al día. El diagnóstico se confirmó mediante un estudio citogenético convencional por bandeo G y estudio molecular cuali o cuantitativo. Luego de obtenerse la remisión citogenética completa, cada seis meses se realizó el monitoreo molecular. A partir del año 2005 en FUNDALEU se utiliza la técnica de PCR en tiempo real, mediante el método estandarizado a nivel internacional. En 41 pacientes (48%) se realizó dosaje plasmático de imatinib para evaluar la absorción de éste. Monitoreo de la enfermedad Para confirmar la remisión citogenética completa (Ph1 0%) se realizó fluorescencia in situ (FISH) en sangre periférica. Los análisis se efectuaron siguiendo el protocolo convencional con sondas comerciales específicas para BCR (22q11) y ABL (9q34) loci (LSI bcr/abl Dual Fusion Probe-Vysis-Abott Molecular Inc. Des Plaines IL) que analizó 400 núcleos en cada caso.1 Para medir los niveles de transcriptos BCR-ABL cada seis meses se realizó una PCR en tiempo real en sangre periférica. Para lograr mayor sensibilidad ante la enfermedad mínima residual, las muestras siempre se procesaron en las 2-5 horas posteriores a la extracción. Para la amplificación se utilizó el método de Taqman (PE Applied Biosystems, USA) siguiendo el protocolo estandarizado del gen BCR-ABL establecido por el programa europeo (EAC).2 Los resultados se expresaron como porcentajes de la razón del ABL como gen control y nuestro laboratorio los convirtió a la escala internacional (IS). El factor de conversión específico fue validado por el laboratorio de referencia en Adelaida, Australia.3 (IS% bcr-abl.) Concentraciones plasmáticas de imatinib: se obtuvieron mediante LC-MS7MS-tandem mass spectrometry (Esp TermoFinnigan TSQQuantum). Se consideró como concentración plasmática óptima IPL>1002 ng/mL. Criterios de respuesta, definición Remisión citogenética completa: 0% de células Ph (+) en las metafases analizadas por bandeo G. Recaída citogenetica: pérdida de la remisión citogenética completa, y una o más metafases Ph(+). Respuesta molecular mayor: %BCR-ABL/ABL: <0,1% (IS). 4 Respuesta molecular completa: <0.01%. Para el análisis se consideraron las respuestas moleculares mayores y completas sostenidas por lo menos durante los últimos 24 meses, con evaluaciones Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 semestrales. Ante un aumento en el nivel de transcriptos, de 1 o 2 log, se repitió la PCR en tiempo real entre el segundo y tercer mes. Ante la confirmación se solicitó un estudio de mutaciones del dominio cinasa (realizado en un laboratorio externo) y un estudio citogenético para evaluar el estado de la enfermedad. Se considera un nivel plasmático de imatinib óptimo al mayor de 1002 ng/mL.1 Método estadístico Para comparar dos grupos de variables continuas se utilizaron las pruebas de Mann-Whitney y de variables categóricas y binarias, prueba de la χ2 o Fisher. La recaída citogenética se estimó a través de curvas de Kaplan-Meier. La supervivencia libre de recaída citogenética se estimó mediante el método de Kaplan-Meier.2,3 Se consideró desde el diagnóstico hasta la pérdida de la remisión citogenética completa. Se realizó análisis univariado para identificar factores pronósticos predictores de recaída citogenética aplicando el logrank test. Se consideró una p <0.05 como estadísticamente significativa. RESULTADOS La mediana de seguimiento desde el inicio del imatinib hasta la última actualización fue de 62 meses (rango 1498). La mediana de edad de todos los pacientes incluidos fue de 50 años (rango 15-78). Como primera línea de tratamiento, 60 (69%) pacientes recibieron imatinib de manera continua y 27 (31%) después del interferón. De los 87 pacientes en seguimiento, 86 (99%) obtuvieron remisión citogenética completa, con una mediana de tiempo desde el inicio del imatinib hasta la remisión citogenética completa de nueve meses (rango 3- 24). Se diagnosticaron 87 pacientes con leucemia mieloide crónica y se siguieron en nuestra institución, 86 ( 99%) alcanzaron remisión citogenética completa y uno remisión completa mayor. En la actualidad, 73 de 87 (84%) pacientes continúan en tratamiento con imatinib, 12 (14%) cambiaron de tratamiento a un inhibidor de cinasa de tirosina de segunda generación (4 por falla , 3 por respuesta subóptima molecular y 5 por intolerancia). De los pacientes que fallaron, uno tuvo la mutación G250E que es resistente a múltiples inhibidores de cinasa de tirosina; en la actualidad recibe tratamiento con IFN. El otro paciente tuvo una transformación a crisis blástica con diagnóstico de sarcoma granulocítico en tratamiento de inducción para leucemia mieloide aguda. Dos 13 Pavlovsky C y col. pacientes decidieron suspender el tratamiento con imatinib sin indicación médica por motivos personales; se obtuvo una respuesta molecular mayor. Las dos pacientes viven, sin otro dato de seguimiento. Evolución de los pacientes en remisión citogenética completa De los 86 pacientes en remisión citogenética completa, 63 (73%) obtuvieron una respuesta molecular mayor estable. Se dividieron en dos grupos según la obtención de respuesta molecular mayor: quienes tuvieron respuesta molecular mayor sostenida lograron una supervivencia libre de recaída citogenética a 10 años significativamente más prolongada (100 vs 65% , P=0.000, Figura 1) sin repercusión en la supervivencia global. Cuatro pacientes que perdieron la remisión citogenética completa se encontraban en el grupo que nunca había logrado una respuesta molecular mayor. No alcanzar una respuesta molecular mayor estable determina mayor riesgo de recaída citogenética (4 sin respuesta molecular mayor vs 0 en respuesta molecular mayor). Obtener una respuesta molecular mayor sostenida en el tiempo se considera un factor pronóstico favorable para recaída citogenética. Con la dosis de imatinib de 400 mg al día desde la primera evaluación molecular realizada con PCR en tiempo real y con seguimiento semestral, se observa un incremento de la respuesta molecular mayor de 48 a 73%. Se comprueba que un grupo de 23 pacientes tuvo respuesta subóptima,3 sin conseguir respuesta molecular mayor a lo largo del seguimiento. Debido al riesgo de perder la remisión citogenética completa, este grupo se monitoreó y se repitió el estudio molecular ante cambios de más de un logaritmo; se llevó un estricto control del apego al tratamiento y medición de las concentraciones plasmáticas de imatinib. La medición de las concentraciones plasmáticas de imatinib se realizó en 41 pacientes, 37 ( 90%) tuvieron un nivel plasmático de imatinib mayor de 1002 ng/mL; 85% pertenecían al grupo de respuesta molecular mayor (Cuadro 2). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre pacientes con concentraciones plasmáticas de imatinib mayores de 1002 ng/mL, según el estatus molecular. Se analizaron las características clínicas asociadas con la pérdida de la remisión citogenética completa. En el análisis univariado (Cuadro 2) se observan los diferentes factores pronósticos con repercusión en la pérdida de la remisión citogenética completa. El único factor pronóstico estadísticamente significativo fue la obtención de respuesta molecular mayor a p=0.000. DISCUSIÓN Entre 75 y 90% de los pacientes con leucemia mieloide crónica-fase crónica alcanzan remisión citogenética Cuadro 2. Riesgo de pérdida de la remisión citogenética completa según factores pronósticos, análisis univariado Variable Género Femenino Masculino Edad Menor de 60 años Mayor de 60 años Tratamientos previos a Imatinib Imatinib primera línea IFN previo a imatinib Obtención de respuesta molecular mayor Figura 1. Supervivencia libre de recaída citogenética según la respuesta molecular obtenida. 14 Si No Riesgo de Sokal Bajo Intermedio-alto n = 86 Recaída citogenética p 43 43 3 1 0.29 65 21 4 0 0.24 60 26 2 2 0.40 63 23 0% 4% 0.00 47 39 2 2 0.21 Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Diez años de seguimiento completa durante el tratamiento con imatinib a dosis de 400 mg al día.1 Debido a que con imatinib se logran altas tasas de remisión citogenética completa, el objetivo del tratamiento es hoy en día conseguir respuestas moleculares. Sin embargo, la profundidad y tiempo en que debe obtenerse la respuesta molecular es aún un tema de debate. Algunos estudios describieron que la obtención de la respuesta molecular mayor está asociada con la duración más prolongada de la remisión y supervivencia libre de progresión.2 No conseguir una respuesta molecular mayor a 18 meses se considera respuesta subóptima al tratamiento con imatinib, según las recomedaciones de la ELN.3 El seguimiento del estudio IRIS a siete años muestra los resultados moleculares convertidos a la escala internacional con un incremento de la respuesta molecular mayor de 13 a 86% desde el tercer mes de tratamiento al mes 72. A 18 meses los pacientes que no habían alcanzado respuesta molecular mayor tuvieron una supervivencia libre de evento de 89% comparada con 98% con respuesta molecular mayor (p=0.01).3 La probabilidad de perder la remisión citogenética completa en quienes tuvieron respuesta molecular mayor fue de 3 vs 26% en pacientes en remisión citogenética completa, pero sin respuesta molecular mayor. El último análisis del IRIS, con ocho años de seguimiento, confirma que ningún paciente con respuesta molecular mayor obtenida a 12 meses, progresó a fases avanzadas. Estos datos sugieren 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 RMMa Sin RMMa Figura 2. Evolución de la respuesta molecular en el tiempo Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 que alcanzar una respuesta molecular mayor sería un factor seguro de protección para pacientes tratados con imatinib en primera línea. Con base en el conocimiento de que la cantidad de pacientes analizada en nuestra institución es limitada, se confirma que quienes no alcanzan respuesta molecular mayor tienen más riesgo de recaída citogenética (4/23 vs 0/63, P=0.000). Si la respuesta molecular mayor se confirma y mantiene en el tiempo de manera continua le confiere estabilidad a la remisión citogenética completa; esto fue reportado por Palandri y sus colaboradores4 y confirmado en nuestra población. Similares resultados se observaron en 276 pacientes con leucemia mieloide crónica tratados con imatinib (74% altas dosis) y analizados por el MDACC. Alcanzar una respuesta molecular mayor continua y con duración de más de 12 meses, se asoció con mayor supervivencia libre de progresión.5 En nuestra población el nivel de transriptos BCR-ABL disminuyó con el tiempo y mejoró la respuesta molecular mayor desde que comenzó a ser evaluada mediante PCR en tiempo real en nuestra institución (de 48 a 73%). Un grupo de pacientes permaneció con respuesta subóptima. Marín y su grupo analizaron a pacientes con respuesta subóptima y describieron que tienen mayor riesgo de perder la remisión citogenética completa que los que nunca habían obtenido respuesta molecular mayor;6 sin embargo, no hubo diferencias en la supervivencia. Los estudios farmacocinéticos para evaluar las concentraciones de imatinib en plasma son una herramienta útil que se correlaciona con la respuesta clínica del paciente y permite identificar a los pacientes con mal apego al tratamiento, exceso de toxicidad o con respuesta subóptima.7 En nuestro estudio se observó una correlación entre la respuesta molecular mayor y la concentración plasmática de imatinib óptimo; los resultados no fueron estadísticamente significativos, quizá por el bajo número de pacientes evaluados. La descripción de la experiencia de nuestro centro con el tratamiento con inhibidores de cinasa de tirosina muestra que la obtención de respuesta molecular mayor es un factor de buen pronóstico para la persistencia de remisión citogenética completa. El estudio de PCR en tiempo real estandarizado en la escala internacional es, en la actualidad, el método de elección para monitorear la enfermedad mínima residual en pacientes con leucemia mieloide crónica en remisión citogenética completa. 15 Pavlovsky C y col. REFERENCIAS 1. Druker B, Guilhot F, O'Brien S, et al. Five-year follow-up of imatinib therapy for newly diagnosed chronic myelogenous leukemia in chronic phase shows sustained responses and high overall survival. N Engl J Med 2006;355:2408-2417. 2. Lavallade H, Apperley JF, Khorashad JS, et al. Imatinib for newly diagnosed patients with chronic myeloid leukemia: Incidence of sustained responses in an intention-to-treat analysis. J Clin Oncol 2008;26:3358-3363. 3. Baccarani M, Cortes J, Pane F, et al. Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. J Clin Oncol 2009;27:6041- 6051. 4. Kantarjian HM, Dixon D, Keating MJ, et al. Characteristics of accelerated disease in chronic myelogenous leukemia. Cancer 1988;51:1441-1446. 5. Pinkel D, Straum T, Gray JW. Cytogenetic analysis using quantitative high sensitivity fluorescence hybridization. Proc Natl Acad Sci 1986;83(9):2934-2938. 6. Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripta for residual disease detection in leukemia – a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003;17(12):2318-2357. 7. Branford S, Fletcher L, Cross NC, et al. Desirable performance characteristics for BCR-ABL measurement on an international reporting scale to allow consistent interpretation of individual patient response and comparison of response rates between clinical trials. Blood 2008;112:3330-3338. 8. Picard S, Titier K, Etienne G, et al. Thorough imatinb plasma levels are associated with both cytogenetic and molecular responses to standard dose imatinib in chronic myeloid leukemia. Blood 2008;109:3496-3499. 16 9. Kaplan EL, Meier P. Non parametric estimation from incomplete observations. J Am Stat Assoc 1958;53:457-481. 10. Peto R, Pike M, Armitage P, et al. Design and analysis of a randomized clinical trial requiring prolonged observation of each patient. II Analysis and examples. Br J Cancer 1977;35:1-39. 11. O'Brien SG, Guilhot F, Larson RA, et al. Imatinib compared with interferon and low dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2003;348:994-1004. 12. Hughes TP, Kaeda J, Branford S, et al. Frequency of mayor molecular responses to imatinib or interferon alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2003;349:1424-1432. 13. Hughes TP, Hochhaus A, Branford S, et al. Long-term prognostic significance of early molecular response to imatinib in newly diagnosed chronic myeloid leukemia: an analysis from the international randomized study of interferon versus STI571 (IRIS). Blood 2010. 14. Palandri F, Iacobucci I, Soverini S, et al. Treatment of Ph1ladelPh1a- Positive Chronic Myeloid Leukemia with Imatinib: Importance of a Stable Molecular Response. Clin Cancer Res 2009;15:1059-1063. 15. Kantarjian H, O'Brien S, Shan J, et al. Cytogenetic and molecular responses an outcome in chronic myelogenous leukemia: need for new response definitions? Cancer 2008;115:837-845. 16. Marin D, Milojkovic D, Olavarria E, et al. European LeukemiaNet criteria for failure or sub-optimal response reliably identify patients with CML in early chronic phase treated with imatinib whose eventual outcome is por. Blood 2008;112:4437-4444. 17. Brandford S, Hughes TP. Practical considerations for monitoring patients with chronic myeloid leukemia. Semin Hematol 2010;47(4):327-334. Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Rev Hematol Mex 2011;12(1):17-22 Artículo original Impacto de la disparidad de sexo entre donador y receptor en el trasplante alogénico de células hematopoyéticas con un esquema de acondicionamiento no mieloablativo César Homero Gutiérrez Aguirre,* Omar David Borjas Almaguer,* Olga G Cantú Rodríguez,* Oscar González Llano,* José Carlos Jaime Pérez,* David Gómez Almaguer* RESUMEN Antecedentes: el trasplante alogénico de células hematopoyéticas de un donador HLA compatible es el procedimiento de elección para el tratamiento de diversas enfermedades hematológicas neoplásicas y no neoplásicas. Algunos estudios han encontrado mayor incidencia de enfermedad injerto contra huésped y de rechazo cuando hay disparidad de sexo entre donador y receptor. En este estudio se analiza la incidencia de la enfermedad injerto contra huésped y la supervivencia de pacientes que recibieron un trasplante alogénico de células hematopoyéticas de donador del mismo o de diferente sexo. Material y método: estudio retrospectivo efectuado con los expedientes de 56 pacientes que recibieron un trasplante de células hematopoyéticas, independientemente de su enfermedad de base. Veintinueve pacientes tenían el mismo sexo que el donador y 27 con diferencia de sexo entre donador y receptor. La media de seguimiento fue de 34 meses. Todos los pacientes recibieron un esquema de acondicionamiento de intensidad reducida con ciclofosfamida, busulfan y fludarabina. La profilaxis para enfermedad injerto contra huésped incluyó ciclosporina y metotrexato. Resultados: la dosis mediana de células CD34+ infundidas fue de 5.9 (±2.3) x 106 por kilo de peso, sin diferencia significativa entre ambos grupos. La supervivencia fue mayor en el grupo de pacientes con donador de sexo diferente (88 vs 79%), pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (p=.209). La incidencia de enfermedad injerto contra huésped aguda y crónica en el grupo de pacientes con donador del mismo sexo fue de 31 y 17.2%, respectivamente, mientras que en el grupo de pacientes con donador de sexo diferente fue de 26 y 33.2%, respectivamente, sin diferencia estadística significativa (p=.42 y p=.09 respectivamente). El quimerismo completo fue de 58% en el grupo de trasplante con donador del mismo sexo, mucho mayor que 18.5% del grupo con donador de sexo diferente (p=.004). Conclusiones: la discrepancia de sexo entre donador y receptor no influyó en la incidencia de enfermedad injerto contra huésped y no tuvo efecto en la supervivencia. Lo ideal es elegir un donador del mismo sexo que el receptor cuando se planea realizar un trasplante alogénico de células hematopoyéticas, utilizando un esquema de acondicionamiento de intensidad reducida pues hay más posibilidades de lograr quimerismo completo. Palabras clave: disparidad de sexo, donador, receptor, trasplante alogénico, células hematopoyéticas, acondicionamiento no mieloablativo. ABSTRACT Background: Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) from a compatible HLA donor is the procedure of choice for the treatment of diverse neoplasic and non-neoplasic hematologic diseases. Some studies have found a higher incidence of graft versus host disease (GVHD) and rejection when there is sex disparity between donor and recipient. In this study we analyzed the incidence of GVHD and survival of patients receiving a reduced-intensity HSCT from donors with or without sex disparity. Materials and Methods: We included 56 patients who underwent reduced intensity conditioning before allogeneic HSCT regardless of the underlying disease. Twenty nine patients were sex-matched with the donors and in 27 patients sex disparity between donor and recipient existed. The median follow-up was 34 months. Each patient received a reduced intensity conditioning with cyclophosphamide, busulfan and fludarabine; prophylaxis for GVHD included cyclosporine and methotrexate. Results: The median dose of CD34+ infused was of 5.9 (±2.3) x 106 per kg of weight. Survival was higher in the group of patients with a donor of different sex (88% vs 79%), although without statistic significance (p=.209). The incidence of acute and chronic GVHD in the group of patients with same-sex donor was 31% and 17.2% respectively, while in the group of different sex it was 26% and 33.2% respectively, with no statistic significance. (p=.42 and p=.09 respectively). Complete chimerism was 58% in the no sex disparity group, significantly higher than 18.5% in the sex mistmached group (p=.004). Conclusion: Sex disparity between donor and recipient had no influence in the incidence of GVHD and had not a measurable effect on survival. Ideally, a donor on the same sex as the receptor, if reduced intensity allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is used, should be choose since there is a higher chance of achieve a complete chimerism. Key words: Donor, recipient, allogeneic stem cell, transplantation, reduced-intensity conditioning. Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 17 Gutiérrez Aguirre CH y col. E l trasplante alogénico de células hematopoyéticas de un donador HLA compatible es el procedimiento de elección para el tratamiento de diversas enfermedades hematológicas neoplásicas y no neoplásicas.1-3 Algunos estudios han relacionado el éxito del trasplante con diversas características, como: enfermedad de base, edad del paciente, condición clínica del paciente, infección por citomegalovirus, compatibilidad ABO, diferencia de sexo entre donador y receptor, multiparidad del donador, entre otras.4,6 Por lo general, se prefiere utilizar un donador HLA compatible relacionado y con base en esto, en casos afortunados con más de un donador compatible, elegir el que implique más posibilidades de éxito de acuerdo con sus características. Las células trasplantadas ejercen un efecto inmunológico en el receptor que actúa en combinación con los medicamentos administrados en el acondicionamiento para la erradicación del tumor, esto es cierto particularmente cuando se utilizan esquemas de acondicionamiento de intensidad reducida.7-9 Sin embargo, el efecto inmunitario de los linfocitos trasplantados no siempre es benéfico para el receptor, pues pueden dar origen a la enfermedad injerto contra huésped que se presenta en 45 a 75% de los pacientes, en quienes afecta la calidad de vida y aumenta la mortalidad.9,10,11 A pesar de la compatibilidad donador-receptor de las moléculas HLA y del uso adecuado de esquemas de inmunosupresión, la enfermedad injerto contra huésped aparece en un alto porcentaje de pacientes que reciben un trasplante alogénico de células hematopoyéticas alogénico debido, en parte, a los complejos menores de antígenos de compatibilidad (mHAg).12-15 Dependiendo de su expresión y su distribución estos antígenos también son causa de enfermedad injerto contra huésped, entre los mHAg se ha descrito * Servicio de Hematología del Hospital Universitario Dr. José Eleuterio González, Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, NL, México. Recibido: noviembre, 2010. Aceptado: diciembre, 2010. Este artículo debe citarse como: Gutiérrez-Aguirre CA, BorjasAlmaguer OD, Cantú-Rodríguez OG, González-Llano O, JaimePérez JC, Gómez-Almaguer D. Impacto de la disparidad de sexo entre donador y receptor en el trasplante alogénico de células hematopoyéticas con un esquema de acondicionamiento no mieloablativo. Rev Hematol Mex 2011;12(1):17-22. www.nietoeditores.com.mx 18 un grupo de proteínas codificadas por el cromosoma Y (H-Y) con distribución en todos los tejidos, que pudieran ser reconocidas cuando hay diferencia de sexo entre el donador y el receptor.16 Existe una amplia distribución de H-Y mHAg y es probable que la incompatibilidad de estos antígenos sea independiente del HLA. Algunos estudios han encontrado mayor incidencia de enfermedad injerto contra huésped cuando el donador es de sexo femenino y el receptor es de sexo masculino y mayor incidencia de rechazo del trasplante cuando el receptor es de sexo femenino y el donador es de sexo masculino.12,13,17 En este estudio se analiza la influencia de la disparidad de sexo en la incidencia de enfermedad injerto contra huésped en un grupo de pacientes que recibieron un trasplante alogénico de células hematopoyéticas alogénico utilizando un esquema de acondicionamiento de intensidad reducida. MATERIAL Y MÉTODO Estudio retrospectivo efectuado con base en el análisis de los expedientes clínicos de 280 pacientes que recibieron un trasplante alogénico de células hematopoyéticas en el servicio de Hematología del Hospital Universitario de Monterrey NL, México, en los últimos 10 años. Se incluyeron en el estudio los pacientes mayores de un año de edad, que tuvieran un seguimiento mayor de 100 días después de su trasplante en el mismo hospital, que contaran con determinación de células CD34+ y mononucleares trasplantados, y al menos un estudio de quimerismo después del día +30 para valorar el éxito del trasplante, sin hacer distinción en el diagnóstico. Se excluyeron los pacientes que recibieron trasplantes con disparidad HLA en uno o más antígenos, trasplantes de células hematopoyéticas de cordón umbilical y haploidénticos. También se excluyeron los pacientes que, por algún motivo, no completaron satisfactoriamente el esquema de profilaxis para enfermedad injerto contra huésped con ciclosporina y metotrexato. Obtención de células hematopoyéticas Todos los pacientes recibieron células hematopoyéticas de sangre periférica. Se administró filgrastim (10 µg/kg/ día) a los donadores en los días -4 a -1. Se realizaron una o dos aféresis al donador en el día 0 y +1, dependiendo de las células CD34+ obtenidas por medio de uno de los siguientes equipos: Baxter CS-3000 PLUS (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA), AMICUS (Baxter Healthcare, Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Disparidad de sexo entre donador y receptor Deerfield, IL, USA), o COBE-Spectra (Gambro, Lakewood, CO, USA). El propósito de la recolección fue procesar 5,000-7,000 mL de sangre por metro cuadrado en cada procedimiento de aféresis con el fin de obtener al menos 5x108 células mononucleares o 2x106 células CD34+ por kg de peso del receptor. Régimen de acondicionamiento Todos los pacientes recibieron un régimen de acondicionamiento de intensidad reducida con busulfan oral 4 mg/ kg/día administrado los días -6 y -5, ciclofosfamida intravenosa 350 mg/m2/día en los días -4, -3 y -2 y fludarabina intravenosa 30 mg/m2/día en los días -4, -3 y -2. Como prevención de enfermedad injerto contra huésped se utilizó ciclosporina oral a 4 mg/kg/día iniciando en el día -1 y metotrexato intravenoso 5 mg/m2 administrado los días +1, +3, +5 y +11.7-9 La ciclosporina se continuó hasta el día 180 con ajustes de dosis para mantener concentraciones plasmáticas entre 150 y 250 ng/mL y, después, disminuida gradualmente durante 60 días hasta suspenderse. En los pacientes con datos de enfermedad injerto contra huésped, la disminución de ciclosporina se realizó en periodos más prolongados de acuerdo con las condiciones clínicas del paciente. Como profilaxis para infecciones se utilizaron ciprofloxacino oral, aciclovir oral y fluconazol oral hasta que se observó recuperación hematológica con más de 0.5 x 109/L neutrófilos. Estudios de los productos de aféresis El conteo de glóbulos blancos, células mononucleares y células CD34+ se realizó por citometría de flujo en un aparato EPICS Elite ESP (Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA), con un anticuerpo monoclonal anti-CD34 HPCA-2 (Becton Dickinson, San José, CA, USA). No se usaron procedimientos para selección celular. Las células hematopoyéticas se infundieron inmediatamente después de cada recolección en todos los pacientes. Análisis de quimerismo A todos los pacientes se les realizaron estudios de quimerismo. En los pacientes con disparidad de sexo se utilizó una técnica de hibridación in situ con fluorescencia para identificar los cromosomas X y Y, mientras que en ausencia de disparidad se recurrió a la determinación de microsatélites en el ADN. Se definió quimerismo completo Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 cuando se encontraron 100% células del donador en la sangre periférica del receptor, quimerismo mixto cuando se encontró 1% o más células del receptor y falla de quimerismo cuando no se encontraron células del donador. RESULTADOS Se incluyeron 56 pacientes que cumplieron totalmente con los criterios de inclusión, 29 eran del mismo sexo que el donador y 27 con diferencia de sexo entre donador y receptor (Cuadro 1). La media de seguimiento fue de 34 meses. No se encontró diferencia entre ambos grupos en la cantidad de células CD34+ infundidas (p=.20) (Cuadro 2). Supervivencia De los 29 pacientes del grupo de trasplante con donador del mismo sexo, fallecieron seis pacientes en el transcurso de los 10 años (20.7%), la supervivencia media en meses fue de 44.53 (CI=95, 37.55 - 51.51). De los 27 pacientes del grupo de trasplante con donador de diferente sexo fallecieron 4 pacientes (14.8%), y la supervivencia en meses promedio fue de 66.53 (CI=95, 56.55 - 76.51). En general, la supervivencia fue mayor en el grupo de los pacientes con donador de sexo diferente (85.2 vs 79.3%), pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (p=.209). Así mismo, la mortalidad fue mayor en el grupo de pacientes con donador del mismo sexo, sin diferencia estadísticamente significativa (p=.731) (Figura 1). Enfermedad injerto contra huésped aguda La incidencia de enfermedad injerto contra huésped aguda en el grupo de pacientes con donador del mismo sexo fue de 31% (grado I-II: 20.6%, grado III-IV: 10.4%), mientras que en el grupo de pacientes con donador de sexo diferente fue de 26% (grado I-II: 14.8 %, grado III-IV: 11.1%), sin diferencia estadísticamente significativa (p=.42). Enfermedad injerto contra huésped crónica La incidencia de enfermedad injerto contra huésped crónica en el grupo de pacientes con donador del mismo sexo fue de 17.2% (limitada: 3.4%, extensa: 13.8%), mientras que en el grupo de pacientes con donador de sexo diferente fue de 33.2 % (limitada: 25.9%, extensa: 7.3%). Aunque la incidencia de enfermedad injerto contra huésped crónica fue mayor en el grupo de pacientes con donador de sexo diferente, no se encontró diferencia significativa (p=.09). 19 Gutiérrez Aguirre CH y col. Cuadro 1. Edad y diagnóstico de los pacientes incluidos Característica Grupo total n=56 Mismo sexo n=29 Diferente sexo n=27 P Edad mediana (rango) en años Anemia aplásica Leucemia granulocítica crónica Linfoma Hodgkin Leucemia linfoblástica Leucemia mieloblástica Linfoma no Hodgkin Mieloma múltiple Mielodisplasia 29.11 (3-61) 3.6% (2) 17.9% (10) 8.9% (5) 28.6% (16) 21.4% (12) 10.7% (6) 5.4% (3) 3.6% (2) 30(3-59) 3.4% (1) 20.7% (6) 6.8% (2) 17.2% (5) 27.6% (8) 66.7% (4) 33.3% (1) 6.9% (2) 20(5-61) 3.7% (1) 14.8% (4) 11.1% (3) 40.7% (11) 14.8% (4) 33.3% (2) 66.7% (2) 0% (0) .208 Grupo total n=56 Mismo sexo n=29 Diferente sexo n=27 p 34.01(±17) 31.7(±15) 36.49(±19) .313 6.5(±1.8) 5.9(±2.3) 6.40(±1.5) 6.34(±2.4) 6.76(±2.17) 5.34(±2.21) .586 .207 Cuadro 2. Células trasplantadas Seguimiento en meses, media Células trasfundidas: Mononucleares X 108 CD34+ x 106 Quimerismo Se realizaron estudios de quimerismo en los 56 pacientes incluidos mediante técnicas previamente descritas. Solo un paciente incluido en el grupo de trasplante con donador del mismo sexo tuvo falla de quimerismo. En el grupo de trasplante con donador del mismo sexo se encontró quimerismo completo en 17 pacientes (58.6%) y quimerismo mixto en 11 pacientes (37.9%). En el grupo de trasplante con donador de sexo diferente se encontró quimerismo completo en cinco pacientes (18.5%) y quimerismo mixto en 22 pacientes (81.5%). El quimerismo completo fue más frecuente en el grupo de trasplante con donador del mismo sexo (p=.004). Trasplantes con donador de sexo diferente Figura 1. Supervivencia global para ambos grupos de pacientes 20 Se analizó el grupo de pacientes que recibieron células hematopoyéticas de un donador de sexo diferente, formando los subgrupos donador femenino-receptor masculino (F-M) con 15 pacientes y donador masculinoreceptor femenino (M-F) con 12 pacientes (Cuadro 3). No se encontró diferencia significativa en la incidencia de enfermedad injerto contra huésped aguda (p=.48), enfermedad injerto contra huésped crónica (p=.44), ni en Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Disparidad de sexo entre donador y receptor Cuadro 3. Incidencia de enfermedad injerto contra huésped (EICH) y quimerismo en pacientes con donador de sexo diferente. F-M: donador femenino-receptor masculino, M-F: donador masculinoreceptor femenino EICHa I-II EICHa III-IV EICHc limitada EICHc extensa Quimerismo completo Quimerismo mixto Grupo F-M n=15 Grupo M-F n= 12 3 (20%) 1 (6.6%) 4 (26.2%) 0 1 (6.6%) 14 (93.4%) 1 (8.3%) 2 (16.6%) 3 (25%) 2 (16.6%) 4 (33.3%) 8 (66.7%) la supervivencia (p=.88) entre estos grupos. (Figura 2) En el grupo donador masculino-receptor femenino se observó quimerismo completo en 33.3% de los casos, mientras que en el grupo donador femenino-receptor masculino se observó solo en 6.6% de los casos; sin embargo, no fue estadísticamente significativo (p=.13). Figura 2. Supervivencia de los subgrupos de pacientes con donador de sexo diferente (F-M: donador femenino-receptor masculino, M-F: donador masculino-receptor femenino) Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 DISCUSIÓN En este estudio no se encontró diferencia significativa en la supervivencia de ambos grupos (grupo con donador del mismo sexo: 79% vs grupo con donador de diferente sexo: 85%) siendo similar a la encontrada en otros estudios.13,18 En un estudio realizado por Stern y colaboradores13 se observó mayor supervivencia en pacientes que recibieron un trasplante alogénico de células hematopoyéticas de donador del mismo sexo que en los que tenían un donador de sexo diferente (68 vs 60% p=0.001); sin embargo, este estudio se efectuó en pacientes con diagnóstico de anemia aplásica y el trasfondo inmunológico de la enfermedad de base es diferente al de los pacientes incluidos en nuestro estudio. La selección del donador de células hematopoyéticas para un trasplante alogénico juega un papel importante en el éxito del procedimiento. La repercusión de la diferencia de sexo entre donador y receptor se ha demostrado en estudios que han encontrado menor supervivencia y mayor mortalidad relacionada con enfermedad injerto contra huésped en receptores masculinos con donadores femeninos y mayor frecuencia de rechazo del trasplante en receptores femeninos con donadores masculinos.17,18,19 En los pacientes incluidos en este estudio la incidencia de enfermedad injerto contra huésped aguda y crónica fue similar entre el grupo de pacientes con donador del mismo sexo (31 y 17.2%) y el grupo de pacientes con donador de sexo diferente (26 y 33%); sin embargo, en este último grupo la enfermedad injerto contra huésped fue más frecuente en forma limitada. Se ha sugerido que algunas proteínas codificadas por el cromosoma X pueden ser selectivamente expresadas en células femeninas pero no masculinas, y que éstas proveen antígenos menores H que pueden reconocerse después del trasplante en mujeres con células de donadores de sexo masculino. Quizá algunos genes autosómicos regulados por hormonas sexuales puedan ser expresados de manera diferente en hombres que en mujeres y podrían codificar antígenos menores H.20 Respecto al análisis del quimerismo, en el grupo de donador del mismo sexo se observó mayor número de pacientes que lograron quimerismo completo (58.6%) en comparación con los pacientes del grupo de donador de sexo distinto (18.5%). Esto pudiera explicarse por el reconocimiento de los antígenos menores de histocompatibilidad en las distintas células de los donadores, ya sea 21 Gutiérrez Aguirre CH y col. masculino o femenino, predisponiendo a la destrucción celular por mecanismos inmunológicos del receptor. Este hallazgo en nuestro estudio sugiere que cuando se realiza un trasplante alogénico de células hematopoyéticas bajo un régimen de acondicionamiento de intensidad reducida, se logra con mayor frecuencia quimerismo completo cuando el donador y el receptor son del mismo sexo. Respecto al análisis entre los subgrupos M-F y F-M, no se encontró diferencia en supervivencia ni prevalencia de enfermedad injerto contra huésped. En el grupo M-F se observó quimerismo completo en 33.3% de los casos, mientras que en el grupo F-M se observó solo en 6.6% de los casos; sin embargo, no fue estadísticamente significativo (p=.13), probablemente por el reducido número de pacientes incluidos en estos subgrupos. Se concluye que la discrepancia de sexo entre donador y receptor de un trasplante alogénico de células hematopoyéticas alogénico, utilizando un esquema de acondicionamiento de intensidad reducida, no influyó en la incidencia de enfermedad injerto contra huésped ni en la supervivencia; sin embargo, en los casos que sea posible debería elegirse un donador HLA compatible del mismo sexo que el receptor pues hay más posibilidades de lograr un quimerismo completo. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 22 Pai SY, Notarangelo LD. Hematopoietic cell transplantation for Wiskott-Aldrich syndrome: advances in biology and future directions for treatment. Immunol Allergy Clin North Am 2010;30(2):179-194. Persons DA. The challenge of obtaining therapeutic levels of genetically modified hematopoietic stem cells in betathalassemia patients. Ann NY Acad Sci 2010;1202:69-74. Roifman CM. 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Veinticinco de los 30 pacientes (80%) tenían mayor riesgo de infección debido a que recibieron: alemtuzumab (n=9), esteroides para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped (n=12) o uso de donador no relacionado (n=12). Los pacientes se monitorizaron con prueba semanal de reacción en cadena de polimerasa (PCR) en un laboratorio central para conocer la concentración de citomegalovirus. Cinco pacientes tuvieron toxicidad a la médula ósea relacionada con el valganciclovir (menos de 1,000 neutrófilos por µL = 1, menos de 50,000 plaquetas por µL = 4). La infección por citomegalovirus ocurrió en cuatro pacientes sin ninguna evidencia de enfermedad invasiva. Los nuevos estudios diagnósticos han mejorado la detección y el diagnóstico de las infecciones por citomegalovirus. A pesar de estos adelantos, aproximadamente 5% de los pacientes que reciben terapia preventiva contra citomegalovirus resultan con enfermedad invasiva a los pulmones, hígado, tubo gastrointestinal u otros órganos. La prescripción más frecuente de fármacos inmunosupresores potentes y el uso de donadores alternos han aumentado la incidencia de infección por citomegalovirus. En conclusión, el valganciclovir en las dosis utilizadas en este estudio es bien tolerado con incidencia baja y reversible de mielosupresión. Además, la incidencia de infección con citomegalovirus fue baja en este grupo de pacientes en riesgo alto de infección por citomegalovirus. Palabras clave: valganciclovir, profilaxis, citomegalovirus, infección, trasplante alogénico. ABSTRACT Despite improvements in methods for the early diagnosis of Cytomegalovirus (CMV) infection, 5% of allogeneic stem cell transplant patients receiving preemptive therapy develop CMV disease. In addition, the use of highly immunosuppressive and the use of mismatched donors have increased the incidence of CMV infection and disease. Thirty CMV seropositive patients participated in a prospective trial evaluating the safety and efficacy of oral valganciclovir administered at 900 mg daily 5 days a week starting 21 to 35 days after transplant and continuing through Day 100 post transplant. Twenty-four of 30 (80%) patients had other risk factors for the development of CMV infection including: use of alemtuzumab (n=9), corticosteroid therapy for treatment of graft versus host disease (n=12), or unrelated donor transplant (n=12). Patients were monitored with weekly quantitative CMV PCR analysis at a central lab. Five patients developed myeloid toxicity related to valganciclovir (absolute neutrophil count < 1,000/µL = 1, platelets < 50,000/µL = 4). CMV infection occurred in 4 patients with no CMV disease in any of the patients. We conclude that valganciclovir at the dose used in this study is well tolerated with minimal, reversible myelosuppression. The incidence of CMV infection with valganciclovir prophylaxis was low in this high-risk group. Key words: Valganciclovir, prophylaxis, cytomegalovirus infection, allogeneic stem cell transplantation. * Texas Transplant Institute, San Antonio, TX, USA. ** Center for Cellular and Gene Therapy, Baylor College of Me dicine, Houston, TX, USA. *** University of Texas Health Science Center, San Antonio, TX, USA **** University of Wisconsin Medical School, Madison, WI, USA. 1 Honolulu, HI, USA. Este artículo debe citarse como: Bachier C, Shaughnessy P, Grmley M, Carrum G, Freytes CO, Callander N, Walsh T, LeMaistre CF. Valganciclovir for the prophylaxis of cytomegalovirus infection early after allogenic stem cell transplantation. Rev Hematol Mex 2011;12(1):23-27. www.nietoeditores.com.mx Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 C ytomegalovirus prophylaxis with intravenous ganciclovir was studied previously and was associated with a decreased incidence of CMV infection and disease but at the cost of increased myelosuppression, risk of infection, and in some trials, increased mortality.1-8 These side effects of ganciclovir, coupled with the need for intravenous administration and improvements in detection techniques has made preemptive therapies the most common method of CMV prevention.9 However, preemptive therapy for CMV is associated with systemic CMV disease in up to 5% of patients, frequently 23 Bachier C y col. associated with serious morbidity and mortality. 10,11 As newer strategies in stem cell transplantation have increased the degree of immunosupression there has been a concomitant increase in the incidence of CMV infection and disease. The increased use of alternative donors, in vivo and in vitro T-lymphocyte depletion techniques including T-cell purging, and highly immunosuppressive drugs such as alemtuzumab, antithymocyte globulin, and fludarabine all increase the risk of viral reactivation post transplant.12-14 The use of alternative donors and peripheral blood stem cell transplants have also increased the incidence of chronic graft versus host disease and its associated need for prolonged corticosteroid therapy. Valganciclovir is a valine esther of ganciclovir that is hydrolyzed to ganciclovir after oral administration. A dose of 900 mg of valganciclovir orally provides a dose equivalent to 5 mg/kg of intravenous ganciclovir. 14-16 Valganciclovir has been shown to be as effective as oral ganciclovir in the treatment and prevention of CMV infection and disease in organ transplant and AIDS patients.18 There are limited reports on the use of valganciclovir after allogeneic stem cell transplant. Studies by Einsele and colleagues have shown that the bioavailability of valganciclovir after allogeneic stem cell transplant is affected on patients with intestinal GVHD.19 Patients with intestinal GVHD had lower exposure to ganciclovir after oral valganciclovir when compare to patients receiving intravenous ganciclovir. Despite this difference, the effectiveness in clearance of CMV from the blood was similar in patients receiving valganciclovir or IV ganciclovir in the preemptive treatment of CMV reactivation. The use of valganciclovir for the prophylaxis of CMV in high-risk patients could decrease the incidence of CMV infection without the need for intravenous drugs. We are now reporting the results of a single arm trial evaluating the safety and efficacy of valganciclovir for the early prophylaxis (<100 days after transplant) of CMV infection and disease after allogeneic stem cell transplant. MATERIAL AND METHODS Thirty patients from 3 centers were enrolled in this trial. At these centers, non-eligible patients received preemptive therapy with intravenous ganciclovir or valganciclovir per 24 institutional standards. Eligible patients included CMV seropositive recipients or CMV seronegative recipients of CMV seropositive grafts. Other inclusion criteria included estimated creatinine clearance of ≥50 mL/min, platelet count ≥50,000/µL, and WBC count ≥ 1,000/µL at the start of prophylaxis. Valganciclovir prophylaxis started between days 21 and 35 post transplant and after myeloid recovery from their conditioning regimen. Patients received valganciclovir at 900 mg daily 5 days a week until day 100 post transplant. For patients weighing 30-50 kg, dosing of valganciclovir was reduced to 450 mg orally 5 days/ week. CMV monitoring consisted of weekly quantitative plasma CMV PCR performed at a central lab according to the Amplicor® CMV test (Roche Diagnostics). Threshold for positivity was ≥ 1000 copies/mL. Management of myelosuppression For neutrophil counts below 1,000/µL or platelets below 50,000/µL, valganciclovir therapy was temporarily discontinued. Causes other than valganciclovir myelosuppresion were investigated including tumor recurrence, effect of concomitant drugs and infections. G-CSF was allowed at the discretion of the principal investigator. Valganciclovir was restarted at 900 mg 3 days a week if the ANC increased to 1,000/µL or if the platelet count increased to 50,000/µL after stopping valganciclovir and if neutropenia or thrombocytopenia were considered to be due to valganciclovir toxicity. Patients were taken off study if neutropenia lasted more than 7 days. If myelosuppression non-related to valganciclovir resolved, study drug was restarted at dose used prior to development of neutropenia or thrombocytopenia. Dose modifications for patients developing impaired renal function *Cr Cl (mL/min) Dose for patients >50 kg ≥ 50 40-49 25-39 ≤ 24 900 mg M®F 450 mg M®F 450 mg MWF Off study *Cr Cl = measured creatinine clearance Statistical Analysis The primary objective of the study was to determine the incidence of neutropenia associated with the use of valRevista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Valganciclovir for the prophylaxis of cytomegalovirus infection early after allogeneic stem cell transplantation ganciclovir. Neutropenia was defined as ANC <1,000/µL. The goal was to have an incidence of neutropenia of less than 30% (unrelated to disease progression, infections or other drugs). That incidence would be an approximately 50% reduction on the incidence of neutropenia associated with the use of IV gancicyclovir in the prophylaxis setting. A sample size of 30 achieved 91% power to detect a difference of 0.3 between the null hypothesis proportion of 0.6 and the alternative hypothesis proportion of 0.3 using a two-sided, binomial hypothesis test with a target significance level of 0.05 (the actual significance level is 0.03842; beta value = 0.08447). RESULTS Patient characteristics Thirty patients from three institution participated in the study. All patients were enrolled after signing Institutional Review Board approved consent forms. Most common reason for not enrolling patients were not meeting eligibility criteria due to increased creatinine clearance or pancytopenia. Patient characteristics are described in Table 1. All patients were CMV seropositive prior to transplant. Median age for the group was 53 years (range 14-70). Stem cell source included peripheral blood (n=26) or bone marrow (n=4). Donor source included matchrelated sibling (n=18), or match-unrelated donors (n=12). Patients on the study received ablative (n=17) or reduced intensity conditioning regimens (n=13). Twenty-four of 30 (80%) patients had other risk factors for the development of CMV infection including: use of alemtuzumab (n=9), corticosteroid therapy of ≥ 1 mg of solumedrol equivalent/kg for treatment of graft versus host disease (n=12), or unrelated donor transplant (n=12), (Table 2). Of the 12 patients with graft versus host disease (GVHD), 5 had GVHD involving the lower gastrointestinal tract. Table 1. Patient Characteristics (N=30) Median Age (range) Source of Stem Cells Bone Marrow Peripheral Blood Type of Transplant Related Unrelated Type of Conditioning Regimen Ablative Non-Ablative 53 (14-70) 4 26 18 12 17 13 Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Table 2. Risk Factors for CMV Infection (N=30) Graft versus Host Disease Use of Alemtuzumab Unrelated Donor Patients with at least one risk factor 12 9 12 24 Toxicity Myelosuppression related to valganciclovir include thrombocytopenia (4) and neutropenia (1). The patient with neutropenia received granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). An additional patient received two doses of G-CSF prior to the development of neutropenia for a WBC of 1,700/µL. None of the other 28 patients received growth factors during administration of valganciclovir. All patients restarted valganciclovir with dose adjustments after resolution of myelosuppression. In addition, 9 patients required modification in the dose of valganciclovir due to decrease in creatinine clearance. No other grade 3 or 4 toxicities related to valganciclovir were reported. CMV infection and survival CMV infection as measured by CMV PCR of ≥ 1000 copies/mL occurred in 4 patients. None of the patients developed CMV disease. CMV infection occurred in 2 patients during treatment of graft versus host disease and in 1 patient who received alemtuzumab as part of his conditioning regimen. The incidence of CMV infection was 3/24 in high-risk patients. CMV infection occurred 2-4 weeks after starting prophylaxis and at a median of 47 days post transplant (range 42-60 days). All four patients had resolution of their CMV infection after treatment with either an increased dose of valganciclovir at 900 mg twice daily x 10-14 days (n=2) or by replacing valganciclovir with IV ganciclovir at 5 mg/kg twice daily x 10-14 days (n=2). None of the 5 patients with gastrointestinal GVHD developed CMV infection. Patients continued CMV prevention off protocol and per institutional standards between day +100 and 6-month post transplant. CMV prevention strategies during this period consisted of either prophylaxis with valganciclovir or preemptive therapy with either valganciclovir or IV ganciclovir. CMV infection between day +100 and 6 months post transplant was monitored in 21 patients. Of these, 4 developed CMV infection between 100 days and 25 Bachier C y col. 6 months post transplant. Three of these patients received preemptive therapy while one developed CMV infection while on valganciclovir prophylaxis. All four patients were successfully treated with intravenous ganciclovir. Overall survival for this cohort was 93% and 63% at 100 days and 6 months post-transplant respectively. Causes of death were: relapse (n=5), graft versus host disease (n=3), sepsis (n=2) and interstitial pneumonitis (n=1) not related to CMV. DISCUSSION An increasing number of CMV infections occur late after allogeneic stem cell transplant (>100 days).20 Factors associated with an increased risk of late CMV infection include: immune suppression associated with graft versus host disease, low CD4 counts, the use of donor lymphocytes, and prolonged use of ganciclovir early after allogeneic stem cell transplant.14,20,21 Risk factors also identify a patient population at increased risk of CMV infection early after allogeneic stem cell transplant (Table 3).12-14 The incidence of CMV infection in seropositive patients receiving alemtuzumab as part of the conditioning regimen was reported to be as high as 85% with a median time to CMV infection of 27 days.13 Similarly the incidence of early CMV infection is high in patients developing graft versus host disease and in patients undergoing unrelated donor transplant.12,26 Furthermore, the time to progression from viral detection to overt CMV disease is shortened in highly immunesuppressed patients.23 Prophylactic strategies may have a role for this high risk group. CMV prophylaxis with ganciclovir requires intravenous administration and is associated with increased toxicities related to myelosuppression. In previous studies, the severity of myelosuppression associated with ganciclovir prophylaxis varied with the schedule of administration and was reported at a time when growth factors were not routinely used. Safer and more convenient strategies for Table 3. Risk Factors for CMV Infection Reference N Junghaus et. al. 59 Risk unrelated donor transplant Charkarbartic, et. al. 101 Alemtuzumab Miller et. al. 26 81 Acute GvHD CMV prevention are under investigation. Valacyclovir is a valyl ester of acyclovir with improved bioavailability. Oral valacyclovir proved to be as effective as intravenous ganciclovir in the early prophylaxis of CMV but required the intake of 8 grams of drug per day and it appeared to be effective only in low risk patients.21,24 Valganciclovir, as reported in this trial was well tolerated with minimal, reversible myelosuppression. The low incidence of myelosuppression is likely related to reduced dosing and adjustments based on creatinine clearance. It could also be related to the use of peripheral blood as the source of stem cells in most study patients and the use G-CSF. Despite dose adjustments, the incidence of CMV infection was low in this small study of patients at high risk. Resistance after valganciclovir prophylaxis was not observed as all 4 patients developing CMV infection were successfully treated with IV ganciclovir or increased doses of valganciclovir. Furthermore, late CMV infection at 3 to 6 months post-transplant occurred in 4 patients and all were successfully treated with IV ganciclovir. Recent studies have identified patients with a higher incidence of CMV infection and disease. Valganciclovir prophylaxis is an alternative for patients who are at high risk of CMV infection. Randomized, placebo controlled studies are needed to conclusively define the role of valganciclovir and other active drugs in the early prophylaxis of CMV infection and the ultimate goal of preventing CMV disease. REFERENCES 1. 2. 3. 4. CMV Incidence (%) 68 85 (CMV seropositive patients) 41 5. Prentice HG and Kho P. Clinical strategies for the Management of Cytomegalovirus infection and Disease in Allogeneic Bone Marrow Transplant. BMT 1997;19:135-142. Goodrich JM, Mori M, Gleaves CA, et al. Early Treatment with Ganciclovir to Prevent Cytomegalovirus Disease After Allogeneic Bone Marrow Transplantation. N Engl J Med 1991;325:1601-1607. 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Blood 1986;67:1162-1167. 27 Rev Hematol Mex 2011;12(1):28-31 Artículo original Body mass index as an indicator of prognosis in patients undergoing allogenic hematopoietic stem cell transplantation Guillermo J Ruiz-Delgado,*,**,*** Julia A Lutz-Presno,*,*** Carlos Alarcón-Urdaneta,*,**,**** Jacqueline Calderón-García*,1 Guillermo J Ruiz-Argüelles*,**,*** RESUMEN Entre marzo de 1996 y diciembre de 2010 se hicieron 138 trasplantes de células hematopoyéticas en el Centro de Hematología y Medicina Interna de la Clinica Ruiz de Puebla. Los pacientes se estratificaron de acuerdo con el índice de masa corporal (IMC) previo al trasplante: 17 pacientes tuvieron IMC bajo, 62 IMC normal y 59 IMC alto. La mediana de supervivencia global (SG) fue de 9, 12 y 22 meses respectivamente. Independientemente de otras variables, los pacientes con IMC baja tuvieron una supervivencia menor que la de quienes se encontraron con IMC normal (SG a 58 meses de 24 versus 32%), en tanto que los pacientes con sobrepeso tuvieron mejor pronóstico (mediana de SG de 22 meses y SG de 43% a 130 meses). Nuestros hallazgos demuestran una correlación entre el IMC pre-trasplante y la supervivencia post-trasplante y podrían ser de utilidad para definir con más precisión el apoyo nutricional a los pacientes que van a recibir trasplantes de células hematopoyéticas. Palabras clave: IMC, índice de masa corporal, prognosis, México, obesidad, desnutrición. ABSTRACT Between March 1996 and December 2010, a total of 138 patients received an allogeneic stem cell transplantation in the Centro de Hematología y Medicina Interna of the Clinica Ruiz. Patients were stratified according to pretransplantation body mass index (BMI) values: 17 patients had low BMI, 62 had normal BMI and 59 patients had high BMI. Median overall survival (OS) for these three groups were respectively 9, 12 and 22 months. Patients with a low BMI had a lower OS than those with a normal BMI (58-month OS of 24% versus 32%), whereas patients with an increased BMI had a better outcome (median OS of 22 months and 43% OS at 130 months) than those with a normal BMI. Our findings demonstrate a correlation between pretransplantation BMI and posttransplantation survival and should provide insight into how to better manage nutritional support for patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation. Key words: Allografts, BMI, body-mass-index, prognosis, México, obesity, malnutrition * Centro de Hematología y Medicina Interna. Clínica RUIZ. ** Laboratorios Clínicos de Puebla. Clínica RUIZ *** Universidad Popular Autónoma del Estado de Puebla **** Universidad Autónoma de Puebla 1 Facultad de Medicina. Universidad La Salle. México Correspondence: Dr. Guillermo J. Ruiz-Argüelles. Centro de Hematología y Medicina Interna 8B Sur 3710. Puebla 72530, México. E-mail: gruiz1@clinicaruiz.com Este artículo debe citarse como: Ruiz-Delgado GJ, Lutz-Presno JA, Alarcón-Urdaneta C, Calderón-García J, Ruiz-Argüelles GJ. Body mass index as an indicator of prognosis in patients undergoing allogenic hematopoietic stem cell transplantation. Rev Hematol Mex 2011;12(1):28-31. www.nietoeditores.com.mx 28 B oth obesity and malnutrition are considered risk factors for complications and increased relapse and nonrelapse mortality in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).1 An inferior outcome after allogeneic HSCT has been reported in obese adult patients in both allogeneic and autologous HSCT: Overweight individuals seem to develop more complications of graft versus host disease and more infections than its normal counterparts.1 On the other hand, malnutrition has been shown to be a critical prognostic factor in patients with acute lymphoblastic leukemia: 2,3 Undernourished patients relapse more frequently and have worse survival Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 Body mass index as an indicator of prognosis in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation than well-nourished patients.2 To elucidate the impact of pretransplantation body mass index (BMI) on clinical outcome, we performed a retrospective cohort study with registration data from the Centro de Hematología y Medicina Interna of the Clínica Ruiz in Puebla, Mexico. MATERIAL AND METHODS a) Patients Data were analysed from all patients who underwent HSCT using the Mexican reduced intensity conditioning schedule in the Centro de Hematología y Medicina Interna de Puebla of the Clinica Ruiz between March 1996 and December 2010. Patients were stratified according to pretransplantation BMI values: low BMI: BMI < 18.5 kg/m2, normal BMI: 18.5 - 25 kg/m2, and high BMI: > 25 kg/m2. b) Allo-HSCT The “Mexican method” of RIC was used in all patients.4 A Karnofsky score of 100% was required to conduct the allograft. In all instances, the donor was a sibling with compatible (5/6) or identical (6/6) HLA. The study protocol was approved by the Institutional Review Board and the Ethics Committee of the institution. Written consent was obtained from all patients. Subcutaneous G-CSF (10 μg/kg/day) was given to the sibling donors on days -5 to +2, and one to three aphaeresis procedures were planned for days 0, +1 and +2 by means of a Haemonetics V-50 PLUS machine (Haemonetics Corporation, Braintree, MA), a Baxter C-3000 PLUS machine (Baxter Healthcare, Deerfield, IL), an AMICUS (Baxter Healthcare, Deerfield, IL) or a COBE-Spectra (Gambro, Lakewood, CO) using the Spin-Nebraska protocol.4 The endpoint of collection was the processing of 5000-7000 ml of blood/m2 in each aphaeresis procedure, providing a total amount of at least 2 x 106 viable CD34+ cells/kg of the weight of the recipient. The Mexican method of non-ablative conditioning used in this study consisted of the following:20 oral busulphan, 4 mg/kg, given on days -6 and -5; I.V. cyclophosphamide, 350 mg/m2, on days -4, -3 and -2; and I.V. fludarabine, 30 mg/m2, on days -4, -3 and -2. In 5 patients with very severe aplastic anaemia, busulphan was not used, and the cyclophosphamide dose was doubled on days -4 through -1; oral cyclosporin A (CyA) was administered at 5 mg/ kg starting on day –1. In all the patients I.V. methotrexate (5 mg/m2) was given on days +1, +3, +5 and +11, CyA Revista de Hematología Volumen 12, núm. 1, enero-marzo 2011 was continued through day 180, with adjustments made to obtain serum CyA levels of 150–275 ng/mL, and then tapered over 30-60 days. If GVHD was present, CyA was tapered over a longer period. Ondansetron (1 mg I.V. every hour for 4 h after I.V. chemotherapy), an oral quinolone, and an azole were used in all patients until granulocyte counts were greater than 500 x 106/L for 3 consecutive days. The PBSC aphaeresis products were infused on days 0 to +1. The total counts of white blood cells, mononuclear cells (MNCs) and CD34+ cells were enumerated by flow cytometry5 with an EPICS Elite ESP machine (Coulter Electronics, Hialeah, FL), using the anti-CD34 monoclonal antibody HPCA-2 (Becton Dickinson, San José, CA). No purging procedures were performed. Engraftment was defined as an absolute neutrophil count of >0.5 x 109/L for at least 3 consecutive days, and platelet engraftment was defined as occurring on the first of 7 consecutive days with a platelet count of >20 x 109/L, without a platelet transfusion. Graft failure was defined as the failure to reach an absolute granulocyte count of >0.5 x 109/L on day +30. Chimerism was assessed in cases involving a sex mismatch with a fluorescent in situ hybridisation technique to mark the X and Y chromosomes.6 In cases with an ABO mismatch, a flow cytometry-based approach was used, whereas polymorphic markers (STRs)7 were analysed in the absence of any mismatch. c) Statistics The primary objective of the analysis was to assess the survival after the HSCT. Overall survival (OS) was calculated from the day of HSCT until the day of death or the last follow-up and was estimated according to the Kaplan-Meier method8 using the log-rank chi-square test. RESULTS a) Patients Between March 1996 and December 2010, a total of 138 patients received an allogeneic HSCT and were included in the study, all of them with a Karnofsky performance index of 100%. Details regarding age, gender, donor type, donor and recipient genders, and diagnosis are listed in Table 1. Patients were stratified according to pretransplantation BMI values (vide supra): 17 patients had low BMI, 62 had normal BMI and 59 patients has high BMI. 29 Ruiz-Delgado GJ y col. 1 0.9 Fraction surviving 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110120 130 Time in months < 18.5 18.5-25 >25 Figure 1. Overall survival of the patients which were allografted, classified according to the body mass index: 17 patients with low BMI (<18.5 kg/m2), 62 with normal BMI (18.5 – 25 kg/m2) and 59 with high BMI (>25 kg/m2 ) b) Allografts All patients received peripheral blood stem cells allografts. Most of the grafts (67%) were 6/6 matches. Engraftment occurred in all patients. Chimerism studies were performed in all patients using the techniques previously described. Evidence of chimerism was found in all the allografted individuals. c) Survival Patients with low, normal or high BI had different median OS: 9, 12 and 22 months respectively (p <0.01). Patients with a low BMI had a lower OS than those with a normal BMI (58-month OS of 24% versus 32%). Patients with an increased BMI had a better outcome (median OS of 22 months and 43% OS at 130 months) than those with a normal BMI (110-month OS of 32%). DISCUSSION Both obesity and malnutrition have been considered as adverse prognostic factors in patients undergoing HSCT.1, 9-11 Obesity is associated with an increased risk of hyperglycemia, which can lead to an inferior outcome after allogeneic HSCT (9-10). On the other hand, malnutrition has been reported to be associated with an increased risk of early death after allogeneic HSCT.10,11 We2,3 and others3,12 have previously shown that a low BMI is associated with 30 a worse outcome and diminished OS in patients with acute leukemia treated with combined chemotherapy. In this study, a BMI below 18.5 kg/m2 was associated with a worse prognosis after allogeneic HSCT (58-month OS of 24%); however, the difference in survival was not statistically significant when compared with that observed in well nourished individuals. On the other hand, an increased BMI (> 25 kg/m2) was not associated with a worse outcome; by the contrary, an increased BMI was associated with a better long-term post-allograft outcome (130-month OS of 43%), this information being consonant with the recent observation which indicates that obesity does not preclude safe and effective allogeneic HSCT.13 Our findings demonstrate a correlation between pretransplantation BMI and posttransplantation survival. Although BMI depends strongly on multiple factors, the effect of both malnutrition and obesity on clinical outcome should be evaluated in a prospective study. There is currently no agreement regarding a suitable target range of pretransplantation BMI for clinical management. These results should provide insight into how to better manage nutritional support for patients undergoing HSCT. REFERENCES 1. Fuji S, Kim SW, Yoshimura K, Akiyama H, Okamoto S, Sao H, Takita J, Kobayashi N, Mori S. Japan Marrow Donor Program.: Possible association between obesity and posttransplantation complications including infectious diseases and acute graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant 2009;15:73-82. 2. Lobato-Mendizábal E, Ruiz-Argüelles GJ, Marín-López A.: Leukaemia and nutrition I. Malnutrition is an adverse prognostic factor in the outcome of treatment of patients with standard-risk acute lymphoblastic leukaemia. Leuk Res 1989;13:899-906. 3. Lobato-Mendizábal E, López-Martínez B, Ruiz-Argüelles GJ. A critical review of the prognostic value of the nutritional status at diagnosis in the outcome of therapy of children with acute lymphoblastic leukemia. Rev Invest Clín Méx 2003; 55:31-35. 4. 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