Superficies biomiméticas - Sociedad Mexicana de Ciencia de

©Sociedad Mexicana de Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales
Superficies y Vacío 23(S) 166-171, agosto de 2010
Superficies biomiméticas: efectos del agente osteinductor
fosfatasa alcalina y calcitonina
López-Aldrete A.f, *
Posgrado Institucional en Ingeniería y Ciencia de Materiales, UASLP
Hernández-Salinas A. E.
Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, UASLP
Alvarado Estrada K.N.
Laboratorio de Ciencias Básicas, Facultad de Estomatología, UASLP
Morales Corona J.
Departamento de Física, UAM-I
Apdo. Postal 55-534, Iztapalapa, México, D.F., 09340
Terán Figueroa Y.
Facultad de Enfermería, UASLP
Pérez E.
Instituto de Física, UASLP
Universidad Autónoma de San Luis Potosí
Av. Manuel Nava No. 6 Zona Universitaria C. P. 78290
San Luis Potosí, S.L.P.
(Recibido: 18 de febrero de 2010; Aceptado: 20 de abril de 2010)
f
En este trabajo se reporta la adsorción de la enzima fosfatasa alcalina (FA) y la hormona calcitonina (CA) sobre
superficies de titanio modificadas con polimerización por plasma y adsorción de polielectrolitos (PELs) a fin de obtener
superficies biocompatibles para el cultivo celular. La biocompatibilidad se estudió in Vitro por cultivo celular primario de
osteoblastos de rata (OBr). Los resultados muestran evidencia del efecto en la expresión de las moléculas de adhesión de
los osteoblastos sobre las superficies modificadas.
Palabras clave: Polielectrolitos; Fosfatasa Alcalina; Calcitonina; Titanio; Osteoblastos
This study reports the adsorption of the alkaline phosphatase enzyme (ALP) and the calcitonin hormone (CA) on titanium
modified surfaces. The objective is to get biocompatible surfaces for cell culture prepared with plasma polymerization
and polyelectrolytes adsorption (PELs). The biocompatibility was studied in vitro by primary cell culture of rat osteoblasts
(OBr). The results show evidence of the effect in the expression of the adhesion molecules of osteoblasts on modified
surfaces.
Keywords: Polyelectrolytes; Phosphatase Alkaline; Calcitonin; Titanium; Osteoblasts
interpretado tradicionalmente como la necesidad de que
sean inertes en el entorno fisiológico.
Un biomaterial es un aditamento no vivo utilizado en un
aparato médico y concebido para interactuar con sistemas
biológicos. [1] Así pues, el biomaterial elegido para
fabricar un implante deberá satisfacer las diferentes
propiedades requeridas para su buen comportamiento a
corto y largo plazo, tales como biocompatibilidad
(capacidad de un material de ser utilizado en una aplicación
específica con una respuesta adecuada del tejido receptor)
[1], la resistencia mecánica, la resistencia a la degradación,
la conformabilidad, la disponibilidad, etc. [2,3] El titanio
comercialmente puro (Ti c. p.) es generalmente aceptado
1. Introducción
En la última década, el diseño de los biomateriales está
experimentando una evolución gradual en la ingeniería de
materiales de los dispositivos basados en la ingeniería de
tejidos. A estos dispositivos implantables se les exige que
cumplan ciertos requerimientos mecánicos pero no se
aprovechan las potentes fuerzas regeneradoras del
organismo, sin embargo, estos implantes funcionan muy
bien en términos generales [1] y deben permanecer mucho
tiempo en el cuerpo, aportando las propiedades mecánicas
requeridas, sin causar efectos adversos al paciente, por lo
que también deben ser biocompatibles. Este aspecto se ha
*
aldrete@ifisica.uaslp.mx
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como bioinerte y que provoca leves reacciones en el medio
biológico [4] y sus adecuadas propiedades mecánicas, son
los factores determinantes para que sea el elegido por
excelencia para la fabricación de los implantes dentales. A
este respecto, cabe decir que su magnífico comportamiento
en el tejido a corto y a largo plazo es debido a las
propiedades específicas de su superficie y, es por ello, que
los avances más significativos en la mejora de dicha
respuesta se están consiguiendo controlando las distintas
propiedades asociadas a la calidad superficial. [4]
Por otro lado, el material bioactivo causa reacciones
tisulares favorables, lo que lleva al establecimiento de
enlaces químicos directos con los tejidos circundantes. La
hidroxiapatita (HA) es bioactiva para el tejido óseo debido
a que es la fase mineral del hueso. Este hecho hace que las
células la “reconozcan” como biológicamente no ajeno y
esto lleva a la unión química entre ella y el tejido ordenado,
lo que algunos autores han denominado como
biointegración. De hecho, para que un material sea
bioactivo en el tejido óseo, es condición indispensable que
se forme in Vivo una capa de HA sobre su superficie, la
cual en última instancia se enlaza con el hueso. Su
principal inconveniente son sus propiedades mecánicas ya
que es un material excesivamente frágil. [5]
Por esta razón en la implantología dental sólo se emplea
como recubrimiento sobre el metal. De esta manera, se
intenta combinar la bioactividad de la HA con las
excelentes propiedades mecánicas del Ti c.p. Además de la
HA y fosfatos de calcio, hay otros materiales que han
demostrado su capacidad para evitar la formación de la
capa colaginosa y avascular lo cual compromete la
estabilidad del implante. Ejemplos de ello en los tejidos
duros, son los vidrios denominados Bioglass, [6,7] en
diferentes morfologías, modos de obtención y como
recubrimientos, o el propio Ti convertido en bioactivo por
medio de tratamientos químicos. [3,7,8] Son dos, las
tendencias más importantes en cuanto a la elección del
biomaterial para la fabricación del implante dental: primero
el Ti c.p. (bioinerte, osteointegración) y segundo este
mismo metal recubierto con una capa de alguna sustancia
biología (bioactivo, biointegración).
La investigación aquí presentada propone una estrategia
a fin de obtener materiales biocompatibles y bioactivos que
interaccionen con el medio biológico agregando
biomoléculas que el organismo reconozca y puedan dar una
señal que inicie o acelere la respuesta fisiológica
regenerativa. Las superficies de titanio son modificadas
con polímeros y se bioactivan adsorbiendo en ellas dos
biomoléculas (calcitonina y fosfatasa alcalina), para
posteriormente evaluarlas in Vitro con un cultivo celular
primario de osteoblastos de calvaria de rata (OBr) con el
fin de analizar con inmunofluorescencia la expresión de
dos moléculas de adhesión como son la vinculina (V) y la
integrina beta 1 (Iβ1). La FA es una enzima que está
presente en diferentes órganos, incluyendo los huesos, el
hígado y los intestinos; y se encuentra en cierta cantidad en
la sangre de las personas sanas. La FA es segregada por
células de estirpe mesenquimal como los fibroblastos,
Figura 1. Imagen de microscopía de fluorescencia (20x). Expresión de
las moléculas de adhesión a las 24 hrs. Superficie de titanio sin
modificar: expresión de vinculina (A), expresión de integrina beta1 (B);
Superficie TiCA: expresión de vinculina (C), expresión de integrina
beta 1 (D); Superficie TiFA: expresión de vinculina (E), expresión de
integrina beta 1 (F).
Figura 2. Imagen de microscopía de fluorescencia (20x). Expresión de
las moléculas de adhesión a las 48 hrs. Superficie de titanio sin
modificar: expresión de vinculina (A), expresión de integrina beta1 (B);
Superficie TiCA: expresión de vinculina (C), expresión de integrina
beta 1 (D); Superficie TiFA: expresión de vinculina (E), expresión de
integrina beta 1 (F).
Figura 3. Imagen de microscopía de fluorescencia (20x). Expresión de
las moléculas de adhesión a las 54 hrs. Superficie de titanio sin
modificar: expresión de vinculina (A), expresión de integrina beta1
(B); Superficie TiCA: expresión de vinculina (C), expresión de
integrina beta 1 (D); Superficie TiFA: expresión de vinculina (E),
expresión de integrina beta 1 (F).
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osteoblastos y linfocitos, por lo que el organismo la
reconoce como una señal inductora en diferentes procesos
fisiológicos. [9,10] Las concentraciones de FA pueden
subir siempre que aumente la actividad de las células óseas
(p.ej, durante los períodos de crecimiento de la niñez,
embarazo, después de una fractura o colocación de un
implante). Además la mineralización depende de altas
concentraciones locales de calcio y fosfato para formar
hidroxiapatita cálcica (componente principal del tejido
óseo) y la FA interviene en los procesos de
osteoregeneración aumentando el fosfato cálcico.
Conjuntamente la FA tiene un efecto en la proliferación
celular y de secreción de matriz proteínica sobre los
fibroblastos y osteoblastos. [11,12,13] La calcitonina (CA)
es una hormona calcioreguladora y una antagonista
fisiológica de la hormona paratiroidea (PTH) y, por tanto,
probablemente actúen juntas para conservar la
concentración normal de calcio ionizado en el líquido
extracelular. [14] El estimulo de la secreción de la
calcitonina es la hipercalcemia y su acción principal se
ejerce sobre el hueso, donde inhibe la resorción ósea
espontánea o la inducida por la PTH o la vitamina D,
produciendo hipocalcemia. [15]
Figura 4. Gráfica de Densitometría de Western Blot. Expresión de la
molécula de adhesión vinculina (V) de los osteoblastos de rata
adheridos a las tres superficies en diferentes tiempos. Línea continua
corresponde al titanio sin modificar, línea punteada corresponde a la
superficie TiCA y la línea intermitente corresponde a la superficie
TiFA.
adsorción de las biomoléculas, en el primer grupo de
muestras se adsorbe FA (200 µg/mililitro) y el segundo
grupo CA (100 UI/mililitro), se deja secar las muestras a
temperatura ambiente y se almacenan a 4 °C [14,15,16]
hasta su evaluación in Vitro con el cultivo celular.
Para la evaluación in Vitro, se obtiene un cultivo
primario de osteoblastos (OBr) a partir de los parietales de
rata Winstar neonato por medio de la técnica de digestión
enzimática. [17] El explante de los parietales se coloca en
una caja de cultivo de 35 mm3 (Corning) que contiene 3
mililitros de medio de cultivo DMEM (Gibco)
suplementado con 15% de suero de ternera (Gibco),
penicilina (Pisa) 100 UI/mililitro y estreptomicina (Pisa)
100 μg/mililitros. Se coloca la caja de cultivo que contiene
el explante en una incubadora con flujo de CO2 (5%), con
una temperatura de 37oC y una humedad relativa del 85%
durante 6 días. Se realizan cambios de medio de cultivo
cada tercer día. [18] El explante y el medio de cultivo se
retiran al sexto día y se agrega 1 mililitro de tripsina-EDTA
(Gibco) al 0.25% durante 10 minutos (durante este tiempo
se introduce la caja dentro de la incubadora en las mismas
condiciones mencionadas anteriormente), esto provoca que
los OBr se desprendan de la caja, al termino de los 10
minutos se agrega 1 mililitro de DMEM para neutralizar el
efecto de la tripsina. Se obtiene 2 mililitro de solución que
contiene los OBr desprendidos y se centrifuga la solución a
1500 rpm durante 15 minutos, se retira el sobrenadante y a
continuación se agrega 2 mililitro de medio de cultivo
DMEM (Gibco) suplementado con 15% de suero de ternera
(Gibco), Anti-Anti (antibiótico y antimicótico de Gibco),
Piruvato de sodio 100mM (Gibco), MEM NEAA
(aminoácidos no esenciales), L-Glutamina 1% (Gibco),
ácido ascórbico 50 µg/mililitro (Sigma), se resuspende la
pastilla celular en esta solución, la cual se deposita1
mililitro en cada caja de cultivo de 35 mm3 para tener la
primera transferencia. Se hacen cambios de medio de
cultivo cada tercer día hasta la confluencia del cultivo. Al
2. Materiales y métodos
La superficie que se modifica para bioactivarse es
Titanio c.p. (Láminas de 5 mm2, con un espesor 0.5 mm,
Alfa Aesar-Johnson Matthey Company), se modifican 10
láminas por cada grupo. La modificación de las superficies
se realiza utilizando dos técnicas de polimerización, la
primera técnica es la polimerización por plasmas y se
deposita una capa de polímero (polialilamina PAA SigmaAldrich) sobre la superficie de titanio y la segunda técnica
es la adsorción de 4 capas de polielectrolitos
autoensamblados por medio de inmersión alternando un
polilelectrolito aniónico (acido poliglutámico PGA SigmaAldrich) y un polielectrolito catiónico (poli-L-lisina PLL
Sigma-Aldrich) los cuales se adsorben por atracción entre
fuerzas electrostáticas sobre las superficies y finalmente se
hace la adsorción de las diferentes biomoléculas, para un
grupo la adsorción de fosfatasa alcalina (FA SigmaAldrich) y otro grupo la adsorción de calcitonina (CA
sintética de salmón Novartis). [15] El procedimiento de
modificación del Titanio se inicia eliminando trazas de
grasa y suciedad colocando las superficies dentro del
reactor de plasmas a un voltaje máximo de 100W durante
20 minutos, a continuación se hace la polimerización por
plasmas con un voltaje de 25W durante 25 minutos para la
deposición de la primera capa del polímero PAA
(protonación de la superficie), la adsorción de los PELs y
las biomoléculas se realiza con la inmersión de los
sustratos de Ti-PAA en la solución con el polielectrolito
respectivo (PGA o PLL; ambos 200 µg/mililitro) por 20
minutos, seguido de un lavado con solución amortiguadora
de fosfatos (PBS Sigma) durante 10 minutos entre cada
PEL, se adsorben 4 capas de PELs (2 de cada PEL). Al
terminar la adsorción de los polielectrolitos se hace la
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un número menor de células adheridas (Fig. 2 E y F) en
comparación con los otros dos grupos y la expresión de la
molécula Iβ1 es menor en los tres grupos (Fig. 2 B, D, F)
comparado con las muestras de las 24 hrs (Fig. 1 B, D, F).
En el caso de las muestras procesadas a las 54 horas es
evidente que existe un numero mayor de OBr adheridos a
la superficie de Ti y al igual que la expresión de las dos
moléculas de adhesión (Fig. 3 A y B), los OBr adheridos al
grupo de TiCA tiene una expresión mayor de la molécula
V (Fig. 3 C) y no se observa expresión de la molécula Iβ1
(Fig. 3 D), el grupo de TiFA tiene un número menor de
células adheridas a su superficie y por lo tanto la expresión
de las moléculas de adhesión disminuye sin embargo
presenta la expresión de las dos moléculas de adhesión V e
Iβ1 en comparación con el grupo anterior (Fig. 3 E y F).
Con respecto al análisis con densitometría de Western
Blot la expresión de la molécula de adhesión V (Fig. 4) se
observa que es mayor en el grupo de Ti que los otros dos
grupos (TiFA y TiCA), y a las 54 hrs. el grupo de TiCA
tiene una notable disminución en la expresión de la
molécula V, en el caso del análisis con densitometría de
Western Blot la expresión de la molécula de adhesión Iβ1
(Fig. 5) en las primeras 24 hrs. es mayor en el grupo de Ti,
a las 48 hrs los grupos de TiCA y TiFA presentan una
mayor expresión con respecto al grupo de Ti, a las 54 hrs.
la expresión de la molécula de adhesión en los grupos de Ti
y TiCA es igual, en cambio en el grupo de TiFA la
expresión de la molécula Iβ1 disminuye notoriamente.
Figura 5. Gráfica de Densitometría de Western Blot. Expresión de la
molécula de adhesión integrina beta 1 (Iβ1) de los osteoblastos de rata
adheridos a las tres superficies en diferentes tiempos. Línea continua
corresponde al titanio sin modificar, línea punteada corresponde a la
superficie TiCA y la línea intermitente corresponde a la superficie
TiFA.
tener el cultivo confluente se realiza el mismo
procedimiento para desprender los OBr. Se obtiene la
solución celular la cual se utiliza para hacer el cultivo sobre
las superficies modificadas con un inoculo de 2.0 x 104
células/mililitro. [18]
Los cultivos celulares de los OBr se hizo en los dos
grupos de superficies modificadas, el grupo de superficies
modificadas con fosfatasa alcalina (Ti-FA) y el grupo de
superficies modificadas con calcitonina (Ti-CA) así como
el grupo de Titanio sin modificar (Ti) de acuerdo con los
siguientes tiempos 24 hrs, 48 hrs y 54 hrs. Al término de
cada tiempo todas las muestras se prepararon siguiendo el
protocolo establecido para realizar las evaluaciones de
inmunofluorescencia [19], se utilizó un microscopio
confocal invertido Leica DMI-4000B. Se determina la
expresión de las dos moléculas de adhesión vinculina (V) e
integrina beta 1 (Iβ1), utilizando el doble marcaje de
anticuerpos (anti-vinculina y anti-integrina beta 1; Santa
Cruz Biotechnology) para posteriormente marcar los
anticuerpos con sus respectivos anticuerpos fluorescentes
(Alexa 488 para el anticuerpo de la vinculina y 594 para el
anticuerpo de la integrina beta 1). Las muestras procesadas
se montaron sobre un portaobjetos cubriéndolas con una
gota de entellan (Merck) para ser observadas en el
microscopio confocal.
4. Discusión
El trabajo aquí presentado tiene como fin evaluar el
efecto en el cultivo celular de la CA y FA adsorbidas en las
superficies de Titanio modificadas. La metodología
empleada para este fin se basa en la utilización de dos
técnicas de polimerización, primeramente se deposita una
capa de polímero (PAA) por polimerización por plasmas,
posteriormente la construcción de multicapas de
polielectrolitos (PELs) con dos PELs de diferente carga
(aniónico PGA y catiónico PLL) que sirven de andamiaje
en la superficie de titanio para la adsorción de las
biomoléculas CA y FA. La polimerización por plasmas
sobre el titanio permite obtener una inversión de carga de
la superficie de éste, en una superficie que presenta una
carga positiva a causa de los grupos aminos del PAA.
Las superficies modificadas con el plasma de alilamina
tienen una carga superficial positiva siendo entonces
idóneas para la construcción de las multicapas partiendo de
un PEL aniónico y adsorbiendo en la última capa un PEL
catiónico que permite la adsorción de las biomoléculas (CA
y FA) las cuales tienen una carga eléctrica negativa.
[16,20,21] La correcta adsorción de la CA y la FA sobre las
superficies modificadas ha sido caracterizada por FTIR en
ambas superficies y reportado en un trabajo previo. [22]
Asimismo la caracterización del cultivo primario de
osteoblastos de calvaria de rata (OBr) también esta
reportado en otro trabajo por publicar. [23]
3. Resultados
Los osteoblastos de calvaria de rata (OBr) cultivados en
todas las muestras que se procesaron a las 24 horas,
presentan una mayor expresión de la molécula vinculina
(V); (Fig. 1 A, C, E) en comparación con la expresión de la
molécula integrina beta 1(Iβ1), (Fig. 1 B, D, F). A las 48
hrs en el grupo de TiCA (Fig. 2 C) la expresión de la
molécula V es mayor en comparación con los grupos de Ti
(Fig. 2 A y B) y TiFA (Fig. 2 E y F), el grupo TiFA tiene
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superficies con la FA adsorbida. Por lo tanto estas
superficies evaluadas in Vitro son biocompatibles.
La asociación de las propiedades fisicoquímicas del
titanio y las propiedades biológicas de las películas de los
polielectrolitos podrían llevarnos a optimizar la
biointegración
de
las
superficies
modificadas.
Conjuntamente, la biofuncionalización de las superficies al
incorporar una biomolécula a los polielectrolitos (CA y
FA) es un factor que podría mejorar el proceso de
biointegración. El procedimiento descrito en este trabajo
permite modificar superficies metálicas como el caso del
Titanio, el cual es el componente principal de los implantes
dentales, por lo que se plantea la posibilidad de llevar a
cabo la bioactivación de un implante dental modificando su
superficie y posteriormente evaluar su comportamiento in
Vivo.
Actualmente el grupo de investigación del Laboratorio
de Polímeros del Instituto de Física de la Universidad
Autónoma de San Luis Potosí trabaja en el desarrollo de un
modelo de implante modificado con Calcitonina, el cual
evalúa la superficie biofuncionalizada y bioactivada en un
modelo animal.
La molécula de adhesión vinculina es una molécula que
se encuentra en la superficie de la membrana celular la cual
permite entre otras funciones servir de “ancla” para iniciar
y mantener la adhesión del OBr a la superficie. Por otra
parte la molécula de adhesión integrina beta 1 es una
molécula transmembranal por lo tanto una de sus funciones
es de servir como “ligante” de moléculas de la matriz
extracelular, por ejemplo fibronectina, colágeno,
vitronectina, las cuales complementan la adhesión de la
célula a una superficie, por esta razón la célula al adherirse
a una superficie disminuye la expresión de éstas moléculas
de adhesión.
En cuanto a la proliferación celular en el caso de la
superficie TiFA observamos que ésta va disminuyendo. La
presencia de la FA en la superficie modificada inhibe el
crecimiento celular comprometiendo la viabilidad de los
OBr. Como se mencionó anteriormente la FA es segregada
por células de estirpe mesenquimal como los fibroblastos,
osteoblastos y linfocitos, por lo que en primera instancia
promueve la formación de matriz proteínica que,
dependiendo del tipo celular y el tipo de regeneración, esta
matriz tiene la capacidad de mineralizarse. La función de la
FA es hidrolizar iones fosfato a partir de un radical
orgánico a un pH alcalino, sin embargo aún cuando su
actividad está estrechamente asociada con la producción de
cualquier tejido mineralizado [24], principalmente en los
procesos de osteoregeneración [12], también se acepta la
posibilidad de que la enzima esté asociada con el proceso
de provisión de iones fosfato en los sitios de
mineralización. [25]
En el caso de las superficies modificadas con CA aunque
tradicionalmente se ha considerado que los osteoblastos
carecen de receptores para la CA, en algunos experimentos
se ha comprobado cierta acción de la misma sobre estas
células; consiste en un efecto anabólico, con estimulación
de la formación ósea producida por proteína morfogenética
ósea 2 (BMP-2) y de la producción de factores de
crecimiento. [26] Por ello resulta interesante que se ha
demostrando la existencia de receptores de calcitonina en
los osteoblastos. [27] Teóricamente la CA ejercería una
acción directa y estimuladora sobre los osteoblastos, por
receptores específicos, actuando vía proteína-kinasa C. [27]
Es necesario esperar la reproducción de este interesante
hallazgo antes de considerarlo un hecho probado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la beca Conacyt 213622.
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5. Conclusiones
Los resultados muestran que una biomolécula como la
CA o la FA puede ser exitosamente depositada sobre una
superficie de titanio modificada con polielectrolitos, y más
aún, esta es biofuncional y bioactiva, lo cual podría
considerarse dentro del campo de la implantología con una
posible aplicación clínica.
La técnica de adsorción de polilectrolitos permite la
adsorción de las biomoléculas CA y FA. La presencia de
la CA tiene un factor inductor sobre los OBr. Las células
adheridas y la proliferación de éstas fue mayor que en las
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