Evaluación de la biodegradabilidad y

Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales
Departamento de Ingeniería Química, Tecnología de Alimentos
y Tecnologías del Medio Ambiente
TESIS DOCTORAL
EVALUACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD Y
ECOTOXICIDAD DE TENSIOACTIVOS EN EL MEDIO
ACUÁTICO MARINO
Miguel Ángel Sibila Lores
Cádiz, Abril de 2008
EVALUACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD Y
ECOTOXICIDAD DE TENSIOACTIVOS EN EL MEDIO
ACUÁTICO MARINO
Memoria presentada por el Licenciado D. Miguel Ángel Sibila Lores para optar al
Grado de Doctor en Ingeniería Química por la Universidad de Cádiz
LA PRESENTE TESIS DOCTORAL HA SIDO DIRIGIDA POR LOS PROFESORES
DOCTORES DE LA UNIVERSIDAD DE CÁDIZ D. JOSE MARÍA QUIROGA
ALONSO, CATEDRÁTICO DEL ÁREA DE TECNOLOGÍAS DEL MEDIO
AMBIENTE, Y D. JOSE ANTONIO PERALES-VARGAS MACHUCA, PROFESOR
TITULAR DE UNIVERSIDAD DEL ÁREA DE TECNOLOGÍAS DEL MEDIO
AMBIENTE
AGRADECIMIENTOS
“Es de bien nacido ser agradecido”
Quisiera agradecer a todas y cada una de las personas, que no son pocas,
que, de una manera u otra, han contribuido a la elaboración de esta Tesis. Quien me
conoce sabe que la escritura no es mi fuerte, entre otras muchas cosas. Si bien,
espero poder reflejar lo mejor posible la importancia de cada una de ellas en la
finalización de este doctorado.
Especial agradecimiento a mis directores de Tesis, Jose María Quiroga y
Jose Antonio Perales, a quienes no sólo les debo gran parte de este trabajo, sino
también una parte importante de todo mi aprendizaje y formación. Gracias por todo
el apoyo y esfuerzo mostrado, fruto del cual se ha llevado a cabo la elaboración de
diversas publicaciones internacionales, una de ellas recientemente publicada.
Gracias por vuestra paciencia (en algunos momentos, infinita), por todas esas
“horas extras” de correcciones, planificación de ensayos, etc., y en general, por
vuestra motivación y afecto durante todos estos años.
A D. Diego Sales Márquez, director del Grupo de Investigación de
Tecnología del Medio Ambiente y actual Rector Magnífico de la Universidad de
Cádiz, por su confianza y apoyo, en mayor medida, en los inicios de mi doctorado.
A la Consejería de Innovación, Educación y Empresa de la Junta de
Andalucía, por la financiación del presente trabajo a través de una ayuda para la
Formación de Doctores en Centros de Investigación y Universidades de Andalucía.
A todos y cada uno de los profesores del Área de Tecnologías del Medio
Ambiente, y en especial a la profesora Carmen Garrido, por su dedicación y ayuda
en los ensayos de ecotoxicidad así como en los “aspectos estéticos” de trabajos
presentados en diferentes congresos. Sus enseñanzas en todo lo relacionado con la
Toxicología marina constituyen una pieza clave tanto en la elaboración de este
trabajo como en las publicaciones realizadas.
A Isabel Cumbreras (Beli), secretaría del Departamento de Ingeniería
Química, Tecnología de Alimentos y Tecnologías del Medio Ambiente, por el
apoyo mostrado en todos los aspectos administrativos.
A mi “segunda familia”, Antonio Liñeiro, Alberto, Abel, Txomin y
Mohammed (Mou), con quienes tuve el placer de “crecer” en este mundillo,
compartir tantas horas de laboratorio, lamentar ensayos fallidos, disfrutar de
momentos “lúdico-festivos” inolvidables (y los que aún quedan por venir) y con los
que siempre he podido confiar. Mis más dulces recuerdos se los debo a ellos.
A los antiguos compañeros del grupo TMA, Natalia, Esther, Inma, Carlos,
Álvaro, etc, quienes durante varios años compartieron conmigo “las penas y
alegrías” y quienes me ofrecieron su cariño y apoyo.
A la nueva generación de investigadores y doctorandos, Jesús, Pablo, Elisa,
Santiago, Manolo, Andalucía, Cristina, María José (mi “cencerrito” favorito), Julia,
Juana, etc., quienes consiguen transmitirme ese entusiasmo, dedicación y energía
que desprenden, y a los ya veteranos Dani, Youssef, Liboeiro, etc., por su amistad
y por aliviar, quizás sin saberlo, mis amargos momentos en el laboratorio (unas
lecciones de guitarra, un cigarrito o un cafelito).
A Jose Ignacio Lores, por su colaboración en el diseño gráfico del presente
trabajo.
A Beatriz Muñoz, por su ayuda en las traducciones tanto de la presente
Tesis como en las publicaciones realizadas.
A los doctores Walter Giger y Hans-Peter Kohler del Instituto Federal
Suizo de Ciencias Acuáticas y Tecnología (EAWAG), por brindarme la
oportunidad de realizar una estancia bajo sus tutelas, y complementar así mi
formación.
A mis compañeros del Instituto Federal Suizo, Simón, Darío, Patricia,
Enrique, Tobias, Holger, Andreas, Christopher, Marius, Vishaka, etc., quienes
hicieron de mi estancia una experiencia única e inolvidable.
A mis amigos Esteban, Juanqui, Javi, Lladó, Manolo, Miguelito, Iván, etc.
por su amistad y por regalarme unas sonrisas de vez en cuando.
A mis padres y hermanos, quienes de una manera indirecta pero constante
han sufrido los dulces y amargos momentos que uno atraviesa cuando se aventura
en un trabajo de este calibre. Gracias por vuestro cariño, paciencia, apoyo y
comprensión, del que he podido disfrutar en todo momento.
A Rafa, quien además de ser de la familia considero uno de mis mejores
amigos. Gracias por esos inolvidables momentos, viajes, marchitas, etc., que me
permitieron “desconectar” un poco del trabajo.
Finalmente, quisiera extender mi agradecimiento a todas esas personas, que
aún no estando presentes en esta lista, han aportado su granito de arena,
contribuyendo así a la finalización de este trabajo.
A todos, Gracias
A mi Familia
A Santiago Santiago González,
quien merecía algo mejor
ÍNDICE
Resumen
Summary
R-1
S-1
Introducción y objetivos
Referencias
IO-1
IO-5
Capítulo 1. Antecedentes bibliográficos
1. Tensioactivos y Medio Ambiente
2. Biodegradabilidad en el medio acuático
3. Toxicidad en el medio acuático
Referencias
I-2
I-6
I-12
I-17
Capítulo 2. Metodología
1. Diseño experimental
2. Medio de ensayo y punto de muestreo
3. Metodología para el estudio de la biodegradabilidad
4. Metodología para el estudio de la toxicidad aguda estándar
5. Metodología para el estudio de la evolución de la toxicidad
durante la biodegradación
Referencias
Capítulo 3. Sales de alquil trimetil amonio
1. Introducción
2. Materiales
3. Resultados y discusión
3.1. Ensayos de biodegradación
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estándar
3.3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación
4. Conclusiones
Referencias
Capítulo 4. Nonilfenoles etoxilados
1. Introducción
2. Materiales
3. Resultados y discusión
3.1. Ensayos de biodegradación
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estándar
3.3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación
II-2
II-7
II-8
II-12
II-16
II-17
III-2
III-7
III-8
III-14
III-19
III-24
III-25
IV-2
IV-8
IV-9
IV-15
IV-20
i
4. Conclusiones
Referencias
Capítulo 5. Alquil etoxisulfatos
1. Introducción
2. Materiales
3. Resultados y discusión
3.1. Ensayos de biodegradación
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estándar
3.3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación
4. Conclusiones
Referencias
Capítulo 6. Alcoholes etoxilados
1. Introducción
2. Materiales
3. Resultados y discusión
3.1. Ensayos de biodegradación
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estándar
3.3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación
4. Conclusiones
Referencias
IV-23
IV-24
V-2
V-9
V-10
V-15
V-20
V-23
V-24
VI-2
VI-11
VI-12
VI-18
VI-23
VI-26
VI-27
Capítulo 7. Estudio comparativo de la biodegradabilidad y ecotoxicidad de los
tensioactivos
1. Biodegradabilidad de los tensioactivos estudiados en el medio acuático marino
2. Toxicidad aguda de los tensioactivos estudiado sobre organismos marinos
3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación de los
diferentes tensioactivos estudiados
VII-2
VII-5
Conclusiones generales
General conclusions
CG-1
GC-1
ii
VII-9
RESUMEN
El medio marino está constituido por una amplia diversidad de ecosistemas tales
como los arrefices de coral, manglares, sistemas litorales rocosos y arenosos, etc. Cada uno
de estos sistemas contiene una biota característica representada por miles de especies que
con excesiva frecuencia están expuestas a gran variedad de contaminantes derivados,
generalmente, de la actividad humana. Más allá de los detergentes, cuya aplicación es la
más común, los tensioactivos poseen numerosas aplicaciones dada sus propiedades
emulsionantes, humectantes, dispersantes, así como de solubilidad y resistencia a la dureza
del agua. Su elevado y creciente consumo ha hecho de estas sustancias uno de los
contaminantes más frecuentes en el medio acuático. Al objeto de evaluar los posibles
riesgos ambientales de estos compuestos, resulta imprescindible el conocimiento de su
distribución, comportamiento, destino y efectos tóxicos en el medio natural.
La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo fundamental el estudio de la
biodegradabilidad y ecotoxicidad de diferentes familias de tensioactivos (catiónicos, noiónicos y aniónicos) en el medio acuático marino.
En el capítulo 1 se lleva a cabo una revisión general de los aspectos fundamentales
tratados en este trabajo. En primer lugar se resumen las características físico-químicas más
importantes de los tensioactivos así como sus principales efectos adversos en el medio
ambiente y la normativa vigente al respecto. Los principales modelos cinéticos de
biodegradación y los aspectos más relevantes relacionados con el estudio de la toxicidad en
el medio acuático marino son también presentados en este capítulo.
El capítulo 2 describe la metodología utilizada durante el desarrollo del trabajo
experimental. Se han realizado tres tipos de ensayos: ensayos de biodegradación, ensayos
de toxicidad aguda estándar sobre organismos marinos y ensayos combinados de toxicidad
y biodegradación. Todos los ensayos de biodegradación y toxicidad se realizaron en agua
de mar natural procedente de la zona litoral de Sancti Petri (Cádiz, España). Las principales
características físico-químicas de cada tensioactivo y medio de ensayo aparecen descritas
en los capítulos correspondientes.
Los capítulos 3, 4, 5 y 6 exponen los resultados obtenidos en los ensayos de
biodegradación y ecotoxicidad de los diferentes tensioactivos estudiados así como en los
ensayos combinados de biodegradación y toxicidad de los medios de ensayo.
Así, en el capítulo 3 se lleva a cabo el estudio de la biodegradabilidad y
ecotoxicidad de una sal de alquil trimetil amonio, en particular del cloruro de dodecil
trimetil amonio (DTMAC), perteneciente a la familia de los tensioactivos catiónicos. El
R-1
porcentaje de eliminación de carbono orgánico disuelto (COD) fue elevado, con un valor
promedio del 91%. Los valores de tiempo de latencia y vida media fueron de 15,17 y 26,95
días, respectivamente. La toxicidad del tensioactivo dependió significativamente del
organismo ensayado, siendo el crustáceo marino A. franciscana el menos sensible al
mismo. En el caso de las microalgas, los valores de IC50 estuvieron comprendidos entre
0,69 y 6,34 mg L-1 DTMAC. El tensioactivo presenta una biodegradabilidad
ambientalmente aceptable, ya que durante su biodegradación no se aprecia un aumento de
la toxicidad del medio.
En el capítulo 4 se muestran los resultados obtenidos para el tensioactivo no-iónico
Tergitol®NP9, perteneciente al grupo de los nonilfenol etoxilados. Éstos indican la
existencia de un potencial para la degradación del tensioactivo en el medio marino
(porcentaje de biodegradación final superior al 80%). El modelo cinético que mejor
describió la biodegradación final de Tergitol®NP9 bajo las condiciones ensayadas fue el
modelo cinético de primer orden. Las microalgas presentaron una mayor toxicidad que el
crustáceo A. franciscana, siendo las especies I. galbana y C. gracilis las más sensibles al
tensioactivo. Los resultados parecen indicar que el tensioactivo no presenta una
biodegradación ambientalmente aceptable dado que durante el proceso degradativo tuvo
lugar la formación de metabolitos más tóxicos que el compuesto original.
El capítulo 5 está dedicado a la biodegradabilidad y ecotoxicidad del tensioactivo
aniónico Empicol®ESB 70/SP, perteneciente al grupo de los alquil etoxisulfatos. El
porcentaje de eliminación de COD fue alto, aunque a una baja velocidad de degradación
(>96,5% biodegradación al cabo de 124 días). Durante el proceso degradativo se
distinguieron dos etapas, una primera que podría corresponder con la ruptura hidrolítica de
la molécula, y otra en la que la degradación ocurre principalmente vía ω- y β-oxidaciones.
En relación a la toxicidad, la microalga D. salina se mostró como la más sensible al
tensioactivo. No se detectaron metabolitos más tóxicos durante la biodegradación del
tensioactivo, lo cual indica que el tensioactivo presenta una biodegradabilidad
ambientalmente aceptable.
En el capítulo 6 se exponen los resultados obtenidos con un tensioactivo no-iónico
alcohol etoxilado, conocido comercialmente como Findet®1214N/23. Los ensayos de
biodegradación mostraron un elevado porcentaje de biodegradación final en agua de mar
(>95%), aunque a una baja velocidad de biodegradación (tiempo de vida media= 56,8 días).
El modelo de orden cero fue seleccionado para el cálculo del tiempo de latencia y vida
media. Los valores de toxicidad para las microalgas (EC50) estuvieron comprendidos entre
5,0 mg L-1 para C. gracilis y 35,03 mg L-1 para el alga verde T. chuii, mientras que el
crustáceo A. franciscana presentó un valor de LC50 (72-h) de 23,33 mg L-1. Los resultados
obtenidos del experimento combinado de toxicidad y biodegradación indicaron una
biodegradabilidad del tensioactivo ambientalmente aceptable.
R-2
El capítulo 7 proporciona una síntesis y comparación de los resultados obtenidos
en los estudios de esta investigación. Finalmente, se enumeran las principales conclusiones
generales y se apunta por dónde deberían dirigirse las futuras investigaciones en este
campo.
R-3
SUMMARY
The marine environment is made up of complex and diverse ecosystems such as
coral reefs, mangrove forests, rocky and sandy shores, etc. These systems are composed of
a specific biota represented by thousands of species which are often exposed to different
pollutants generally derived from the human activities. Despite the fact that surfactants are
mainly used in household detergent, they also have a large number of applications due to
their physicochemical properties such as good foaming, high water solubility, low hardness
sensitivity and dispersant properties. Since their high and increasing worldwide
consumption, they have been identified as one of the major pollutants of the aquatic
environment. In order to assess their environmental risks, the distribution, behaviour, fate
and biological effects of these surfactants in the environment should be considered.
The aim of the present Doctoral Thesis is to study the biodegradability and
ecotoxicity of different families of surfactants (cationic, non-ionic and anionic) in the
marine aquatic environment.
Chapter 1 shows a revision of the fundamental concepts related to this work.
Firstly, the main physico-chemical characteristics of the surfactants are summarised as well
as their adverse effects in the environment and the recent legislation. The major
biodegradation kinetic models, as well as the most relevant aspects related to the study of
the toxicity in marine environments, are also presented in this chapter.
Chapter 2 describes the methodology used in the present work. Three different
types of studies have been carried out: biodegradation tests using commercial surfactants,
toxicity tests of surfactants on marine organisms and studies concerning the evolution of
testing medium toxicity during the biodegradative process of the surfactants. Pristine
natural sea water samples collected from the coastal area of Sancti Petri (Cadiz, Spain)
were used as test medium in the biodegradation and toxicity tests. Main physico-chemical
characteristics of each surfactant and tested medium are shown in the corresponding
chapters.
Chapters 3, 4, 5 and 6 show the results obtained from the biodegradability and
ecotoxicity tests of the different commercial surfactants as well as the combined toxicity
and biodegradation tests of the test media.
Chapter 3 studies the biodegradability and ecotoxicity of an alkyl trimethyl
ammonium salt (DTMAC), a cationic surfactant. A high dissolved organic carbon (DOC)
removal percentage was observed, showing a mean value of 91%. Lag and half-life times
were 15.17 and 26.95 days, respectively. Toxicity of the cationic surfactant depended
S-1
significantly on the tested organism, being the marine invertebrate A. franciscana the least
sensitive species. In the case of microalgae, IC50 values ranged between 0.69 and 6.34 mg
L-1 DTMAC. During the surfactant biodegradation process no increase of toxicity of the
test medium with respect to the initial medium toxicity was observed, indicating that the
surfactant shows an environmental acceptable biodegradability.
Chapter 4 shows the results obtained for the non-ionic surfactant Tergitol®NP9,
which belongs to the well known group of nonylphenol ethoxylates. The results indicated
that there is a potential for the biodegradation of Tergitol®NP9 in sea water (ultimate
biodegradation percentage >80%). The kinetic model which best described the ultimate
biodegradation of the surfactant under the tested conditions was the first-order model.
Microalgae showed a higher toxicity than the marine invertebrate A. franciscana, being the
species I. galbana and C. gracilis the most sensitive. Biodegradation intermediates showed
a higher toxicity than the parent compound, which means that the surfactant does not seem
to show an environmental acceptable biodegradability.
Chapter 5 studies the biodegradability and ecotoxicity of the commercial anionic
Empicol ESB 70/SP, an alkyl ethoxysulphate surfactant. DOC removal percentage was
relatively high, although at a slow biodegradation rate (biodegradation percentage >96.5%
in 124 days). Two different stages were observed during the biodegradation process; the
first stage would correspond with the breakdown of the molecule by means of hydrolytic
reactions meanwhile the second stage may be characterized by the final degradation via ωand β-oxidations of the intermediates resulting from the first stage. Regarding the toxicity,
the microalga D. salina was the most sensitive species. No toxic metabolites were detected
during the biodegradation process, indicating that the surfactant shows an environmental
acceptable biodegradability.
®
Chapter 6 provides the biodegradability and ecotoxicity of the alcohol ethoxylate
Findet®1214N/23, a non-ionic surfactant. The results obtained from the biodegradation tests
indicated a high ultimate biodegradation percentage in sea water (>95%) although at a very
slow rate (half-life time = 56.8 days). Zero-order kinetic model was the most appropriate
model describing the surfactant kinetic under the conditions tested. Lag and half-life times
were calculated from the selected kinetic model. EC50 values for microalgae ranged from
5.0 mg L-1 for C. gracilis to 35.03 mg L-1 for T. chuii meanwhile the marine invertebrate A.
franciscana showed a 72-h LC50 value of 23.33 mg L-1. The results obtained from the study
of the evolution of the test medium toxicity indicate that the surfactant shows an
environmental acceptable biodegradability.
Chapter 7 provides a synthesis and comparison of the results obtained from all the
experiments and studies conducted during this investigation. Finally, the main general
conclusions are listed and suggestions for future researches are provided.
S-2
INTRODUCCIÓN
Y
OBJETIVOS
Introducción y objetivos
El medio marino constituye uno de los ecosistemas más importante del planeta,
cubriendo un 71% de la superficie de la Tierra (361 x 106 km2) (Millero, 2006). Además,
representa un 99% del espacio vital disponible y contiene un 90% de la biosfera, es decir,
posee una mayor diversidad biológica que los ecosistemas terrestres y de agua dulce (CE,
2005). Incluye océanos, estuarios, salinas, lagunas saladas, y ecosistemas submareales,
costeros y tropicales tales como arrecifes de coral y manglares.
El medio ambiente marino desempeña un papel determinante en las condiciones
climáticas y meteorológicas y resulta un elemento imprescindible para nuestra vida. Así,
constituye nuestra principal fuente de oxígeno, albergando al mayor productor de oxígeno
atmosférico, el fitoplancton marino, cuya producción supone alrededor del 90% de la
producción mundial de oxígeno. Desde un punto de vista socio-económico, el medio
acuático marino representa, sin lugar a dudas, un factor importante para la prosperidad
económica, el bienestar social y la calidad de vida.
A lo largo de la Historia, la distribución de los asentamientos del hombre no ha
sido uniforme por toda la superficie terrestre, sino que ha tendido a concentrarse en las
regiones más ricas, las cuales ofrecen un mayor número de posibilidades económicas y
sociales. Se estima que, en la actualidad, la población litoral alberga de forma directa o
indirecta el 50,3% de la población mundial, con una densidad de población media de 80
personas por km2, es decir, 2,5 veces superior al promedio total de la que habita en el
interior de los continentes. Estas cifras indican la clara tendencia del hombre a desplazarse
a estas zonas dada la ventaja que representa la riqueza de sus recursos, posicionándolas
como áreas estratégicas y de gran relevancia para su estudio. Asimismo, entre los años
2000 y 2030, se prevé un aumento de la población urbana mundial del 72%, mientras que
en el caso de la superficie del territorio ocupado por las ciudades de más de 100.000
habitantes se estima un aumento del 175%, lo que supone un importante incremento en la
ocupación de las zonas costeras (Meléndez, 2007).
Como consecuencia del aumento demográfico y de la industrialización,
urbanización y turismo en las zonas costeras, el medio ambiente marino se encuentra
sometido a un progresivo deterioro. Las aguas residuales constituyen, por volumen, la
principal fuente de contaminación del medio marino y costero. Las descargas de aguas
residuales costeras han aumentado de manera considerable en los tres últimos decenios.
Estas aguas, además de nutrientes (nitrógeno y fósforo, principalmente) y materia orgánica
fácilmente biodegradable, también contienen cantidades significativas de compuestos
xenobióticos, es decir, compuestos orgánicos cuya única fuente en el medio ambiente es de
origen antropogénica.
Los tensioactivos constituyen, por volumen, uno de los principales compuestos
xenobióticos presentes en las aguas residuales urbanas. Su producción anual mundial
IO-2
Introducción y objetivos
alcanza los 12,5 millones de toneladas por año, con un incremento anual estimado de
500.000 toneladas (Edser, 2006). Sin embargo, desde un punto de vista ambiental, existe
una incertidumbre generalizada sobre el comportamiento de estos compuestos en el medio
acuático y terrestre.
La preocupación por la conservación del medio ambiente marino ha aumentado
considerablemente en los últimos años. Una de las consecuencias más directas consiste en
la implantación de nuevas restricciones para el uso de determinados compuestos así como
reglamentaciones que limiten sus vertidos. La Comisión Europea (2003), basándose en el
Reglamento Nº 1488/94 y las Directivas 93/67/EEC y 98/8/EC, elaboró una guía técnica
para la evaluación de los posibles riesgos generados por la presencia de compuestos
químicos en los diferentes compartimentos ambientales, entre ellos, el medio acuático
marino.
La evaluación de riesgo ambiental comprende el estudio del destino final de un
determinado compuesto tras ser vertido al medio así como de los posibles efectos adversos
sobre los organismos pertenecientes a los diferentes compartimentos ambientales
receptores. El riesgo ambiental se calcula mediante la comparación de la concentración
ambiental estimada (PEC) y la concentración estimada de no efecto (PNEC) para cada
compartimento.
Al objeto de evaluar el destino final de un determinado compuesto resulta
sumamente necesario el conocimiento de los múltiples procesos y transformaciones físicoquímicas y biológicas a los que se puede ver sometido. La biodegradación constituye uno
de los procesos degradativos más importantes, desempeñando un papel fundamental en la
eliminación de compuestos en el medio receptor. Debido a que se ve influenciada por un
gran número de factores ambientales, el estudio de la biodegradabilidad de un compuesto
en un determinado compartimento ambiental supone una ardua tarea que no es posible
abordar en un solo trabajo experimental. Se requiere el análisis de los resultados de
múltiples trabajos realizados bajo diferentes condiciones que se puedan dar en el medio de
estudio (naturaleza del medio, concentración del compuesto, temperatura, etc.)
El estudio de la toxicidad constituye otro de los factores clave en la evaluación del
riesgo ambiental pues nos permite establecer la concentración umbral de un determinado
compuesto por encima de la cual se pueden producir efectos adversos en la biota y, en
consecuencia, garantizar la integridad del ecosistema. A partir de las concentraciones de
efectos calculadas para diferentes organismos (NOEC, LOEC, E(L)C50, etc.) se puede
establecer un valor pronóstico de concentración ambiental que no produciría ningún efecto
sobre la comunidad biológica (PNEC).
IO-3
Introducción y objetivos
Objetivos
Objetivo general
La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo fundamental el estudio de la
biodegradabilidad y ecotoxicidad de tensioactivos correspondientes a diferentes familias
(sales de alquil trimetil amonio, nonilfenol etoxilados, alquil etoxisulfatos y alcoholes
etoxilados) en el medio acuático marino.
Objetivos específicos
Para alcanzar este objetivo general, se han formulado diferentes objetivos específicos:
•
Estudiar la biodegradación final o mineralización de diferentes familias de
tensioactivos mediante el método estandarizado de frasco agitado (OPPTS 835.3160
“Biodegradabilidad en agua de mar”), propuesto por la Agencia de Protección
Ambiental de los Estados Unidos (USEPA).
•
Modelizar la cinética de biodegradación de los diferentes tensioactivos en agua de mar
natural bajo condiciones ambientales controladas.
•
Estudiar la toxicidad aguda de los tensioactivos sobre diferentes organismos marinos:
microalgas (Nannochloropsis gaditana, Isochrysis aff. galbana, Chaetoceros gracilis,
Dunaliella salina y Tetraselmis chuii) y crustáceos marinos (Artemia franciscana).
•
Estudiar la evolución de la toxicidad de los diferentes medios de ensayos durante el
proceso de biodegradación, al objeto de detectar la presencia de intermediatos de
biodegradación que pueden resultar más tóxicos que el tensioactivo original.
•
Comparar los resultados obtenidos en los ensayos de biodegradación y ecotoxicidad
para los diferentes tensioactivos ensayados.
Estos objetivos proporcionan la base para el desarrollo del trabajo experimental, cuyos
resultados son discutidos en los sucesivos capítulos. En el último apartado se resumen las
conclusiones más relevantes de la presente Tesis Doctoral.
IO-4
Introducción y objetivos
Referencias
CE, Comisión Europea, 1993. Directiva 93/67/EC de la Comisión, de 20 de julio de 1993,por la que se fijan los
principios de evaluación del riesgo, para el ser humano y el medio ambiente, de las sustancias notificadas
de acuerdo con la Directiva 67/548/CEE del Consejo. Official J. L., 227: 9-18.
CE, Comisión Europea, 1994. Reglamento (CE) nº 1488/94 de la Comisión, de 28 de junio de 1994, por el que se
establecen los principios de evaluación del riesgo para el ser humano y el medio ambiente de las
sustancias existentes de acuerdo con el Reglamento (CEE) nº 793/93 del Consejo.Official J. L., 161: 3-11
CE, Comisión Europea, 1998. Directiva 98/8/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 16 de febrero de 1998
relativa a la comercialización de biocidas. Official J. L., 123: 1-63.
CE, Comisión Europea, 2003. Guía Técnica Europea para la evaluación de riesgos basada en la Directiva
93/67/EC de la Comisión, de 20 de julio de 1993, el Reglamento (CE) nº 1488/94 de la Comisión, de 28
de junio de 1994, y la Directiva 98/8/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 16 de febrero de
1998. Agencia Europea de Sustancias Químicas, Italia.
CE, Comisión Europea, 2005. Comunicación de la Comisión al Consejo y al Parlamento Europeo: Estrategia
temática sobre la protección y la conservación del medio ambiente marino SEC(2005)1290.
COM(2005)504 final. Bruselas, Bélgica.
Edser, C., 2006. Latest market analysis. Focus on surfactants. An international newsletter monitoring technical and
commercial developments for all surface active agents, Ed. Elsevier, Mayo, 2006.
Meléndez, G., 2007. Liberar el potencial del crecimiento urbano. Informe sobre el Estado de la Población Mundial
2007. Fondo de Población de las Naciones Unidas (UNFPA). República Dominicana.
Millero, F. J., 2006. Chemical Oceanography. (Eds) Kennish, M. J. Marine Science Series. CRC Press. Miami,
Florida, USA.
IO-5
Capítulo 1
ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
Resumen
En el presente capítulo se lleva a cabo una breve revisión bibliografía de los
aspectos más relevantes de la Tesis Doctoral. En primer lugar se resumen las características
más importantes de los tensioactivos así como los posibles problemas que éstos pueden
generar sobre el medio ambiente y la legislación vigente al respecto. Posteriormente, se
describen los principales modelos cinéticos de biodegradación descritos en la bibliografía.
Finalmente, se abordan aspectos relacionados con la toxicidad de compuestos en el medio
acuático, en particular en el medio acuático marino.
Capítulo 1
1. Tensioactivos y Medio Ambiente
Los tensioactivos, también conocidos como agentes de superficie, constituyen un
amplio grupo de compuestos químicos con un gran número de aplicaciones debido a sus
propiedades de solubilidad, detergencia, resistencia a la dureza del agua, así como
emulsionantes, dispersantes y humectantes. Estos compuestos, de naturaleza anfifílica,
constan de dos partes estructurales o grupos bien diferenciados, uno hidrófilo y otro
hidrófobo. La presencia de ambos grupos en su molécula le confieren diversas propiedades
tales como la capacidad para disminuir la tensión superficial del agua, la formación de
monocapas de esparcimiento ó de absorción en la interfase agua/aire, la formación de
emulsiones y/ó microemulsiones, la formación de micelas, etc.
En función del carácter iónico del grupo hidrófilo, los tensioactivos se dividen en
cuatro grandes familias: aniónicos, cuando presentan una carga eléctrica negativa,
catiónicos, cuando es positiva, anfóteros, cuando presentan propiedades aniónicas o
catiónicas según el pH del medio y no-iónicos cuando aún presentando una ionicidad ésta
no está definida netamente como negativa o positiva. En la Tabla I.1 se muestran los
principales tipos de tensioactivos utilizados así como sus acrónimos.
Tabla I.1.
Acrónimos de los principales tipos de tensioactivos (Ying, 2006).
Clase
Tensioactivos
aniónicos
Tensioactivos
No-iónicos
Tensioactivos
catiónicos
I-2
Nombre común
Acrónimo
Lineal alquilbenceno sulfonatos
LAS
Alcanos sulfonatos secundarios
SAS
Alcoholes éter sulfatos (alquil etoxisulfatos)
AES
Alcoholes sulfatos (alquil sulfatos)
AS
Alquilfenoles etoxilados
APE ó APEO
Nonilfenoles etoxilados
NPE ó NPEO
Octilfenoles etoxilados
OPE ó OPEO
Alcoholes etoxilados
AE ó AEO
Sales de amonio cuaternario
QAC
Haluros de alquil trimetil amonio
TMAC
Haluros de alquil dimetil amonio
DMAC
Haluros de alquil bencil dimetil amonio
BDMAC
Haluros de dialquil dimetil amonio
DADMAC
Cloruro de bi(alquil grasa hidrogenada) dimetil amonio
DTDMAC
Cloruro de bi(alquil grasa hidrogenada) trimetil amonio
DTTMAC
Cloruro de dietil éster dimetil amonio
DEEDMAC
Antecedentes bibliográficos
Desde un punto de vista comercial, los tensioactivos más utilizados han sido los
lineal alquilbenceno sulfonatos (LAS), alquil etoxisulfatos (AES), alquil sulfatos (AS),
alquilfenoles etoxilados (APE), alcoholes etoxilados (AE), y las sales de amonio
cuaternario (QAC). Desde un punto de vista científico, los lineal alquilbenceno sulfonatos
(LAS), alquil etoxisulfatos (AES) y las sales de amonio cuaternario (QAC) constituyen los
tensioactivos más estudiados (Ying, 2006).
Dada la gran versatilidad de tensioactivos, estos compuestos encuentran aplicación
en numerosos campos tecnológicos. Entre éstas destacan: formulaciones de detergentes,
productos de higiene corporal, cosméticos, aplicaciones alimentarias, pinturas y barnices,
aplicaciones agrícolas, farmacéuticas, emulsiones de asfalto, tratamiento de cueros y/ó
flotación de minerales.
Producción y consumo de tensioactivos
La producción mundial de tensioactivos alcanza unos 12,5 millones de toneladas
por año, con un incremento anual estimado de 500.000 toneladas (Edser, 2006).
Considerando la producción total de tensioactivos, alrededor del 60% corresponde a
tensioactivos utilizados en detergentes domésticos, mientras que un 30% es empleado en
aplicaciones técnicas e industriales, un 7% en limpieza industrial y 6% en productos de
higiene corporal (Edser, 2006). En la Figura I.1 se representa el consumo total de
tensioactivos para el año 2006 en las principales regiones del mundo.
África
8,6%
6,9%
Estados Unidos/Canadá
4,2% 2,8%
26,7%
Europa Occidental
China
Centro Europa/Europa Oriental
11,4%
Latino América
15,6%
23,9%
Japón
Oriente Medio
Figura I.1. Consumo mundial de tensioactivos durante el año 2006 (Janshekar y col.,
2006).
En Europa, los datos más recientes encontrados estimaban una producción total de
tensioactivos de 2,48 millones de toneladas para el año 2000, de los cuales un 49,6%
corresponde a no iónicos, un 40,2% a tensioactivos aniónicos, un 8,3% a catiónicos y un
1,8 % a la producción de anfóteros (UMSICHT, 2003).
I-3
Capítulo 1
En las Figuras I.2A y I.2B se representan la evolución del consumo de
tensioactivos (excluidos los jabones) en España, durante los años 1996-2006. Existe un
claro un aumento del consumo total de tensioactivos durante los últimos años, pasando de
un valor de 240 a 388 millones de Kg, lo que supone un aumento total del 61% (INE,
2006). Asimismo, se observa un consumo fluctuante para los tensioactivos aniónicos, sin
apenas incremento en valores absolutos durante la última década (Fig. I.2B). Para el resto
de tensioactivos el consumo aumenta claramente, siendo más acusado en el caso de los
tensioactivos catiónicos, superando ligeramente el consumo de aniónicos a partir del año
2002 (INE, 2006).
500
200
400
160
Cationicos
Anionicos
Otros
6
Consumo (10 Kg)
Consumo (106 Kg)
No-ionicos
300
200
100
0
1994
A
1996
1998
2000
2002
Año
2004
2006
2008
120
80
40
0
1994
B
1996
1998
2000
2002
2004
2006
2008
Año
Figura I.2. Evolución del consumo de tensioactivos en España durante los años 19962006. (A) consumo total de tensioactivo, (B) consumo de tensioactivos por
tipo (INE, 2006).
Implicaciones ambientales
A pesar del gran número de aplicaciones y de las numerosas ventajas que
presentan los tensioactivos tanto en el ámbito industrial como económico y sanitario, desde
un punto de vista ambiental, éstos son considerados como un importante contaminante del
medio acuático. Una vez utilizados, estos compuestos llegan a las estaciones depuradoras a
través de las aguas residuales urbanas e industriales y en determinados casos son vertidos
directamente a las aguas superficiales. Durante el tratamiento de las aguas residuales, un
elevado porcentaje de estos compuestos es eliminado mediante procesos de biodegradación
y adsorción en el material particulado, mientras que los metabolitos generados son
dispersados en los diferentes compartimentos ambientales (Ying, 2006).
Los principales efectos atribuibles a los tensioactivos como consecuencia de su
presencia en el medio acuático son: (1) producción de efectos tóxicos adversos sobre los
organismos que habitan en el medio receptor, (2) producción de espumas tanto en ríos
I-4
Antecedentes bibliográficos
como en estaciones depuradoras de aguas residuales, (3) efectos sobre la aireación,
coagulación y sedimentación en estaciones depuradoras de aguas residuales, y (4)
contaminación de acuíferos (no es muy frecuente y suele ser consecuencia de otro tipo de
contaminación mas importante).
Normativa sobre tensioactivos y medio ambiente
El creciente consumo de tensioactivos así como sus posibles repercusiones
ambientales constituyen las principales razones por las que diferentes instituciones y
organismos públicos hayan promulgado normas para el control y uso de estas sustancias.
En el ámbito europeo, se han establecido diversas directivas relativas a la biodegrabilidad,
control y uso de sustancias tensioactivas. Así, por ejemplo, la Directiva del Consejo
82/243/CEE regula la aspectos relacionados con la biodegradación de tensioactivos
utilizados en formulaciones detergentes. También cabe destacar la incorporación legislativa
en materia de calidad de agua de la Directiva Marco de Aguas (Directiva 60/2000/CE), la
cual incluye a los compuestos 4-p-nonilfenol y p-ter-octifenol, derivados de los
tensioactivos nonilfenoles etoxilados y octilfenoles etoxilados, respectivamente, en la lista
de sustancias prioritarias en el ámbito de la política de aguas. En el ámbito estatal, la
reglamentación técnico-sanitaria para la elaboración, circulación y comercio de detergentes
y limpiadores es regulada mediante el Real Decreto 770/1999, de 7 de Mayo mientras que
en el ámbito autonómico andaluz la Consejería de Medio Ambiente en 1997 publicó la
Orden de de 14 de Febrero, por la que se clasifican las aguas litorales andaluzas y se
establecen los objetivos de calidad de las aguas afectadas directamente por los vertidos.
I-5
Capítulo 1
2. Biodegradabilidad en el medio acuático
La biodegradación constituye uno de los principales procesos de transformación de
los compuestos xenobióticos en el medio acuático. Durante dicho proceso, los
microorganismos utilizan los tensioactivos como fuente de energía (procesos catabólicos)
y/ó sustrato (procesos anabólicos) (Ying, 2006).
En el proceso de biodegradación de compuestos orgánicos intervienen numerosas
variables tales como las características físico-químicas del medio (oxígeno disuelto,
temperatura, pH, luz, concentración de nutrientes, etc.), las características físico-químicas
del compuesto (solubilidad, concentración, etc.) y/ó los microorganismos presentes (tipos,
concentración, etc.).
Modelos cinéticos de biodegradación
El conocimiento de la cinética de biodegradación de un determinado contaminante
orgánico resulta esencial a la hora de evaluar su persistencia en el medio y valorar los
posibles riesgos que pueden suponer para la biota. Asimismo, nos permite conocer la
concentración de tensioactivo en cualquier instante, predecir los niveles más probables, y
evaluar si el compuesto será eliminado antes de ser transportado a un comportamiento
ambiental determinado (Alexander, 1994).
Modelo cinético de Monod
La mayoría de los modelos cinéticos para el crecimiento celular y el consumo de
sustrato se encuentran basados en el modelo cinético Monod (1949), cuya ecuación viene
dada por la siguiente expresión:
μ=
μ max ·S
Ks + S
(1)
donde μ es la velocidad específica de crecimiento, μmax es la máxima velocidad específica
de crecimiento, S es la concentración de sustrato limitante del crecimiento celular, y Ks es
una constante que representa la concentración de sustrato a la cual la velocidad de
crecimiento es la mitad de la velocidad máxima. En la Figura I.3 se representa gráficamente
la expresión correspondiente al modelo cinético de Monod.
I-6
Antecedentes bibliográficos
μ (T-1)
μmax
μmax/2
Ks
Concentración de Sustrato (M V-1)
Figura I.3. Evolución de la velocidad específica de crecimiento en función de la
concentración de sustrato.
Existen determinadas limitaciones a la hora de aplicar el modelo cinético de
Monod a la biodegradación de compuestos en el medio acuático. En primer lugar, el
modelo esta concebido para un cultivo bacteriano puro, el cual utiliza el sustrato como
fuente de carbono y energía. En segundo lugar, el modelo considera el sustrato en cuestión
como la única fuente de carbono. Finalmente, asume que el compuesto orgánico es
totalmente soluble en agua y no presenta ningún efecto tóxico sobre los microorganismos,
que los organismos se encuentran en un medio líquido bien aireado y que los nutrientes
inorgánicos y factores de crecimiento necesarios están presentes en exceso.
A pesar de que el modelo de Monod no es aplicable a determinados procesos
degradativos, existen muchas otras situaciones en las que este modelo proporciona una
buena aproximación para modelizar el crecimiento de cultivos mixtos y consumo de
sustrato limitante del crecimiento (Simkins y Alexander, 1984).
Simplificaciones del modelo cinético de Monod
Simkins y Alexander (1984), a partir de simplificaciones del modelo cinético de
Monod, obtuvieron seis modelos cinéticos de mineralización, incluyendo exclusivamente
las variables concentración de sustrato y densidad celular. En la Tabla I.2 se recogen los
diferentes modelos cinéticos propuestos por Simkins y Alexander, así como las
condiciones necesarias para su aplicación.
I-7
Capítulo 1
Tabla I.2.
Modelos cinéticos de biodegradación usando solamente las variables
concentración de sustrato y biomasa (Simkins y Alexander, 1984).
Modelo
Condiciones
necesarias
Ecuación
-dS/dt =
A) Primer Orden
B0 >> S0
S0 << KS
K1 · S
B) Logístico
S0 << KS
K3 · S · (S0 + B0 - S)
B0 >> S0
K0 • S
( KS + S )
C) Monod
(sin crecimiento)
D) Monod
(con crecimiento)
E) Orden Cero
F) Logarítmico
Ninguna
B0 >> S0
S0 >> KS
S0 >> KS
Constantes
Unidades de las
constantes
μmax • B0
K1 =
h-1
KS
μmax
K3 =
KS
mg · L-1 · h-1
K0 = μmax · B0
mg · L-1 · h-1
μmax
h-1
K0
K0 = μmax · B0
mg · L-1 · h-1
μmax · (S0 + B0 - S)
μmax
h-1
μmax • S • ( S0 + B0 − S )
( KS + S )
S0= concentración inicial de sustrato; S= concentración de sustrato; Ks= constante que representa la
concentración de sustrato a la cual la velocidad de crecimiento es la mitad de la velocidad máxima; B0=
cantidad de sustrato requerido para producir una concentración inicial de microorganismos X0; μmax=
máxima velocidad específica de crecimiento, S es la concentración de sustrato limitante del crecimiento
celular
En la Figura I.4 se resume gráficamente las diferentes condiciones (columna 2 de
la Tabla I.2) bajo las cuales son aplicables los modelos cinéticos propuestos por Simkins y
Alexander (1984).
Log10 X0
A
PRIMER
ORDEN
C
MONOD
(sin crecimiento)
E
ORDEN
CERO
F
D
MONOD
(con crecimiento)
LOGARÍTMICA
B
LOGÍSTICA
Concentración de Sustrato
Figura I.4. Modelos cinéticos en función de la concentración de sustrato y biomasa
(Simkins y Alexander, 1984).
I-8
Antecedentes bibliográficos
Las curvas de biodegradación correspondientes a los diferentes modelos cinéticos
de Simkins y Alexander se representan en la Figura I.5. Al igual que ocurre con la cinética
de Monod, estos modelos presentan una serie de limitaciones que deberían tenerse en
cuenta a la hora de su aplicación. En primer lugar, estos modelos cinéticos asumen una
producción constante de células en el tiempo así como un rendimiento constante biomasasustrato. Por otro lado, estos modelos no son aplicables cuando influye de manera decisiva
determinados factores ambientales tales como la presencia de otros sustratos, depredación
por protozoos, presencia de compuestos inhibidores, etc.
100
90
Sustrato remanente (%)
80
70
C
B
60
E
F
50
40
A
D
30
20
10
0
Tiempo
Figura I.5. Curvas de biodegradación de compuestos de acuerdo con los modelos
cinéticos mostrados en la Tabla I.2. (Alexander, 1985).
Modelo cinético de Quiroga-Sales y Romero
Para salvar estos inconvenientes, Quiroga y Sales (1988) desarrollaron un modelo
cinético en el que la velocidad de degradación viene dada por un polinomio de segundo
grado, el cual es sólo función de la concentración de sustrato, y cuya ecuación viene dada
por la siguiente expresión:
-
dS
= K2 • ST2 + K1 • ST + K0
dt
(7)
donde K0, K1 y K2 corresponden a los coeficientes del polinomio de segundo grado y ST es
la concentración de sustrato en un tiempo T.
Separando variables e integrando la ecuación 7 obtenemos la expresión para la
concentración de tensioactivo, la cual viene dada por la siguiente ecuación:
I-9
Capítulo 1
S=
h • ( S0 − q ) − q • ( S0 − h) • e p •t
( S0 − q ) − ( S0 − h) • e p •t
(8)
siendo:
p=
K12 − 4 • K2 • K0
q=
( − K1 + p)
2 • K2
h=
( − K1 − p)
2 • K2
S0 = concentración inicial de sustrato.
De la ecuación 8 se sigue que la velocidad de consumo de sustrato se anula cuando
la concentración de sustrato presente en el medio es igual a "q" o "h", ya que éstas serían
las soluciones de dicha ecuación. El hecho de que la velocidad de consumo de sustrato se
anule para el valor de concentración de materia orgánica S = q, implica que q es el valor
mínimo alcanzable de concentración de materia orgánica y, por tanto, representa el nivel de
materia orgánica no biodegradable para este tipo de microorganismos.
Romero (1991), estudiando el comportamiento de procesos de degradación en
discontinuo, obtuvo una ecuación basada en un polinomio de segundo grado respecto a la
concentración de sustrato presente en el medio, similar a la ecuación empírica propuesta
por Quiroga y Sales (1988). La ecuación viene dada por la siguiente expresión:
St =
S 0 • ( S t 0 − S nb ) + S nb • ( S t 0 − S 0) • e μ max •t
( S t 0 − S nb ) + ( S t 0 − S 0) • e
(9)
μ max • t
donde St es la concentración total de sustrato en un instante t, Sto es la concentración inicial
total de sustrato, S0 es la máxima concentración de sustrato invertible en formación de
biomasa, Snb es la concentración de sustrato no biodegradable, y µmax es la máxima
velocidad específica de crecimiento de los microorganismos.
Romero (1991) da una interpretación física a los parámetros cinéticos p, h y q
obtenidos por Quiroga y Sales (1988) a partir de las expresiones matemáticas utilizadas.
Así, p tendría el significado de una velocidad máxima ya que es el producto de la constante
de velocidad observada por la concentración máxima de microorganismos alcanzable en el
medio. Es decir, supondría aquella velocidad máxima alcanzable cuando el término K2 = 0.
El término h tiene dimensiones de sustrato y corresponde a la máxima cantidad disponible
I-10
Antecedentes bibliográficos
en el medio para formar biomasa e incluye el término relativo a la concentración inicial de
microorganismos. Finalmente, el término q representa la concentración de sustrato no
metabolizable por los microorganismos. Lógicamente, la velocidad de degradación en
procesos discontinuos se anula para los valores de h y q (cuando aún no han comenzado a
degradar al sustrato, S=S0=h, y cuando no existe sustrato biodegradable en el medio,
S=Snb=q, respectivamente).
Este modelo ha sido aplicado con éxito tanto a la degradación de tensioactivos en
aguas naturales (Perales y col., 1999; Quiroga y col., 1999; Manzano y col., 1998, 1999)
como a otros sustratos orgánicos (vinazas y FORSU) (Romero, 1991; Fernández, 2008).
I-11
Capítulo 1
3. Toxicidad en el medio acuático
El incremento de la producción y uso de sustancias potencialmente tóxicas, y el
papel del medio acuático como sumidero de muchas de ellas ha hecho que cada vez sea más
necesario poder valorar los efectos de tales compuestos, no sólo sobre el hombre, sino
también sobre los organismos y ecosistemas. La experiencia muestra que es menos costoso,
económica y ambientalmente, prevenir la posible contaminación de un ecosistema que su
posterior recuperación (Van Leewen, 1990).
La presencia de compuestos xenobióticos en el medio natural puede generar
efectos considerables sobre otros compuestos que existen de manera natural en el medio,
sobre componentes físicos y biológicos y/ó sobre determinados procesos claves para la
supervivencia del ecosistema. La magnitud de tales efectos depende de las propiedades
físico-químicas del contaminante y sus metabolitos, la concentración de compuesto en el
medio, la frecuencia de descarga y las propiedades de los propios ecosistemas
(Ramamoorthy y Baddaloo, 1995). Además, dada la singularidad de cada medio, un
ecosistema nunca resulta representativo de otro (Koyman, 1987; Van Leewen, 1990). Así,
ecosistemas aparentemente similares pueden ser afectados de manera diferente por una
misma concentración de un determinado compuesto. Por lo tanto, a la hora de evaluar los
posibles efectos de un determinado compuesto en el medio natural resulta imprescindible
considerar todas y cada una de las condiciones que caracterizan al ecosistema en cuestión.
Un factor determinante en el efecto de un contaminante es el periodo de
exposición. Así, en función del tipo de exposición, se distinguen dos tipos de efectos:
efectos agudos, aquellos debidos a exposiciones de una elevada concentración de
compuesto durante un periodo de tiempo relativamente corto, y efectos crónicos, aquellos
generados por la exposición prolongada a una baja concentración de un determinado
compuesto (Ramamoorthy y Baddaloo, 1995).
Evaluación de la toxicidad acuática. Tipos de ensayos de toxicidad
La toxicología acuática estudia los posibles efectos adversos de compuestos
químicos y sus mezclas sobre organismos acuáticos en diferentes niveles de organización,
desde el subcelular y organismos individuales hasta comunidades y ecosistemas (Rand,
1995). La toxicología acuática se centra, básicamente, en aquellos efectos agudos y
crónicos considerados como adversos tales como mortalidad, efectos sobre el crecimiento,
reproducción, etc., así como de los procesos de recuperación de la biota cuando la
exposición cesa. Una relativamente reciente rama de la toxicología consiste en el estudio de
la relación entre los efectos tóxicos y la estructura molecular, y es conocida por las siglas en
inglés QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship), y tiene como objetivo final
I-12
Antecedentes bibliográficos
tener una cierta capacidad de predicción de efecto de los compuestos sobre los organismos
en función de sus propiedades estructurales (Rand, 1995).
La evaluación de los efectos potenciales toxicológicos de compuestos en
organismos acuáticos, es decir, la concentración de un compuesto y el tiempo de exposición
necesario para producir un determinado efecto, se lleva a cabo mediante ensayos de
toxicidad acuática. En función del tipo de exposición al que el organismo es sometida,
distinguimos tres tipos de ensayos de toxicidad: aguda, subcrónica, y crónica.
Los ensayos de toxicidad aguda están diseñados para determinar la concentración
de compuesto que produce efectos adversos en los organismos expuestos durante un corto
periodo de tiempo en un medio controlado (Ramamoorthy y Baddaloo, 1995). Los criterios
de efecto más utilizados en este tipo de ensayos son la mortalidad, inmovilidad, pérdida de
equilibrio, e inhibición del crecimiento. Generalmente, su duración suele estar comprendida
entre las 24 y 96 horas, aunque en algunos casos este periodo no está predeterminado
(Rand, 1995).
Los ensayos de toxicidad crónica permiten evaluar los posibles efectos adversos de
compuestos bajo unas condiciones de exposición a largo plazo y empleando
concentraciones subletales (Rand, 1995). En este tipo de ensayos, la respuesta tóxica
observada puede ser el resultado de los efectos directos del compuesto en cuestión, de una
forma alterada del compuesto, de una redistribución de los metabolitos en el organismo, y/ó
efectos en órganos diana, y en sistemas enzimáticos y hormonales. Su duración suele ser
variable; en un ensayo crónico completo el organismo es expuesto al compuesto durante un
ciclo de vida reproductivo completo.
Los procedimientos de toxicidad subcrónica están diseñados generalmente para
evaluar los efectos adversos de compuestos administrados a organismos durante repetidas
exposiciones en una dosis diaria desde un periodo de varios días hasta 3 o 4 meses. Son
considerados ensayos de exposición prolongada y sus dosis de efecto son inferiores a las
empleadas en los ensayos de toxicidad aguda. El periodo de estudio suele variar entre los
21 y 30 días, con un incremento en el nivel de dosis al final del periodo y una prolongación
del tratamiento por un periodo adicional si los efectos son cuestionables.
En general, los ensayos de toxicidad deben de cumplir una serie de requerimientos
mínimos. Así, por ejemplo, la respuesta de un determinado ensayo debe ser repetible; no
sería válido un ensayo que cada vez que se realizase los resultados difirieran entre sí,
aunque siempre existe una variabilidad en la respuesta debido al factor de manipulación que
deberá minimizarse lo máximo posible. Además, dada la gran variabilidad que introducen
los propios organismos, se deben buscar aquellos cuyo tamaño permita que cada ensayo se
lleve a cabo con un gran número de especies. Por otro lado, la Directiva 2000/60/CE,
I-13
Capítulo 1
Marco de Aguas, recomienda la obtención de datos de toxicidad, tanto puntuales (agudos)
como correspondientes a un periodo prolongado en el tiempo (crónicos), a partir de
diferentes taxones acuáticos (algas y /o macrófitos, invertebrados, peces, etc.).
Un factor a tener en cuenta en los ensayos de toxicidad es la homogeneidad de los
ensayos con respecto a la heterogeneidad de los ecosistemas. Esto se puede reflejar en la
intervención de variables que no son tenidas en cuenta en estudios puntuales (Van Leewen,
1990). Como ejemplo no deben olvidarse los posibles efectos de una desviación de la
temperatura media para determinada una época pudiendo acentuar la toxicidad del
compuesto en cuestión. El ciclo de vida del organismo ensayado constituye otro de los
factores a tener en cuenta, ya que la toxicidad puede verse acentuada o mitigada en función
de la “edad” del organismo. Asimismo, también resulta importante realizar estudios
exhaustivos que nos permitan comprobar la representatividad de las especies seleccionadas
con respecto al compartimento que estamos estudiados.
Parámetros ambientales
Al objeto de establecer las concentraciones admisibles para un determinado
organismo expuesto y comparar los efectos producidos en individuos procedentes de
diferentes niveles de organización, resulta necesario medir y expresar la toxicidad de forma
cuantitativa. Los valores generados en los ensayos de toxicidad nos permite determinar la
concentración más alta del compuesto ensayado que no produce ningún efecto
estadísticamente significativo en organismos de ensayos en comparación con los
organismos control (NOEC, “no-observed-effect concentration”) así como la concentración
más baja a la que se observa un efecto estadísticamente significativo (LOEC, “lowestobserved-effect concentration”). Sin embargo, el concepto de “no efecto” se encuentra poco
definido y es específico para cada especie, ya que considera cualquier efecto subletal que
difícilmente será generalizable para toda la comunidad biológica. Por ello y al objeto de
facilitar la comparación entre los resultados obtenidos en ensayos de toxicidad bien de un
mismo compuesto sobre diferentes organismos, o bien la de diferentes compuestos sobre el
mismo organismo, se emplea preferentemente los valores de LC50, concentración en la cual
se observa un 50% de mortalidad de los organismos ensayados, o EC50, concentración en la
que se observa un efecto determinado (por ejemplo, inhibición de crecimiento) en el 50%
de los organismos después de un cierto tiempo de exposición (Rand, 1995).
La mayoría de los estudios de toxicidad van dirigidos a la obtención de
información para calcular el riesgo ambiental. La evaluación del riesgo ambiental se basa
en el cálculo de la concentración ambiental que no produciría efecto alguno sobre la
comunidad ecológica (PNEC, “predicted no effect concentration”), la cual es obtenida a
partir de las parámetros ambientales de los correspondientes ensayos de toxicidad (NOEC,
LC50, EC50, etc.).
I-14
Antecedentes bibliográficos
Ensayos de toxicidad en agua de mar
Son numerosos los ensayos de toxicidad que se han llevado a cabo con diferentes
organismos acuáticos marinos correspondientes a diferentes grupos taxonómicos. Sin
embargo, tan sólo un reducido número de estos ensayos han sido desarrollados
formalmente y considerados como ensayos normalizados para incorporarlos a los
procedimientos regulativos de las normativas o textos legislativos. La gran mayoría de los
procedimientos de los ensayos de toxicidad en agua de mar se limitan a una respuesta aguda
o un ensayo a corto plazo no superior a 4 días, y generalmente utilizando como especies de
ensayo a peces e invertebrados para determinar la concentración letal media (LC50) o la
concentración efectiva media (EC50) del compuesto en cuestión. De hecho, basándose en la
limitada información que existe actualmente acerca del cultivo en laboratorio, sobre los
ciclos de vida, la dieta y las posibles enfermedades de un gran número de las especies
estudiadas en agua de mar, tan sólo un pequeño número de estos ensayos podrían
considerarse como estándares (Garrido, 2002).
En la Tabla I.3 se muestran los principales ensayos toxicidad en agua de mar
encontrados en la bibliografía (Rand, 1995). En la actualidad, también es posible encontrar
una extensa bibliografía acerca de protocolos de ensayos de toxicidad estandarizados en las
paginas web de organismos oficiales gubernamentales y ambientales tales como USEPA
(Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos), ECETOC (Centro Europeo de
Ecotoxicología y Toxicología de Compuestos Químicos), OCDE (Organización para la
Cooperación y el Desarrollo Económico), etc.
I-15
Capítulo 1
Tabla I.3.
CÓDIGO
8111
8112
8310
8410
8510
8610
8710
8712
8720
8910
E-1191-90
E-729-88a
E-1241-92
E-1440-91
E-724-89
E-1463-92
E-1367-92
E-1192-88
E-1218-90
1004
1005
1006
1007
1008
1009
797.1050
797.1075
797.1400 y 40
797.1520 y 60
797.1600
797.1800
797.1930 y 50
797.1970
I-16
Ensayos de toxicidad de agua de mar (Rand, 1995, modificado por Garrido,
2002).
TÍTULO
Métodos Normalizados, Parte 8000 (APHA y col., 1992)
Bioestimulación (Productividad algal)
Procedimiento de ensayo de toxicidad para fitoplancton
Procedimiento de ensayo de toxicidad para protozoos ciliados
Procedimiento de ensayo de toxicidad de corales escleroactínidos
Procedimiento de ensayo de toxicidad de anélidos
Procedimiento de ensayo de toxicidad de moluscos
Procedimiento de ensayo de toxicidad de microcrustáceos
Procedimiento de ensayo de toxicidad de acartia
Procedimiento de ensayo de toxicidad de macrocrustáceos
Procedimiento de ensayo de toxicidad de peces
ASTM (ASTM, 1993)
Guía para realizar ensayos de toxicidad durante el ciclo de vida en mísidios
Guía para realizar ensayos de toxicidad aguda con peces, macroinvertebrados, y anfibios
Guía para realizar ensayos de toxicidad durante estadios tempranos de vida de Peces
Guía para realizar ensayos de toxicidad aguda con el rotífero del género Brachionus
Guía para realizar ensayos de toxicidad agudos de tipo estáticos y de flujo continuo con embriones de cuatro especies de moluscos
bivalvos de agua de mar
Guía para realizar ensayos de toxicidad agudos estáticos y de flujo continuo con mísidios de la Costa Oeste de EEUU
Guía para realizar ensayos de toxicidad en sedimentos de 10 días de duración con anfípodos marinos y estuáricos
Guía para realizar ensayos de toxicidad aguda en efluentes acuosos con peces, macroinvertebrados y anfibios
Guía para realizar ensayos de toxicidad estática de 96-horas con microalgas
Test Agudos en Efluentes de la EPA (USEPA, 1991)
Ensayos de toxicidad aguda en efluentes con Mysidopsis bahía
Ensayos de toxicidad aguda en efluentes con Cyprinodon variegatus
Ensayos de toxicidad aguda en efluentes con Menidia sp.
Test Crónicos en Efluentes de la EPA (USEPA, 1991)
Método de supervivientes larvarios y ensayos de crecimiento de Cyprinodon variegatus
Método de supervivientes embrio-larvales y ensayo de teratogeneicidad de Cyprinodon variegatus
Método de supervivientes larvarios y crecimiento de Menidia Beryllina
Método de supervivencia, crecimiento y ensayo de fecundidad de Mysidopsis bahia
Método del ensayo de fertilización del erizo de mar Arbacia punctulata
Método del ensayo de reproducción sexual algal de Champia parvulata
EPA TSCA Procedimientos de toxicidad del Código de regulación Federal (TSCA, 1990)
Ensayo de toxicidad aguda en algas
Ensayo de toxicidad aguda en algas de agua dulce y marina
Ensayo de toxicidad aguda en peces
Ensayo de bioconcentración en peces
Ensayo de toxicidad con estadios tempranos de peces
Ensayo de toxicidad aguda en ostras
Ensayo de toxicidad aguda con mísidios (camarones)
Ensayo de toxicidad aguda con pendidos
EPA-FIFRA Procedimientos de toxicidad (USEPA, 1985, 1986)
Procedimiento de Evaluación Estándar: Ensayos de toxicidad aguda para organismos marinos y estuáricos:
- Ensayo de toxicidad de 96-horas para peces estuáricos (EPA-540/9-85-009, 1985)
- Test de Toxicidad de 96 horas para camarones (EPA-540/9-85-010, 1985)
- Procedimiento de Evaluación Estándar: Test de Toxicidad Aguda para organismos marinos y estuáricos (Estudio de deposición de
concha en moluscos de 96 horas y flujo abierto) (EPA- 540/1-85-011, 1985)
- Procedimiento de Evaluación Estándar: Test de Toxicidad Aguda para organismos marinos y estuáricos (Estudio de embriones y
larvas en moluscos de 48 horas) (EPA-540/9-86-012, 1986)
- Procedimiento de Evaluación Estándar: Estadios tempranos de vida en peces (EPA-540/9-86-138, 1986)
- Procedimiento de Evaluación Estándar: Test de Toxicidad durante el ciclo de vida en peces (EPA-540/9-86-137, 1986)
- Procedimiento de Evaluación Estándar: Plantas no-vasculares: Crecimiento y Reproducción en Plantas Acuáticas -Nivel 1 y 2 (EPA
540/9-86-134, 1986)
OECD Test Guidelines
No especifica procedimientos de ensayos de toxicidad en agua salada
Medioambiente Canadá (Environment Canada, 1992)
Test de toxicidad aguda en sedimentos usando anfípodos marinos y de estuario
Ensayo de fertilización con equinoideos
Antecedentes bibliográficos
Referencias
Alexander, M., 1985. Biodegradation of organic chemicals. Env. Sci. Technol. 18, 106-111.
Alexander, M., 1994. Biodegradation and biorremediation. Academic Press, Inc. Londres.
APHA, AWWA, WPCF, 1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public
Health Association, Washington DC.
ASTM, 1993. En: ASTM (Ed.). Annual Book of ASTM Standards. ASTM, Philadelphia, PA.
BOE, 1999. Real Decreto 770/1999 de 7 de Mayo por el que se aprueba la reglamentación técnico-sanitaria para la
elaboración, circulación y comercio de detergentes limpiadores. BOE nº 118 de 18 de Mayo de 1999.
BOJA, 1997. Orden de 14 de Febrero de 1997 por la que se clasifican las aguas litorales andaluzas y se establecen
los objetivos de calidad de las aguas afectadas directamente por los vertidos. BOJA nº 27 de 1997 de 4 de
Marzo de 1997.
CE, Comisión Europea, 1982. Directiva 82/243/CE referente a la aproximación de las legislaciones de los estados
miembros relativas a los métodos de control de la biodegradabilidad de los tensioactivos aniónicos.
Bruselas, Bélgica, DO L 109/18 de 1982.
CE, Comisión Europea, 2000. Directiva 2000/60/CE del parlamento Europeo y del Consejo, de 23 de octubre de
2000, por la que se establece un marco comunitario de actuación en el ámbito de la política de aguas
DOCE 327/l de 2000.
Edser, C., 2006. Latest market analysis. En: Elsevier (Ed.). Focus on surfactants.
Environment Canada, 1992. Biological Test Methods. Environment Canada, Conservation and Protection, Ottawa,
Ontario, Canada.
Fernández, L. A., 2008. Caracterización cinética de la degradación anaerobia termofílica seca de la FORSU.
Efecto de diferentes pretratamientos sobre la biodegradabilidad del residuo. Tesis Doctoral. Dpto.
Ingeniería Química, Tec. Alimentos y Tec. Medio Ambiente. Universidad de Cádiz, Cádiz.
Garrido, M.C., 2002. Criterios de calidad ambiental. Aplicación a aguas limitadas del Golfo de Cádiz. Tesis
Doctoral. Dpto. Ingeniería Química, Tec. Alimentos y Tec. Medio Ambiente. Universidad de Cádiz,
Cádiz.
INE, 2006. Instituto Nacional de Estadística. http://www.ine.es/pls/nomen/eip_entrada.
Janshekar, H., R.J. Chang, R.J., Yokose, K., Ma, X., 2006. Surfactants In: Consulting, S. (Ed.).
http://www.sriconsulting.com/SCUP/Public/Reports/SURFA000/, China.
Koyman, S.A.L.M., 1987. A safety factor for IC50 values allowing for differences among species. Water Res 21,
269-276.
Manzano, M.A., Perales, J.A., Sales, D., Quiroga, J.M., 1998. Effect of concentration on the biodegradation of a
nonylphenol polyethoxylate in river water. Bull Environ Contam Toxicol 61, 489-496.
I-17
Capítulo 1
Manzano, M.A., Perales, J.A., Sales, D., Quiroga, J.M., 1999. The effect of temperature on the biodegradation of a
nonylphenol polyethoxylate in river water. Water Res 33, 2593-2600.
Monod, J., 1949. The growth of bacterial cultures. Ann. Rev. Microbiol. 3, 371-380.
Perales, J.A., Manzano, M.A., Sales, D., Quiroga, J.M., 1999. Biodegradation kinetics of LAS in river water.
International Biodeterioration & Biodegradation 43, 155-160.
Quiroga, J. M. y Sales, D., 1988. Degradación de Tensioactivos aniónicos por las bacterias presentes en el agua de
mar. Ingeniería Química, vol. agosto, 103-106.
Quiroga, J.M., Perales, J.A., Romero, L.I., Sales, D., 1999. Biodegradation kinetics of surfactants in seawater.
Chemosphere 39, 1957-1969.
Ramamoorthy, S. y Baddaloo, E. G., 1995. Handbook of chemical toxicity profiles of biological species. Vol. I.:
Aquatic species. CRC Press, Inc., Florida, USA.
Rand, G.M., 1995. Fundamentals of aquatic toxicology. Effects, Environmental Fate and Risk Assessment. Taylor
& Francis, Washington.
Romero, L.I., 1991. Desarrollo de un modelo matemático general para los procesos de fermentación: cinética de la
biodegradación anaerobia. Tesis Doctoral. Dpto. Ing. Qca., Tec. Alimentos y Tec. Medio Ambiente.
Universidad de Cádiz, Cádiz.
Simkins, S., Alexander, M., 1984. Models for mineralization kinetics with the variables of substrate concentration
and population density. Appl Environ Microbiol 47, 1299-1306.
TSCA, 1990. Environmental effects testing guidelines. 40 CFR.
UMSICHT, F.I., 2003. Anaerobic Biodegradation of Detergent Surfactants. Oberhausen.
USEPA, 1985. Toxic substances control act test guidelines; final rules. Federal Register 50: 797.1050, 797.1075 y
797.1060.
USEPA, 1986. Quality Criteria for Water. EPA 440/5-86-001.Washington DC.
USEPA, 1991. Pre-draft technical guidance on the application of sediment quality criteria for the protection of
aquatic life. Office of Science and Technology Washington, Distrito de Colombia.
Van Leewen, K., 1990. Ecotoxicological effects assessment in the Netherland: recent development. Environmental
Managament 14(6).
Ying, G.G., 2006. Fate, behavior and effects of surfactants and their degradation products in the environment.
Environ Int 32, 417-431.
I-18
Capítulo 2
METODOLOGÍA
Resumen
El capítulo que a continuación se presenta recoge la metodología empleada
durante la realización del trabajo experimental. En primer lugar se detalla el diseño
experimental seguido para el estudio de la biodegradabilidad y toxicidad de los diversos
tensioactivos así como las condiciones de cada ensayo realizado. A continuación se
describen los métodos de ensayo de biodegradación en agua de mar, de toxicidad aguda
estándar con microalgas y crustáceos marinos, y finalmente, la metodología seguida en los
ensayos de toxicidad durante la biodegradación de los tensioactivos.
Capítulo 2
1. Diseño experimental
En el siguiente apartado se describen las condiciones de los ensayos de
biodegradación, toxicidad aguda estándar y los ensayos combinados de toxicidad y
biodegradación.
Ensayos de biodegradación
Al objeto de estudiar la biodegradabilidad final ó mineralización de los diferentes
tensioactivos en el medio acuático marino, se han llevado a cabo diversos ensayos de
biodegradación. El método empleado fue el de frasco agitado, propuesto por la USEPA
(1998a). En las Tablas II.1, II.2, II.3 y II.4 aparecen recogidas las condiciones de cada uno
de estos ensayos para los diferentes tensioactivos: tipo de ensayo, identificación,
concentración inicial de tensioactivo, concentración de benzoato sódico (sustancia de
referencia) y concentración de HgCl2. Todos los medios de ensayos estuvieron basados en
una matriz de agua de mar natural. La localización del punto de toma de muestra así como
las condiciones de ensayo aparecen recogidas en los apartados 2 y 3 del presente capítulo,
respectivamente. Las principales características físico-químicas de los medios de ensayo así
como de los tensioactivos empleados se detallan en los correspondientes capítulos
(capítulos 3, 4, 5 y 6).
Tabla II.1. Diseño de experimentos para el estudio de la biodegradabilidad del
tensioactivo catiónico cloruro de dodecil trimetil amonio (DTMAC).
Ensayo
Código
Control
Referencia
Abiótico
Tensioactivo
Tensioactivo
Tensioactivo
CO1
REF1
AB1
C1
C2
C3
DTMAC
(mg L-1 COD)
18
18
18
18
Benzoato sódico
(mg L-1 COD)
15
-
HgCl2
(mg L-1)
100
-
Tabla II.2. Diseño de experimentos para el estudio de la biodegradabilidad del
tensioactivo no-iónico nonilfenol etoxilado (NPEO).
II-2
Ensayo
Código
Control
Referencia
Abiótico
Tensioactivo
Tensioactivo
Tensioactivo
CO2
REF2
AB2
N1
N2
N3
NPEO
(mg L-1 COD)
12
12
12
12
Benzoato sódico
(mg L-1 COD)
20
-
HgCl2
(mg L-1)
100
-
Metodología
Tabla II.3. Diseño de experimentos para el estudio de la biodegradabilidad del
tensioactivo aniónico alquil etoxisulfato (AES).
Ensayo
Código
Control
Referencia
Abiótico
Tensioactivo
Tensioactivo
Tensioactivo
CO3
REF3
AB3
AES1
AES2
AES3
AES
(mg L-1 COD)
18
18
18
18
Benzoato sódico
(mg L-1 COD)
15
-
HgCl2
(mg L-1)
100
-
Tabla II.4. Diseño de experimentos para el estudio de la biodegradabilidad del
tensioactivo no-iónico alcohol etoxilado (AE).
Ensayo
Código
Control
Referencia
Abiótico
Tensioactivo
Tensioactivo
Tensioactivo
CO4
REF4
AB4
AE1
AE2
AE3
AE
(mg L-1 COD)
16
16
16
16
Benzoato sódico
(mg L-1 COD)
15
-
HgCl2
(mg L-1)
100
-
Ensayos de toxicidad aguda estándar
En las Tablas II.5, II.6, II.7 y II.8 se indican los ensayos realizados para el estudio
de la toxicidad aguda estándar (TE) de los diferentes tensioactivos. En ellas se recogen el
grupo taxonómico del organismo usado, la especie, su identificación y la respuesta
estudiada. Todos los ensayos se llevaron a cabo en agua de mar natural (véase apartado 2).
Las principales características físico-químicas y biológicas del medio de ensayo
empleado para cada tensioactivo se recogen en los correspondientes apartados de
posteriores capítulos (capítulos 3, 4, 5 y 6). La metodología empleada para la realización de
los ensayos de inhibición de crecimiento y mortalidad aparece detallada en el apartado 3 del
presente capítulo.
II-3
Capítulo 2
Tabla II.5. Diseño de experimentos para el estudio de la toxicidad estándar (TE) del
tensioactivo catiónico cloruro de dodecil trimetil amonio (DTMAC).
Grupo
Algas
Algas
Algas
Algas
Algas
Crustáceos
Organismo
N. gaditana
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
A. franciscana
Código
TE1
TE2
TE3
TE4
TE5
TE6
Efecto
Inhibición crecimiento(IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Mortalidad, 48 y 72-h
Tabla II.6. Diseño de experimentos para el estudio de la toxicidad estándar (TE) del
tensioactivo no-iónico nonilfenol etoxilado (NPEO).
Grupo
Algas
Algas
Algas
Algas
Algas
Crustáceos
Organismo
N. gaditana
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
A. franciscana
Código
TE7
TE8
TE9
TE10
TE11
TE12
Efecto
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Mortalidad, 48 y 72-h
Tabla II.7. Diseño de experimentos para el estudio de la toxicidad estándar (TE) del
tensioactivo aniónico alquil etoxisulfato (AES).
Grupo
Algas
Algas
Algas
Algas
Algas
Crustáceos
Organismo
N. gaditana
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
A. franciscana
Código
TE13
TE14
TE15
TE16
TE17
TE18
Efecto
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Mortalidad, 48 y 72-h
Tabla II.8. Diseño de experimentos para el estudio de la toxicidad estándar (TE) del
tensioactivo no-iónico alcohol etoxilado (AE).
Grupo
Algas
Algas
Algas
Algas
Algas
Crustáceos
II-4
Organismo
N. gaditana
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
A. franciscana
Código
TE19
TE20
TE21
TE22
TE23
TE24
Efecto
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Inhibición crecimiento (IC), 96-h
Mortalidad, 48 y 72-h
Metodología
Ensayos de evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante el proceso de
biodegradación
Los siguientes ensayos tuvieron como objetivo comprobar si a lo largo del proceso
de biodegradación no tienen lugar transformaciones en la molécula de tensioactivo que
conlleven la formación de subproductos más tóxicos, esto es, que presenta una
biodegradabilidad ambientalmente aceptable. Para ello, se llevaron a cabo ensayos de
toxicidad sobre microalgas y crustáceos marinos de muestras procedentes de los ensayos de
biodegradación tomadas en diferentes estadíos del proceso. En las Tablas II.9, II.10, II.11 y
II.12 se recogen los diferentes ensayos realizados así como las condiciones empleadas en
cada uno de ellos. Se indican el grupo taxonómico del organismo usado, la especie, su
identificación, los porcentajes de biodegradación a las que se tomaron las, y finalmente, el
efecto estudiado.
Tabla II.9. Diseño de experimentos para el estudio de la toxicidad durante el proceso de
biodegradación (TB) del tensioactivo catiónico cloruro de dodecil trimetil
amonio (DTMAC).
Grupo
Algas
Algas
Algas
Algas
Algas
Crustáceos
Organismo
N. gaditana
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
A. franciscana
Código
TB1
TB2
TB3
TB4
TB5
TB6
Biodegradación (%)
0, 17, 40, 55, 70, 81, 95
0, 17, 40, 55, 70, 81, 95
0, 17, 40, 55, 70, 81, 95
0, 17, 40, 55, 70, 81, 95
0, 17, 40, 55, 70, 81, 95
0, 17, 40, 55, 70, 81, 95
Efecto
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
Mortalidad, 48 y 72-h
Tabla II.10. Diseño de experimentos para el estudio de la toxicidad durante el proceso de
biodegradación (TB) del tensioactivo no-iónico nonilfenol etoxilado (NPEO).
Grupo
Algas
Algas
Algas
Algas
Algas
Crustáceos
Organismo
N. gaditana
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
A. franciscana
Código
TB7
TB8
TB9
TB10
TB11
TB12
Biodegradación (%)
0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93
0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93
0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93
0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93
0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93
0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93
Efecto
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
Mortalidad, 48 y 72-h
Tabla II.11. Diseño de experimentos para el estudio de la toxicidad durante el proceso de
biodegradación (TB) del tensioactivo aniónico alquil etoxisulfato (AES).
Grupo
Algas
Algas
Algas
Algas
Algas
Crustáceos
Organismo
N. gaditana
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
A. franciscana
Código
TB13
TB14
TB15
TB16
TB17
TB18
Biodegradación (%)
0, 18, 36, 55, 78, 91
0, 18, 36, 55, 78, 91
0, 18, 36, 55, 78, 91
0, 18, 36, 55, 78, 91
0, 18, 36, 55, 78, 91
0, 18, 36, 55, 78, 91
Efecto
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
Mortalidad, 48 y 72-h
II-5
Capítulo 2
Tabla II.12. Diseño de experimentos para el estudio de la toxicidad durante el proceso de
biodegradación (TB) del tensioactivo no-iónico alcohol etoxilado (AE).
Grupo
Algas
Algas
Algas
Algas
Algas
Crustáceos
II-6
Organismo
N. gaditana
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
A. franciscana
Código
TB19
TB20
TB21
TB22
TB23
TB24
Biodegradación (%)
0, 20, 37, 53, 63, 77, 94
0, 20, 37, 53, 63, 77, 94
0, 20, 37, 53, 63, 77, 94
0, 20, 37, 53, 63, 77, 94
0, 20, 37, 53, 63, 77, 94
0, 20, 37, 53, 63, 77, 94
Efecto
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
IC, 72 y 96-h
Mortalidad, 48 y 72-h
Metodología
2. Medio de ensayo y punto de muestro
El medio de ensayo empleado tanto en los ensayos de biodegradación como de
toxicidad contenía como matriz principal agua de mar natural procedente de la zona externa
de la desembocadura del Caño de Sancti Petri (área litoral de Sancti Petri, Cádiz). Se trata
de un canal de 17 km de longitud de flujo-reflujo de mareas que comunica la Bahía interior
de Cádiz con el océano Atlántico (Figura II.1).
El canal presenta una gran importancia desde el punto de vista económica debido a
las actividades que soporta (con los puertos deportivos de Gallineras y Sancti Petri y el
astillero militar de la Carraca), a las que se le suman la presencia de núcleos urbanos (San
Fernando y Chiclana de la Frontera) y un alto valor ecológico (Vidal y Tejedor, 2005). El
punto de toma de muestra está localizado en la parte más externa de la desembocadura del
caño, una zona con fuerte influencia mareal y muy poco antropizada, como muestran los
resultados de los análisis realizados al agua tomada en esta zona (capítulos 3, 4, 5 y 6).
N
Punto de
muestro
Figura II.1.
Situación geográfica del Caño de Sancti Petri y fotografías de la zona de
muestreo.
II-7
Capítulo 2
3. Metodología para el estudio de la biodegradabilidad
En este apartado se expone la metodología seguida para el estudio de la
biodegradabilidad de los diversos tensioactivos, así como una breve descripción del
material común empleado en los ensayos.
Método de ensayo
Los ensayos de biodegradación realizados en el presente trabajo siguieron la
directriz OPPTS 835.3160 “Biodegradabilidad en agua de mar”, propuesta por la Agencia
de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA, 1998a). Esta directriz contempla
dos posibles métodos de ensayo: el método de frasco cerrado y el método de frasco agitado.
En este trabajo, se optó por emplear el método de frasco agitado dado que este método
permite, entre otras, tomar muestras periódicas para realizar el análisis cuantitativo de los
tensioactivos y de parámetros analizados (oxígeno disuelto, temperatura y pH) así como
para los ensayos de toxicidad.
El método de frasco agitado consiste en una variante en agua de mar del ensayo
homólogo de la Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico (OECD, 1992),
desarrollado por el Instituto Danés de Calidad del Agua (Nyholm y Kristensen, 1987). Los
resultados de este ensayo no deben tomarse como indicadores de fácil biodegradabilidad,
pero pueden usarse específicamente para obtener información acerca de la
biodegradabilidad de compuestos en ambientes marinos. Así, un resultado positivo en el
ensayo (eliminación del carbono orgánico disuelto (COD) >70% en menos de 60 días)
indicaría la existencia de un potencial para su degradación en el medio marino estudiado.
Por el contrario, un resultado negativo no descartaría tal potencial aunque sería necesario
llevar a cabo nuevos estudios, por ejemplo, empleando concentraciones inferiores, para
corroborar esta hipótesis.
Descripción del método
Las muestras de agua de mar fueron tomadas con ayuda de una botella
oceanográfica tipo Ruttner a 0,5 m de profundidad y posteriormente, filtradas mediante
filtros de fibra de vidrio de 1 μm de tamaño de poro nominal, para eliminar partículas
gruesas. A continuación las muestras fueron enriquecidas con 1 mL L-1 de diferentes
soluciones stock de nutrientes (Tabla II.13) y finalmente, aclimatadas durante 24 horas en
oscuridad a 20 ± 1ºC, al objeto de permitir el pre-acondicionamiento de los
microorganismos a las condiciones de ensayo.
Los reactores empleados en los ensayos de biodegradación eran de borosilicato de
color ámbar con una capacidad de 2,5 L, con objeto de que el proceso tuviese lugar bajo luz
II-8
Metodología
difusa. A cada reactor se le adicionó un volumen de 1,5 L de agua de mar aclimatada,
dejando así un espacio vacío suficiente para permitir la correcta re-oxigenación del medio.
Los experimentos se llevaron a cabo en una cámara termostatizada en oscuridad y a 19 ±
2ºC. La agitación del medio de ensayo se llevó a cabo de forma periódica mediante la
inyección de un pequeño flujo de aire, el cual además de agitar la disolución, permitió la
aireación de la misma (Figura II.2). En el caso del tensioactivo no-iónico NPEO la
agitación se llevó a cabo mediante un agitador magnético para evitar a la formación de
espuma, y por tanto, la disminución de su biodisponibilidad.
Tabla II.13. Composición química de las soluciones stock de nutrientes empleadas en los
ensayos de biodegradación (USEPA, 1998).
Solución stock de nutrientes
Solución stock I
Solución stock II
Solución stock III
Solución stock IV
Figura II.2.
Compuesto
Concentración (g L-1)
KH2PO4
8,5
K2HPO4
21,75
Na2HPO4 · 2H2O
33,3
NH4Cl
CaCl2
MgSO4
FeCl3 · 6H2O
0,5
27,5
22,5
0,25
Cámara termostatizada empleada para los ensayos de biodegradación.
Los experimentos de biodegradación estaban constituidos por: (a) un ensayo
control, el cual contenía exclusivamente agua de mar aclimatada, (b) un ensayo referencia,
formado por agua de mar aclimatada y una concentración de 15-20 mg L-1 de COD de
II-9
Capítulo 2
benzoato sódico, (c) un ensayo abiótico, el cual contenía una concentración aproximada de
tensioactivo de 15 mg L-1 COD y 100 mg L-1 de HgCl2, y finalmente (d) un triplicado,
formado por agua de mar aclimatada y una concentración aproximada de tensioactivo de 15
mg L-1 COD. El objetivo del ensayo abiótico fue comprobar si durante el experimento tuvo
lugar algún proceso de pérdida de concentración por mecanismos no biológicos tales como
hidrólisis, adsorción, volatilización, etc., mientras que el ensayo de referencia tuvo como
fin comprobar la actividad de la flora microbiana natural contenida en el agua de mar
empleada. Así, un resultado negativo en los ensayos de biodegradación, incluido el ensayo
de referencia, indicaría que éstos son debidos a una baja actividad microbiana del agua de
mar empleada y no a razones estructurales del compuesto ensayado, y, por lo tanto, habría
que repetir el experimento con agua procedente de otra zona.
La concentración de sustrato en los ensayos de biodegradación fue determinada
mediante medidas de carbono orgánico disuelto (COD). Estas medidas se realizaron de
acuerdo con el método estándar de combustión infrarroja 5310B (APHA y col., 1992) con
la ayuda de un analizador Shimadzu TOC-5050A. Previo a su análisis, las muestras fueron
filtradas a través de filtros de fluoruro de polivinilideno de 0,22 μm de tamaño de poro
nominal (Millipore, S.A.). La determinación de los parámetros de control (pH, oxígeno
disuelto y temperatura) se llevó a cabo periódicamente, al objeto de garantizar que el
proceso degradativo estuviera transcurriendo bajo condiciones no limitantes. La
determinación del oxígeno disuelto se realizó mediante un oxímetro portátil con electrodo
selectivo de membrana, corrector de salinidad y compensador de temperatura (WTW Gmb,
Prod. nº Oxi 330). La determinación del pH fue potenciométrica, empleándose un pHmetro
portátil (Crison Instruments, S.A., Prod. nº 507) dotado de un electrodo combinado de
vidrio Ag/AgCl y un compensador automático de temperatura con una resolución de 0,01
unidades de pH.
Modelización cinética
Los valores de concentración de sustrato obtenidos a lo largo de los ensayos de
biodegradación fueron ajustados a diferentes modelos cinéticos propuestos por diversos
autores (Simkins y Alexander, 1984; Quiroga y col., 1999) mediante técnicas de regresión
no lineal, con la ayuda del programa estadístico Sigma Plot 8.0. La selección del modelo
cinético más apropiado se llevó a cabo en función de la simplicidad de los modelos que
presentan un mejor ajuste. Para determinar la bondad del ajuste del modelo cinético a los
datos experimentales se han considerado: (a) el coeficiente de determinación (R2), (b) el
significado físico de los parámetros cinéticos calculados, y (c) los resultados obtenidos en
el análisis estadístico de la Chi-cuadrado (χ2).
II-10
Metodología
El análisis de la χ2 nos permite evaluar de una manera fácil y rápida la bondad del
ajuste de los datos experimentales a un determinado modelo matemático (Press y col.,
1986). Básicamente, consiste en el cálculo del parámetro estadístico Q, probabilidad de que
la Chi-cuadrado exceda al azar un determinado valor χ2 teórico, y el cual nos da una medida
cuantitativa de la bondad de ajuste del modelo. Así, valores Q muy próximos a cero
indicarían que las diferencias aparentes entre los datos experimentales y los datos
correspondientes al modelo teórico no son debidas a fluctuaciones experimentales y por
tanto, el modelo podría ser estadísticamente rechazado. Por el contrario, valores Q
próximos a la unidad indicarían que tales diferencias pueden ser debidas a variaciones
casuales, indicando así un buen ajuste del modelo. Sin embargo, valores muy próximos a la
unidad indicarían un excelente ajuste entre los datos experimentales y teóricos, demasiado
bueno literalmente para ser cierto, y suele ser debido, normalmente, a una sobreestimación
de los errores de medidas. En general, un valor aceptable de χ2 para un ajuste relativamente
bueno es aquel en el que χ2 ≅ ν, siendo ν el número de grados de libertad (ν = N - M, N es el
número de datos y M el número de parámetros del modelo ajustado).
A partir de las ecuaciones y parámetros cinéticos se calcularon los valores del
tiempo de latencia (tL ó t10), t50 y el de vida media (t1/2), considerando tL el tiempo
transcurrido hasta alcanzar un 10% de biodegradación, t50 el tiempo transcurrido en
alcanzar un 50% de biodegradación, a partir del tiempo de latencia y t1/2 el transcurrido
hasta alcanzar el 50% de biodegradación, considerando el tiempo de latencia (Figura II.3).
Biodegradación (%)
100
t50
50
10
tL
t1/2
Tiempo (T-1)
Figura II.3. Típica curva de biodegradación empleando el método de frasco agitado
(USEPA, 1998).
II-11
Capítulo 2
4. Metodología para el estudio de la toxicidad aguda estándar
A continuación se describe la metodología empleada para el estudio de toxicidad
aguda estándar con microalgas y crustáceos marinos.
Ensayos de toxicidad con microalgas marinas
Se han empleado un total de cinco especies de microalgas marinas:
Nannochloropsis gaditana (clase Eustigmatophyceae), Isochrysis aff. galbana (clase
Primnesiophyceae), Chaetoceros gracilis (clase Bacillariophyceae), Dunaliella salina
(clase Chlorophyceae) y Tetraselmis chuii (clase Prasinophyceae) (Figura II.4). Todas las
especies procedían de la colección de cepas de microalgas del Instituto de Ciencias Marinas
de Andalucía (ICMAN-CSIC) (Lubian y Yufera, 1989).
A
Figura II.4.
B
C
D
E
Algas usadas: (A) N. gaditana, (B) I. galbana, (C) C. gracilis, (D) D. salina
y (E) T. chuii.
Para el estudio de la toxicidad aguda sobre las microalgas marinas se llevaron a
cabo ensayos de inhibición del crecimiento. El procedimiento seguido estuvo basado en
diversos métodos estándares propuestos por la Agencia de Protección Ambiental de los
Estados Unidos (USEPA, 1996, 1998b, 2002a, 2002b), la Asociación de la Salud Pública
Americana (APHA y col., 1992), la Organización para la Cooperación y el Desarrollo
Económico (OECD, 1998) y otros autores (Rand, 1995; Kooijman y col., 1996; Garrido,
2002).
La preparación de los inóculos se realizó en dos etapas. En una primera etapa, los
inóculos fueron cultivados en agua de mar sintética esterilizada, al objeto de sanear los
cultivos y evitar cualquier fuente de contaminación. Una vez alcanzada una determinada
concentración, estos inóculos fueron cultivados en agua de mar natural esterilizada. Todos
los inóculos de microalgas fueron cultivados en frascos Erlenmeyer de borosilicato de 500
mL a 20 ± 1ºC e iluminación continua (220 µmol m-2 sec-1), conteniendo 100 mL de agua
de mar sintética (USEPA, 2002a) o natural esterilizada, y un suplemento de nutrientes y
vitaminas, de acuerdo con el medio f/2 (Guillard y Ryther, 1962), el cual fue modificado
empleando una concentración doble de nitrato y fosfato (Huertas y col., 2000) y silicatos
(Garrido, 2002) (Tabla II.14). La concentración de biomasa fue estimada a partir de la
II-12
Metodología
densidad óptica del cultivo (DO) medida mediante un colorímetro (Nannocolor PT-3
MACHEREY-NAGEL) a una longitud de onda de 690 nm (DO, 690 nm).
Tabla II.14. Composición del medio nutritivo, modificado del f/2, empleado en los
ensayos de toxicidad con microalgas (Garrido, 2002).
Compuesto
f/2
(g L-1)
Medio nutritivo
(mg L-1)
Elemento
Medio nutritivo
(mg L-1)
Macronutrientes
NaNO3
150,0
150,0
N
10,0
10,0
P
NaPO4H2·2H2O
3,15
3,15
Fe
FeCl3· 6H2O
0,5
0,5
Si (*)
Na2O3Si
Metales traza
0,010
0,010
Cu
CuSO4· 5H2O
0,022
0,022
Zn
ZnSO4· 7H2O
0,010
0,010
Co
CoCl2· 6H2O
0,180
0,180
Mn
MnCl2· 4H2O
0,006
0,006
Mo
Na2MoO4· 2H2O
Vitaminas
0,100
0,100
Vitamina B1
0,005
0,005
Vitamina B12
Otros componentes
4,36
4,36
(**)
EDTA-Na2· 2H2O
(*) No incluido en la composición inicial de f/2. Sólo necesario para diatomeas.
(**) Suprimir este compuesto en ensayos con metales.
24,724
1,985
0,651
0,121
0,003
0,005
0,002
0,050
0,002
Los ensayos de inhibición de crecimiento fueron realizados en tubos de vidrio de
borosilicato de 10 mL, conteniendo 2 mL de inóculo y 2 mL de una solución conocida de
tensioactivo, ambos preparados en agua de mar natural y enriquecidos con medio de
nutrientes f/2 modificado. La densidad de biomasa inicial óptima en los cultivos de
microalgas fue de 0,200-0,300 unidades de absorbancia, concentración a la cual el cultivo
se encuentra en fase de crecimiento exponencial (Perales, 2001). Los cultivos fueron
incubados a 20 ± 1ºC, con un foto-período de 24 horas y una intensidad de luz de 220 µmol
m2 sec, utilizando una incubadora de precisión modelo Hot-Cold GL 4000700 (J. P.
Selecta, S.A.) (Figura II.5).
Todas las concentraciones empleadas, así como los controles, fueron ensayadas
por triplicado. La concentración de biomasa fue medida inicialmente y a las 24, 48, 72 y 96
horas de incubación. Las velocidades de crecimiento de las microalgas fueron analizadas
estadísticamente mediante interpolación lineal para determinar los valores 96-h IC50
(concentración que produce un 50% de inhibición de crecimiento en los cultivos de
microalgas al cabo de 96 horas de exposición), utilizando para ello el programa informático
ICp (Norberg-King, 1988, 1993). Los parámetros LOEC (concentración más baja ensayada
II-13
Capítulo 2
que produce efecto) y NOEC (concentración más elevada ensayada que no produce efecto)
fueron calculados mediante el test de Dunnet o Steel, dependiendo de los resultados
obtenidos previamente en los test Shapiro-Wilk de normalidad y test de Bartlett de
homogeneidad de la varianza (USEPA, 2002a). Para el cálculo de dichos parámetros se
empleo el programa estadístico ToxStat (West y Gulley, 1996).
Figura II.5.
Incubadora modelo Hot-Cold GL 4000700 utilizada en los ensayos de
toxicidad estándar con microalgas marinas.
Ensayos de toxicidad con Artemia franciscana
Para la realización de los ensayos de toxicidad con crustáceos marinos se empleó
la especie Artemia franciscana (código 1301), cuyos quistes fueron proporcionados por el
Instituto de la Artemia en Bélgica (Artemia Reference Center, State University of Ghent
and Laboratory of Biological Research in Aquatic Pollution, Bélgica) (Figura II.6A). La
medida de toxicidad se ha basado en la mortalidad del crustáceo marino después de un
determinado tiempo de exposición al tensioactivo en comparación con un control no tóxico.
A
Figura II.6.
II-14
B
Ensayo de toxicidad estándar con crustáceos marinos. (A) Fotografía del
crustáceo Artemia sp. (B) Preparación de las placas Petri empleadas en los
ensayos.
Metodología
La metodología empleada en los ensayos de toxicidad con crustáceos ha seguido
las directrices propuestas por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos
(USEPA, 1992, 1996, 1998b, 2002a, 2002b), la Organización para la Cooperación y el
Desarrollo Económico (OECD, 1998), la Sociedad Americana para el Ensayos de
Materiales (ASTM, 2004) y diversos autores (Rand, 1995; Garrido, 2002).
Para la eclosión de los quistes de A. franciscana se emplearon frascos Erlenmeyer
de borosilicato de 250 mL, conteniendo 100 mL de agua de mar sintética esterilizada
(USEPA, 2002a). Los quistes fueron incubados a 20 ± 1ºC, iluminación constante y
aireación suave. Bajo estas condiciones, el tiempo de eclosión requerido fue de
aproximadamente 24 horas. Los nauplios eclosionados fueron transferidos con la ayuda de
una pipeta Pasteur a agua de mar sintética fresca.
Los experimentos fueron realizados en placas Petri de borosilicato (55mm de
diámetro) (Figura II.5), conteniendo un número total de 10 individuos por placa. Estos
individuos eran transferidos en un volumen inferior a 50 µL con la ayuda de una pipeta
Pasteur. Posteriormente se añadieron 8 mL de la concentración del tóxico a ensayar y se
incubaron a 20 ± 1ºC y en oscuridad.
Todas las concentraciones de tensioactivos así como el control fueron ensayados
por quintuplicado. Al cabo de 24, 48 y 72 horas se contó, con ayuda de una lupa, el número
de individuos muertos (inmovilidad durante 10 segundos y color blanquecino) y vivos.
La determinación de los valores LC50 (concentración que provoca la mortalidad de
un 50% de la población de individuos) a las 48 y 72 horas de exposición al tensioactivo se
llevo a cabo siguiendo el procedimiento propuesto por la Agencia de Protección Ambiental
de los Estados Unidos (USEPA, 2002b). En aquellos casos en los que los datos no reunían
las condiciones necesarias para aplicar el método Probit (Finney, 1962), se empleó el
método Trimmed Spearman-Karber ó Spearman-Karber, dependiendo de los porcentajes de
mortalidad observados a las concentraciones máximas y mínimas ensayadas (USEPA,
2002b). La determinación de los parámetros LOEC (concentración más baja ensayada que
produce efecto) y NOEC (concentración más elevada ensayada que no produce efecto) se
llevó a cabo siguiendo el mismo procedimiento que en el caso de las microalgas.
II-15
Capítulo 2
5. Metodología para el estudio de la evolución de la toxicidad durante la
biodegradación.
Durante el proceso de biodegradación de los tensioactivos se analizó la evolución
de la toxicidad del medio de ensayo. Los porcentajes de biodegradación a los que fueron
tomadas las muestras de toxicidad se recogen en el apartado 1 del presente capitulo (Tablas
II.9, II.10, II.11 y II.12).
La metodología empleada para los ensayos de toxicidad con aguas procedentes de
diferentes estadíos del ensayo de biodegradación ha sido análoga a la metodología descrita
para los ensayos de toxicidad aguda estándar con microalgas y crustáceos marinos
(apartado 4). En el caso de las microalgas, se realizó una modificación de la metodología de
los ensayos estándares de toxicidad al objeto de evitar la dilución de las concentraciones de
tensioactivo. En este caso, los inóculos de microalgas fueron centrifugados, una vez
alcanzada la densidad óptima. Posteriormente, se procedió a la eliminación del
sobrenadante y, finalmente, a la re-suspensión de las microalgas en 4 mL de muestra
procedente de los diferentes estadíos de biodegradación (enriquecidas con medio nutritivo
f/2 modificado) hasta alcanzar una concentración de biomasa optima (0,200-0,300 unidades
de absorbancia).
II-16
Metodología
Referencias
APHA, AWWA, WPCF, 1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public
Health Association, Washington DC.
ASTM, 2004. Standard guide for conducting static and flow-through acute toxicity tests with mysids from the west
coast of the United States. E1463-92. En: ASTM (Ed.). Annual Book of ASTM Standards. ASTM,
Philadelphia, PA.
Finney, D.J., 1962. Probit analysis. Cambridge University Press, Cambridge.
Garrido, M.C., 2002. Criterios de calidad ambiental. Aplicación a aguas limitadas del Golfo de Cádiz. Tesis
Doctoral. Dpto Ingeniería Química, Tec. Alimentos y Tec. Medio Ambiente. Universidad de Cádiz,
Cádiz.
Guillard, R.R., Ryther, J.H., 1962. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula
confervacea (cleve) Gran. Can J Microbiol 8, 229-239.
Huertas, E., Montero, O., Lubián, L.M., 2000. Effects of dissolved inorganic carbon availability on growth,
nutrient uptake and chlorophyll fluorescence of two species of marine microalgae. Aquacultural
Engineering 22, 181–197.
Kooijman, S.A.L.M., Hanstveit, A.O., Nyholm, N., 1996. No effect concentrations in algal growth inhibitions
tests. Water Res 30, 1625-1632.
Lubian, L.M., Yufera, M., 1989. Colección de cepas de microalgas del Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía
(CSIC). Instituto de Ciencias Marinas, Cádiz.
Norberg-King, T.J., 1988. An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. NETAC Technical
Report 05-88. United States Environmental Protection Agency, Duluth, MN.
Norberg-King, T.J., 1993. A linear interpolation method for sub-lethal toxicity: The inhibition concentration (ICp)
approach. NETAC Technical Report 03-93. United States Environmental Protection Agency, Duluth,
MN.
Nyholm, N., Kristensen, P., 1987. Screening methods for assessment of biodegradability of chemical substances in
seawater. Final report of the ring test programme. Commission of the European Communities.
Nyholm, N., Kristensen, P., 1992. Screening methods for assessment of biodegradability of chemicals in seawater
results from a ring test. Ecotoxicol Environ Saf 23, 161-172.
OECD, 1992. OECD guidelines for the testing of the chemicals. 301: Ready biodegradability. OECD, Paris.
OECD, 1998. Series on testing and assessment. Number 10-Report of the OECD workshop on statistical analysis
of aquatic toxicity data. ENV/MC/CHEM(98)18. OECD, Paris.
Perales, J.A., 2001. Variabilidad de la biodegradación y toxicidad de compuestos xenobióticos en el medio
marino. Aplicación a lineal alquilbenceno sulfonatos en aguas del Golfo de Cádiz. Tesis Doctoral. Dpto.
de Ingeniería Química, Tec. Alimentos y Tec. Medio Ambiente. Universidad de Cádiz, Cádiz.
II-17
Capítulo 2
Press, W.A., Flannery, B.P., Teukolsky, S.A., Vetterling, W.T., 1986. Numerical recipes, the art of scientific
computing. Cambridge University Press, Cambridge.
Quiroga, J.M., Perales, J.A., Romero, L.I., Sales, D., 1999. Biodegradation kinetics of surfactants in seawater.
Chemosphere 39, 1957-1969.
Rand, G.M., 1995. Fundamentals of aquatic toxicology. Effects, Environmental Fate and Risk Assessment. Taylor
& Francis, Washington.
Simkins, S., Alexander, M., 1984. Models for mineralization kinetics with the variables of substrate concentration
and population density. Appl Environ Microbiol 47, 1299-1306.
USEPA, 1992. 797.1930 Mysid shrimp acute toxicity test. Toxic Substances Control Act. Environmental Effects
Testing Guidelines. US Code of Federal Regulations, Washington DC.
USEPA, 1996. Algal toxicity Tiers I and II. Series 850-Ecological effects test guidelines. OPPTS 850.5400.
EPA/712/C-96/164. USEPA, Washington DC.
USEPA, 1998a. Fate, transport and transformation test guidelines. OPPTS. "Biodegradability in Sea Water"
835.3160. EPA 712–C–98–351. The Federal Bulletin Board. U.S. Government Printing Office
Washington, DC.
USEPA, 1998b. Guidance for data quality assessment. Practical methods for data analysis. EPA/600/R-96/084.
USEPA, Washington DC.
USEPA, 2002a. Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and
Marine Organisms. EPA-821-R-02-012 USEPA, Washington DC.
USEPA, 2002b. Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and receiving waters to
freshwater organisms. EPA-821-R-02-013. USEPA, Washington DC.
Vidal, J., Tejedor, B., 2005. Study of the dynamic behaviour of the Sancti Petri channel, southwest coast of Spain.
Ciencias Marinas 31, 617-626.
West, I., Gulley, 1996. Toxstat version 3.5. Western Ecosystems Technology, Inc. Cheyenne, WY.
II-18
Capítulo 3
SALES DE ALQUIL TRIMETIL AMONIO
Resumen
Dentro de la gran familia de los tensioactivos catiónicos, las sales de alquil trimetil
amonio destacan por sus numerosas aplicaciones tanto domésticas como industriales. Sin
embargo, la bibliografía existente acerca del comportamiento ambiental de estos
tensioactivos en el medio marino es, hasta la fecha, muy escasa. El siguiente capítulo
presenta los resultados del estudio de la biodegradabilidad y ecotoxicidad del tensioactivo
catiónico cloruro de dodecil trimetil amonio (DTMAC) en agua de mar natural procedente
de la zona costera de Sancti Petri (Cádiz). El método de ensayo para el estudio de la
biodegradación final del tensioactivo se ha basado en la directriz OPPTS 835.3160
“Biodegradabilidad en agua de mar”, propuesta por la Agencia de Protección Ambiental de
los Estados Unidos (USEPA). El estudio de la toxicidad se ha llevado a cabo mediante
ensayos de inhibición del crecimiento de diversas especies de microalgas así como ensayos
de mortalidad del crustáceo marino Artemia sp. Finalmente, se ha estudiado la evolución de
la toxicidad del medio de ensayo a lo largo del proceso degradativo sobre estos organismos
marinos. Los resultados indican un elevado porcentaje de biodegradación final del
tensioactivo (>90%). Asimismo, la microalga C. gracilis constituye la especie más sensible
al tensioactivo. Dado que no se observa un incremento de la toxicidad del medio se puede
concluir que el tensioactivo presenta una biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
Capítulo 3
1. Introducción
Sales de alquil trimetil amonio. Características y usos
Las sales de alquil trimetil amonio constituyen un importante grupo dentro de la
amplia gama de tensioactivos catiónicos con numerosas aplicaciones industriales y
domésticas (Huber, 1984; García y col., 1999; Nalecz-Jawecki y col., 2003). Así, cabe
destacar su utilización en productos cosméticos, tales como acondicionadores ó colorantes
para el cabello, así como en otros productos de cuidado personal (Madsen y col., 2001).
Su estructura química se compone de una parte hidrófoba constituida por una
cadena alquílica, generalmente lineal, con un número de átomos de carbono comprendido,
normalmente, entre 12 y 18, y una parte hidrófila, formada por un átomo de nitrógeno
cuaternario con tres radicales metilo. En función del tipo de contraión presente en la
molécula (anión Cl- ó Br-) se diferencian dos tipos de sales: cloruros de alquil trimetil
amonio (ATMAC) y bromuros de alquil trimetil amonio (ATMAB) (Figura III.1).
CH3
R
N+
CH3
X-
CH3
Figura III.1. Estructura química del tensioactivo catiónico sal de alquil trimetil amonio
(R= CxH2x+1, x= 12-18; X- = Cl- ó Br-).
Niveles de alquil trimetil amonio en el medio acuático
La determinación de sales de alquil trimetil amonio y, en general de tensioactivos
catiónicos, en diferentes compartimentos acuáticos ha sido objeto, sorprendentemente, de
muy pocos estudios. Tan sólo se han encontrado datos referentes a la presencia del
tensioactivo cloruro de bi(alquil grasa hidrogenada) dimetil amonio (DTDMAC) en
efluentes de estaciones depuradoras de aguas residuales (Versteeg y col., 1992) y en agua
de río (Leuwen y col., 1992), con concentraciones de 62 y 2-34 μg L-1 DTDMAC,
respectivamente.
Debido a su naturaleza anfifílica, durante el tratamiento de las aguas residuales los
tensioactivos catiónicos son adsorbidos con gran facilidad en la superficie del material
particulado. Esto hace que las concentraciones esperadas de estos compuestos en la fase
acuosa sean, en principio, relativamente bajas. Kupfer (1982) y Topping y Waters (1982)
III-2
Sales de alquil trimetil amonio
observaron una reducción del 95% de la concentración total de tensioactivos catiónicos en
un sistema de lodos activos, siendo gran parte de esta eliminación debida a procesos de
adsorción sobre los flóculos biológicos. Además, Huber (1987) encontró una eliminación
de entre el 20 y 40% de tensioactivos catiónicos en el decantador primario de una estación
depuradora de aguas residuales debido a procesos de adsorción en los sólidos
sedimentables.
Biodegradabilidad de las sales de alquil trimetil amonio
Hasta la fecha, pocos son los estudios que se han llevado a cabo sobre la
biodegradación de sales de alquil trimetil amonio en ambientes aerobios ó anaerobios.
Mackrell y Walter (1978) propusieron tres posibles rutas metabólicas para la degradación
de estos tensioactivos bajo condiciones aerobias (Figura III.2). Una primera ruta consiste en
la ruptura del enlace C-N de la cadena alquílica (N-desalquilación) dando lugar a un
aldehído y a una amina terciaria, la cual a su vez se degradaría mediante sucesivas rupturas
del enlace C-N de los grupos metilos (N-desmetilación). Otra posible ruta de degradación
sería la ruptura del enlace C-N de uno de los grupos metilo, dando lugar a formaldehído y
una amina terciaria, la cual se degradaría mediante N-desalquilación y/ó N-desmetilaciones.
El ataque microbiano sobre la cadena alquílica de la molécula mediante ω-β oxidaciones
constituye la tercera posible ruta de biodegradación de estos compuestos. Para condiciones
anaerobias, no se ha encontrado bibliografía en la que se describa las posibles rutas de
biodegradación de estos compuestos.
El acortamiento de la cadena alquílica mediante ω-β oxidaciones ha sido
demostrado por Dean-Raymond y Alexander (1977) en estudios de degradación del
tensioactivo C10TMAC con Xanthomonas sp. Sin embargo, estudios llevados a cabo con
lodos activos procedentes de una estación depuradora de aguas residuales urbanas sugieren
que el mecanismo de biodegradación de las sales de alquil trimetil amonio consiste en una
N-desalquilación, seguida de N-desmetilaciones (Nishiyama y col., 1995). En esta ruta, la
sal de alquil trimetil amonio sería inicialmente degradada a trimetil-amina mediante una Ndesalquilación y posteriormente transformada en dimetil-amina, y a su vez, en metil-amina.
Sin embargo, este último compuesto raramente ha sido detectado (Nishiyama y col., 1995).
En general, las sales de amonio cuaternaria son consideradas biológicamente
degradables bajo condiciones aerobias (Ying, 2006). Games y col. (1982) demostraron que
durante el proceso degradativo no se generan metabolitos recalcitrantes y describieron un
tiempo de vida media de 2,5 horas para la biodegradación primaria del tensioactivo cloruro
de octadecil trimetil amonio (C18TMAC) en un sistema de lodos activos. Asimismo,
estudios llevados a cabo sobre diferentes homólogos de sales de alquil trimetil amonio
(bromuros de dodecil, tetradecil y hexadecil trimetil amonio) y empleando agua de mar
III-3
Capítulo 3
inoculada indicaron una completa biodegradación primaria bajo condiciones aerobias
(García y col., 2001).
Sal de amonio cuaternario
CH3
R
N+
CH3
X-
CH3
N-desalquilación
ω-oxidación
N-desmetilación
O
R
C
H
Aldehído
H3C
+
CH3
N
H
O
+
H
CH3
Trimetil amina
C
R
Formaldehído
CH3
N
CH3
Amina terciaria
CH3
O
C
N+
R1
HO
CH3
CH3
Amina cuaternaria
β- oxidación
N-desalquilación
N-desmetilación
CO2, H2O, NH3 /NH4+
N-desmetilación
O
N-desalquilación
HO
CH3
C
N+
R2
CH3
CH3
Amina cuaternaria
+
O
H3 C
C
OH
Ácido acético
Figura III.2. Rutas de biodegradación de las sales de aquil trimetil amonio (Mackrell y
Walter, 1978) (R=C12-C18; R1=R-1, R2=R-2).
La elevada mineralización que presentan estos tensioactivos también ha sido
puesta de manifiesto en diversas experiencias. Así, por ejemplo, Games y col (1982)
observaron un alto grado y velocidad de mineralización para el tensioactivo C18TMAC a
concentraciones iniciales de ensayo comprendidas entre 0,1 y 1 mg L-1. Larson y Vashon
(1983) estimaron un tiempo de vida media de 2,2 días para dicho tensioactivo empleando
agua de río previamente aclimatada. En estudios de mineralización en agua de río y
mediante14C del tensioactivo C18TMAC (10 μg/l) también se ha observado una elevada
biodegradación final, obteniéndose porcentajes de 14CO2 superiores al 60% y 75% al cabo
III-4
Sales de alquil trimetil amonio
de 7 y 21 días, respectivamente (Boethling, 1984). En un medio de ensayo constituido por
agua de mar inoculada, García y col. (2001) observaron una completa mineralización para
diferentes homólogos de sales de alquil trimetil amonio (bromuros de dodecil, tetradecil y
hexadecil trimetil amonio) en un periodo comprendido entre 7 y 11 días de ensayo. Por otro
lado, diversos estudios han demostrado un aumento del grado de mineralización del
tensioactivo catiónico cloruro de alquil trimetilamonio (ATMAC) cuando se combina con
el tensioactivo aniónico lineal alquil benceno sulfonato (LAS). Games y col. (1982)
encontraron que una concentración de 20 mg L-1 de C18TMAC inhibía la producción
endógena de CO2 en un sistema de lodos activos, descartando por tanto su biodegradación,
mientras que para una mezcla de C18TMAC y LAS (ambos en una concentración de 20 mg
L-1) se alcanzó un porcentaje de mineralización del 81% al cabo de 25 días de ensayo.
Aunque pocos son los estudios que se han llevado a cabo sobre la
biodegradabilidad de tensioactivos catiónicos en condiciones anaerobias, se considera que
las sales de alquil trimetil amonio, y en general, los tensioactivos catiónicos no son
anaeróbicamente biodegradables. García y col. (1999) describieron una pobre
biodegradación primaria y la ausencia de mineralización de diversos compuestos de alquil
trimetil amonio bajo condiciones anaerobias. Por otro lado, Janicke y Hilge (1979)
encontraron una mínima y/ó inexistente disminución de la concentración de sales de
amonio cuaternario en digestores anaerobios.
Los estudios de biodegradación de las sales de alquil trimetil amonio llevados a
cabo por diversos autores muestran que la biodegradabilidad de los diferentes homólogos
disminuye, en general, a medida que aumenta la longitud de cadena alquílica. En estudios
realizados por Masuda y col. (1976) los porcentajes de biodegradación para diferentes
homólogos de ATMAC al cabo de 10 días de ensayos fueron del 73% para C8, 63% para
C10, 59% para C12, 35% para C14 y 0% para C16 y C18. Por otro lado, García y col. (2001)
encontraron una completa biodegradación primaria del C12TMAB y C14TMAB al cabo de 3
días mientras que para C16TMAB ésta no se alcanzó hasta los 6 días de ensayo. Asimismo,
se observó una mineralización total de estos tensioactivos al cabo de 6 días para C12 y C14 y
11 días para C16.
Toxicidad de las sales de alquil trimetil amonio en el medio acuático
La bibliografía existente en relación a la toxicidad acuática de las sales de alquil
trimetil amonio (ATMAC y ATMAB) sobre diferentes grupos taxonómicos (algas,
invertebrados, peces, etc.) es abundante, aunque cabe destacar que generalmente se tratan
de organismos acuáticos no marinos.
Para el caso específico de las algas, los datos de toxicidad aportados en la
bibliografía parecen indicar que se tratan de un grupo de organismos muy sensible a los
III-5
Capítulo 3
tensioactivos catiónicos, encontrándose valores de EC50 generalmente inferiores a 1 mg L-1.
Así, Utsunomiya y col. (1997a) para una sal de alquil trimetil amonio con una cadena
alquílica comprendida entre 16 y 18 átomos de carbono (C16-18TMAC) encontraron valores
de EC50 (24-h, formación de 13C-Glicerol) de 0,79 mg L-1 para la microalga marina
Dunaliella sp., mientras que para la especie de agua dulce Chlorella pyrenidosa el valor de
IC50 (96-h) fue de 0,28 mg L-1 (Utsunomiya y col., 1997b). Lewis y Hamm (1986)
investigaron los efectos de diversos tensioactivos ATMAC sobre el crecimiento de diversas
especies de algas. Para las microalgas Selenastrum capricornutum y Microcystis
aeruginosa, los valores de IC50 (96-h) hallados para el tensioactivo C16TMAB fueron de
0,09 mg L-1 y 0,03 mg L-1, respectivamente. Para el caso de C12TMAC, los valores de IC50
(96-h) estuvieron comprendidos entre 0,12 mg L-1 para Microcystis aeruginosa y 0,20 mg
L-1 para Navicula pelliculosa.
Los valores encontrados en la bibliografía de toxicidad aguda de las sales de alquil
trimetil amonio sobre invertebrados acuáticos son, en todos los casos, inferiores a 1 mg L-1,
al igual que ocurre con las microalgas. Estudios de toxicidad aguda con bromuros de
dodecil, tetradecil y hexadecil trimetil amonio mostraron, concentraciones de efecto (EC50,
24-h, movilidad) comprendidas entre 0,13 y 0,18 mg L-1 sobre el crustáceo D. magna
(García y col., 2001). Lewis y Suprenant (1983) encontraron efectos tóxicos (LC50, 48-h)
sobre el crustáceo Gammarus sp. a una concentración media de 0,1 mg L-1 de C16TMAC.
La toxicidad de las sales de alquil trimetil amonio sobre peces ha sido objeto de
estudio de pocos autores. En un estudio realizado por Boethling y Lynch (1992) para una
serie de sales de alquil trimetil amonio, mostraban valores de EC50 comprendidos entre 0,86
y 8,6 mg L-1 para la carpa Idus melanotus. Asimismo, Singh y col. (2002), para el
C16TMAC, determinaron los valores de EC50 (movilidad, 48-h) para tres especies de peces
de agua dulce, siendo ésta de 1,21 mg L-1 para la trucha arco iris (Salmo gairdneri), 8,24
mg L-1 para el pez mosquito (Gammbusia affinis) y 3,58 mg L-1 para la carpa dorada
(Carassius auratus).
De forma general, la toxicidad de los tensioactivos catiónicos aumenta con la
longitud de la cadena alquílica como consecuencia del aumento de la hidrofobicidad de la
molécula (García y col., 2001). Sin embargo, en ensayos de toxicidad realizados sobre el
crustáceo D. magna y la fotobacteria P. phosphoreum, García y col. (2001) no observaron
diferencias significativas en la toxicidad de diferentes homólogos. Esto puede ser atribuido
a la baja biodisponibilidad de los homólogos de cadena alquílica más largas como
consecuencia de su menor solubilidad.
III-6
Sales de alquil trimetil amonio
2. Materiales
En el siguiente apartado se describen las principales características físico-químicas
del tensioactivo catiónico, objeto del presente estudio, así como del medio de ensayo
empleado tanto en los ensayos de biodegradación como de toxicidad sobre organismos
marinos.
Tensioactivo ensayado
El tensioactivo catiónico empleado en el presente estudio fue el cloruro de dodecil
trimetil amonio (DTMAC), CAS 112-00-5 y suministrado por Sigma Aldrich, S.A.
(Barcelona). Se trata de un homólogo puro constituido por una cadena alquílica de 12
átomos de carbono y fórmula empírica C15H34ClN. Posee un peso molecular de 263,89 g
mol-1, una solubilidad en agua de 50 g L-1 y una pureza superior al 99% de materia activa.
Medio de ensayo
En la Tabla III.1 se recogen las principales características físico-químicas y
biológicas del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradación y toxicidad. Como
puede observarse las concentraciones de nitrito, nitrato, amonio y fosfato se encuentran por
debajo del límite de detección del método. Por otro lado, el análisis microbiológico desvela
la ausencia de microorganismos indicadores de influencia de aguas residuales urbanas.
Además, se aprecia una baja concentración de carbono orgánico disuelto, similar a las
descritas en aguas oceánicas (USEPA, 1998). Estos resultados indican que se trata de un
agua de excelente calidad y con muy bajo nivel ó nulo de contaminación.
Tabla III.1. Características del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradación y
toxicidad del tensioactivo catiónico (valor medio ± desviación estándar, n=3).
Parámetro
Unidades
Valor
Parámetro
Unidades
Valor
-1
-
< 0,020
Oxígeno disuelto
% saturación
89,9 ± 1,8
Nitrato
mg L NO3
Temperatura
ºC
21,0 ± 0,3
Amonio
mg L-1 NH4+
< 0,007
Conductividad
mS cm-1
51,1 ± 0,2
Fosfato
mg L-1 PO43-
< 0,015
pH
-
8,25 ± 0,04
Silicato
mg L-1 Si
0,046 ± 7·10-4
Salinidad
38,7 ± 0,2
-1
Dureza total
-1
2+
mg L Ca
-3
316 ± 45
Carbono Total
mg L C
26,5 ± 0,5
Clorofila a
mg m
Carbono inorgánico
mg L-1 C
25,6 ± 0,5
Estreptococos fecales
UFC 100mL-1
No detectado
Carbono orgánico
mg L-1 C
0,97 ± 0,01
Coliformes fecales
UFC 100mL-1
No detectado
< 0,015
Enterococos
UFC 100mL-1
No detectado
Nitrito
-1
mg L NO2
-
Cl a
0,85 ± 0,10
III-7
Capítulo 3
3. Resultados y discusión
Los resultados de los distintos ensayos realizados con DTMAC durante el trabajo
experimental se discuten en este apartado. En primer lugar, se resume el análisis de los
parámetros de control medidos en el proceso de biodegradación. Posteriormente, se
exponen los resultados correspondientes al estudio cinético del proceso de mineralización
del tensioactivo estudiado. A continuación, se discuten los valores de toxicidad aguda
obtenidos a partir de los ensayos de inhibición de crecimiento y mortalidad sobre
microalgas y crustáceos marinos. Finalmente, se comentan los resultados obtenidos en los
ensayos de toxicidad con muestras procedentes de diferentes estadíos del ensayo de
biodegradación.
3.1. Ensayos de biodegradación
Parámetros de control
En la Figura III.3 se recogen la evolución del pH y oxígeno disuelto en los ensayos
de biodegradación (C1, C2 y C3) y en el control (CO1).
8,4
100
O2 (%saturación)
pH
8,3
8,2
CO1
C1
C2
C3
8,1
8,0
80
60
40
CO1
C1
C2
C3
20
0
0
10
20
30
Tiempo (d)
40
50
0
10
20
30
40
50
Tiempo (d)
Figura III.3. Evolución del pH y oxígeno disuelto en el ensayo control (CO1) y los ensayos
de biodegradación con DTMAC (C1, C2 y C3).
Como puede observarse en la Figura III.3, los valores de pH permanecen
prácticamente constantes a lo largo del experimento de biodegradación, sin diferencias
significativas entre los ensayos de biodegradación y el ensayo control, mostrando valores
medios de pH (valor medio ± DE) de 8,2 ± 0,1.
III-8
Sales de alquil trimetil amonio
Respecto a la concentración de oxígeno disuelto, se aprecia en general un descenso
inicial de los niveles de oxígeno, los cuales se mantienen durante el resto del experimento.
No obstante, la concentración de oxígeno disuelto en los ensayos de biodegradación y
ensayo control permanece dentro de un intervalo que garantiza el desarrollo apropiado de
los microorganismos aerobios, mostrando valores medios de 73,7 ± 3,1 y 78,3 ± 3,7 % de
saturación para los ensayos de biodegradación y control, respectivamente.
En el caso del ensayo de referencia los valores de pH y oxígeno disuelto
estuvieron comprendidos entre 8,3 ± 0,1 y 76,9 ± 13,7 % de saturación, respectivamente.
Los valores medios de temperatura en los ensayos control, referencia y biodegradación con
tensioactivos fueron de 20,0 ± 0,1ºC, 19,9 ± 0,2ºC y 20,0 ± 0,1°C, respectivamente.
A la vista de estos resultados se puede concluir que las condiciones experimentales
durante el proceso de biodegradación del tensioactivo fueron no limitantes para un
desarrollo óptimo de la microbiota responsable de la actividad degradativa.
Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos control, referencia y abiótico
Concentración (mg COD L-1)
En la Figura III.4 se muestra la evolución del carbono orgánico disuelto (COD) en
los ensayos control, referencia (benzoato sódico) y abiótico (HgCl2).
20
15
10
REF1
AB1
CO1
5
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (d)
Figura III.4. Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos control (CO1),
referencia (REF1) y abióticos (AB1) a lo largo del proceso de biodegradación.
Se puede observar como la concentración de COD en el ensayo control permanece
constante a lo largo del experimento, alcanzando valores medios de 0,9 ± 0,7 mg L-1 COD.
III-9
Capítulo 3
Asimismo, los valores de COD en el medio abiótico, en presencia de HgCl2,
permanecen en torno al valor inicial a lo largo del ensayo, mostrando un porcentaje medio
de mineralización del 1,1 ± 0,8 %. Este resultado viene a descartar la contribución de
procesos abióticos tales como adsorción, precipitación, etc. en la eliminación del
tensioactivo DTMAC en los ensayos de biodegradación realizados.
En cuanto al ensayo de referencia, puede observarse como el benzoato sódico es
degradado en una extensión superior al 50% al cabo de 5 días de ensayo, mientras que al
cabo de 9 días el porcentaje de degradación es superior al 90%. Estos valores son acordes a
los hallados por otros autores (Nyholm y Kristensen, 1992; Staples y col., 2001; Perales y
col., 2007) para el mismo sustrato y medio de ensayo (tiempo de vida media comprendido
entre 1 y 7 días), indicando la adecuada actividad de la población microbiana presente en el
medio.
Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos con tensioactivo
-1
Concentración (mg COD L )
En la Figura III.5 se representan los valores de concentración residual de DTMAC
(mg L-1 COD) a lo largo del experimento para los tres ensayos realizados. Los puntos
indican los valores medios experimentales, mientras que las barras de error denotan la
desviación estándar (n=3).
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (d)
Figura III.5. Evolución de la concentración residual de DTMAC (mg COD L-1) en los
ensayos de biodegradación. La línea continua corresponde a la curva obtenida
del ajuste de los valores experimentales a un modelo cinético logístico.
III-10
Sales de alquil trimetil amonio
Se puede observar como la concentración de COD se mantiene prácticamente
constante durante los primeros días de ensayo (fase de latencia) para posteriormente
comenzar el proceso metabólico, alcanzándose porcentajes de mineralización superiores al
55% (8,3 mg L-1 COD) y 91% (1,6 mg L-1 COD) al cabo de unos 28 y 40 días de ensayo,
respectivamente. De acuerdo con la directiva OPPTS 835.3160 “Biodegradabilidad en agua
de mar” (USEPA, 1998), los resultados obtenidos en los ensayos de biodegradabilidad con
DTMAC (más de un 90% de biodegradación al cabo de 40 días de ensayo) manifiestan la
existencia de un potencial para la biodegradación del tensioactivo en el medio acuático
marino.
La presencia de una fase de adaptación de los microorganismos responsables de la
degradación del tensioactivo (fase de latencia, aclimatación o inducción) ha sido también
puesta de manifiesto por diversos autores para otros tensioactivos y medios de ensayo
(Shimp, 1989; Manzano y col., 1998; Perales y col., 1999; Staples y col., 2001; Perales y
col., 2007). Así, Manzano y col. (1998) establecieron que la presencia de esta fase puede
ser debida bien a una baja concentración de microorganismos con capacidad para degradar
el tensioactivo en el medio ó bien a que la microbiota presente en el medio empleado no ha
estado expuesta anteriormente al tensioactivo en cuestión, y por tanto, ha de aclimatar su
sistema enzimático a la nueva fuente de sustrato (inducción enzimática). Otros autores
defienden que este comportamiento puede ser consecuencia del efecto tóxico o
bacteriostático generado por la presencia de altas concentraciones de sustrato sobre las
poblaciones bacterianas presentes en el medio (García y col., 1999). Por otro lado,
Wiggings y Alexander (1988a, 1988b) establecieron como posibles causas, además de las
ya mencionadas, la falta de nutrientes, predación por protozoos ó la mutación de especies.
En nuestro caso, podemos descartar estas últimas como posibles causas del periodo de
aclimatación dado que el medio de ensayo fue previamente enriquecido con un medio de
nutrientes y filtrado (eliminación de protozoos). Además, dado que no se observa una fuerte
variabilidad en el tiempo de latencia entre los diferentes ensayos replicados de
biodegradación podemos considerar que la mutación de especies no tuvo lugar. En
conclusión, la presencia de esta fase de aclimatación puede ser debida a una baja
concentración de microorganismos en el medio, a que la microbiota presente en el medio
empleado no haya estado expuesta anteriormente al tensioactivo DTMAC y/ó al efecto
bacteriostático generado por la presencia del tensioactivo.
Modelización cinética
Los ensayos de biodegradación actuales propuestos por la Organización para la
Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE), así como otros organismos, por ejemplo,
la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA), no recogen un
tratamiento cinético preciso de los datos experimentales; tan sólo se limitan al cálculo,
mediante métodos gráficos, de los parámetros cinéticos tiempo de latencia (tL), t50 (tiempo
III-11
Capítulo 3
transcurrido hasta alcanzar un 50% de biodegradación, sin considerar la fase de latencia) y
tiempo de vida media (t1/2).
Con el fin de conocer la cinética de biodegradación del tensioactivo en el medio
marino, bajo las condiciones ensayadas, y calcular de una manera rigurosa los parámetros
cinéticos tL, t50 y t1/2, se han ajustado los valores experimentales obtenidos a diferentes
modelos cinéticos de consumo de sustrato propuestos por Simkins y Alexander (1984) y
Quiroga y col. (1999).
En la Tabla III.2 se recogen los valores de los parámetros cinéticos y estadísticos
estimados para cada uno de los modelos aplicados. Se puede observar como sólo los
modelos logístico y de Quiroga, Sales y Romero (Q-S-R) muestran un buen ajuste a los
datos experimentales, con coeficientes de determinación (R2) muy próximos a la unidad en
ambos casos (R2 > 0,98). Además, en ambos casos se obtienen parámetros cinéticos con un
coherente significado físico. Sin embargo, el análisis de la chi-cuadrada (χ2) desvela que
sólo en el caso de aplicar un modelo logístico a los resultados experimentales, se obtiene un
valor del parámetro estadístico Q próximo a la unidad (χ2 ~ ν), lo que viene a indicar que
las diferencias aparentes entre los datos experimentales y los datos generados por el modelo
se deben principalmente a fluctuaciones experimentales y no a una falta de ajuste de los
datos experimentales al modelo. Estos resultados indican que el modelo cinético logístico
es el que mejor describe la cinética de mineralización del tensioactivo DTMAC en agua de
mar y bajo las condiciones ensayadas. En la Figura III.5 se representa mediante una línea
continua los valores obtenidos al ajustar los valores experimentales a un modelo cinético
logístico.
Tabla III.2. Parámetros cinéticos y estadísticos correspondientes a los resultados de
biodegradación de DTMAC en agua de mar.
Modelo
Primer-orden
(Simkins y
Alexander, 1984)
Logístico
(Simkins y
Alexander, 1984)
Q-S-R
(Quiroga y col.,
1999)
a
Parámetro cinético
-1
S0 (mg COD L )
24,09 ± 9,82
K1 (d-1)
0,039 ± 0,022
S0 (mg COD L-1)
19,16 ± 2,39
B0 (mg COD L-1)
0,146 ± 0,032
KLg (mg COD L-1 d-1)
0,0094 ± 0,044
S0 (mg COD L-1)
19,03 ± 2,23
Sto (mg COD L-1)
19,10 ± 2,33
Snb (mg COD L-1)
0,957 ± 2,62
μmax (d-1)
0,209 ± 0,087
Datos presentados como valor medio ± DE (n=3)
III-12
Valora
Parámetros estadísticos
R2
χ2
ν
Q
0,80
8642,5
49
0
0,98
55,96
48
0,200
0,98
100,05
47
1,05E-05
Sales de alquil trimetil amonio
A partir de los parámetros cinéticos obtenidos del ajuste del modelo logístico a los
datos experimentales, y al objeto de poder comparar los resultados con los obtenidos por
otros autores, se ha calculado el tiempo de latencia (tL), t50 y el tiempo de vida media (t1/2).
Para ello se emplearon las siguientes ecuaciones cinéticas obtenidas a partir de un modelo
logístico por Perales y col. (2007):
⎡1 ⎛ S
⎞⎤
Ln ⎢ • ⎜⎜ 0 + 10 ⎟⎟⎥
9
B
⎝ 0
⎠⎦
tL = ⎣
K Lg • (S 0 + B0 )
t 50
⎡⎛ 9 • (S 0 + 2 • B 0 ) ⎞⎤
⎟⎟⎥
Ln ⎢⎜⎜
⎣⎢⎝ (S 0 + 10 • B 0 ) ⎠⎦⎥
=
K Lg • (S 0 + B 0 )
t1 / 2 = t 50 + t L
(1)
(2)
(3)
Sustituyendo los valores de los parámetros cinéticos por los obtenidos
anteriormente para el modelo logístico (Tabla III.2), se obtiene un valor medio de tiempo
de latencia (tL) de 15,17 días, un valor de t50 de 11,78 días y un tiempo de vida media (t1/2)
de 26,95 días.
Diversos son los estudios que han abordado la mineralización de las sales de alquil
trimetil amonio en diferentes medios; si bien la mayoría de ellos emplean condiciones
experimentales muy dispares. Como consecuencia, resulta difícil realizar comparaciones
con los resultados mostrados en el presente trabajo. Así, por ejemplo, Madsen (2001) para
el tensioactivo C16TMAC y empleando una concentración inicial de 10 mg L-1 obtuvo un
porcentaje de mineralización del 40% al cabo de 28 días en un medio mineral inoculado.
Por el contrario, Boethling (1984) usando una concentración 1000 veces menor (10 μg L-1)
y otro medio de ensayo (agua de río) obtuvo valores comparables (75% mineralización al
cabo de 21 días). Sin embargo, Larson y Vishon (1983) empleando un medio pre-expuesto
al tensioactivo, hallaron velocidades de degradación 10 veces más bajas (50%
mineralización al cabo de 2,2 días). En el caso de agua de mar, tan sólo se ha encontrado un
estudio llevado a cabo por García y col. (2001), los cuales obtuvieron tiempos de vida
media comprendidos entre 6 y 11 días, usando una concentración de 5 mg L-1 de
tensioactivo y un inóculo de microorganismos. Como conclusión no podemos afirmar que
la velocidad de degradación en el medio marino de estos compuestos sea mayor o menor
que en otros ambientes. Si bien, se puede establecer que los datos obtenidos son análogos a
los encontrados por Boethling (1984) y Madsen (2001), comparables a los obtenidos por
García y col. (2001) en agua de mar inoculada, y muy diferentes a los descritos por Larson
y Vishon (1983) en agua de río aclimatada.
III-13
Capítulo 3
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estándar
Ensayos de toxicidad con microalgas marinas
En la Figura III.6 se muestra la evolución temporal de la concentración neta de
biomasa (densidad óptica neta, DOn = DOt=t – DOt=0) para diferentes concentraciones de
exposición de DTMAC (mg L-1) en los ensayos estándar de toxicidad con microalgas. Se
pueden observar diferentes efectos tóxicos dependiendo de la especie de microalga
ensayada. Así, para las microalgas I. galbana y C. gracilis se observan porcentajes de
inhibición del crecimiento superiores al 15%, incluso para la mínima concentración
ensayada (1 mg DTMAC L-1). Por el contrario, el crecimiento de las microalgas N.
gaditana y T. chuii es inhibido a concentraciones iguales o superiores a 4 y 5 mg DTMAC
L-1, respectivamente. Un caso intermedio es el de la microalga D. salina, la cual presenta
efectos tóxicos a concentraciones iguales o superiores a 2 mg DTMAC L-1. Por otro lado,
podemos observar que el tensioactivo DTMAC muestra efectos letales para todas las
microalgas. En el caso de I. galbana y C. gracilis, se aprecia una mortalidad de los cultivos
(valores negativos de densidad óptica neta) al cabo de 24 horas de ensayo a concentraciones
superiores a 3 mg DTMAC L-1, mientras que la mortalidad de los cultivos N. gaditana, D.
salina y T. chuii tiene lugar a concentraciones superiores de 6 y 8 mg DTMAC L-1,
respectivamente.
III-14
Sales de alquil trimetil amonio
0,6
N. gaditana
0,6
0
2
4
6
8
0,4
10 mg L-1
0,2
I. galbana
0
1
2
3
4
0,5
0,4
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
0,8
0,3
5 mg L-1
0,2
0,1
0,0
0,0
-0,1
-0,2
0
20
40
60
80
-0,2
100
0
20
Tiempo (h)
0,5
60
80
100
80
100
C. gracilis
0
1
2
3
4
0,4
DOn (690 nm)
40
Tiempo (h)
0,3
5 mg L-1
0,2
0,1
0,0
-0,1
0
20
40
60
80
100
Tiempo (h)
1,0
0,6
10 mg L-1
0,4
0,2
0,0
T. chuii
0
5
10
20
30
0,5
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
0,8
0,6
D. salina
0
2
4
6
8
0,4
40 mg L-1
0,3
0,2
0,1
0,0
-0,2
-0,1
0
20
40
60
Tiempo (h)
80
100
0
20
40
60
Tiempo (h)
Figura III.6. Evolución de la concentración neta de biomasa (DOn, 690 nm) en el ensayo
de toxicidad estándar con microalgas. Las barras de error denotan las
desviaciones estándares (n=3).
III-15
Capítulo 3
Los valores medios de las concentraciones de inhibición del crecimiento (IC50),
NOEC (concentración más elevada a la que no se observan efectos adversos) y LOEC
(concentración más baja a la que se observan efectos adversos) calculadas para cada una de
las microalgas ensayadas y un periodo de exposición de 96 horas se recogen en la Tabla
III.3. Se puede observar como los valores de IC50 (inhibición del crecimiento) están
comprendidos entre 0,69 y 6,34 mg DTMAC L-1, dependiendo de la especie. Por otro lado,
los resultados mostrados en la tabla muestran que los valores de NOEC son inferiores a la
mínima concentración ensayada en todos los casos, a excepción de la microalga T. chuii.
De acuerdo con los valores IC50 obtenidos, podemos establecer el siguiente orden de
sensibilidad de las diferentes microalgas al tensioactivo: C. gracilis > I. galbana ≈ D.
salina > N. gaditana > T. chuii, siendo esta última la más tolerante al tensioactivo
catiónico.
Tabla III.3. Valores de IC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estándar
con microalgas marinas y el tensioactivo DTMAC.
Organismo
Efecto tóxico
Concentración (mg L-1)
N. gaditana
96-h IC50
4,01 (3,36-4,55)a
96-h NOEC
3,04b
96-h LOEC
4,06b
96-h IC50
1,45 (1,23-1,61)a
96-h NOEC
< 1,02b
96-h LOEC
1,02b
96-h IC50
0,69 (0,59-0,73)a
96-h NOEC
< 1,02b
96-h LOEC
1,02b
96-h IC50
1,24 (1,16-1,38)a
96-h NOEC
< 2,08b
96-h LOEC
2,08b
96-h IC50
6,34 (5,36-7,33)a
96-h NOEC
< 5,07b
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
96-h LOEC
5,07b
Concentración, valor medio (Intervalo de confianza, 95%)
b
Concentración de efecto basado en concentraciones experimentales
a
Como ya se ha comentado en el apartado de introducción, la bibliografía existente
en torno a la toxicidad de estos compuestos sobre microalgas marinas es muy limitada. Esto
hace que la comparación de los resultados obtenidos en el presente estudio con los
resultados descritos en la bibliografía no resulte sencilla. Tan sólo se han encontrado datos
de toxicidad del tensioactivo C16-18TMAC sobre la especie Dunaliella sp., obteniéndose un
III-16
Sales de alquil trimetil amonio
valor de EC50 (24-h, formación de 13C-Glicerol) de 0.79 mg L-1 (Utsunomiya y col., 1997a).
Como puede apreciarse en la Tabla III.3 los valores obtenidos en los ensayos de toxicidad
con microalgas para DTMAC resultan del mismo orden de magnitud que el obtenido por
Utsunomiya y col. (1997a). Sin embargo, si se comparan los valores obtenidos en el
presente trabajo con los valores de toxicidad descritos para diferentes sales de alquil trimetil
amonio en microalgas de agua dulce, se observan que éstos difieren significativamente en
uno o varios órdenes de magnitud, dependiendo de la especie ensayada. Así, por ejemplo,
Lewis y Hamm (1986) encontraron valores de IC50 (96-h) comprendidos entre 0,03 y 0,2
para las especies S. capricornutum y M. aeruginosa, lo que supone una toxicidad de 10-100
órdenes de magnitud mayor que las encontradas en especies marinas. En un estudio de
toxicidad realizado por Utsunomiya y col. (1997b) sobre la microalga Chlorella
pyrenoidosa se muestran valores de toxicidad ligeramente inferiores (EC50= 0,28 mg L-1)
que los observados en el presente trabajo para las microalgas marinas. Estos resultados
parecen indicar que los efectos tóxicos agudos generados por la presencia de sales de alquil
trimetil amonio son más acusados en especies de microalgas de agua dulce que en especies
marinas. Si bien sería deseable contar con un mayor número de datos para poder afirmar
esta observación.
Ensayos de toxicidad con Artemia franciscana
En este apartado se muestran los resultados de toxicidad obtenidos para el
crustáceo A. franciscana expuesto a concentraciones crecientes de DTMAC. La siguiente
gráfica muestra el porcentaje de supervivientes obtenidos para periodos de exposición de 48
y 72 horas.
A. franciscana
Supervivientes (%)
100
80
60
40
20
48h
72h
0
0
20
40
60
80
100
Concentración (mg L-1)
Figura III.7.Efecto de DTMAC sobre A. franciscana a las 48 y 72 horas de exposición.
Los datos se representan como valor medio ± DE (n=5).
III-17
Capítulo 3
Se puede observar un aumento de la mortalidad de la población de artemias como
consecuencia del efecto tóxico del tensioactivo, alcanzando el valor máximo (100%
mortalidad) a una concentración de DTMAC de 75 mg L-1 tanto a las 48 como a las 72
horas de exposición. Asimismo, se aprecia un aumento de la toxicidad del tensioactivo al
aumentar el periodo de exposición, disminuyendo así el porcentaje de supervivencia. Por
otro lado, cabe destacar que para un periodo de exposición de 48 horas prácticamente no se
observan efectos letales sobre la población de crustáceos a concentraciones inferiores de
30,5 mg DTMAC L-1, mientras que al cabo de 72 horas de exposición el porcentaje de
mortalidad fue inferior al 20% a concentraciones inferiores de 22,5 mg DTMAC L-1. Los
valores de los parámetros de toxicidad LC50 (concentración que produce la mortalidad del
50% de la población), NOEC y LOEC calculados para un periodo de exposición de 48 y 72
horas se recogen en la Tabla III.4.
Tabla III.4. Valores de LC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estándar
con crustáceos y el tensioactivo DTMAC.
Organismo
Efecto tóxico
Concentración (mg L-1)
A. franciscana
48-h LC50
46,74 (44,62-48,87)a
72-h LC50
34,19 (31,89-36,66)a
48-h NOEC
31,5b
48-h LOEC
50,0b
72-h NOEC
22,5b
72-h LOEC
27,0b
Concentración, valor medio (Intervalo de confianza, 95%)
b
Concentración de efecto basado en concentraciones experimentales
a
De manera similar a lo que ocurre con las microalgas marinas, no se han
encontrado en la bibliografía valores de toxicidad de las sales de alquil trimetil amonio
sobre artemias ni otros crustáceos marinos, limitándose los datos de toxicidad hallados en la
bibliografía a especies agua dulce. Sin embargo, si comparamos los valores obtenidos
anteriormente (Tabla III.4) con los aportados por otros autores para diferentes sales de
alquil trimetil amonio y especies de agua dulce se aprecian diferencias significativas entre
ambos. En un estudio llevado a cabo por Lewis y Suprenant (1983) sobre el crustáceo
Gammarus sp. se mostraba un valor de LC50 (48-h) de 0,1 mg L-1. Por otro lado, García y
col. (2001) obtuvieron valores de EC50 (24-h) comprendidos entre 0,13 y 0,38 mg L-1 para
el crustáceo D. magna. Estos resultados parecen indicar que, al igual que ocurre con las
microalgas marinas, los efectos adversos de estos tensioactivos sobre crustáceos marinos
son menos acusados que en especies de agua dulce. No obstante, sería necesario realizar
más ensayos de toxicidad con estos tensioactivos utilizando un mayor número de especies
III-18
Sales de alquil trimetil amonio
tanto de agua dulce como marinas al objeto de obtener un conjunto de datos más
homogéneos y corroborar así esta hipótesis.
3.3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación
El presente apartado tiene como objetivo el estudio de la evolución de la toxicidad
del medio de ensayo a lo largo del proceso degradativo, con el fin de determinar si durante
la biodegradación del tensioactivo se generan metabolitos más tóxicos (en cantidad y/ó
naturaleza) que el tensioactivo original o si por el contrario, el tensioactivo presenta una
biodegradación ambientalmente aceptable, disminuyendo así la toxicidad del medio de
ensayo a medida que es degradado.
En la Figura III.8 se representa la evolución temporal de la toxicidad del medio de
ensayo (% inhibición del crecimiento/mortalidad) y grado de mineralización (%) durante el
ensayo de biodegradación del tensioactivo catiónico DTMAC.
III-19
Capítulo 3
60
60
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
40
20
20
0
0
10
20
30
60
60
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
40
20
20
0
0
40
0
10
Tiempo (días)
100
60
60
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
40
20
20
0
0
10
20
30
Inh. crecimiento, 96-h (%)
80
0
80
60
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
40
20
20
0
0
0
10
40
20
20
0
0
20
30
40
Mortalidad, 72-h (%)
60
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
Biodegradación (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
60
Tiempo (días)
20
30
40
A. franciscana
100
100
80
10
40
Tiempo (días)
80
0
100
80
60
40
T. chuii
40
40
D. salina
Tiempo (días)
100
30
100
Biodegradación (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
80
40
20
Tiempo (días)
C. gracilis
100
40
Biodegradación (%)
0
80
100
80
80
60
60
40
40
LC,72-h (%)
Biodegradación (%)
20
20
0
Biodegradación (%)
40
80
100
Biodegradación (%)
80
I. galbana
100
Inh. crecimiento, 96-h (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
80
100
Biodegradación (%)
N. gaditana
100
0
0
10
20
30
40
Tiempo (días)
Figura III.8. Evolución del efecto tóxico del medio de ensayo (%) y porcentaje de
mineralización (%) durante el experimento de biodegradación de DTMAC.
III-20
Sales de alquil trimetil amonio
Desde un punto de vista teórico, la evolución de la toxicidad del medio durante el
proceso degradativo puede seguir cuatro patrones de comportamiento:
(a) La toxicidad del medio de ensayo disminuye a medida que se degrada el compuesto,
esto es, se produce una detoxificación del medio, lo que viene a indicar que el sustrato
inicial no sólo constituye la única fuente de toxicidad del medio sino que durante su
biodegradación no se están generando metabolitos más tóxicos (en cantidad y/ó
naturaleza) que el compuesto original. En este caso la representación tendría una forma
análoga a la que se muestra en la Figura III.9A.
Efecto tóxico (%)
Biodegradación (%)
Tiempo (días)
Tiempo (días)
D
C
Efecto tóxico (%)
Biodegradación (%)
40
20
0
80
60
Efecto tóxico (%)
Biodegradación (%)
40
20
Biodegradación (%)
80
Efecto tóxico (%)
100
Biodegradación (%)
Efecto tóxico (%)
100
60
Biodegradación (%)
Efecto tóxico (%)
Biodegradación (%)
Efecto tóxico (%)
B
Biodegradación (%)
Efecto tóxico (%)
A
0
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Figura III.9. Curvas modelo de evolución del efecto tóxico del medio de ensayo (%) y
porcentaje de biodegradación final (%) durante el experimento de
biodegradación de un sustrato.
(b) La toxicidad del medio de ensayo aumenta durante la biodegradación del tensioactivo
como consecuencia de la generación de metabolitos más tóxicos que el compuesto
original (Figura III.9B)
III-21
Capítulo 3
(c) La toxicidad inicial del medio de ensayo es inferior al 100% y dicho valor se mantiene
constante durante los primeros estadíos del proceso de biodegradación, lo que vendría
a indicar que se está generando metabolitos de toxicidad similar (en cantidad y
naturaleza) a la del tensioactivo original (Figura III.9C)
(d) La toxicidad inicial del medio de ensayo es del 100% y dicho valor se mantiene
constante, incluso una vez superada la fase de latencia del proceso de biodegradación.
En este caso no podemos garantizar que durante la biodegradación del tensioactivo se
ha producido metabolitos más o menos tóxicos (en cantidad y naturaleza) que el
compuesto original, puesto que partimos del valor máximo de efecto al inicio del
ensayo (Figura III.9D).
Observando los resultados mostrados en la Figura III.8 se puede apreciar que en el caso
de las microalgas N. gaditana, I. galbana, C. gracilis y D. salina la toxicidad inicial del
medio de ensayo (0% biodegradación del DTMAC) fue del 100%, permaneciendo
constante durante los primeros 25-30 días de ensayo (40-70% biodegradación del
DTMAC). Este hecho se debe a la alta sensibilidad que presentan estas especies de
microalgas en comparación con la elevada concentración inicial de tensioactivo empleado
en el ensayo de biodegradación y no nos permite evaluar si durante la biodegradación del
tensioactivo se están generando metabolitos más ó menos tóxicos que el tensioactivo
original (caso D). En el caso de T. chuii y A. franciscana se puede observar una
detoxificación del medio a medida que transcurre la biodegradación del tensioactivo
alcanzando niveles de detoxificación del medio del 90% al cabo de 44 y 36 días,
respectivamente (caso A).
Si consideramos los valores de efectos tóxicos obtenidos cuando se alcanza
aproximadamente un 50% de mineralización del tensioactivo (día 28, 55% de
mineralización) podemos apreciar que éstos varían significativamente dependiendo de la
especie. Así, en el caso de las microalgas I. galbana y C. gracilis el porcentaje de efecto
observado es del 100% mientras que para D. salina resulta ligeramente inferior (90%). Por
el contrario N. gaditana y T. chuii presentan los menores valores de efectos, mostrando
porcentajes de inhibición del crecimiento del 38 y 11%, respectivamente. En el caso del
crustáceo A. franciscana, se puede observar un efecto toxico del 20% al cabo de 28 días de
ensayo (55% biodegradación). A la vista de estos resultados podemos establecer el
siguiente orden de sensibilidad al medio de ensayo: C. gracilis ≈ I. galbana ≈ D. salina >
N. gaditana > T. chuii ≈ A. franciscana, siendo las microalgas C. gracilis, I. galbana y D.
salina las más sensibles. Si comparamos estos resultados con los obtenidos anteriormente
en los ensayos de toxicidad estándar con DTMAC podemos observar que el grado de
sensibilidad de las especies al tensioactivo catiónico es bastante similar a la que presentan
al medio de ensayo, a excepción del crustáceo el cual muestra una sensibilidad ligeramente
III-22
Sales de alquil trimetil amonio
mayor al medio de ensayo. No obstante, estos resultados parecen indicar que el tensioactivo
(y no los metabolitos) constituyen la principal fuente de toxicidad del medio de ensayo.
Atendiendo a los resultados obtenidos por T. chuii y A. franciscana podemos concluir que
durante la biodegradación del tensioactivo se produce una clara detoxificación del medio
sin formación de metabolitos más tóxicos (en cantidad y/ó naturaleza) que el tensioactivo
original y por lo tanto, que el tensioactivo DTMAC presenta una biodegradación
ambientalmente aceptable.
III-23
Capítulo 3
4. Conclusiones
Las principales conclusiones obtenidas en el presente capítulo son las siguientes:
•
El tensioactivo catiónico DTMAC presenta una elevada biodegrabilidad en el medio
acuático marino bajo las condiciones ensayadas, alcanzando porcentajes de
mineralización superiores al 91% al cabo de 40 días de ensayo, lo que viene a indicar
la existencia de un potencial para la biodegradación de estos tensioactivos en el medio
acuático marino.
•
La cinética de biodegradación final o mineralización del tensioactivo catiónico
DTMAC puede ser explicada mediante un modelo cinético logístico, en el que la
concentración residual de sustrato depende exclusivamente de la concentración inicial
de tensioactivo y microorganismos.
•
La toxicidad del tensioactivo catiónico estudiado depende significativamente del
organismo ensayado. Así, de las diferentes especies de microalgas estudiadas, C.
gracilis representa la especie más sensible al tensioactivo. Respecto al crustáceo
marino A. franciscana, a pesar de que los efectos estudiados han sido diferentes a los
de las microalgas, se obtienen valores de toxicidad muy superiores, lo que parece
indicar una mayor resistencia del crustáceo al tensioactivo estudiado.
•
El estudio de la evolución de la toxicidad del medio de ensayo indica que durante el
proceso de biodegradación tiene lugar la detoxificación del medio sin producción de
intermediatos más tóxicos (en cantidad y naturaleza) que el tensioactivo original. Estos
resultados permiten clasificar al DTMAC como un compuesto de biodegradabilidad
ambientalmente aceptable.
III-24
Sales de alquil trimetil amonio
Referencias
Boethling, R.S., 1984. Environmental fate and toxicity in wastewater treatment of quaternary ammonium
surfactants. Water Research 18, 1061-1076.
Boethling, R.S., D.G. Lynch. 1992. Quaternary ammonium surfactants, pp. 145-177. En: N.T. de Oude (ed.),
detergents, The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 3. Parte F. Anthropogenic compounds.
Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Alemania (review).
Dean-Raymond, D., Alexander, M., 1977. Bacterial metabolism of quaternary ammonium compounds. Appl.
Environ. Microbiol. 33, pp. 1037–1041
Games, L.M., King, J.E., Larson, R.J., 1982. Fate and distribution of a quaternary ammonium surfactant,
octadecyltrimethylammonium chloride (OTAC), in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 16,
483-488.
García, M.T., Campos, E., Sanchez-Leal, J., Ribosa, I., 1999. Effect of the alkyl chain length on the anaerobic
biodegradability and toxicity of quaternary ammonium based surfactants. Chemosphere 38, 3473-3483.
García, M.T., Ribosa, I., Guindulain, T., Sanchez-Leal, J., Vives-Rego, J., 2001. Fate and effect of monoalkyl
quaternary ammonium surfactants in the aquatic environment. Environ Pollut 111, 169-175.
Huber, L.H., 1984. Ecological behavior of cationic surfactants from the fabric softeners in the aquatic
environment. JAOCS 61, 377-382.
Huber, L.H., 1987. Ecological behaviour of cationic surfactants from fabric softeners in the aquatic environment.
J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 377-382.
Janicke W, Hilge G, 1979. Biodegradability of anionic/cationic surfactant complexes under aerobic and anaerobic
conditions of waste water and sludge treatment. Tenside Surfact Det 16, 472–482.
Kupfer, W., 1982. Spurenanalytik von kationischen Tensiden unter den speziellen Bedingungen im Wasser und
Abwasser. Tenside Surfactant Deterg 19, 158-161.
Larson, R.J. and Vashon, R.D., 1983. Biodegradation of cationic surfactants in laboratory and environmental
systems. Dev. Ind. Microbiol. 24, 425–434.
Leuwen, K.v., Carla Roghair, C., Nijs, T.d., Greef, J.d., 1992. Ecotoxicological risk evaluation of the cationic
fabric softener DTDMAC. III. Risk assessment. Chemosphere 24, 629-639.
Lewis, M.A., Hamm, B.G., 1986. Environmental modification of the photosynthetic response of lake plankton to
surfactants and significance to a laboratory - field comparison. Water Res. 20, 1575-1582.
Lewis, M.A., Suprenant, D., 1983. Comparative acute toxicities of surfactants to aquatic invertebrates. Ecotoxicol
Environ Saf 7, 313-322.
Mackrell, J. y Walker, J.R.L., 1978. The biodegradation of quaternary ammonium compounds. Int. Biodeterior.
Bull. 14, 77–83.
III-25
Capítulo 3
Madsen, T., Boyd, H.B., Nylén, D., Pedersen, A.R., Petersen, G.I., Simonsen, F., 2001. Environmental and health
assessment of substances in household detergents and cosmetic detergents and cosmetic detergent
products. DK-EPA, Denmark.
Manzano, M.A., Perales, J.A., Sales, D., Quiroga, J.M., 1998. Effect of concentration on the biodegradation of a
nonylphenol polyethoxylate in river water. Bull Environ Contam Toxicol 61, 489-496.
Masuda, F, S. Machida y M. Kanno, 1976. Studies on the biodegradability of some cationic surfactants. En:
Proceeding of the 7th international congress of surface active agents, Moscow, USSR, 129-138.
Nalecz-Jawecki, G., Grabinska-Sota, E., Narkiewicz, P., 2003. The toxicity of cationic surfactants in four
bioassays. Ecotoxicol Environ Saf 54, 87-91.
Nishiyama, N., Toshima, Y., Ikeda, Y., 1995. Biodegradation of alkyltrimethylammonium salts in actived sludge.
Chemosphere 30, 593-603.
Nyholm, N., Kristensen, P., 1992. Screening methods for assessment of biodegradability of chemicals in seawater
results from a ring test. Ecotoxicol Environ Saf 23, 161-172.
Perales, J.A., Manzano, M.A., Sales, D., Quiroga, J.M., 1999. Biodegradation kinetics of LAS in river water.
International Biodeterioration & Biodegradation 43, 155-160.
Perales, J.A., 2001. Variabilidad de la biodegradación y toxicidad de compuestos xenobióticos en el medio
marino. Aplicación a lineal alquilbenceno sulfonatos en aguas del Golfo de Cádiz. Tesis Doctoral. Dpto.
de Ingeniería Química, Tec. Alimentos y Tec. Medio Ambiente. Universidad de Cádiz, Cádiz.
Perales, J.A., Manzano, M.A., Garrido, M.C., Sales, D., Quiroga, J.M., 2007. Biodegradation kinetics of linear
alkylbenzene sulphonates in sea water. Biodegradation 18, 63-70.
Quiroga, J.M., Perales, J.A., Romero, L.I., Sales, D., 1999. Biodegradation kinetics of surfactants in seawater.
Chemosphere 39, 1957-1969.
Scott, M.J., Jones, M.N., 2000. The biodegradation of surfactants in the environment. Biochim Biophys Acta
1508, 235-251.
Shimp, R., 1989. LAS biodegradation in estuaries. Tenside Surfactant Deterg 26, 390-393.
Simkins, S., Alexander, M., 1984. Models for mineralization kinetics with the variables of substrate concentration
and population density. Appl Environ Microbiol 47, 1299-1306.
Singh, R. P., Gupta, N., Singh, S., Singh, A., Suman, R., Annie, K., 2002. Toxicity of ionic and non-ionic
surfactants to six microbes found in Agra, India. Bull Environ Contam Toxicol 69, 265–70.
Staples, C.A., Naylor, C.G., Williams, J.B., Gledhill, W.E., 2001. Ultimate biodegradation of alkylphenol
ethoxylate surfactants and their biodegradation intermediates. Environ Toxicol Chem 20, 2450-2455.
Topping, B.W., Waters, J., 1982. The monitoring of cationic surfactants in sewage treatment plants. Tenside
Surfactant Deterg 19, 164-169.
III-26
Sales de alquil trimetil amonio
USEPA, 1998. Fate, transport and transformation test guidelines. OPPTS. "Biodegradability in Sea Water"
835.3160. EPA 712–C–98–351 The Federal Bulletin Board. U.S. Government Printing Office
Washington, DC.
Utsunomiya, A., Watanukii, T., Matsusi-fita, K., Nishina, M., Tomita, I., 1997a. Assessment of the toxicity of
linear alkylbenzene sulfonate and quaternary alkylammonium chloride by measuring 13C-glycerol in
Dunaliella sp. Chemosphere 35, 2479-2490.
Utsunomiya, A., Watanuki, T., Matsushita, K., Tomita, I., 1997b. Toxic effects of linear alkylbenzene sulfonate,
quaternary alkylammonium chloride and their complexes on Dunaliella sp. and Chlorella pyrenoidosa.
Environ. Toxicol. Chem. 16, 1247-1254.
van de Plassche, E.J., De Bruijn, J.H.M., Stephenson, R.R., Marshall, S.J., Feijtel, T.C.J., Belanger, S.E., 1999.
Predicted no-effect concentrations and risk characterization of four surfactants: linear alkyl benzene
sulfonate, alcohol ethoxylates, alcohol ethoxylated sulfates, and soap. Environmental Toxicology and
Chemistry 18, 2653–2663.
Versteeg, D.J., Feijtel, T.C., Cowanl, C.E., Ward, T.E., Rapaport, R.A., 1992. An environmental risk assessment
for DTDMAC in the Netherlands. Chemosphere 24, 641-662.
Wiggins, B. A., Alexander, M., 1988a. Role of chemical concentration and second carbon sources in acclimation
of microbial communities for biodegradation. Appl. Environ. Microbiol. 54(11), 2803-2807.
Wiggins, B. A., Alexander, M., 1988b. Role of protozzoa in microbial acclimation for mineralization of organic
chemicals in sewage. Can. J. Microbiol. 34, 661-666.
Ying, G.G., 2006. Fate, behavior and effects of surfactants and their degradation products in the environment.
Environ Int 32, 417-431.
III-27
Capítulo 4
NONILFENOLES ETOXILADOS
Resumen
El presente capítulo muestra los resultados obtenidos en los ensayos de
biodegradación, ecotoxicidad y ensayos combinados de toxicidad y biodegradación del
tensioactivo comercial no-iónico Tergitol®NP9, perteneciente a la familia de los
nonilfenoles etoxilados. Los resultados obtenidos indican la existencia de un potencial para
la degradación del tensioactivo en el medio marino, siguiendo la mineralización del
tensioactivo Tergitol®NP9 una cinética de primer orden. En relación a la toxicidad, las
microalgas son más sensibles a la presencia del tensioactivo que el crustáceo A.
franciscana, y dentro de éstas las especies I. galbana y C. gracilis. Los resultados
obtenidos en los ensayos combinados de toxicidad y biodegradación demuestran que el
tensioactivo Tergitol®NP9 no presenta una biodegradación ambientalmente aceptable,
puesto que durante el proceso degradativo la toxicidad del medio de ensayo aumenta debido
a la formación de metabolitos más tóxicos (en cantidad y/ó naturaleza) que el tensioactivo
original.
Capítulo 4
1. Introducción
Nonilfenoles etoxilados. Características y usos
Dentro de la amplia gama de tensioactivos no-iónicos empleados actualmente, los
alquilfenoles etoxilados (APEOs), y en particular los nonilfenoles etoxilados (NPEOs)
constituyen uno de los agentes de superficie más consumidos en el mundo. Los datos más
recientes de producción apuntaron un consumo total de 77.000 toneladas de NPEOs en
Europa occidental para el año 2001 (OSPAR, 2001).
Su estructura química está formada por una cadena alquílica con 9 átomos de
carbono, un grupo aromático y una cadena etoxilada con un número variable de unidades
etoxiladas (Figura IV.1). Convencionalmente, cada NPEO se describe mediante el número
medio de unidades etoxiladas, el cual puede variar entre 1 y 100, aunque generalmente
suele estar comprendida entre 1 y 20 unidades en función de la formulación. En general, a
medida que incrementa la longitud de la cadena etoxilada, su peso específico, viscosidad y
solubilidad en agua también lo hacen, siendo los NPEOs con un número medio de unidades
etoxiladas superior a seis fácilmente solubles en agua.
O
OH
O
n
R
Figura IV.1.
Estructura química del tensioactivos no-iónico nonilfenol etoxilado (R=
CxH2x+1, x= 9; n= 0-19).
Los NPEOs han sido utilizados ampliamente desde hace más de 40 años en
diferentes aplicaciones tanto domésticas como industriales. Tradicionalmente, estos
tensioactivos se han empleado en formulaciones de detergentes domésticos. No obstante,
los NPEOs también desempeñan un papel fundamental en la formulación de determinados
productos utilizados en diversos procesos industriales tales como: procesos de fabricación
de papel, pinturas, resinas y revestimientos de protección, aceros y/ó plaguicidas así como
en proceso de recuperación de aceites y gas, etc.
Niveles de nonilfenoles etoxilados en el medio acuático
Son numerosos los autores que han centrado sus esfuerzos en la monitorización de
los nonilfenoles etoxilados en el medio acuático, incluido el medio marino. Como
consecuencia existe una amplia bibliografía en relación a la presencia de estos tensioactivos
en el medio acuático.
IV-2
Nonilfenoles etoxilados
En aguas continentales, Ahel y col. (1994b) describieron concentraciones máximas
de 45 μg L-1 para NP1EC (ácido nonilfenoxiacético), 71 μg L-1 para NP2EC (ácido
nonilfenoxietoxiacético), 69 μg L-1 para NP1EO (nonilfenol monoetoxilado), 30 μg L-1 para
NP2EO (nonilfenol dietoxilado) y 45 μg L-1 para NP (nonilfenol) en muestras de aguas
procedentes del río Glatt (Suiza), siendo la concentración de ambos grupos (NPEC y
NPEO) generalmente superior a 10 μg L-1. Además, encontraron la presencia de NPEOs
con un número de unidades etoxiladas comprendido entre 3 y 5, aunque a bajas
concentraciones. Por otro lado, estudios realizados en agua de río por el Centro de
Investigación del Agua (Water Research Center, WRc, 1991) describieron concentraciones
de diferentes homólogos de APEOs comprendidas entre 1 y 80 μg L-1. Asimismo, estudios
de monitorización llevados a cabo en diversos ríos en los Estados Unidos observaron
concentraciones del metabolito NP de 2 μg L-1 en el río Delaware (Philadelphia), 10 μg L-1
en el río Rin y 1000 μg L-1 en un afluente del río Savannah (BUA, 1991).
Los estuarios y océanos también se encuentran expuestos a los nonilfenoles
etoxilados y sus metabolitos bien por el aporte de ríos contaminados ó bien debido a
descargas directas de aguas residuales. Así, por ejemplo, Marcomini y col. (1990, 2000)
encontraron diversos nonilfenoles etoxilados en la laguna de Venecia, la cual ha sido
sometida a numerosas descargas de vertidos urbanos e industriales. Los resultados
obtenidos mostraban niveles de NPEOs de 4,5 μg L-1, siendo los oligómeros de entre 5 y 10
unidades etoxiladas los más frecuentes. Por otro lado, Kvestak y col. (1994) examinaron la
distribución de NPEOs en el efluente de una estación depuradora de aguas residuales y en
el estuario del río Krka, un estuario fuertemente estratificado en la región adriática. Los
niveles encontrados en las aguas residuales variaron entre 70 y 2960 μg NPEO L-1, mientras
que en el estuario estuvieron comprendidos entre 1,1 y 6 μg L-1 en el agua salobre y 0,1-0,7
μg L-1 en la capa salina.
Biodegradabilidad de los nonilfenoles etoxilados
La biodegradabilidad de los alquilfenoles etoxilados (APEOs), y en particular de
los nonilfenoles etoxilados (NPEOs), tanto en ensayos en laboratorios con aguas
continentales como en estaciones depuradoras de aguas residuales ha sido objeto de estudio
de diversos autores (Yoshimura, 1986; Maki y col., 1994; Manzano y col., 1998, 1999;
Mann y Boddy, 2000).
La ruta de biodegradación de los NPEOs más aceptada es la propuesta por
Yoshimura (1986), la cual aparece recogida en la Figura IV.2.
IV-3
Capítulo 4
Nonilfenol etoxilado
(NPnEO)
O
OH
O
n
R
Hidrólisis
(mecanismo a)
O
OH
O
n-1
O
Hidrólisis
(mecanismo a)
R
Oxidación
(mecanismo b)
Nonilfenol etoxilado
NP(n-1)EO
O
OH
OH
O
O
O
R
ω-oxidación
(mecanismo c)
Ácido nonilfenoxietoxiacético
NP2EC
R
Nonilfenol dietoxilado
NP2EO
Hidrólisis
(mecanismo a)
O
O
OH
ω-oxidación
(mecasnismo c)
O
OH
R
R
Ácido nonilfenoxiacético
NP1EC
Nonilfenol monoetoxilado
NP1EO
Reducción
(mecanismo b)
OH
Hidrólisis
(mecanismo a)
R
Nonilfenol
NP
Figura IV.2. Rutas de biodegradación de los nonilfenoles etoxilados (Yoshimura, 1986)
(R=C9H19).
La biodegradación primaria consiste, primeramente, en un ataque hidrolítico sobre
los grupos etoxilados de la cadena polietoxilada dando lugar a NPEOs de cadena más corta
(mecanismo a; Swisher, 1987), que puede conllevar a la producción de metabolitos tales
IV-4
Nonilfenoles etoxilados
como nonilfenol dietoxilado (NP2EO) y monoetoxilado (NP1EO) y/ó nonilfenol (NP); si
bien este último sólo ha sido observado en condiciones anaerobias (Ahel y Giger, 1994a).
Por otro lado, Swisher (1987) propuso la carboxilación del grupo alcohol terminal
de la cadena polietoxilada como otra de las posibles rutas de biodegradación (mecanismo
b). Sin embargo, otros autores establecen que esta carboxilación sólo es dominante después
del acortamiento de la cadena etoxilada a una o dos unidades etoxiladas (mecanismo c;
Ahel y col., 1987; Ball y col., 1989).
Rudling y Solyom (1974) y Maki y col (1994) propusieron la formación de
NP2EC y NP1EC a partir de NPEO de cadena etoxilada corta (mecanismo b) bajo
condiciones aerobias, mientras que la formación de NP2EO y NP1EO tendrían lugar bajo
condiciones anaerobias (mecanismo a). Por otro lado, no contemplan la transformación de
NP2EO y NP1EO a NP2EC y NP1EO, respectivamente, tal y como propone Yoshimura
(1986).
Otra posible reacción consiste en la oxidación de la cadena alquílica, cuya
existencia ha sido puesta de manifiesto por diversos autores (Osburn y Benedict, 1966).
Schobert y col. (1981) encontraron alquilfenol dietoxilado con grupos carboxílicos en la
parte hidrófoba en mayor proporción que el compuesto sin oxidar. Pese a este resultado, no
parece ser un mecanismo principal de degradación debido al grado de ramificación que
suele presentar la cadena alquílica.
La degradación total implica la completa mineralización de la estructura aromática
de los NP/ NPEC (Swisher, 1987), aunque la mayoría de los estudios indican que mientras
que la biodegradación primaria parece ser particularmente rápida (pérdida de las unidades
etoxiladas), la metabolización de los biointermediatos NP, NP1EO, NP2EO, NP3EO y
carboxilados NP1EC y NP2EC resulta extremadamente lenta (Talmage, 1994; Field y
Reed, 1996; Potter y col., 1999; Staples y col., 1999).
La biodegradabilidad de los NPEOs viene determinada principalmente por la
estructura de la cadena alquílica, obteniéndose porcentajes de biodegradación y velocidades
de degradación menores en el caso de cadenas alquílicas ramificadas (Kravetz, 1990). La
posición del anillo bencénico en la cadena alquílica también influye en la velocidad de
degradación. Así, los NPEOs en los que la unión del grupo aromático a la cadena alquílica
tiene lugar en el carbono primario, presentan velocidades de biodegradación mayores
(Little, 1977). Otro factor determinante en la velocidad de degradación de los NPEOs
consiste en el número de unidades etoxiladas, obteniéndose velocidades de degradación
menores a medida que aumenta el número de unidades etoxiladas (Little, 1977; Sivak y
col., 1982).
IV-5
Capítulo 4
Toxicidad de los nonilfenoles etoxilados en el medio acuático
Como se ha podido apreciar en el apartado anterior, la ruta metabólica de los
NPEOs conduce a la formación de biointermediatos, muchos de los cuales resultan ser
persistentes, y más tóxicos que el compuesto original (Naylor y col., 1992; Jobling y
Sumpter, 1993; Ahel y col., 1994a; White y col., 1994; Ahel y col., 1996). Estos
metabolitos pueden ser hidrófobos, como es el caso de NP, NP1EO y NP2EO (Giger y col.,
1984; Ahel y Giger, 1985; Brown, 1988) o hidrófilos, NP1EC y NP2EC (Giger y col.,
1984; Ahel y col., 1987). Estudios realizados sobre diversas especies de peces encontraron
una mayor toxicidad de estos metabolitos (NP1EO, NP2EO, NP1EC, NP2EC y NP) sobre
peces de agua dulce (Yoshimura, 1986) y estuáricos (Hall y col., 1989) que el tensioactivo
original. Por otro lado, Kravetz y col. (1991) y Maguire (1999) demostraron que la
persistencia de estos compuestos es mayor que la de otros tensioactivos tales como lineal
alquilbenceno sulfonatos (LAS) y alcoholes etoxilados (AE). Además, estudios llevados a
cabo por diversos autores han demostrado que algunos de estos metabolitos tales como los
NP exhiben efectos estrogénicos (Jobling y Sumpter, 1993; White y col., 1994).
Debido a la elevada capacidad de bioacumulación en organismos (Ekelund y col.,
1990), persistencia en el medio, y toxicidad, se han llevado a cabo, en diversos países,
diferentes medidas para limitar el uso de estos tensioactivos. Así, por ejemplo, en la
Directiva 60/2000/CE, Marco de Aguas, de la Comunidad Europea se han incorporado los
metabolitos 4-para-nonilfenol y para-ter-octilfenol a la lista de sustancias prioritarias (UE,
2001). Además, existen otros acuerdos nacionales e internacionales que restringen la
utilización de los nonilfenoles y nonilfenoles etoxilados tales como: Recomendación
PARCOM 92/8 (resultado de la Convención OSPAR para la Protección del Medio Marino
del Nordeste atlántico) sobre Nonilfenoles Etoxilados (PARCOM, 2002), el Reglamento
793/93/CE sobre la evaluación y control de sustancias existentes (CE, 1993), el programa
“Existing Chemicals Programme” de la OCDE (Organización para la Cooperación y el
Desarrollo Económico) (OECD, 1987), etc.
De manera general, la toxicidad de los nonilfenoles etoxilados incrementa a
medida que lo hace la longitud de la cadena alquílica (McLeese y col., 1981). Este hecho
también ha sido observado por Hall y col. (1989) en ensayos de toxicidad sobre el camarón
(Mysidopsis bahia) mostrando valores de LC50 (48-h) de 0,9-2 mg L-1 para el tensioactivo
NP9EO, 2,5 mg L-1 para NP15EO y >100 mg L-1 para NP40EO y NP50EO. Por otro lado,
estudios llevados a cabo por Yoshimura (1986) han puesto de manifiesto la disminución de
la toxicidad de estos tensioactivos a medida que aumenta el número de unidades etoxiladas.
En la actualidad, la bibliografía existente en torno a la toxicidad de NPEOs en
organismos marinos es relativamente escasa, en comparación con los estudios realizados
con organismos de agua dulce. En el caso de microalgas marinas, tan sólo se han
IV-6
Nonilfenoles etoxilados
encontrado dos referencias bibliográficas, siendo los valores obtenidos muy dispares.
Ukeles (1965) estudió el efecto de estos tensioactivos sobre doce especies de microalgas
marinas, mostrando una inhibición total del crecimiento a concentraciones superiores a 100
mg L-1 para una serie de NPEOs comerciales ramificados (Igepal). Por otro lado, Moreno y
col. (2001) encontraron un valor de IC50 de 1,0 mg L-1 para el tensioactivo NP10EO y la
microalga C. gracilis. Respecto a la toxicidad en crustáceos marinos, Hall y col. (1989) y
Patoczka y Pulliam (1990) encontraron valores similares de efectos tóxicos sobre el
camarón (Mysidopsis bahia) y el tensioactivo NP9EO, con valores de LC50 (48-h) de 0,9-2
y 1,23 mg L-1, mientras que estudios posteriores llevados a cabo por Dorn y col. (1993)
mostraron valores muy superiores (LC50= 12-50 mg L-1 NP9EO) para un periodo de
exposición de 96-h y el mismo organismo.
En el caso de microalgas de agua dulce, los valores de toxicidad encontrados en la
bibliografía para el tensioactivo NP9EO suelen oscilar entre 12 y 50 mg L-1 (Lewis, 1986;
Dorn y col., 1993). Respecto a la toxicidad en invertebrados en agua dulce, la bibliografía
descrita en relación a la toxicidad de estos tensioactivos es muy extensa, encontrándose una
gran variabilidad de los valores de toxicidad en función del tensioactivo y especie
ensayada. Así, se han descrito valores de EC50 comprendidos entre 19,3 y >100 mg L-1 para
el tensioactivo NP12EO (Portmann y Wilson, 1971; van Emden y col., 1974; Waldock y
Thain, 1991) y superiores a 10 mg L-1 para NP10EO (Swedmark y col., 1971, 1976) sobre
diferentes especies de crustáceos y moluscos. Para el tensioactivo NP9EO, se han
observado diferencias significativas en el grado de sensibilidad de los crustáceos Daphnia
sp. Mientras que para la especie Daphnia magna los valores de LC50 (48-h) descritos en la
bibliografía son de 14 mg L-1 para NP9EO (Kravetz y col., 1991; Naylor, 1995), para la
especie Daphnia pulex estos valores resultan ligeramente inferiores, mostrando una LC50
(48-h) de 2,9 mg L-1 (Salanitro y col., 1988). Asimismo, se ha observado una elevada
toxicidad de los metabolitos NP1EO y NP2EO con valores de LC50 (24-h) de 0,39 y 0,56
mg L-1, respectivamente (Sun y col., 2005). Por otro lado, un estudio realizado por Isidoro
y col. (2006) mostraba valores de EC50 (48-h, movilidad) comprendidos entre 0,07 y 10 mg
L-1 sobre el crustáceo Ceriodaphnia dubia.
Respecto a la toxicidad de estos tensioactivos sobre peces de agua dulce, se han
encontrado efectos tóxicos letales (LC50, 96-h) sobre el pez carpa (Pimephales promelas) a
concentraciones comprendidas entre 1,6 y 46 mg L-1 NP9EO (OECD, 1997; Dorn y col.,
1993; Talmage, 1994) mientras que para las carpas Carassius auratus y Leuciscus idus los
valores de toxicidad descritos (LC50, 48-h) son de 18 y 7 mg L-1 NP9EO, respectivamente
(OECD, 1997).
IV-7
Capítulo 4
2. Materiales
A continuación se detallan las principales características físico-químicas del
tensioactivo ensayado así como del medio empleado en los ensayos de biodegradación y
toxicidad.
Tensioactivo ensayado
El tensioactivo no-iónico estudiado consistió en un nonilfenol etoxilado
comercialmente conocido como Tergitol®NP9 ó IGEPAL CO-630, CAS 127087-87-0, y
fue suministrado por Fluka Chemie A.G. (Barcelona). Concretamente se trata de un
poli(oxi-1,2-etanodiol),α-(4-nonilfenil)-ω–hidroxi, con fórmula empírica C33H60O10. El
tensioactivo posee una cadena alquílica ramificada de 9 átomos de carbono y está formado
por una mezcla de homólogos de diferente longitud de cadena etoxilada, con un grado
medio de etoxilación de 9,3. Es soluble en agua, posee un peso molecular de 616 g mol-1 y
una pureza del 99,7% de materia activa.
Medio de ensayo
En la Tabla IV.1 se recogen las principales características físico-químicas y
biológicas del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradación y toxicidad. Dado
que las muestras de agua de mar fueron tomadas en el mismo punto que en el estudio
anterior (capítulo 3, apartado 2), los valores obtenidos para los distintos parámetros son
muy similares a los obtenidos con el tensioactivo DTMAC. De manera análoga al estudio
anterior, podemos concluir que se trata de un agua de excelente calidad correspondiente a
una zona costera muy poco antropizada.
Tabla IV.1. Características del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradación y
toxicidad del tensioactivo no-iónico Tergitol®NP9 (valor medio ± desviación
estándar, n=3).
Parámetro
Unidades
Valor
Parámetro
Unidades
Oxígeno disuelto
% saturación
91,4 ± 1,2
Nitrato
mg L-1 NO3-
< 0,020
Temperatura
ºC
19,5 ± 0,3
Amonio
mg L-1 NH4+
< 0,007
Conductividad
mS cm-1
35,6 ± 0,2
Fosfato
mg L-1 PO43-
< 0,015
pH
-
8,10 ± 0,04
Silicato
mg L-1 Si
0,018 ± 0,002
Salinidad
-
36,8 ± 0,4
Dureza total
mg L-1 Ca2+
320 ± 20
Carbono Total
mg L-1 C
27,4 ± 0,5
Clorofila a
mg m-3 Cl a
0,85 ± 0,10
26,2 ± 0,5
Estreptococos fecales
UFC 100mL-1
1,0 ± 1,5
1,17 ± 0,02
Coliformes fecales
UFC 100mL-1
No detectado
-1
No detectado
-1
Carbono inorgánico
mg L C
Carbono orgánico
mg L-1 C
Nitrito
IV-8
-1
mg L NO2
-
< 0,015
Enterococos
UFC 100mL
Valor
Nonilfenoles etoxilados
3. Resultados y discusión
3.1. Ensayos de biodegradación
Parámetros de control
En la Figura IV.3 se representa la evolución de los parámetros de control pH y
oxígeno disuelto en los ensayos de biodegradación (N1, N2 y N3) y en el control (CO2).
Como puede observarse en dicha figura los valores de pH sin presencia de substrato
(ensayo control) oscilan entre 8 y 8,3 presentando un valor medio de 8,2 ± 0,1 (valor medio
± DE). Para todos los demás ensayos de biodegradación se obtiene un comportamiento
similar al ensayo control, con un valor medio de 8,25 ± 0,1.
100
O2 (%saturación)
8,4
pH
8,2
8,0
7,8
CO2
N1
N2
N3
7,6
80
60
40
CO2
N1
N2
N3
20
0
0
10
20
30
Tiempo (d)
40
50
0
10
20
30
40
50
Tiempo (d)
Figura IV.3. Evolución del pH y oxígeno disuelto en el ensayo control (CO2) y los
ensayos de biodegradación con NPEO (N1, N2 y N3).
Respecto a la concentración de oxígeno disuelto, se puede apreciar en la Figura
IV.3 como los valores de oxigeno disuelto, tanto en el ensayo control como en los ensayos
de biodegradación, fueron prácticamente constantes a lo largo del experimento, mostrando
porcentajes medios de saturación del 76,1 ± 2,6 y 77,2 ± 0,5 %, respectivamente
En el caso del ensayo de referencia, los valores de pH y oxígeno disuelto se
encuentran comprendidos entre 8,1 ± 0,1 y 77,8 ± 9.51 % de saturación, respectivamente.
Los valores medios de temperatura en los ensayos de biodegradación, ensayo referencia y
control fueron de 18,1 ± 0,1ºC, 18,5 ± 0,9 ºC, y 18,46 ± 0,2°C, respectivamente.
IV-9
Capítulo 4
A la vista de estos resultados podemos afirmar que durante el experimento de
biodegradación las condiciones de pH, oxígeno y temperatura fueron no limitantes para el
desarrollo de la microbiota responsable de la actividad degradativa y, por tanto, de la
mineralización del substrato ensayado.
Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos control, referencia y abiótico
Concentración (mg COD L-1)
En la Figura IV.4 se muestran la evolución del carbono orgánico disuelto (COD) en
los ensayos control, referencia (benzoato sódico) y abiótico (HgCl2).
REF2
AB2
CO2
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (d)
Figura IV.4. Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos control (CO2),
referencia (REF2) y abiótico (AB2) a lo largo del proceso de
biodegradación.
Tal y como se muestra en la Figura IV.4 el contenido de carbono orgánico disuelto
(mg L-1) en los ensayos control y abiótico permaneció prácticamente constante a lo largo
del experimento, con valores medios de COD de 1,6 ± 0,6 mg L-1 y 12,5 ± 0,6 mg L-1,
respectivamente. En el caso del ensayo abiótico (con presencia de HgCl2), se alcanzó un
porcentaje medio de mineralización del tensioactivo del 1,7 ± 2,7 %, por lo que parece que
los procesos abióticos tales como adsorción, precipitación, etc. no contribuyen en la
eliminación del tensioactivo.
En el caso del ensayo referencia, la Figura IV.4 muestra como la concentración de
carbono orgánico disuelto disminuye drásticamente durante los primeros 9 días de ensayo,
siendo degradado en una extensión superior al 50% al cabo de 5 días de ensayo; si bien el
IV-10
Nonilfenoles etoxilados
benzoato sódico fue degradado en un porcentaje superior al 85% al cabo de 9 días. Estos
valores están en consonancia con los descritos por diversos autores para el mismo sustrato
(Nyholm y Kristensen, 1992; Staples y col., 2001; Perales y col., 2007), lo que viene a
indicar la adecuada actividad de la población microbiana presente en el medio de ensayo.
Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos con tensioactivo
-1
Concentración (mg COD L )
En la Figura IV.5 se recoge la evolución de la concentración de carbono orgánico
disuelto (mg COD L-1) a lo largo del experimento de biodegradación del tensioactivo noiónico Tergitol®NP9.
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (d)
Figura IV.5. Evolución del carbono orgánico disuelto (mg COD L-1) durante la
biodegradación del tensioactivo Tergitol®NP9 para los tres ensayos de
biodegradación con tensioactivos. Los datos experimentales se expresan como
el valor medio ± DE (n=3). La línea continua corresponde a la curva obtenida
del ajuste de los valores experimentales a un modelo cinético de primer orden.
La Figura IV.5 muestra una disminución de la concentración de COD a lo largo
del experimento, alcanzando valores de 5,2 mg L-1 COD (55% de mineralización) y 2,4 mg
L-1 COD (80% de mineralización) al cabo de 29 y 53 días de ensayo, respectivamente.
Atendiendo al criterio establecido por la directriz OPPTS 835.3160 “Biodegradabilidad en
agua de mar” (USEPA, 1998), estos resultados (porcentaje de biodegradación superior al
70% en un tiempo inferior a 60 días) ponen de manifiesto la existencia de un potencial para
la biodegradación del tensioactivo en el medio acuático marino.
Cabe destacar la ausencia de una fase de aclimatación o adaptación de la población
microbiana a la nueva fuente de sustrato. Ensayos de biodegradación del nonilfenol
IV-11
Capítulo 4
etoxilado NP15EO en agua de río prístina también han mostrado una fase de adaptación
muy corta o casi inexistente (tiempo de latencia entre 1 y 3 días), sugiriendo como posibles
causas la presencia en el medio de una significativa concentración de microorganismos
capaces de degradar primariamente (hidrólisis) el tensioactivo (Manzano y col., 1998). Por
el contrario, estudios llevados a cabo por Perales y col. (2007) en el que empleaba como
medio de ensayo agua de mar de la misma procedencia que la empleada en el presente
trabajo, obtuvieron una importante fase de aclimatación (tiempo de latencia entre 6,06 y
7,27 días) para la biodegradación primaria del tensioactivo aniónico lineal alquil benceno
sulfonato (LAS). Si comparamos los resultados obtenidos por Perales y col. (2007) con los
resultados hallados en el presente trabajo, ambos con la misma matriz, observamos
diferencias significativas en la fase de aclimatación del proceso de degradación. Estas
diferencias pueden ser atribuidas a las características de las enzimas responsables de la
biodegradación del tensioactivo. En el caso del tensioactivo aniónico LAS, el mecanismo
inicial de biodegradación consiste en el acortamiento de la cadena alquílica mediante ω- y
β-oxidaciones llevadas a cabo por enzimas oxidativas tales como alcano monooxigenasa y
dehidrogenasa (Scott y Jones, 2000). Por el contrario, durante la etapa inicial de
biodegradación de los NPEOs tiene lugar la ruptura hidrolítica de la cadena etoxilada dando
lugar a NPEOs de cadena más corta. Esta ruptura tiene lugar gracias a enzimas hidrolíticas,
las cuales podrían ser más frecuentes en el sistema enzimático de la microbiota natural o
bien ser sintetizadas más rápidamente que las correspondientes enzimas oxidativas.
Modelización cinética
Al objeto de conocer la cinética de mineralización del Tergitol®NP9 en agua de
mar, los valores experimentales de concentración en el tiempo se ajustaron a diferentes
modelos cinéticos. En la Tabla IV.2 se recogen los valores de los parámetros cinéticos y
estadísticos calculados para los diferentes modelos cinéticos aplicados.
Se puede apreciar, en un primer análisis, que todos los modelos cinéticos presentan
un buen ajuste a los datos experimentales (R2 = 0,97). Sin embargo, un análisis más
detallado demuestra que sólo en el caso de aplicar un modelo cinético de primer orden se
obtienen parámetros cinéticos con un significado físico coherente. Así, por ejemplo, en el
caso del modelo logístico se obtiene un valor de B0 (cantidad de sustrato necesaria para
producir la concentración inicial de microorganismos) injustificablemente alto en
comparación con los obtenidos por otros autores. A modo de ejemplo, Perales y col. (2007),
para el tensioactivo LAS y empleando el mismo medio de ensayo que el presente estudio,
estimaron valores de B0 comprendidos 0,267 y 0,565 mg LAS L-1. Por otro lado, para el
tensioactivo DTMAC el valor de B0 obtenido en el presente estudio ha sido de 0,146 mg
COD L-1 (ver capítulo 3, apartado 3). En el caso del modelo cinético de Quiroga, Sales y
Romero se puede apreciar que el valor calculado para el parámetro Sto (concentración
inicial de tensioactivo) es muy superior a la concentración real empleada en los ensayos.
IV-12
Nonilfenoles etoxilados
Por otro lado, el análisis de la chi-cuadrada (χ2) muestra que solamente en el caso del
modelo de primer orden, los valores del parámetro Q (probabilidad de que la chi-cuadrado
exceda al azar un determinado valor χ2 teórico) alcanza el valor más próximo a la unidad (Q
= 0,338), indicando que las diferencias aparentes entre los datos experimentales y teóricos
se deben probablemente a fluctuaciones casuales y no a una falta de ajuste de los datos
experimentales al modelo (véase capítulo 2, apartado 3). A la vista de los resultados
obtenidos, podemos concluir que el modelo que mejor describe la cinética de
mineralización del tensioactivo Tergitol®NP9 en agua de mar bajo las condiciones
estudiadas es el modelo de primer orden, descrito por Simkins y Alexander (1984). Los
valores teóricos de concentración de COD en el tiempo obtenidos a partir del modelo
cinético de primer orden se representan mediante línea continua en la Figura IV.5.
Tabla IV.2. Parámetros cinéticos y estadísticos correspondientes a los resultados de
biodegradación del Tergitol®NP9 en agua de mar.
Modelo
Primer-orden
(Simkins y
Alexander, 1984)
Logístico
(Simkins y
Alexander, 1984)
Q-S-R
(Quiroga y col.,
1999)
a
Valor a
Parámetro cinético
-1
S0 (mg COD L )
11,91 ± 1,28
K1 (d-1)
0,03 ± 0,006
S0 (mg COD L-1)
11,82 ± 2,12
B0 (mg COD L-1)
131,6 ± 605,1
KLg (mg COD L-1 d-1)
0,0002 ± 0,001
S0 (mg COD L-1)
21,74 ± 92,35
-1
Sto (mg COD L )
15200 ± 20E+06
Snb (mg COD L-1)
1,23 ± 8,13
μmax (d-1)
0,050 ± 0,147
Parámetros estadísticos
R2
χ2
ν
Q
0,97
21,07
10
0,338
0,97
179,5
9
6,40E-34
0,97
105,02
8
3,98E-19
Datos presentados como valor medio ± DE (n=3)
Una vez seleccionado el modelo cinético que mejor describe la mineralización del
tensioactivo en el medio marino, se procede a calcular el tiempo de latencia (tL), t50 (el
tiempo necesario para alcanzar un 50% de biodegradación, sin considerar el tiempo de
latencia), y el tiempo de vida media (t1/2). Sustituyendo los valores obtenidos anteriormente
para el modelo cinético de primer orden en las ecuaciones (1), (2) y (3), obtenidas a partir
del modelo de primer orden por Perales y col. (2007), obtenemos un valor medio de tiempo
de latencia (tL), t50 y tiempo de vida media (t1/2) de 3,51, 19,59 y 23,10 días,
respectivamente.
tL = −
Ln(0.9)
K1
(1)
IV-13
Capítulo 4
t 50 =
Ln(0.9 / 0.5)
K1
t1 / 2 = t 50 + t L
(2)
(3)
La bibliografía encontrada acerca de la biodegradación de los nonilfenoles etoxilados
en diferentes medios de ensayos (agua de río, agua estuáricas, lodos activos y sedimento)
muestra un amplio intervalo de velocidades de biodegradación. Así, por ejemplo, Staples y
col. (2001), estudiando la mineralización del tensioactivo NP9EO en un sistema de lodos
activos, mostraron valores de tiempo de vida media comprendidos entre 7 y 13,6 días,
empleando una concentración inicial de 10 mg L-1, mientras que en sedimento y agua de
río, los tiempos de vida media fueron de 18,2 y 18,6 días, respectivamente. En el caso de
agua de río, Manzano y col. (1998) encontraron porcentajes de mineralización
comprendidos entre el 30 y 70% al cabo de 30 días para el tensioactivo NP15EO y una
concentración inicial de 5 mg L-1. Similares porcentajes de mineralización han sido
obtenidos por Potter y col. (1999) en aguas estuáricas al cabo de 183 días de ensayos; si
bien el proceso de biodegradación primaria se completó al cabo de 24 días. Por el contrario,
estudios llevados a cabo por Jonker y col. (2001) en agua de río mostraron valores de
velocidad de degradación primaria más rápida, con porcentajes del 99% al cabo de 4 días
de ensayos. Estos valores están en consonancia con los obtenidos por Yoshimura (1986), el
cual describió un tiempo de vida media para la degradación primaria de un NPEO de 4 días
en agua de río y 10 días en sedimentos.
Si comparamos los valores obtenidos en el presente apartado con los valores
descritos anteriormente, observamos que difieren significativamente. Estas diferencias
pueden ser debidas a la concentración inicial de tensioactivo empleada, al tipo de
biodegradación medida (primaria o final) y/o a la estructura química del NPEO (longitud y
ramificación de cadena alquílica y número de unidades etoxiladas). No obstante, a pesar de
estas diferencias, los valores obtenidos en el presente estudio, son comparables a los
obtenidos por Staples y col. (2001) y Manzano y col. (1998) en agua de río.
IV-14
Nonilfenoles etoxilados
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estándar
Ensayos de toxicidad con microalgas marinas
En la Figura IV.6 se muestra la evolución temporal de la concentración neta de
biomasa (densidad óptica neta, DOn = DOt=t – DOt=0) para diferentes concentraciones de
exposición de Tergitol®NP9 (mg L-1).
En todas las microalgas ensayadas se observan efectos tóxicos sobre el crecimiento
de los cultivos, aunque a diferentes concentraciones de ensayo. En el caso de las microalgas
I. galbana y C. gracilis se aprecian efectos inhibitorios a concentraciones superiores a 3 mg
L-1 Tergitol®NP9 al cabo de 24 horas de exposición. Por otro lado, para concentraciones
iguales o superiores a 4 mg L-1 las microalgas N. gaditana y T. chuii muestran una drástica
disminución del crecimiento al cabo de 24 y 48 horas, respectivamente. Asimismo, se
puede observar como en algunos casos no sólo ha tenido lugar una inhibición del
crecimiento sino un descenso de la concentración inicial de biomasa (mortalidad). En el
caso de las microalgas N. gaditana, I. galbana y C. gracilis esta mortalidad tiene lugar a
concentraciones superiores a 8 mg L-1 tras 24 horas de exposición. Por el contrario, las
microalgas D. salina y T. chuii mostraron efectos letales sólo durante la primera etapa de
exposición (24 horas) y a concentraciones superiores a 14 y 20 mg L-1, respectivamente.
Transcurrido este periodo, se observa una recuperación de los cultivos, incluso a la
concentración más alta de tensioactivo estudiada.
IV-15
Capítulo 4
0,8
0,4
10 mg L-1
0,2
I. galbana
0
3
4
6
8
0,5
0,4
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
0,6
0,6
N. gaditana
0
2
4
6
8
0,3
10 mg L-1
0,2
0,1
0,0
0,0
-0,1
-0,2
-0,2
0
20
40
60
80
100
0
20
Tiempo (h)
0,6
60
80
100
80
100
C. gracilis
0
1
3
5
7
0,5
DOn (690 nm)
40
Tiempo (h)
0,4
0,3
9 mg L-1
0,2
0,1
0,0
-0,1
-0,2
0
20
40
60
80
100
Tiempo (h)
1,0
0,6
16 mg L-1
0,4
0,2
T. chuii
0
4
20
40
60
0,6
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
0,8
0,8
D. salina
0
4
8
10
14
0,4
90 mg L-1
0,2
0,0
0,0
-0,2
-0,2
0
20
40
60
Tiempo (h)
80
100
0
20
40
60
Tiempo (h)
Figura IV.6. Evolución de la concentración neta de biomasa (DOn, 690 nm) en el ensayo de
toxicidad estándar con microalgas. Las barras de error denotan las
desviaciones estándares (n=3).
IV-16
Nonilfenoles etoxilados
Los valores de las concentraciones de inhibición del crecimiento (IC50), NOEC y LOEC
calculadas para cada una de las microalgas ensayadas y un periodo de exposición de 96
horas se reflejan en la Tabla IV.3.
Tabla IV.3. Valores de IC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estándar
con microalgas marinas y el tensioactivo Tergitol®NP9.
Organismo
Efecto
Concentración (mg L-1)
N. gaditana
96-h IC50
5,41 (4,99-5,73)a
96-h NOEC
2,92b
96-h LOEC
3,99b
96-h IC50
4,57 (4,32-4,84)a
96-h NOEC
2,12b
96-h LOEC
2,92b
96-h IC50
3,45 (2,79-4,87)a
96-h NOEC
2,12b
96-h LOEC
2,92b
96-h IC50
13,95 (11,25-15,06)a
96-h NOEC
7,98b
96-h LOEC
10,1b
96-h IC50
25,82 (22,76-29,84)a
96-h NOEC
< 4,72b
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
96-h LOEC
4,72b
Concentración, valor medio (Intervalo de confianza, 95%)
b
Concentración de efecto basado en concentraciones experimentales
a
Tal y como se muestra en la Tabla IV.3, los valores de IC50 se encuentran
comprendidos entre 3,45 mg L-1 para el caso de C. gracilis y 13,95 mg L-1 para la
microalga T. chuii. Por otro lado, se puede observar como los valores NOEC varían entre
2,12 mg L-1 para I. galbana y C. gracilis y 7,98 mg L-1 para la microalga D. salina. De
acuerdo con los valores IC50 obtenidos, podemos establecer el siguiente orden de
sensibilidad de las diferentes microalgas al Tergitol®NP9: C. gracilis ≈ I. galbana > N.
gaditana > D. salina > T. chuii, siendo esta última la más tolerante.
Estos resultados son comparables a los encontrados por otros autores (Moreno y col.,
2001) para NP10EO y la microalga marina C. gracilis (IC50= 1 mg L-1); si bien la menor
toxicidad puede ser debida a la mayor longitud de cadena etoxilada que presenta el
tensioactivo. En relación con especies de agua dulce, se obtienen órdenes de magnitud
similares a los obtenidos con otras especies. Así, por ejemplo, para el homólogo de NPEO
IV-17
Capítulo 4
de longitud de cadena etoxilada de 9 unidades etoxiladas (NP9EO), los valores de EC50 (96h) oscilan entre 12 y 50 mg L-1 para la microalga Selenastrum capricornutum (Lewis, 1986;
Dorn y col., 1993).
Ensayos de toxicidad con Artemia franciscana
En el presente apartado se muestran los resultados de toxicidad obtenidos para el
crustáceo A. franciscana expuesto a crecientes concentraciones de Tergitol®NP9. La Figura
IV.7 recoge el porcentaje de supervivientes obtenidos para periodos de exposición de 48 y
72 horas.
A. franciscana
Supervivientes (%)
100
80
60
40
20
48h
72h
0
0
20
40
60
80
100
Concentración (mg L-1)
Figura IV.7. Efecto del Tergitol®NP9 sobre A. franciscana a las 48 y 72 horas de
exposición. Los datos se representan como valor medio ± DE (n=5).
Se puede observar un aumento del efecto tóxico a medida que aumenta la
concentración de tensioactivo, alcanzando valores máximos de efecto del 78 y 92% al cabo
de 48 y 72 horas, respectivamente. Por otro lado, se aprecia una disminución del porcentaje
de supervivientes al aumentar el periodo de exposición, como consecuencia de un aumento
del efecto tóxico del tensioactivo. A concentraciones inferiores a 15 mg L-1 no se observan
efectos tóxicos significativos para ambos periodos de exposición.
Los valores de los parámetros de toxicidad LC50, NOEC y LOEC calculados para
un periodo de exposición de 48 y 72 horas se recogen en la Tabla IV.4.
IV-18
Nonilfenoles etoxilados
Tabla IV.4. Valores de LC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estándar
con crustáceos y el tensioactivo Tergitol®NP9.
Organismo
Efecto tóxico
Concentración (mg L-1)
A. franciscana
48-h LC50
41,2 (34,43-47,99)a
72-h LC50
30,34 (26,06-33,84)a
48-h NOEC
15,18b
48-h LOEC
30,36b
72-h NOEC
15,18b
72-h LOEC
30,36b
Concentración, valor medio (Intervalo de confianza, 95%)
b
Concentración de efecto basado en concentraciones experimentales
a
Si se comparan los resultados obtenidos en la Tabla IV.4 con los recogidos en la
bibliografía (véase capítulo de introducción) para los NPEOs con otras especies de
invertebrados, nos encontramos con una amplia variabilidad de efectos adversos
dependiendo del tensioactivo y organismo en cuestión. Para el caso del tensioactivo
NP9EO, los valores obtenidos en el presente estudio resultan muy superiores a los descritos
para el camarón marino Mysidopsis bahia (LC50, 48-h= 0,9-2 mg L-1), mientras que para el
crustáceo D. magna estas diferencias no son tan acusadas (LC50 = 14 mg L-1).
Otros parámetros importantes a considerar a la hora de estudiar la toxicidad son los
valores de la mínima concentración que provoca un efecto observable (LOEC) y la máxima
concentración que no presenta efecto observable (NOEC). Si comparamos las
concentraciones de NPEOs en el medio acuático natural (excluyendo las aguas residuales)
descritas en la bibliografía (véase capítulo de introducción), en todos los casos inferiores a
80 µg NPEO L-1, con los valores del parámetro NOEC obtenidos, tanto para las microalgas
como invertebrados marinos (Tabla IV.3), estos últimos resultan ser 3 ó 4 órdenes de
magnitud mayores (dependiendo de la especie) que las concentraciones ambientales. Estos
resultados parecen indicar, en un principio, que el tensioactivo estudiado NP9EO no supone
un riesgo ambiental para el medio acuático marino. No obstante, cabe indicar que existe
una diferencia importante entre la naturaleza del tensioactivo utilizado en los ensayos de
toxicidad (Tergitol®NP9) y los NPEOs hallados en aguas naturales. En el caso de éstos
últimos estamos hablando de homólogos de cadena alquílica corta, y por lo tanto más
tóxicos (Yoshimura, 1986; Hall y col., 1989) que los NP9EO. Por todo esto, hay que
considerar que a la hora de evaluar el riesgo ambiental de un compuesto no sólo hay que
referirse al sustrato original sino también a los subproductos de la transformación del
mismo en el compartimento estudiado, pues de lo contrario se corre el peligro de
subestimar su riesgo ambiental.
IV-19
Capítulo 4
3.3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación
En el presente apartado se lleva a cabo el estudio de la evolución del medio de
ensayo durante la biodegradación del tensioactivo no-iónico Tergitol®NP9 sobre diversas
especies de microalgas marinas y un crustáceo marino.
En la Figura IV.8 se representa la evolución temporal de la toxicidad del medio de
ensayo (% de inhibición del crecimiento/mortalidad) y grado de mineralización (%) durante
el ensayo de biodegradación del tensioactivo no-iónico Tergitol®NP9.
Se puede observar como en el caso de las microalgas N. gaditana, I. galbana y C.
gracilis el porcentaje inicial de efecto (0% de biodegradación del tensioactivo) es del
100%, permaneciendo constante durante los primeros 34 días de ensayos, momento en el
que el tensioactivo se ha mineralizado un 64%. Esto puede ser debido a la elevada
sensibilidad de estas tres microalgas al tensioactivo junto a la elevada concentración inicial
empleada en los ensayos de biodegradación. Como consecuencia de ello, no podemos
determinar si durante la biodegradación del tensioactivo Tergitol®NP9 tiene lugar la
formación de metabolitos más o menos tóxicos (en cantidad y/ó naturaleza) que el
tensioactivo original para estas tres especies de microalgas. Estaríamos pues ante un caso
tipo D (véase capítulo 3, apartado 3.3).
En el caso de las microalgas D. salina y T. chuii observamos un porcentaje inicial
de efecto (0% biodegradación) inferior al 80%. Asimismo, se aprecia un incremento de la
toxicidad del medio durante la fase inicial de biodegradación, alcanzando valores máximos
(100% inhibición del crecimiento) al cabo de 6 días de ensayo, momento en el cual el
tensioactivo Tergitol®NP9 alcanza un porcentaje de biodegradación del 16%,
aproximadamente. Al cabo de 34 días de ensayo (64% biodegradación), y tal como se
observa para el resto de las microalgas se produce una disminución de la toxicidad del
medio como consecuencia del proceso de mineralización. En el caso del crustáceo A.
franciscana, se puede observar un comportamiento análogo, esto es, un aumento inicial de
la toxicidad del medio al biodegradarse el tensioactivo. En la Figura IV.8 vemos como el
porcentaje inicial de efecto tóxico (10% mortalidad) es relativamente bajo, en comparación
con el observado para las microalgas (80-100% inhibición del crecimiento), pero a
continuación la toxicidad del medio aumenta drásticamente, alcanzando valores máximos
de efecto (100%) al cabo de 11 días de ensayos (alrededor del 40% de mineralización). Una
vez alcanzado este máximo efecto adverso del medio de ensayo (entre el día 15 y 23 de
ensayo), la toxicidad disminuye paulatinamente a medida que avanza el proceso de
mineralización.
IV-20
Nonilfenoles etoxilados
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
40
20
20
0
0
0
20
40
60
80
80
60
60
40
40
20
0
0
100
20
80
60
60
40
40
20
20
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
20
40
60
Biodegradación (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
80
0
60
60
40
40
20
20
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
0
20
40
40
20
20
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
Figura IV.8.
80
0
100
Mortalidad, 72-h (%)
60
Biodegradación (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
60
60
60
80
100
A. franciscana
100
100
80
40
40
0
Tiempo (días)
80
Tiempo (días)
100
80
0
0
T. chuii
20
100
80
80
100
0
80
D. salina
Tiempo (días)
0
60
100
100
Inh. crecimiento, 96-h (%)
C. gracilis
0
40
0
Tiempo (días)
Tiempo (días)
100
20
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
Biodegradación (%)
40
60
80
100
80
80
60
60
40
40
20
20
LC, 72-h (%)
Biodegradación (%)
0
0
20
40
60
Biodegradación (%)
60
100
Biodegradación (%)
80
Biodegradación (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
80
I. galbana
100
100
Inh. crecimiento, 96-h (%)
N. gaditana
100
0
80
100
Tiempo (días)
Evolución del efecto tóxico del medio de ensayo (%) y porcentaje de
mineralización (%) durante el experimento de biodegradación de
Tergitol®NP9.
Los resultados obtenidos para las microalgas D. salina y T. chuii y el crustáceo A.
franciscana parecen confirmar que durante la mineralización del tensioactivo no-iónico
Tergitol®NP9 en agua de mar tiene lugar un aumento de la toxicidad del medio como
IV-21
Capítulo 4
consecuencia de la formación de metabolitos más tóxicos (en cantidad y/ó naturaleza) que
el tensioactivo original y por tanto, el tensioactivo no presenta una biodegradación
ambientalmente aceptable.
Si tenemos en cuenta la ruta de biodegradación aerobia de los NPEOs podemos
apreciar que este aumento de la toxicidad probablemente sea debido a la presencia de
biointermediatos hidrófobos, tales como NP1EO, NP2EO y NP3EO, e, hidrófilos,
principalmente NP1EC y NP2EC, los cuales han sido identificados como más tóxicos que
los NPEOs (Yoshimura, 1986; Hall y col., 1989; Kravetz y col., 1991; Jobling y Sumpter,
1993; White y col., 1994; Maguire, 1999).
Los resultados obtenidos en el presente apartado están en consonancia con los
descritos por otros autores (Naylor y col., 1992; Jobling y Sumpter, 1993; Ahel y col.,
1994a; White y col., 1994; Ahel y col., 1996), quienes muestran que durante el proceso de
degradación de los alquilfenoles etoxilados tiene lugar la formación de biointermediatos,
muchos de los cuales resultan ser más tóxicos y persistentes que el compuesto original.
IV-22
Nonilfenoles etoxilados
4. Conclusiones
Las principales conclusiones obtenidas en el presente capítulo son las siguientes:
•
El tensioactivo no-iónico Tergitol®NP9 presenta una elevada biodegrabilidad en el
medio acuático marino bajo las condiciones ensayadas, alcanzando porcentajes de
mineralización superiores al 80% al cabo de 53 días de ensayo, lo que indica la
existencia de un potencial para la biodegradación de estos tensioactivos en el medio
acuático marino.
•
La biodegradación final o mineralización del tensioactivo no-iónico en agua de mar
bajo las condiciones ensayadas sigue una cinética de primer orden, caracterizada por la
ausencia de una fase inicial de aclimatación de los microorganismos responsables de la
degradación del Tergitol®NP9.
•
La toxicidad del tensioactivo Tergitol®NP9 experimenta una gran variabilidad
dependiendo del organismo ensayado. Así, de las diferentes especies de microalgas
estudiadas, las microalgas marinas I. galbana y C. gracilis se muestran como las más
sensibles. Respecto al crustáceo marino A. franciscana, a pesar de que los efectos
estudiados han sido diferentes a los de las microalgas, se obtienen valores de toxicidad
superiores, lo que parece indicar una mayor resistencia del crustáceo al tensioactivo
estudiado.
•
Los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad aguda con microalgas y
crustáceos marinos junto con los datos disponibles de niveles ambientales de esta
familia de tensioactivos parecen indicar que las concentraciones de NP9EO presentes
en el medio acuático marino, como tal, no suponen un riesgo ambiental. No obstante,
dada la elevada toxicidad que presentan los intermediatos generados durante su
degradación (principalmente NPE1EO, NPE2EO, NPE1EC y NPE2EC), sería preciso
disponer de los valores de concentración de no efecto (NOEC) de estos metabolitos y
no del compuesto original para evaluar el riesgo ambiental del NP9EO en su conjunto,
esto es incluyendo sus subproductos.
•
El estudio de la evolución de la toxicidad del medio de ensayo indica que durante el
proceso de biodegradación del Tergitol®NP9 tiene lugar un aumento de la toxicidad del
medio como consecuencia de la formación de intermediatos más tóxicos (en cantidad
y/ó naturaleza) que el tensioactivo original. Estos resultados permiten clasificar al
tensioactivo Tergitol®NP9 como un compuesto de biodegradabilidad ambientalmente
no aceptable.
IV-23
Capítulo 4
Referencias
Ahel, M., Conrad, T., Giger, W., 1987. Persistent organic chemicals in sewage effluents. Environ Sci Technol 21,
697-703.
Ahel, M., Giger, W., 1985. Determination of Alkylphenols-ethoxylate surfactants in mechanical-biological sewage
treatment. Water Sci. Technol. 19, 449-360.
Ahel, M., Giger, W., Koch, M., 1994a. Behavior of alkylphenol polyethoxylate surfactants in the aquatic
environment. I. Occurrence and transformation in seawage treatment. Water Res 28, 1131-1142.
Ahel, M., Giger, W., Schaffner, C., 1994b. Behaviour of alkylphenol polyethoxylate surfactants in the aquatic
environment. II. Occurrence and transformation in rivers. Water Res. 28, 1143-1152.
Ahel, M., Schaffner, C., Giger, W., 1996. Behavior of alkylphenol polyethoxylate surfactants in the aquatic
environment. III. Occurrence and elimination of their persistent metabolites during infiltration of river
water to groundwater. Water Res 30, 37-46.
Ball, H.A., Reinhard, M., McCarthy, P.L., 1989. Biotransformation of halogenated and nonhalogenated
octylphenol polyethoxylate residues under aerobic and anaerobic conditions. Environ Sci Technol 23,
951-961.
Brown, D., 1988. Alkylphenol ethoxylates: an environmental impact assessment. 2nd World Surfactant Congress,
352-360.
BUA, 1991. Nonylphenol. VCH, Weinheim, Germany.
Calamari, D. and R. Marchetti. 1973. The toxicity of metals and surfactants to rainbow trout (Salmo gairdneri
Rich.). Water Res. 7, 1453–1464.
CE, 1993. Council Regulation 793/93/EEC of March 1993 on the evaluation and control of risks of existing
substances. Official Journal of the European.
Dorn, P.B., Salanitro, J.P., Evans, S.H., Kravetz, L., 1993. Assessing the aquatic hazard of some branched and
linear non-ionic surfactants by biodegradation and toxicity. Toxicol Chem 12, 1751-1762.
Dwyer, D.F., Tiedje, J.M., 1986. Metabolism of polyethylene glycol by two anaerobic bacteria, Desulfovibrio
desulfuricans and a Bacteroides sp. App.Environ.Microbiol. 52, 852-856.
Ekelund, R., Bergman, A., Granmo, A., Berggren, M., 1990. Bioaccumulation of 4-nonylphenols in marine
animals. Environ.Pollut. 79, 107-120.
Ferreira, C.S., Nunes, B.A., Henriques-Almeida, J.M., Guilhermino, L., 2007. Acute toxicity of oxytetracycline
and florfenicol to the microalgae Tetraselmis chuii and to the crustacean Artemia parthenogenetica.
Ecotoxicol Environ Saf 67, 452-458.
Field, J.A., Reed, R.L., 1996. Nonylphenol polyethoxy carboxylate metabolites of non-ionic surfactants in U.S.
paper mill effluents, municipal sewage treatment plant effluents and river waters. Environ Sci Technol
30, 3544-3550.
IV-24
Nonilfenoles etoxilados
Giger, W., Brunner, P.H., Schaffner, C., 1984. 4-Nonylphenol in sewage sludge: accumulation of toxic
metabolites from nonionic surfactants. Science 225, 623-625.
Giger, W., Stephanou, E., Schaffner, C., 1981. Persistent organic chemicals in sewage effluents. I. Identifications
of nonylphenols and nonylphenol ethoxylates by glass capillary gas chromatography/mass spectrometry.
Chemosphere 10, 1253-1263.
Granmo, A., Ekelund, R., Magnusson, K., Bergrenn, M., 1989. Lethal and sublethal toxicity of 4-nonylphenol to
the common mussel. Environmental pollution 59, 229-239.
Guerra, R., 2001. Ecotoxilological and chemical evaluation of phenolic compounds in industrial effluents.
Chemosphere 44, 1737-1747.
Hall, W.S., Patoczka, J.B., Mirenda, R.J., Porter, B.A., Miller, E., 1989. Acute toxicity of industrial surfactants to
Mysidopsis bahia. Arch Environ Contam Toxicol 18, 765-772.
Isidori, M., Lavorgna, M., Nardelli, A., Parrella, A., 2006. Toxicity on crustaceans and endocrine disrupting
activity on Saccharomyces cerevisiae of eight alkylphenols. Chemosphere 64, 135-143.
Jobling, S., Sumpter, J.P., 1993. Detergent components in sewage effluent are weakly estrogenic to fish: An in
vitro study using rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes. Aquatic Toxicology 27, 361-372.
Jonkers, N., Knepper, T.P., de Voogt, P., 2001. Aerobic biodegradation studies of nonylphenol ethoxylates in river
water using liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Environ Sci Technol 35,
335-340.
Kravetz, L., 1990. Biodegradation pathways of non-ionic ethoxylates. Influence of the hydrophobe structure. ACS
Symp. Ser. 433, 96-109.
Kravetz, L., Salanitro, J.P., Dorn, P.B., Guin, K.F., 1991. Influence of hydrophobe type and extent of branching on
environmental response factors on nonionic surfactants. J Am Oil Chem Soc 68, 610-618.
Kvestak, R., Terzic, S., Ahel, M., 1994. Input and distribution of alkylphenol polyethoxylates in a stratified
estuary. Marine Chem. 46, 89-100.
Lechuga, M.M., 2005. Biodegradación y toxicidad de tensioactivos comerciales. Tesis Doctoral. Dpto. de
Ingeniería Química. Universidad de Granada, Granada.
Lewis, M.A., 1986. Comparion of the effects of surfactants on freshwater phytoplankton communities in
experimental enclosures and on algal growth in the laboratory. Environmental Toxicology and Chemistry
5, 319-322.
Little, A.D., 1977. Human safety and environmental aspect of major surfactants. En: Service, N.T.I. (Ed.).
Documento PB 301 193/9ST, Springfield, Virginia.
Maguire, R.J., 1999. Review of the persistence of nonylphenol and nonylphenol ethoxylates in aquatic
environments. Water Qual Res J Canada 34, 37-78.
Maki, H., Masuda, N., Fujiwara, Y., Ike, M., Fujita, M., 1994. Degradation of alkylphenol ethoxylates by
Pseudomonas sp. strain TR01. Appl Environ Microbiol 60, 2265-2271.
IV-25
Capítulo 4
Mann, R.M., Boddy, M.R., 2000. Biodegradation of a nonylphenol ethoxylate by the autochthonous microflora in
lake water with observations on the influence of light. Chemosphere 41, 1361-1369.
Manzano, M.A., Perales, J.A., Sales, D., Quiroga, J.M., 1998. Effect of concentration on the biodegradation of a
nonylphenol polyethoxylate in river water. Bull Environ Contam Toxicol 61, 489-496.
Manzano, M.A., Perales, J.A., Sales, D., Quiroga, J.M., 1999. The effect of temperature on the biodegradation of a
nonylphenol polyethoxylate in river water. Water Res 33, 2593-2600.
Marchetti, R. 1965. The toxicity of Nonylphenol ethoxylate to the developmental stages of the rainbow trout,
Salmo gairdneri Richardson. Ann. Appl. Biol. 55, 425–430.
Marcomini, A., Pavoni, B., Sfriso, A., Orio, A., 1990. Persistent metabolites of alkylphenol polyethoxylates in the
marine environment. Marine Chem. 29, 307-323.
Marcomini, A., Lojana, G., Sfriso, A., Quiroga, J. M., 1990. Behavior of anionic and nonionic surfactants and
their persistent metabolites in the Venice lagoon, Italy. Environmental Toxicology and Chemistry 19(8),
2000-2007.
McLeese, D.W., Zitko, V., Sergeant, D.B., Burridge, L., Metcalfe, C.D., 1981. Lethality and accumulation of
alkylphenols in aquatic fauna. Chemosphere 10, 723-730.
Moreno-Garrido, I., Hampel, M., Lubian, L. M., Blasco, J., 2001. Marine microalgae toxicity test for linear
alkylbenzene sulfonate (LAS) and alkylphenol ethoxylate (APEO). Fresenius J. Anal. Chem. 371(4),
474-478.
Naylor, C.G., 1995. Environmental fate and safety of nonylphenol ethoxylates. American Association of Textile
Chemists and Colourists 27, 29-33.
Naylor, C.G., Mieure, J.P., Adams, J.A., Weeks, J.A., Ctaldi, F.J., Ogle, L.E., Romano, R.R., 1992. Alkylphenol
ethoxylates in the environment. J Am Oil Chem Soc 59, 695-703.
Nyholm, N., Kristensen, P., 1992. Screening methods for assessment of biodegradability of chemicals in seawater
results from a ring test. Ecotoxicol Environ Saf 23, 161-172.
OECD, 1987. Decision-Recommendation of the Council on the Systematic Investigation of Existing Chemicals.
En: Publications, O. (Ed.). C(87)90. OECD, Paris.
OECD (1997). SIDS initial assessment report for 6th SIAM. Prepared by M. Thomas, Environmental Agency,
National Centre for Ecotoxicology and Hazardous Substances, Londres.
Okamura, H., Aoyama, I., Liu, D., Maguire, R.J., Pacepavicius, G.L., Lau, Y.L., 2000. Fate and ecotoxicity of the
new antifouling compound Irgarol 1051 in the aquatic environment. Water Res 34, 3523-3530.
Osburn, Q.H., Benedict, J.H., 1966. Polyethoxylates alkylphenol: relationship of structure biodegradation
mechanism. J Am Oil Chem Soc 43, 141-146.
OSPAR, 2001. Strategy with regard to hazardous substances. En: Commision, O. (Ed.). OSPAR, London.
PARCOM, 2002. Recommendation 92/8 on Nonylphenol-ethoxylates.En: Comission, O. (Ed.). OSPAR, London.
IV-26
Nonilfenoles etoxilados
Patoczka, J., Pulliam, G.W., 1990. Biodegradation and secondary effluent toxicity of ethoxylated surfactants.
Water Res 24, 965-972.
Perales, J.A., Manzano, M.A., Garrido, M.C., Sales, D., Quiroga, J.M., 2007. Biodegradation kinetics of linear
alkylbenzene sulphonates in sea water. Biodegradation 18, 63-70.
Potter, T.L., Simmons, K., Wu, J., Kostecki, P., Calabrese, E., 1999. Static die-away of a nonylphenol ethoxylate
surfactant in estuarine water samples. Environ Sci Technol 33, 113-118.
Quiroga, J.M., Perales, J.A., Romero, L.I., Sales, D., 1999. Biodegradation kinetics of surfactants in seawater.
Chemosphere 39, 1957-1969.
Routledge, E.J., Sumpter, J.P., 1996. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products
assessed using a recobinant yeast screen. Environ Sci Technol 15, 241-248.
Rudling, L., Solyom, P., 1974. The investigation of biodegradability of branched nonylphenol ethoxylates. Water
Res 8, 115-119.
Salanitro, J.P., Langston, G.C., Dorn, P.B., Kravetz, L., 1988. Activated sludge treatment of ethoxylate surfactants
at high industrial use concentrations. Presented at the International Conference on Water and Wastewater
Microbiology, Newport Beach, Calif., February 8-11.
Scott, M.J., Jones, M.N., 2000. The biodegradation of surfactants in the environment. Biochim Biophys Acta
1508, 235-251.
Schobert, P., Kunkel, E., Espeter, K., 1981. Comparative investigations on the microbial metabolism of a
nonylphenol and an oxoalcohol ethoxylate. Tenside Surf. Det. 18, 64-72.
Sheldon, L.S., Hites, R.A., 1978. Organic compounds in the Delaware River. Environ. Sci. Technol. 12, 11881194.
Simkins, S., Alexander, M., 1984. Models for mineralization kinetics with the variables of substrate concentration
and population density. Appl Environ Microbiol 47, 1299-1306.
Sivak, A., Goyer, M., Perwak, J., 1982. Environmental and human aspects of commerciallly important surfactants.
Solution behaviour of surfactants. Ed. Plenum Publishing Corp 1, 161-188.
Staples, C.A., Naylor, C.G., Williams, J.B., Gledhill, W.E., 2001. Ultimate biodegradation of alkylphenol
ethoxylate surfactants and their biodegradation intermediates. Environ Toxicol Chem 20, 2450-2455.
Staples, C.A., Williams, J.B., Blessing, R.L., Varineau, P.T., 1999. Measuring the biodegradability of nonylphenol
ether carboxylates, octylphenol ether carboxylates and nonylphenol. Chemosphere 38, 2029-2039.
Sun, H., Gu, X., 2005. Comprehensive toxicity study of nonylphenol and short-chain nonylphenol polyethoxylates
on Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 75(4), 677-83.
Swedmark, M., Braaten, B., Emanuelsson, E., Granmo., Å., 1971. Biological effects of surface active agents on
marine animals. Mar. Biol. 9, 183–201.
Swedmark, M., Granmo, Å., Kollberg. S., 1976. Toxicity testing at Kristinberg Marine Biology Station. En:
Pollutants in the aquatic environment. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome
(FAO/SIDA/TF 108, Supplement 1).
IV-27
Capítulo 4
Swisher, R.D., 1987. The analytical methods in surfactants biodegradation. Surfactant biodegradation, 2nd Edition,
47, M. Dekker, New York.
Talmage, S.S., 1994. Environmental and human safety of major surfactants: alcohol ethoxylates and alkylphenol
ethoxylates. A Report to the Soap and Detergent Association. Boca Raton, FL: Lewis Publishers.
UE, 2001. Decisión Nº 2455/2001/CE del parlamento europeo y del consejo de 20 de noviembre de 2001, que
establece la lista de sustancias prioritarias de la política de aguas y la directiva 2000/60/CE. Official J. L
249, 27-30.
Ukeles, R., 1965. Inhibition of unicellular algae by synthetic surface-active agents. J. Phycol. 1, 102–110.
USEPA, 1998. Fate, transport and transformation test guidelines. OPPTS. "Biodegradability in Sea Water"
835.3160. EPA 712–C–98–351 The Federal Bulletin Board. U.S. Government Printing Office
Washington, DC.
White, R., Jobling, S., Hoare, S.A., Sumpter, J.P., Parker, M.G., 1994. Environmentally persistent alkylphenolic
compounds are estrogenic. Endocrinology 135, 175-182.
WRc, 1991. Foaming in Rivers, Water Research Centre.
Xie, L., Thrippleton, K., Irwin, M.A., Siemering, G.S., Mekebri, A., Crane, D., Berry, K., Schlenk, D., 2005.
Evaluation of estrogenic activities of aquatic herbicides and surfactants using an rainbow trout
vitellogenin assay. Toxicol Sci 87, 391-398.
Yoshimura, K., 1986. Biodegradation and fish toxicity of non-ionic surfactants. J. Am. Oil. Chem. Soc. 63, 15901596.
IV-28
Capítulo 5
ALQUIL ETOXISULFATOS
Resumen
En los últimos años, el consumo de los tensioactivos aniónicos alquil etoxisulfatos
(AES) se ha visto fuertemente incrementado debido a sus propiedades, las cuales los hacen
ideales en múltiples aplicaciones. En el presente capítulo se exponen los resultados
obtenidos en los experimentos de biodegradación y ecotoxicidad del alquil etoxisulfato
Empicol®ESB 70/SP en agua de mar natural procedente de la zona costera de Sancti Petri
(Cádiz). Los valores obtenidos indican la existencia de un potencial para la degradación del
tensioactivo Empicol®ESB 70/SP en el medio marino, aunque a baja velocidad de
biodegradación. Durante la mineralización del tensioactivo se distinguen dos etapas, las
cuales siguen una cinética de primer orden y logístico, respectivamente. En relación a la
toxicidad del tensioactivo aniónico, los resultados obtenidos señalan a la microalga D.
salina como la más sensible, mientras que el tensioactivo experimenta menores efectos
adversos sobre el crustáceo marino A. franciscana. Los resultados obtenidos en los ensayos
combinados de toxicidad y biodegradación no indican la presencia de metabolitos más
tóxicos (en cantidad y/ó naturaleza) que el tensioactivo original, por lo que parece que el
tensioactivo presenta una biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
Capítulo 5
1. Introducción
Alquil etoxisulfatos. Características y usos
Los alquil etoxisulfatos (AES), también conocidos como alcoholes éter sulfato ó
alcoholes etoxilados sulfato, son tensioactivos aniónicos utilizados en muy diversos
sectores industriales y domésticos. Aunque históricamente los lineal alquilbenceno
sulfonatos (LAS) han sido los tensioactivo sintéticos aniónicos por excelencia, en cuanto a
su producción y uso así como probablemente el agente de superficie cuyo comportamiento
ambiental (ecotoxicidad y biodegradabilidad) ha sido más estudiado (Perales, 2001), la
importancia y el consumo de los AES se ha visto incrementado en los últimos años. Así,
por ejemplo, para el año 2003 el consumo de AES estimado en América del Norte fue de
491.238 toneladas, mientras que en el caso del LAS se estimó un consumo de 317.513
toneladas para ese mismo año (Modler y col., 2004). Por otro lado, se ha estimado un
consumo anual de AES en Europa de 276.000 toneladas, de las cuales 108.000 toneladas
son empleadas en detergentes domésticos y productos de limpieza (HERA, 2002).
Los AES son obtenidos mediante reacciones de sulfatación de alcoholes etoxilados
de longitud de cadena alquílica y número de unidades etoxiladas variable, utilizando para
ello trióxido de azufre ó ácido clorosulfónico seguida de una inmediata neutralización con
una base, produciéndose generalmente sal de sodio y menos comúnmente sal de amonio. La
mayoría de los AES comerciales están constituidos por complejas mezclas de homólogos
(Feijtel y van de Plassche, 1995) con un número de átomos de carbono en la cadena
alquílica comprendido entre 12 y 18 y de 1 a 5 unidades etoxiladas (Fendinger y col., 1994)
y suelen constituir disoluciones acuosas con una pureza aproximada del 25-30% ó 68-70%
de materia activa. Los AES de sodio se caracterizan por contener, generalmente,
aproximadamente un 2-4% de alcohol etoxilado desulfatado, 1-2% alcohol sin reaccionar y
1-45% de alcohol sulfato y opcionalmente cantidades traza de compuestos inorgánicos
tampones de pH, dependiendo del contenido de materia activa y del grado de etoxilación.
La Figura V.1 recoge la estructura química de los alquil etoxisulfatos.
R
O
O
O
n
S
O-
O
Figura V.1. Estructura molecular del tensioactivo aniónico aquil etoxisulfato (R= CxH2x+1,
x= 12-18; n = 1-5).
V-2
Alquil etoxisulfatos
Niveles de alquil etoxisulfatos en el medio acuático
Hasta el momento, pocos son los autores que han enfocado sus esfuerzos en la
determinación de las concentraciones de AES en el medio acuático, y ninguno en el medio
marino. Tan sólo se han encontrado datos referentes a las concentraciones de estos
compuestos en efluentes de estaciones depuradoras de aguas residuales urbanas y ríos. Así,
por ejemplo, Matthijs y col. (1999) describieron concentraciones medias de 6,5 µg L-1 de
alquil etoxisulfatos de cadena alquílica comprendida entre 12 y 15 átomos (C12-15AES) en
efluentes de diversas estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) de los Países
Bajos. Por otro lado, en un estudio reciente llevado cabo en Estados Unidos por Sanderson
y col., (2006) se hallaron concentraciones totales de alcohol sulfato (AS) y alquil
etoxisulfatos (AES) de 10 y 172 ng L-1, correspondientes a aguas arriba y abajo de un punto
de vertido a un río, respectivamente, mientras que en el influente y efluente de la EDAR se
determinaron concentraciones de 162,3-200,2 mg L-1 y 0,24-2,85 mg L-1, respectivamente.
Biodegradabilidad de los alquil etoxisulfatos (AES)
Steber y Berger (1995) establecieron tres posibles rutas/mecanismos de
biodegradación de los alquil etoxisulfatos en condiciones aerobias, las cuales parecen tener
lugar simultáneamente. En la Figura V.2 se representan los posibles mecanismos aerobios
de biodegradación de los alquil etoxisulfatos (Steber y Berger, 1995).
La primera de estas posible rutas de biodegradación consiste en una ω-oxidación
de la cadena alquílica del AES seguida de β-oxidaciones que provocan un sucesivo
acortamiento de la cadena alquílica, dando lugar a AES carboxilados (mecanismo a).
Un segundo mecanismo de biodegradación consiste en la ruptura enzimática del
grupo sulfato (desulfatación) dando lugar a la formación de un alcohol graso etoxilado
(mecanismo b). Posteriormente, el alcohol etoxilado generado es degradado mediante la
ruptura del enlace central ó bien mediante ω- y β-oxidación de cualquiera de los extremos
de la molécula (véase capítulo 6, apartado 1).
Otro posible mecanismo de biodegradación consiste en la hidrólisis del enlace
central éter (enlace entre la cadena alquílica y etoxilada) dando lugar a un alcohol y un
polietilenetilenglicol sulfato (mecanismo c). El alcohol generado es oxidado danto lugar a
un ácido graso, mientras que el polietilenglicol sulfato es transformado a etilenglicol
mediante desulfatación y sucesivas hidrólisis.
Finalmente, un cuarto posible mecanismo consiste la hidrólisis de un enlace éter
no central dando lugar a la formación de un alcohol etoxilado y etilenglicol sulfato
(mecanismo d). Posteriormente, el alcohol etoxilado es degradado bien mediante la
V-3
Capítulo 5
hidrólisis del enlace central éter ó bien ω- y β-oxidación de cualquiera de los extremos de la
molécula (véase capítulo 6, apartado 1), mientras que el polietilenglicol es eliminado
mediante desulfatación y sucesivas hidrólisis dando lugar a etilenglicol.
Alquil etoxisulfato (AES)
O
R1 O
ω-oxidación
(mecanismo a)
O S O-
O
n
Desulfatación
(mecanismo b)
O
O
HO
R2
O
O
O
O S O-
R1 O
n
Alcohol etoxilado
(capítulo 6, apartado 1)
Alquil etoxisulfato carboxilado
β-oxidación
Hidrólisis no central
(mecanismo d)
O
HO
R3
O
O
O
OH
O
O
n
O S O-
O
O
n
R1
Alquil etoxisulfato carboxilado
O
OH
+
HO
O S O-
O
O
n-1
Hidrólisis central
(mecanismo c)
Alcohol etoxilado
(capítulo 6, apartado 1)
Polietilénglicol
sulfato
Desulfatación
Hidrólisis
O
R 1 OH
Alcohol
+
HO
O
O S O-
Polietilenglicol sulfato
OH
O
Ácido
graso
HO
HO
O
OH
Etilénglicol
Desulfatación
Hidrólisis
Oxidación
R1
O
n
O
OH
Etilénglicol
Figura V.2. Rutas de biodegradación aerobia propuesta para los tensioactivos aniónicos
AES (R1=CxH2x+1, R2= Cx-1H2x, R3= Cx-2H2x-1, x= 12-18; n=1-5) (Steber y
Berger, 1995).
V-4
Alquil etoxisulfatos
En general, los AES son considerados fácilmente biodegradables en condiciones
aerobias, independientemente de la longitud de cadena etoxilada (Painter, 1992; BKH,
1994; Madsen y col., 2001), alcanzando velocidades de degradación primaria y final
similares a la de los alcoholes sulfatos (AS) (Scott y Jones, 2000). Así, por ejemplo, Fischer
(1982), empleando el método de frasco cerrado, obtuvo porcentajes de biodegradación
primaria del 96% al cabo de 30 días de ensayo para diferentes AES. Asimismo, Painter
(1992) encontró porcentajes de biodegradación primaria para el tensioactivo alquil
etoxisulfato de cadena alquílica entre 12 y 14 átomos de carbono y 3 unidades etoxiladas
(C12-14 AE3S) comprendidos entre el 90 y 100% al cabo de 1-5 días de ensayo. Por otro
lado, estudios realizados por Schröder (1995) en agua de río describieron un tiempo de vida
media de aproximadamente 1 hora para diferentes AES.
La biodegradación final o mineralización de los AES también ha sido estudiada
por diversos autores (Swisher, 1987; Holt y col., 1992); si bien la mayoría de estos estudios
han sido realizados en aguas continentales De manera general, los AES se caracterizan por
presentar una elevada biodegradabilidad final. Así, por ejemplo, estudios llevados a cabo
sobre diversos AES mostraron la completa degradación de los metabolitos generados
durante el proceso degradativo, tales como los etilenglicoles sulfatos, conduciendo a la
formación de sulfato inorgánicos y dióxido de carbono (Griffith y col., 1986; White y
Russell, 1988). Por otro lado, en ensayos de simulación de lodos activos con C12-14AE2S y
C12-15oxo-AE3S se han observado porcentajes de eliminación de COD del 58-100% y 96100%, respectivamente, al cabo de 28 días de ensayo (Schöberl y col., 1988). Asimismo,
Steber y Berger (1995) encontraron una completa mineralización (100% de eliminación de
la demanda teórica de oxígeno) del tensioactivo C12-18AE8,5S en ensayos de biodegradación
de frasco cerrado.
La biodegradación de AES bajo condiciones anaerobias también ha sido objeto de
estudio de diversos autores, observándose altos porcentajes de biodegradación (Itoh y col.,
1987; Nuck y Federle, 1996; Painter, 1992; Steber, 1991; Steber y Berger, 1995). En un
estudio de biodegradabilidad anaerobia del tensioactivo C12-14AEO2S (ensayos ECETOC),
Steber (1991) encontró una producción de biogás del 75% al cabo de un período de
incubación de 41 días. Asimismo, Painter (1992), operando en condiciones anaerobias,
encontró una eliminación del 64% de sustancia activa al azul de metileno (MBAS) para el
tensioactivo C12-14AE3S al cabo de 28 días de ensayo y del 70% MBAS para el tensioactivo
C16AE1S en 17días. Por otro lado, estudios llevados a cabo en un digestor a escala de
laboratorio mostraron una mineralización anaerobia (basado en la formación de 14C-gas) del
tensioactivo C14AE3S comprendida entre 88,4% y 87,6% al cabo de 17 días de incubación,
dependiendo de la concentración de inóculo utilizado (Nuck y Federle, 1996).
A diferencia de otros tensioactivos, estudios realizados por Painter (1992) parecen
indicar que el porcentaje de biodegradabilidad de estos compuestos no se ve afectado por
V-5
Capítulo 5
la longitud de la cadena alquílica; si bien su grado de ramificación puede dificultar la
biodegradación primaria de estos tensioactivos, encontrando porcentajes de eliminación
para un AES lineal del 97% al cabo de 3 días, un 90% para un oxo-AES lineal, y 50% para
un AES de cadena ramificada.
Toxicidad de los alquil etoxisulfatos en el medio acuático
Se han encontrado numerosos datos de toxicidad aguda de los AES sobre un total
de 17 especies marinas y de agua dulce correspondientes a diferentes grupos taxonómicos
(algas, invertebrados y peces), aunque la mayoría de estos estudios corresponden a especies
de agua dulce, y en ocasiones no se especifican bien las condiciones de ensayo. En la Tabla
V.1 se resumen algunos de los valores de toxicidad aguda de diversos AES sobre diferentes
organismos acuáticos marinos y de agua dulce recogidos en la bibliografía.
De manera general, los valores de toxicidad (EC50) de los AES se encuentran
comprendidos entre 0,37 y 450 mg L-1, lo que demuestra una gran variabilidad de la
toxicidad en función del taxón, la especie, condiciones de ensayo y tipo de alcohol
etoxilado ensayado. Con respecto al taxón se observan diferencias significativas entre ellos,
estando los valores de EC50 comprendidos entre 0,37 y 65 mg L-1 en el caso de las algas,
0,78 y 167,3 mg L-1 en el caso de los invertebrados y, 0,8 y 450 mg L-1 en el caso de los
peces (Tabla V.1). Asimismo, en un estudio realizado por la consultora BKH (1994), en el
que se recopilan datos de toxicidad de diversos AES sobre organismos acuáticos, se
mostraban valores de EC50 comprendidos entre 3,5 y 10, 4,2 y 350 y, 0,39 y 94,4 mg L-1 en
el caso de algas, crustáceos y peces, respectivamente.
Otra de las fuentes de variabilidad de la toxicidad de los AES consiste en la
especie ensayada. Así, por ejemplo, en el caso de algas marinas, Pavlic y col. (2005)
obtuvieron valores similares de toxicidad (EC50, 72-h) para dos especies de diatomeas,
mientras que para especies de algas de agua dulce estas diferencias fueron algo más
acusadas (Tabla V.1). Respecto a la variabilidad en peces de agua dulce, Reiff y col. (1979)
encontraron una toxicidad similar del tensioactivo C12-15AE3S sobre dos especies diferentes.
Sin embargo, estudios realizados por Singh y col. (2002) encontraron diferencias
significativas entre los peces R. heteromorpha e I. idus melanotus, con valores de IC50 (48h) comprendidos entre 7, 20 y 13,64 mg L-1 de lauril etersulfato sódico (C12AES).
En relación a las condiciones de ensayos (tipo de respuesta, periodo de exposición,
etc.) no se ha encontrado ningún trabajo en el que se compare la toxicidad de los AES a
diferentes condiciones experimentales, aunque en general se asume que cambios en las
condiciones de ensayo (tiempo de exposición, temperatura, etc.) puede influir de manera
significativa en los resultados de los ensayos de toxicidad aguda (Rand, 1995).
V-6
Alquil etoxisulfatos
Tabla V.1.
Resumen de algunos valores de toxicidad aguda de AES sobre organismos
acuáticos recogidos en la bibliografía.
Grupo
Especie
AES
Efecto
Algas marinas
Phaeodactylum tricornutum
C12AES
72-h EC50
Toxicidad
(mg L-1)
0,50
Skeletonema costatum
C12AES
Algas de
agua dulce
Selenastrum capricornutum
C10-15AE3S
48-h EC50
65
C12-14AES
72-h EC50
32
Verge y col., 1996
3,5
Pavlic y col., 2005
Pseudokirchneriella subcapitata
Referencia
Pavlic y col., 2005
0,37
C12AES
Yamane y col., 1984
Scenedesmus subspicatus
C12AES
Invertebrados marinos
Artemia salina
C12-14AE3S
24-h LC50
11,97
Liwarska y col., 2005
Invertebrados de
agua dulce
Daphnia magna
C13,67AE2,25S
96-h EC50
1,17
Maki, 1979
Ceriodaphnia dubia
C12AE1S
48-h LC50
9,55
Dyer y col., 2000
0,50
C12AE2S
Peces de
agua dulce
55,98
C12AE4S
118,26
C12AE8S
43,46
C13AE2S
7,18
C14AE1S
4,08
C14AE2S
4,24
C14AE4S
43,97
C15AE1S
0,78
C15AE2S
18,96
C15AE4S
66,4
C15AE8S
167,31
Salmo gairdneri
C12AES
Gammbusia affinis
C12AES
Carassius auratus
C12AES
12,35
Cirrhina mrigala
C12AES
7,20
Pimephales promelas
C12AE2S
Oncorhynchus mykiss
48-h IC50
10,84
24-h LC50
1,5
C14AE2S
1,8
C16AE2S
1,0
C18AE2S
8,0
C11AE4S
17,0
C14AE4S
4,0
C16AE4S
0,9
C18AE4S
15
C14AE6S
9,3
C16AE6S
0,8
C18AE6S
2,1
C9-10AE2,5S
Singh y col., 2002
13,64
96-h LC50
C12-13AE2S
Painter, 1992
400-450
28
C12-15AE3S
8,9
Salmo trutta
C12-15AE3S
1,0-2,5
Rasbora heteromorpha
C12-15AE3S
Idus idus melanotus
C12-15AE3S
48-h LC50
Reiff y col., 1979
3,9
3,95
V-7
Capítulo 5
Respecto a la estructura química del alquil etoxisulfato, estudios llevados a cabo
por diversos autores (Little, 1981; Painter, 1992; Dyer y col., 2000; Madsen, 2001)
mostraron que la toxicidad de los AES depende principalmente de la longitud de cadena
alquílica y en menor medida del número de unidades etoxiladas. Así, Little (1981) encontró
que la toxicidad aguda de varios AES (C8-C19.6 y 1-3 EO) sobre el pez Lepomis
macrochirus aumentaba a medida que lo hacia la longitud de la cadena alquílica, con
valores de LC50 superiores a 250 mg L-1 para C8, 375 mg L-1 para C10, 24 mg L-1 para C13,
4-7 mg L-1 para C14, 2 mg L-1 para C15 y 0,3 mg L-1 para C16. Asimismo, Painter (1992)
encontró para una serie de AES que la toxicidad sobre la carpa Pimephales promelas
aumentaba a medida que lo hacía la longitud de la cadena alquílica, hasta un máximo de 16
átomos de carbono, a partir del cual la toxicidad experimentaba un descenso debido a su
baja solubilidad, y por tanto, biodisponibilidad. Posteriormente, Dyer y col. (2000)
observaron dos tendencias; en aquellos AES con idéntica cadena alquílica los efectos
tóxicos disminuían a medida que aumentaba el número de unidades etoxiladas, mientras
que para aquellos con igual número de unidades etoxiladas la toxicidad incrementaba a
medida que aumentaba la longitud de la cadena hidrocarbonada (Tabla V.1).
A pesar de la alta toxicidad que presentan algunos AES sobre determinadas
especies acuáticas (Painter, 1992; Pavlic y col., 2005), no se ha descrito en la bibliografía la
formación de metabolitos tóxicos persistentes durante el proceso de biodegradación de los
AES.
V-8
Alquil etoxisulfatos
2. Materiales
A continuación se detallan las principales características del tensioactivo así como
del medio de ensayo empleado para los estudios de biodegradación y ecotoxicidad.
Tensioactivo ensayado
El tensioactivo aniónico utilizado fue un alquil etoxisulfato conocido
comercialmente como Empicol® ESB 70/SP, CAS 68585-34-2 y suministrado por
Huntsman Surface Science Iberica S.L. (Barcelona). Está constituido por una mezcla de
homólogos de cadena alquílica entre 10 y 16 átomos de carbono (predominando C12 y C14)
y dos unidades etoxiladas. Presenta una pureza del 70,0 ± 1,0 % de materia activa, una
densidad (20ºC) de 1,10 g cm-3 y una elevada solubilidad en agua.
Medio de ensayo
Las principales características físico-químicas y biológicas del agua de mar
empleada en los ensayos de biodegradación y ecotoxicidad se reflejan en la Tabla V.2. De
manera análoga a los anteriores capítulos (capítulo 3 y 4), los resultados obtenidos en el
análisis del agua de mar demuestran su bajo grado ó nulo de contaminación.
Tabla V.2.
Características del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradación y
toxicidad del tensioactivo aniónico Empicol® ESB 70/SP (valor medio ±
desviación estándar, n=3).
Parámetro
Unidades
Valor
Parámetro
Unidades
Oxígeno disuelto
% saturación
92,7 ± 1,8
Nitrato
mg L-1 NO3-
Valor
0,033 ± 0,009
Temperatura
ºC
12,5 ± 0,3
Amonio
mg L-1 NH4+
< 0,007
Conductividad
mS cm-1
50,9 ± 0,2
Fosfato
mg L-1 PO43-
< 0,015
-1
pH
-
8,14 ± 0,04
Silicato
mg L Si
0,021 ± 0,003
Salinidad
-
38,5 ± 0,5
Dureza total
mg L-1 Ca2+
418 ± 14
Carbono total
mg L-1 C
26,9 ± 0,5
Clorofila a
mg m-3 Cl a
0,73 ± 0,12
26,4 ± 0,5
Estreptococos fecales
UFC·100mL-1
No Detectado
0,50 ± 0,01
Coliformes fecales
UFC·100mL-1
No Detectado
-1
Carbono inorgánico
mg L C
Carbono orgánico
mg L-1 C
Nitrito
-1
mg L NO2
-
< 0,015
Enterococos
UFC·100mL
-1
No detectado
V-9
Capítulo 5
3. Resultados y discusión
En el siguiente apartado se presentan y discuten los resultados obtenidos en los
diferentes ensayos de biodegradación y ecotoxicidad realizados con el tensioactivo aniónico
Empicol® ESB 70/SP.
3.1. Ensayos de biodegradación
Parámetros de control
La Figura V.3 muestra la evolución de los parámetros de control pH y oxígeno
disuelto en los ensayos de biodegradación (AES1, AES2 y AES3), abiótico (AB3) y control
(CO3) a lo largo del experimento de biodegradación.
8,5
100
O2 (%saturación)
pH
8,0
7,5
CO3
AES1
AES2
AES3
AB3
7,0
6,5
80
60
40
CO3
AES1
AES2
AES3
AB3
20
0
0
20
40
60
80
Tiempo (d)
100
120
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (d)
Figura V.3. Evolución del pH y oxígeno disuelto en el ensayo control (CO3), abiótico
(AB3) y los ensayos de biodegradación con AES (AES1, AES2 y AES3).
Como puede observar en dicha figura el parámetro pH muestra valores similares
en los ensayos control, abiótico y de biodegradación, alcanzando valores medios (valor
medio ± DE) de 7,90 ± 0,15, 8,05 ± 0,15 y 7,95 ± 0,1, respectivamente.
Respecto a la concentración de oxigeno disuelto, se observa una disminución
inicial de los niveles de oxígeno disuelto en los ensayos de biodegradación que
posteriormente se recupera, alcanzándose valores similares a los ensayos control y
abióticos. A pesar de este descenso inicial, los valores de oxígeno disuelto en todos los
ensayos realizados permanecen dentro de un rango que garantizan que éste no ha sido un
factor limitante del proceso degradativo. Los porcentajes de saturación medios obtenidos en
V-10
Alquil etoxisulfatos
los ensayos control, abiótico y de biodegradación fueron del 87,4 ± 2,8%, 87,8 ± 2,9%, y
81,8 ± 6,96%, respectivamente.
Respecto al ensayo de referencia (benzoato sódico), los valores medios de pH y
oxígeno disuelto estuvieron comprendidos entre 7,96 ± 0,14 y 75,6 ± 7,58% de saturación,
respectivamente. Los valores medios de temperatura encontrados en los ensayos control,
abiótico, referencia y de biodegradación fueron de 19,4 ± 0,5ºC, 20,2 ± 0,19ºC, 19,7± 0,2
ºC, y 19,83 ± 0,11°C, respectivamente.
Los resultados obtenidos en el presente apartado indican que durante el
experimento de biodegradación las condiciones experimentales de pH, oxígeno y
temperatura no fueron limitantes para el desarrollo de la población microbiana responsable
del proceso biodegradativo.
Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos control, referencia y abiótico
Concentración (mg COD L-1)
En la Figura V.4 se muestran la evolución seguida por el sustrato residual,
concentración de carbono orgánico disuelto, en los ensayos control, referencia (benzoato
sódico) y abiótico (HgCl2) a lo largo del ensayo de biodegradación.
20
15
10
REF3
AB3
CO3
5
0
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (d)
Figura V.4. Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos control (CO3),
referencia (REF3) y abiótico (AB3) a lo largo del proceso de biodegradación.
Se puede observar como en el caso del ensayo control y abiótico la concentración
de carbono orgánico permanece prácticamente constante a lo largo del experimento de
biodegradación, con valores medios de 1,09 ± 0,80 y 18,59 ± 0,56 mg DOC L-1,
respectivamente. El porcentaje de mineralización alcanzado en el ensayo abiótico fue del
V-11
Capítulo 5
1,82 ± 3,32 %, descartando, por lo tanto, la contribución de procesos abióticos (tales como
precipitación, absorción, etc.) en la eliminación del tensioactivo.
Por el contrario, se puede apreciar como el benzoato sódico (sustancia de
referencia) fue rápidamente degradado, con porcentajes medios de degradación superiores
al 50 y 90 % al cabo de 6 y 9 días, respectivamente. Estos resultados están en consonancia
con los obtenidos por diversos autores (Nyholm y Kristensen, 1992; Staples y col., 2001;
Perales y col., 2007) para el mismo substrato (tiempo de vida media comprendido entre 1 y
7 días), indicando así una apropiada actividad microbiológica del agua de mar usada.
Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos con tensioactivo
En la Figura V.5 se recoge la evolución temporal de la concentración residual de
Empicol ESB 70/SP (mg L-1 COD) presente en el medio de ensayo para los tres ensayos de
biodegradación realizados. Los puntos indican los valores medios experimentales, mientras
que las barras de error denotan la desviación estándar (n=3).
-1
Concentración (mg COD L )
®
20
Etapa A
Etapa B
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (d)
Figura V.5. Evolución de la concentración residual de Empicol®ESB 70/SP (mg COD L-1)
en los ensayos de biodegradación. La línea continua roja corresponde a la
curva obtenida del ajuste de los valores experimentales a un modelo cinético
de primer orden, mientras que la línea continua azul representa el ajuste
correspondiente a un modelo logístico.
En primer lugar, se observa como al cabo de 120 días de ensayo el tensioactivo
Empicol®ESB 70/SP es mineralizado casi en su totalidad, alcanzando porcentajes de
degradación del 25, 60 y 97% al cabo de 9, 60 y 124 días de ensayo, respectivamente. Cabe
V-12
Alquil etoxisulfatos
destacar un descenso de la concentración inicial de carbono orgánico disuelto en el primer
día de ensayo, la cual se corresponde con una acusada disminución de la concentración de
oxígeno disuelto, tal y como observamos en la Figura V.3. Atendiendo al criterio
establecido por la directriz OPPTS, estos resultados (eliminación de COD inferior al 70% al
cabo de 60 días de ensayo) no descartan la capacidad del medio acuático marino para
degradar el tensioactivo aniónico estudiado, aunque sería necesario realizar ensayos
adicionales de biodegradación, por ejemplo, empleando concentraciones iniciales de
tensioactivo inferiores (USEPA, 1998). Sin embargo, los resultados obtenidos tras un
periodo de experimentación de 124 días indican un alto grado de mineralización del
tensioactivo estudiado (97% al cabo de 124 días). Este elevado porcentaje de
biodegradación parece indicar que, efectivamente, existe un potencial para la
mineralización de estos tensioactivos en el medio marino, si bien a una baja velocidad de
degradación si la comparamos con otros tensioactivos o el sustrato de referencia.
Por otro lado, se puede apreciar la existencia de dos etapas durante el proceso de
mineralización del tensioactivo aniónico (Figura V.5). La primera etapa (etapa A) se
encuentra comprendida entre el momento inicial de ensayo hasta el día 45,
aproximadamente, y se caracteriza por una rápida velocidad de degradación y la ausencia
de una fase de adaptación de los microorganismos responsables de la biodegradación. La
segunda etapa (etapa B) abarca aproximadamente desde el día 46 hasta el final del ensayo
y, a diferencia de la primera etapa (etapa A), se puede observar una acusada fase de
adaptación de la población bacteriana y una velocidad de degradación más lenta.
La presencia de estas dos etapas durante la mineralización del Empicol®ESB
70/SP puede justificarse atendiendo al mecanismo de biodegradación de estos tensioactivos
propuestos por Steber y Berger (1995) (Figura V.2) y a los resultados obtenidos por
Manzano y col. (1998) y Perales y col. (2007). Así, Steber y Berger (1995) establecieron
varias posibles rutas de biodegradación que incluyen procesos de hidrólisis y ω-β
oxidaciones, entre otras. Por otro lado, en un estudio llevado a cabo por Manzano y col.
(1998) se mostraba que la degradación del tensioactivo no-iónico NPEO, cuyo principal
mecanismo inicial de ruptura consiste en la hidrólisis de la cadena etoxilada, presentaba una
fase de aclimatación relativamente corta (tiempo de latencia = 1-3 días). Por el contrario,
Perales y col. (2007) mostraron la presencia de una larga fase de adaptación (tiempo de
latencia = 6,67 ± 0,6 días) durante la degradación del tensioactivo aniónico LAS, cuyo
mecanismo inicial de degradación consiste en ω-β oxidaciones (Schöberl, 1989; Scott y
Jones, 2000). Teniendo en cuenta estas consideraciones, los resultados obtenidos en el
presente experimento parecen indicar que durante la primera etapa (etapa A) predomina la
ruptura hidrolítica de los enlaces éter (corto periodo de aclimatación) mientras que en una
segunda etapa (etapa B), estos metabolitos son degradados vía ω-β oxidaciones (largo
periodo de aclimatación).
V-13
Capítulo 5
Con el fin de conocer la cinética de mineralización del tensioactivo en el medio de
ensayo, y al igual que se ha realizado en los anteriores capítulos, se ajustaron los valores
experimentales obtenidos para ambas etapas (etapas A y B) a diferentes modelos cinéticos
de consumo de sustrato propuestos por Simkins y Alexander (1984) y Quiroga y col.
(1999). Los resultados obtenidos a partir del análisis estadístico demuestran que el
tensioactivo Empicol®ESB 70/SP muestra una cinética de primer orden durante la primera
etapa del proceso (etapa A) mientras que durante la segunda etapa (etapa B) el modelo
cinético logístico es el que mejor se ajusta a los datos experimentales. En las Tablas V.3 y
V.4 se recogen los valores de los parámetros cinéticos y estadísticos correspondientes al
modelo cinético de mejor ajuste para cada una de las etapas.
Tabla V.3.
Parámetros cinéticos correspondientes a los resultados de biodegradación de
Empicol®ESB 70/SP en agua de mar.
Parámetros cinéticos a
Modelo
S0
(mg COD L-1)
K1
(d-1)
Primer orden b
16,05 ± 1,48
0,016 ± 0,005
(etapa A)
b
Logístico
8,23 ± 1,46
-(etapa B)
a
Datos presentados como valor medio ± DE (n=3)
b
Simkins y Alexander (1984)
Tabla V.4.
B0
(mg COD L-1)
KLg
(mg COD L-1 d-1)
--
--
0,001 ± 0,004
0,012 ± 0,009
Parámetros estadísticos correspondientes a los resultados de biodegradación
de Empicol®ESB 70/SP en agua de mar.
Parámetros estadísticos
Modelo
R2
b
χ2
Primer orden
0,93 36,65
(etapa A)
b
Logístico
0,95 24,03
(etapa B)
b
Simkins y Alexander (1984)
ν
Q
21
0,050
26
0,574
Al objeto de determinar la velocidad de mineralización del tensioactivo
Empicol®ESB 70/SP bajo las condiciones ensayadas, esto es, los valores del periodo de
latencia y de vida media, se han sustituido los valores de los parámetros cinéticos obtenidos
en la Tabla V.3 en las expresiones propuestas por Perales y col. (2007) para el modelo de
primer orden y logístico (véase capítulos 3 y 4). Así, los valores de tiempo de latencia (tL),
t50 (el tiempo necesario para alcanzar un 50% de biodegradación, sin considerar el tiempo
V-14
Alquil etoxisulfatos
de latencia) y tiempo de vida media (t1/2), calculados para la etapa A fueron de 3,3, 15,3 y
18,6 días, respectivamente. En el caso de la etapa B, los valores de tL, t50 y t1/2 obtenidos
fueron 26,5, 23,3 y 49,8 días, respectivamente.
La velocidad de degradación obtenida en el presente trabajo para el tensioactivo
Empicol®ESB 70/SP (C12-14AE2S) resulta inferior a las mostrados por otros autores para
diversos AES y empleando un medio mineral inoculado (50% mineralización al cabo de 35
días de ensayos). Así, por ejemplo, Schöberl y col. (1988), en un ensayo de fácil
biodegradabilidad (OECD 301), mostraron porcentajes de mineralización del 58-100% y
96-100% al cabo de 28 días de ensayo para los tensioactivos C12–14AE2S y C12–15oxo-AE3S,
respectivamente. Por otro lado, Painter (1992) para un alquil etoxilado de similar estructura
química (C12–14AE3S) encontró porcentajes de biodegradación primaria del tensioactivo C1214AE3S comprendidos entre el 90 y 100% al cabo de 1-5 días de ensayo. Steber y Berger
(1995), empleando el método de frasco cerrado, también observaron una completa
mineralización del tensioactivo C12–18AE8.5S en un periodo inferior a 28 días.
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estándar
Ensayos de toxicidad con microalgas marinas
En la Figura V.6 se muestra la evolución temporal de la concentración neta de
biomasa (densidad óptica neta, DOn = DOt=t – DOt=0) para diferentes concentraciones de
exposición de Empicol®ESB 70/SP (mg L-1) en los ensayos estándar de toxicidad con
microalgas. Se puede apreciar como la toxicidad del tensioactivo aniónico varía
considerablemente dependiendo de la especie ensayada. En general, se observa una
inhibición del crecimiento con respecto al control para todas las microalgas y
concentraciones ensayadas al cabo de 24 horas de exposición. Asimismo, se aprecia como
al cabo de las 96 horas de exposición estos efectos son más acusados, especialmente en las
microalgas N. gaditana, C. gracilis y D. salina. Por otro lado, se pueden observar valores
negativos de DOn al cabo de las 24 horas en todas las microalgas menos N. gaditana,
indicando efectos tóxicos letales sobre las microalgas. Sin embargo, al cabo 48 horas de
ensayo se produce una recuperación de los cultivos para casi todas las concentraciones
ensayadas. Se aprecia como en el caso de I. galbana y T.chuii esta recuperación del
crecimiento tiene lugar para todas las concentraciones ensayadas, mientras que en las
especies C. gracilis y D. salina ésta sólo tuvo lugar a concentraciones iguales o inferiores a
22,4 y 7 mg L-1 Empicol®ESB 70/SP, respectivamente.
V-15
Capítulo 5
1,2
0,8
28 mg L-1
0,6
0,4
0,2
0,0
I. galbana
0
17
20
22
25
1,0
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
1,0
1,2
N. gaditana
0
6
11
17
22
0,8
28 mg L-1
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,2
0
20
40
60
80
100
0
20
Tiempo (h)
0,6
60
80
100
80
100
C. gracilis
0
11
14
17
20
0,5
DOn (690 nm)
40
Tiempo (h)
0,4
0,3
22 mg L-1
0,2
0,1
0,0
-0,1
-0,2
0
20
40
60
80
100
Tiempo (h)
DOn (690 nm)
1,2
1,0
0,8
1,4
D. salina
0
1
3
4
6
7 mg L-1
0,6
0,4
1,0
0,8
T. chuii
0,6
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
-0,2
-0,2
0
20
40
60
Tiempo (h)
Figura V.6.
V-16
0
7
14
28
35
42 mg L-1
1,2
DOn (690 nm)
1,4
80
100
0
20
40
60
Tiempo (h)
Evolución de la concentración neta de biomasa (DOn, 690 nm) en el ensayo
de toxicidad estándar con microalgas. Las barras de error denotan las
desviaciones estándares (n=3).
Alquil etoxisulfatos
En la Tabla V.5 se recogen los valores de las concentraciones de inhibición del
crecimiento (IC50), NOEC y LOEC calculadas para cada una de las microalgas ensayadas y
un periodo de exposición de 96 horas.
Tabla V.5.
Valores de IC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estándar
con microalgas marinas y el tensioactivo Empicol®ESB 70/SP.
Organismo
Efecto tóxico
Concentración (mg L-1)
N. gaditana
96-h IC50
22,05 (21,10-28,66)a
96-h NOEC
8,40b
96-h LOEC
11,20b
96-h IC50
24,02 (21,39-27,73)a
96-h NOEC
16,80 b
96-h LOEC
19,60 b
96-h IC50
20,83 (20,56-21,07)a
96-h NOEC
16,80 b
96-h LOEC
19,40 b
96-h IC50
4,68 (4,09-4,93)a
96-h NOEC
2,80 b
96-h LOEC
4,20 b
96-h IC50
23,10 (20,46-24,55)a
96-h NOEC
7,00 b
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
96-h LOEC
14,00 b
Concentración, valor medio (Intervalo de confianza, 95%)
b
Concentración de efecto basado en concentraciones experimentales
a
Como puede observarse en la Tabla V.5 los valores 96-h IC50 calculados para la
microalga D. salina son notablemente más bajos que los calculados para el resto de
microalgas. Asimismo, no se aprecian diferencias significativas entre el resto de las
microalgas (N. gaditana, I. galbana, C. gracilis y T. chuii). También puede verse como los
valores medio NOEC (96-h) están comprendidos entre 4,20 mg L-1 para D. salina y 19,60
mg L-1 para I. galbana y C. gracilis. De acuerdo con los valores IC50 obtenidos, podemos
establecer el siguiente orden de sensibilidad de las diferentes microalgas al tensioactivo: D.
salina > N. gaditana ≈ I. galbana ≈ C. gracilis ≈ T. chuii. Cabe resaltar la variabilidad de
los valores de IC50 obtenidos en el caso de las microalgas N. gaditana e I. gracilis, para las
cuales se obtuvieron coeficientes de variación del 24,24 y 20,33%, respectivamente.
En el caso de algas marinas, tan sólo se han encontrado datos de toxicidad del
tensioactivo aniónico C12AES sobre las diatomeas Phaeodactylum tricornutum (EC50= 0,50
V-17
Capítulo 5
mg L-1) y Skeletonema costatum (EC50= 0,37 mg L-1) (Pavlic y col., 2005; Tabla V.1)
aunque resultan muy inferiores a los valores de toxicidad hallados en el presente trabajo
(Tabla V.5). La principales diferencias entre el ensayo llevado a cabo por Pavlic y col.
(2005) y el realizado en el presente trabajo radica en la estructura química del AES (si bien
el Empicol®ESB 70/SP presenta una mayor longitud de cadena alquílica (12-14 átomos de
carbono)) y el periodo de exposición empleado (Pavlic y col. emplearon un periodo de 72
horas frente al periodo de 96 horas empleada en el presente trabajo). Atendiendo a estas
diferencias cabría esperar una mayor toxicidad del Empicol®ESB 70/SP, sin embargo,
precisamente ocurre lo contrario, por lo que la causa sólo puede deberse al diferente grado
de sensibilidad de las especies ensayadas.
Respecto a las especies de agua dulce, los valores obtenidos son comparables a los
encontrados por Verge y col. (1996) para la especie S. capricornutum y el alcohol
etoxisulfato C12-14AES (EC50= 32 mg L-1, 72-h). Sin embargo, se observan diferencias
significativas con respecto a las microalgas P. subcapitata y S. subspicatus, las cuales
presentan una sensibilidad muy superior (EC50= 0,50-3,5 mg L-1, 72-h). Estos resultados
ponen de manifiesto, una vez más, la elevada variabilidad que presenta la toxicidad de estos
tensioactivos, dependiendo de la especie ensayada.
Ensayos de toxicidad con Artemia franciscana
A continuación se muestran los resultados de toxicidad obtenidos para el crustáceo
A. franciscana expuesto a crecientes concentraciones de Empicol®ESB 70/SP. La siguiente
gráfica muestra los porcentajes de artemias supervivientes obtenidos para periodos de
exposición de 48 y 72 horas.
A. franciscana
Supervivientes (%)
100
80
60
40
20
48h
72h
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Concentración (mg L-1)
Figura V.7.
V-18
Efecto del tensioactivo AES sobre A. franciscana a las 48 y 72 horas de
exposición. Los datos se representan como valor medio ± DE (n=5).
Alquil etoxisulfatos
A la vista de la Figura V.7 se puede observar que a medida que aumenta la
concentración de ensayo el porcentaje de supervivientes decrece como consecuencia del
efecto tóxico del agente de superficie, siendo este efecto más acusado para un periodo de
exposición de 72 horas. Por otro lado, cabe destacar una elevada variabilidad de los valores
de mortalidad correspondientes a las cinco réplicas.
En la Tabla V.6 se recogen los valores de los parámetros de toxicidad LC50
(concentración que produce la mortalidad del 50% de la población), NOEC y LOEC
calculados para un periodo de exposición de 48 y 72 horas.
Tabla V.6.
Valores de LC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estándar
con crustáceos y el tensioactivo AES.
Organismo
Efecto tóxico
Concentración (mg L-1)
A. franciscana
48-h LC50
38,30 (34,15-42,45)a
72-h LC50
23,92 (19,59-28,26)a
48-h NOEC
4,90 b
48-h LOEC
9,80 b
72-h NOEC
4,90 b
72-h LOEC
9,80 b
Concentración, valor medio (Intervalo de confianza, 95%)
b
Concentración de efecto basado en concentraciones experimentales
a
Se puede apreciar como, a pesar de que el efecto tóxico fue más acusado tras 72
horas de exposición, las concentraciones máximas de efectos observables (NOEC) y
concentraciones mínimas de efectos observables (LOEC) mostraron los mismos valores
para ambos periodos (NOEC = 4.90 mg L-1; LOEC = 9.80 mg L-1). Estos resultados son
comparables con lo obtenidos por Liwarska-Bizukojc y col. (2005) para el crustáceo marino
A. salina y el tensioactivo C12-14EO3S (LC50= 11,97 mg L-1). Dentro del conjunto de datos
hallados en la bibliografía para invertebrados de agua dulce (Tabla V.1), encontramos que
los valores hallados en el presente trabajo resultan inferiores a los obtenidos por Dyer y col.
(2000) para la crustáceo C. dubia y el tensioactivo C12AE2S (LC50= 55,98, 48-h) mientras
que por el contrario presentan menores efectos tóxicos que los observados por Maki y col.
(1979) para la especie D. magna y el tensioactivo de similar estructura química
C13,67AE2,25S (LC50= 1,17, 96-h). En el primer caso, estas diferencias pueden ser debidas a
la menor longitud de cadena de cadena alquílica del tensioactivo C12AE2S con respecto al
tensioactivo ensayado en este trabajo (C12-14AE2S) así como el menor tiempo de exposición
empleado. Por el contrario, en el segundo caso, dado que la estructura química de ambos
tensioactivos y el tiempo de exposición son similares, estas diferencias podrían ser debidas
a los diferentes grados de sensibilidad que presentan los organismos ensayados.
V-19
Capítulo 5
Dado que no se han encontrado datos de concentración de alquil etoxisulfatos en el
medio acuático marino, no es posible evaluar el riesgo que supone la presencia de estos
tensioactivos en este medio. Sin embargo, si tenemos en cuenta los niveles de alquil
etoxisulfatos encontrados en agua de río por Sanderson y col. (2006) (10-172 ng L-1)
podemos apreciar como los valores de concentración de no efecto (NOEC) calculados para
las microalgas y el crustáceo marino (NOEC= 2,8-16,8 mg L-1) son muy superiores a las
concentraciones ambientales encontradas. Partiendo de que las concentraciones de estas
sustancias en el medio marino serían incluso inferiores que en agua de río dado la gran
capacidad de dilución del medio, podemos afirmar que la presencia de estos compuestos no
supone, en principio, un riesgo ambiental para las poblaciones de estas microalgas y
crustáceo marino. No obstante, para corroborar esta hipótesis sería necesario llevar a cabo
un mayor número de estudios de toxicidad aguda y crónica incluyendo un mayor número de
especies así como un programa de monitoreo ambiental de estas sustancias en zonas
costeras.
3.3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación
En el siguiente apartado se presenta y discuten los resultados del estudio de la
evolución de la toxicidad del medio de ensayo a lo largo del proceso biodegradativo del
Empicol®ESB 70/SP. La evolución temporal de la toxicidad del medio de ensayo (%) y
grado de mineralización (% inhibición del crecimiento y mortalidad) durante el ensayo de
biodegradación del tensioactivo se recogen en la Figura V.8.
V-20
Alquil etoxisulfatos
80
60
60
40
40
20
20
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
20
40
60
80
100
80
60
60
40
40
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
20
0
120
0
0
20
Tiempo (días)
100
60
60
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
20
40
20
0
Biodegradación (%)
80
0
0
20
40
60
80
100
60
60
40
40
20
20
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
0
20
40
20
20
0
0
60
80
100
120
Mortalidad, 72-h (%)
60
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
Tiempo (días)
40
60
80
0
100
120
A. franciscana
100
100
Biodegradación (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
60
40
100
80
0
80
20
120
Tiempo (días)
80
0
100
80
120
T. chuii
40
80
D. salina
Tiempo (días)
100
60
100
Inh. crecimiento, 96-h (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
80
40
40
Tiempo (días)
C. gracilis
100
20
Biodegradación (%)
0
0
80
100
80
80
60
60
40
LC,72-h (%)
Biodegradación (%)
20
0
40
20
Biodegradación (%)
0
100
Biodegradación (%)
80
I. galbana
100
Biodegradación (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
100
Inh. crecimiento, 96-h (%)
N. gaditana
100
0
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (días)
Figura V.8. Evolución del efecto tóxico del medio de ensayo y porcentaje de
mineralización durante el experimento de biodegradación del tensioactivo.
De manera general, se observa una disminución del efecto toxico del medio a lo
largo del proceso de mineralización del Empicol®ESB 70/SP, esto es, una detoxificación
del medio de ensayo. En el caso de D. salina se puede apreciar un efecto tóxico máximo
(100% inhibición del crecimiento) durante los primeros estadíos de biodegradación (40
días, aprox.). Este hecho se debe a la alta sensibilidad que presenta esta especie de
V-21
Capítulo 5
microalga (como se pudo comprobar en el apartado 3.2) en comparación con la elevada
concentración inicial de tensioactivo usado en el experimento de biodegradación. Por el
contrario, para el resto de organismos ensayados se puede observar niveles de
detoxificación del 100% al cabo de 96 días (77% biodegradación) en el caso de I. galbana,
C. gracilis, T. chuii y A. franciscana y de 124 días (100% biodegradación) en el caso de N.
gaditana y D.salina (caso A, véase capítulo 3, apartado 3.3).
Si consideramos los valores de efectos tóxicos obtenidos cuando se alcanza
aproximadamente un 50% de mineralización del tensioactivo (día 41 de ensayo), podemos
observar que éstos varían notablemente dependiendo de la especie ensayada. Así, por
ejemplo, en el caso de D. salina se observa un porcentaje de efecto del 100%, mientras que
las microalgas N. gaditana, I. galbana, C. gracilis, y T. chuii muestran porcentajes de
efectos similares, estando comprendidos entre el 10 y 36%. En el caso del crustáceo marino
A. franciscana el efecto tóxico inicial (100% mortalidad) se ve reducido un 90% al cabo de
41 días de ensayos (50% biodegradación, aprox.).
Teniendo en cuenta los valores de toxicidad alcanzados al inicio del experimento
de biodegradación (0% mineralización) así como los efectos tóxicos observados al alcanzar
aproximadamente un 50% de mineralización (día 41 de ensayo), podemos establecer el
siguiente orden de sensibilidad al medio de ensayo: D. salina > N. gaditana ≈ I. galbana ≈
C. gracilis ≈ T. chuii > A. franciscana, siendo la microalga D. salina la más sensible. Si
comparamos estos resultados con los obtenidos anteriormente en los ensayos de toxicidad
estándar con Empicol®ESB 70/SP podemos observar que la sensibilidad de las especies al
tensioactivo aniónico es similar a la que presentan al medio de ensayo, a excepción del
crustáceo, el cual se mostró ligeramente más resistente al medio de ensayo que la microalga
T. chuii. Esta similitud entre los resultados obtenidos en ambos experimentos parece indicar
que el tensioactivo (y no los metabolitos) constituyen la principal fuente de toxicidad del
medio de ensayo.
Atendiendo a los resultados obtenidos para la mayoría de las especies de
microalgas y el crustáceo marino, podemos concluir que durante la biodegradación del
tensioactivo se produce una clara detoxificación del medio sin formación de metabolitos
más tóxicos (en cantidad y/ó naturaleza) que el tensioactivo original y por lo tanto, que el
tensioactivo aniónico Empicol®ESB 70/SP presenta una biodegradación ambientalmente
aceptable.
V-22
Alquil etoxisulfatos
4. Conclusiones
Las principales conclusiones obtenidas en el presente capítulo son las siguientes:
•
El tensioactivo aniónico Empicol®ESB 70/SP presenta una elevada biodegrabilidad
(porcentaje de mineralización superior al 97%) en el medio acuático marino bajo las
condiciones ensayadas, aunque a una baja velocidad de biodegradación.
•
La biodegradación final o mineralización del tensioactivo en agua de mar presenta dos
etapas bien diferenciadas. Los resultados parecen indicar que la primera etapa
corresponde a la ruptura hidrolítica del tensioactivo, mientras que en la segunda etapa
tiene lugar la eliminación de los metabolitos generados durante la etapa anterior
mediante ω- y β-oxidaciones. La cinética de biodegradación del tensioactivo aniónico
durante la primera etapa sigue un modelo cinético de primer orden, mientras que
durante la segunda etapa, el modelo cinético que mejor describe la biodegradación
final del xenobiótico es el logístico.
•
La toxicidad del tensioactivo Empicol®ESB 70/SP depende significativamente del tipo
de organismo ensayado. Así, de las diferentes especies de microalgas estudiadas, la
microalga D. salina constituye, con una amplia diferencia entre las otras cuatro
especies, la más sensible al tensioactivo. Respecto al crustáceo marino A. franciscana,
a pesar de que los efectos tóxicos estudiados han sido diferentes a los de las
microalgas, se obtienen un grado similar de sensibilidad que para el resto de las
microalgas estudiadas.
•
Los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad con organismos acuáticos junto
con los datos disponibles de niveles ambientales de AES parecen indicar que las
concentraciones de AES presentes en el medio acuático marino no suponen un riesgo
ambiental.
•
Las medidas de toxicidad obtenidas en los ensayos combinados de toxicidad con el
experimento de biodegradación indican una clara detoxificación del medio durante el
proceso de mineralización del tensioactivo aniónico Empicol®ESB 70/SP sin
producción de intermediatos más tóxicos (en cantidad y/ó naturaleza) que el
tensioactivo original. Estos resultados permiten clasificar al tensioactivo ensayado
como un compuesto de biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
V-23
Capítulo 5
Referencias
BKH, C.E., 1994. Environmental data review of alkyl ether sulphates (AES). Final Report. The Dutch Soap
Association, Delft, The Netherlands.
Cardellini, P., Ometto, L., 2001. Teratogenic and Toxic Effects of Alcohol Ethoxylate and Alcohol Ethoxy Sulfate
Surfactants on Xenopus laevis Embryos and Tadpoles. Ecotoxicology and Environmental Safety 48, 170177.
Dyer, S.D., Stanton, D.T., Lauth, J.R., Cherry, D.S., 2000. Structure–activity relationships for acute and chronic
toxicity of alcohol ether sulfates. Environmental Toxicology and Chemistry 19, 608–616.
Feijtel, T.C.J., Van de Plassche, E.J., 1995. Environmental risk characterisation of 4 major surfactants used in The
Netherlands. NVZ report, The Netherlands.
Fendinger, N.J., Versteeg, D.J., Weeg, E., Dyer, S., Rapaport, R.A., 1994. Environmental behaviour and fate of
anionic surfactants. En: Baker, L.A. (Ed.). Environmental Chemistry of Lakes and Reservoirs. ACS
Advances in Chemistry Series No. 237. American Chemical Society, Washington DC, United States, pp.
528-557.
Fischer, W.K., 1982. The important aspects of ecological evaluation of fatty alcohols and their derivatives. En:
Henkel (Ed.). Fatty alcohols - Raw materials methods and uses, Dusseldorf, pp. 122-187.
Gerike, P., Jasiak, W., 1986. How completely are surfactants biodegraded? Tenside Deterg. 23, 300-304.
Griffith, E.T., Hales, S.G., Russell, N.J., Watson, G.K., 1986. Metabolite production during the biodegradation of
the surfactant sodium dodecyltriethoxy sulphate under mixed-culture die-away conditions. J. Gen.
Microbiol. 132, 963-972.
HERA, 2002. Alcohol ethoxysulphates (AES): Environmental Risk Assessment. Human and Environmental Risk
Assessment on ingredients of European household cleaning products.
Holt, M.S., Mitchell, G.C., Watkinson, R.J., 1992. The environmental chemistry, fate and effects of nonionic
surfactants. En: Oude, N.T.d. (Ed.). Detergents, The Handbook of Environmental Chemistry. SpringerVerlag, Berlin Heidelberg, Germany, pp. 89-144.
Itoh, S., Naito, S., Unemoto, T., 1987. Comparative studies on anaerobic biodegradation of anionic and non-ionic
surfactants. Eisei Kagaku 33, 415-422.
Lee, D.M., Guckert, J.B., Belanger, S.E., Feijtel, T.C.J., 1997. Seasonal temperature declines do not decrease
periphytic surfactant biodegradation or increase algal species sensitivity. Chemosphere 35, 1143-1160.
Little, A.D., 1981. Human safety and environmental aspects of major surfactants (supplement). En: Service, N.T.I.
(Ed.). A report to the Soap and Detergent Association, ADL. Reference 84048, Springfield, Virginia.
Liwarska-Bizukojc, E., Miksch, K., Malachowska-Jutsz, A., Kalka, J., 2005. Acute toxicity and genotoxicity of
five selected anionic and nonionic surfactants. Chemosphere 58, 1249-1253.
Madsen, T., Boyd, H.B., Nylén, D., Pedersen, A.R., Petersen, G.I., Simonsen, F., 2001. Environmental and health
assessment of substances in household detergents and cosmetic detergents and cosmetic detergent
products. DK-EPA, Denmark.
V-24
Alquil etoxisulfatos
Maki, A.W., 1979. Correlations between Daphnia magna and fathead minnow (Pimephales promelas) chronic
toxicity values for several classes of test substances. J. Fish Res. Board Can. 36, 411-421.
Matthijs, E., Holt, M.S., Kiewiet, A.T., Rijs, G.B., 1999. Environmental monitoring for linear alkylbenzene
sulfonate, alcohol ethoxylate, alcohol ethoxy sulfate and soap. Environ Toxicol Chem 18, 2634-2644.
Modler, R.F., Gubler, R., Inoguchi, Y., 2004. Detergent Alcohols. Chemical Economics Handbook Marketing
Research Report. SRI International, Menlo Park, CA
Nuck, B.A., Federle, T.W., 1996. A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabeled compounds
under realistic conditions. Envir. Science Technol. 30, 3597-3603.
Nyholm, N., Kristensen, P., 1992. Screening methods for assessment of biodegradability of chemicals in seawater
results from a ring test. Ecotoxicol Environ Saf 23, 161-172.
Painter, H.A., 1992. Anionic surfactants. En: Oude, N.T., Huntzinger, O. (Eds.). Anthropogenic Compounds.
Detergents. Springer, Berlin, Germany, pp. 1-88.
Pavlic, Z., Vidakovic-Cifrek, Z., Puntaric, D., 2005. Toxicity of surfactants to green microalgae
Pseudokirchneriella subcapitata and Scenedesmus subspicatus and to marine diatoms Phaeodactylum
tricornutum and Skeletonema costatum. Chemosphere 61, 1061-1068.
Perales, J.A., 2001. Variabilidad de la biodegradación y toxicidad de compuestos xenobióticos en el medio
marino. Aplicación a lineal alquilbenceno sulfonatos en aguas del Golfo de Cádiz. Tesis Doctoral. Dpto.
de Ingeniería Química, Tec. Alimentos y Tec. Medio Ambiente. Universidad de Cádiz, Cádiz.
Perales, J.A., Manzano, M.A., Garrido, M.C., Sales, D., Quiroga, J.M., 2007. Biodegradation kinetics of linear
alkylbenzene sulphonates in sea water. Biodegradation 18, 63-70.
Rand, G.M., 1995. Fundamentals of aquatic toxicology. Effects, Environmental Fate and Risk Assessment. Taylor
& Francis, Washington.
Reiff, B., Lloyd, R., How, M.J., Brown, D., Alabaster, J.S., 1979. The acute toxicity of eleven detergents to fish:
Results of an interlaboratory exercise. Water Research 13, 207-210.
Sanderson, H., Dyer, S.D., Price, B., Nielsen, A.M., Compernolle, R.V., Selby, M., Stanton, K., Evans, A., Ciarlo,
M., Sedlak, R., 2006. Ocurrence and weight-of-evidence risk assessment of alkyl sulfates, alkyl
ethoxysulfates, and linear alkylbenzene sulfonates (LAS) in river water and sediments. Science of the
Total Environment 368, 695-712.
Scott, M.J., Jones, M.N., 2000. The biodegradation of surfactants in the environment. Biochim Biophys Acta
1508, 235-251.
Schöberl, P., 1989. Basic principles of LAS biodegradation. Tenside surfactants 26, 86-94.
Schöberl, P., Bock, K.J., Huber, L., 1988. Ökologisch relevanten Daten von Tensiden in Wasch- und
Reinigungsmitteln (en alemán) [Ecologically relevant data for surfactants in laundry detergents and
cleaning agents]. Tenside Surfactants Detergents 25, 86-98.
Schröder, F.R., 1995. Concentrations of anionic surfactants in receiving riverine water. Tenside Surf. Det. 32, 492497.
V-25
Capítulo 5
Simkins, S., Alexander, M., 1984. Models for mineralization kinetics with the variables of substrate concentration
and population density. Appl Environ Microbiol 47, 1299-1306.
Singh, R.P., Gupta, N., Singh, S., Singh, A., Suman, R., Annie, K., 2002. Toxicity of ionic and nonionic
surfactants to six macrobes found in Agra, India. Bull Environ Contam Toxicol 69, 265-270.
Staples, C.A., Naylor, C.G., Williams, J.B., Gledhill, W.E., 2001. Ultimate biodegradation of alkylphenol
ethoxylate surfactants and their biodegradation intermediates. Environ Toxicol Chem 20, 2450-2455.
Steber, J., 1991. Wie vollständig sind Tenside abbaubar? . Textilveredlung 26, 348-354.
Steber, J., Berger, H., 1995. Biodegradability of anionic surfactants. En: Karsa, D.R., R., P.M. (Eds.).
Biodegradability of Surfactants. Blackie Academic & Professional, Glasgow, United Kingdom, pp. 134182.
Swisher, R.D., 1987. The analytical methods in surfactants biodegradation. Surfactant biodegradation, 2nd Edition,
47, M. Dekker, New York.
Temara, A., Carr, G., Webb, S., Versteeg, D., Feijtel, T., 2001. Marine risk assessment: linear alkyl benzene
sulponates (LAS) in the North Sea. Mar Pollut Bull 42, 635-642.
USEPA, 1998. Fate, transport and transformation test guidelines. OPPTS. "Biodegradability in Sea Water"
835.3160. EPA 712–C–98–351 The Federal Bulletin Board. U.S. Government Printing Office
Washington, DC.
Verge, C., Moreno, A., Roque, S., 1996. Toxicity of anionic surfactants to green microalgae "Scenedesmus
subspicatus" and "Selenastrum capricornutum". Tenside Surfantants Detergents 33, 166-169.
White, G.F., Russell, N.J., 1988. Mechanisms of bacterial biodegradation of alkyl sulphate and alkyl-polyethoxy
sulphate surfactants. En: D.L. Houghton, R.N.S., H.O.W. Eggins (Ed.). 7th Int. Biodeterioration Symp.
Elsevier, Barking, UK, pp. 325-332.
Yamane, A.N., Okada, M., Sudo, R., 1984. The growth inhibition of planktonic algae due to surfactants used in
washing agents. Water Res. 8, 1101-1105.
Ying, G.G., 2006. Fate, behavior and effects of surfactants and their degradation products in the environment.
Environ Int 32, 417-431.
Yoshimura, K., Masuda, F., 1982. Biodegradation of Sodium Alkyl Poly(oxyalkylene)sulfates. J. Am. Oil Chem.
Soc. 59, 328-332.
V-26
Capítulo 6
ALCOHOLES ETOXILADOS
Resumen
Los alcoholes etoxilados (AE) constituyen una de las principales familias de
tensioactivos no-iónicos y destacan por su baja-moderada capacidad de formación de
espumas, resistencia a la dureza del agua y biodegradabilidad. El siguiente capítulo está
dedicado al estudio de la biodegradabilidad y ecotoxicidad del alcohol etoxilado comercial
Findet®1214N/23 en agua de mar. Los resultados obtenidos muestran un elevado grado de
mineralización bajo las condiciones ensayadas, aunque a baja velocidad (>90% al cabo de
108 días de ensayo). El modelo cinético que mejor describe la cinética de mineralización
del tensioactivo en el medio de ensayo consiste en un modelo de orden cero, obteniéndose
valores de tiempo de latencia (tL) y tiempo de vida media (t1/2) de 11,5 y 56,8 días,
respectivamente. En lo que respecta a la toxicidad, los valores de IC50 (96-h) para las
microalgas se encuentran comprendidos entre 5 mg L-1 para C. gracilis y 35,03 mg L-1 para
T. chuii, mientras que en el caso del crustáceo marino el valor de LC50 (72-h) calculado es
de 23,33 mg L-1. Los ensayos de toxicidad combinados con el experimento de
biodegradación muestran una clara detoxificación del medio del ensayo a lo largo del
proceso de mineralización del tensioactivo, lo que viene a indicar que el tensioactivo
presenta una biodegradación ambientalmente aceptable.
Capítulo 6
1. Introducción
Alcoholes etoxilados. Características y usos
Los alcoholes etoxilados (AE) constituyen una de las familias de tensioactivos noiónicos más utilizadas en productos de limpieza domésticos e industriales, así como en
diversos sectores tales como la agricultura, industria textil, industria del papel, etc. Estos
tensioactivos fueron desarrollados como una alternativa ambientalmente más lábil que los
tensioactivos no iónicos alquilfenoles etoxilados (Scott y Jones, 2000), dada la elevada
toxicidad que presentan los metabolitos de degradación de estos últimos (Naylor y col.,
1992; Jobling y Sumpter, 1993; Ahel y col., 1994; White y col., 1994; Ahel y col., 1996).
Entre sus principales características destacan la baja-moderada capacidad de formación de
espumas, resistencia a la dureza del agua y biodegradabilidad. Estas propiedades, tan
deseables desde un punto de vista industrial, han provocado el incremento de su producción
y consumo en los últimos años. Para el año 2002, el volumen de consumo de AE estimado
(empleados exclusivamente en productos domésticos de limpieza) ha sido de 275.000
toneladas (HERA, 2007), mientras que otras estimaciones establecen una producción
mundial anual de 1,1 millones de toneladas (Hauthal, 2004).
Los alcoholes etoxilados son obtenidos a partir de alcoholes de cadena lineal
derivados principalmente de aceite de coco, de grasa animal o sintéticos, a los que se une
un número variable de moles de oxido de etileno. En la Figura VI.1 se recoge la estructura
química general de los AE (n = número de unidades etoxiladas).
R O
O
OH
n
Figura VI.1. Estructura molecular del tensioactivo no-iónico alcohol etoxilado (R =
CxH2x+1, x= 8-18, n = 0-19).
De manera general, las formulaciones de alcoholes etoxilados de uso comercial
están compuestas por una mezcla compleja de oligómeros, con una longitud media de
cadena etoxilada comprendida entre 1 y 20 unidades, mientras que la cadena
hidrocarbonada suele contener entre 8 y 18 átomos de carbono (Mezzanotte y col., 2002).
En función del tipo de cadena alquílica presente en la molécula se puede distinguir entre:
los alcoholes etoxilados de cadena alquílica lineal y los alcoholes etoxilados de cadena
alquílica ramificada. La proporción de oligómeros (número de unidades etoxiladas)
generalmente adopta una distribución de Poisson (Swisher, 1987) y afecta a las propiedades
VI-2
Alcoholes etoxilados
físico-químicas, biodegradabilidad en el medio y uso final (Wang y Fingas, 1993; Ahel y
col., 2000; Mezzanotte y col., 2002; Wind y Belanger, 2006).
Niveles de alcoholes etoxilados en el medio acuático
Tradicionalmente, la determinación de alcoholes etoxilados en influentes y
efluentes de estaciones depuradoras de aguas residuales (EDARs) se ha llevado a cabo
mediante métodos analíticos cualitativos juntos con otros métodos empleados para el
análisis del contenido global en tensioactivos no-iónicos, como por ejemplo el método
BiAs (método de la sustancia activa al bismuto). En la actualidad, los esfuerzos están
directamente dirigidos hacia el desarrollo de nuevos métodos para la determinación
específica de AE a bajas concentraciones en muestras ambientales.
Diversos son los estudios que analizan el comportamiento de estos compuestos
durante el tratamiento de aguas residuales. Así, por ejemplo, Holt y col. (1992), para una
concentración de 3,4 mg L-1 AE en el influente de una EDAR, encontraron concentraciones
en el efluente de 40 µg L-1, lo que supone una eliminación del 99%, aproximadamente. Por
otro lado, Madsen y col. (2001), encontraron porcentajes de eliminación de los alcoholes
etoxilados durante el tratamiento de aguas residuales del 97,5%, con valores de 6-20 µg L-1
AE en el efluente. En un estudio de monitorización llevado a cabo en diferentes EDARs de
los Países Bajos se mostraban altos porcentajes de eliminación de los alcoholes etoxilados,
siendo la concentración media de AE en los efluentes de 6,2 µg L-1 (Matthijs y col., 1999).
La presencia de AE en el medio acuático natural también ha sido objeto de estudio
por parte de diversos autores, aunque solamente se han encontrado valores de
concentraciones ambientales en agua de río. No obstante, los estudios realizados en agua de
río indican una baja presencia de estos compuestos en el medio acuático natural. Así, por
ejemplo, Holt y col. (1992) encontraron concentraciones medias de 4 µg L-1 del alcohol
etoxilado C14-15 en el río Ohio (EEUU). Por otro lado, estudios llevados a cabo en un río en
Japón no encontraron presencia alguna de AE en el compartimento acuático (límite de
detección del método ≤ 5 µg L-1), mientras que en muestras de sedimentos las
concentraciones variaron entre 0 y 1 mg kg-1 (HERA, 2007).
Biodegradabilidad de los alcoholes etoxilados
La ruta de biodegradación aerobia de los alcoholes etoxilados (AE) ha sido
seguida en numerosos estudios (Osburn, 1966; Patterson, 1970; Swisher, 1987), siendo la
más aceptada la propuesta por Marcomini y col. (2000a, 2000b). En la Figura VI.2 se
representan los posibles mecanismos aerobios de biodegradación de los alcoholes
etoxilados (Marcomini y col., 2000a, 2000b).
VI-3
Capítulo 6
Alcohol etoxilado
R1
O
R2
O
Hidrólisis central
(mecanismo a)
OH
n
Hidrólisis oxidativa
(mecanismo c)
ω-oxidación
(mecanismo b)
O
R1
OH
R2
+
HO
Alcohol
O
R1
OH
HO
n
Polietilenglicol
R1
O
R3
O
O
R2
n
Alcohol etoxilado carboxilado
O
OH
Hidrólisis
oxidativa
O
Ácido graso
HO
O
O
OH
HO
n-m
PEG monocarboxilado
R1
R3
O
O
OH
n
O
Alcohol etoxilado dicarboxilado
+
Acortamiento no
oxidativo
β-oxidación
Hidrólisis
O
HO
ω-oxidación
Hidrólisis oxidativa
R1
R2
OH
O
O
Alcohol etoxilado carboxilado
β-oxidación
Hidrólisis
Oxidación
OH
O
PEG
OH
n-m
HO
O
O
O
OH
n-m
PEG dicarboxilado
Figura VI.2. Rutas de biodegradación aerobia propuesta para los tensioactivos no-iónicos
alcoholes etoxilados (AE) (R1= -H para alcoholes lineales, cadena alquílica
lineal o ramificada de 1-6 átomos de carbono para alcoholes ramificados;
R2= cadena alquílica lineal de 10 átomos de carbono; R3= cadena alquílica
lineal de 9 átomos de carbono; m= número par) (Marcomini y col., 2000a,
2000b).
Un posible mecanismo consiste en la ruptura central de la molécula (mecanismo
a), dando lugar a la formación de polietilenglicol con la misma longitud que la cadena
etoxilada, y los correspondientes alcoholes. Posteriormente, las moléculas de
polietilenglicol son degradadas mediante un mecanismo hidrolítico y/ó hidrolítico oxidativo
con la consiguiente formación de polietilenglicol mono y/ó dicarboxílico. Por otro lado, los
alcoholes son transformados en los correspondientes ácidos grasos y posteriormente
incorporados a las rutas metabólicas comunes de los ácidos grasos.
VI-4
Alcoholes etoxilados
Otro posible mecanismo consiste en una oxidación del carbono terminal de la
cadena alquílica (ω-oxidación) originando la formación de alcoholes etoxilados
carboxilados y en última instancia (vía β-oxidaciones) una serie de polietilenglicoles
carboxilados (mecanismo b).
Finalmente, una tercera posibilidad consiste en un ataque primario al carbono
terminal de la cadena polietoxilada mediante un proceso hidrolítico similar al que muestran
los tensioactivos no iónicos del tipo alquilfenol polietoxilado (mecanismo c), dando lugar a
alcoholes etoxilados carboxilados de cadenas más cortas y finalmente, tras un proceso de
ω- y β-oxidaciones e hidrólisis, polietilenglicol dicarboxilado.
A pesar de las diferentes posibles vías de degradación, estudios realizados sobre
diversos AE parecen indicar que, en el caso de AE lineales y la mayoría de los
monoramificados, el principal mecanismo de biodegradación consiste en la ruptura del
enlace central (mecanismo a), mientras para el resto de alcoholes etoxilados ramificados el
mecanismo principal propuesto consiste en la biodegradación primaria a través de una ωoxidación a la cadena polietoxilada (mecanismo b) (Marcomini y col., 2000a, 2000b). Por
el contrario, en condiciones anaerobias, la ruptura del grupo terminal etoxi parece ser la
fase inicial del ataque microbiano (mecanismo c; Huber et al., 2000).
Numerosos son los estudios que se han encontrado en la bibliografía en relación a
la biodegradabilidad primaria y final de los AE en el medio acuático. No obstante, la
mayoría de estos estudios emplean como medio de ensayo agua continental o bien un
medio mineral. De manera general, los alcoholes etoxilados son considerados fácilmente
biodegradables bajo condiciones aerobias y anaerobias (Ying, 2006), alcanzando altos
porcentajes de biodegradación primaria en unidades de lodos activos y otros ambientes
acuáticos, aunque su mineralización presenta valores significativamente más bajos
(Reynolds y col., 1997). En las Tablas VI.1 y VI.2 se recogen algunos de los resultados de
mineralización de los alcoholes etoxilados, tanto lineales como ramificados, encontrados en
la bibliografía.
VI-5
Capítulo 6
Tabla VI.1. Resumen de los datos de biodegradación final o mineralización de alcoholes
etoxilados lineales (Madsen y col., 2001).
Compuesto
Tipo de ensayo
Resultado
C9-11 EO8
Frasco cerrado, 28 d
80% DTO
Referencia
Madsen y col., 1994
C16-18 EO5
Frasco cerrado, 28 d
65-75% DTO
Schöberl y col., 1988
27% DTO
C16-18 EO30
Frasco cerrado, 28 d
C12-18 EO10-14
Frasco cerrado, 28 d
69-86% DTO
C12-15 EO7
BOD, 30 d
92% DTO
C14-15 EO7
BOD, 30 d
83% DTO
C12-15 EO7
Evolución CO2, 28 d
82% DTCO2
Madsen y col., 1996
C12-15 EO9
Evolución CO2, 28 d
64-79% DTCO2
Kravetz y col., 1991
C12-14 EO7-8
Ensayo de agua de río, 28 d
100% COD
Kaluza y Taeger, 1996
C13 EO7-8
Ensayo de agua de río, 28 d
100% COD
C13-15 EO7-8
Ensayo de agua de río, 28 d
100% COD
Kravetz y col., 1991
Ensayo de agua de río, 28 d
100% COD
C15 EO7-8
*DTO= demanda teórica de oxígeno; DTCO2=demanda teórica de dióxido de carbono; COD= carbono orgánico
disuelto
Tabla VI.2. Resumen de los datos de biodegradación final o mineralización de alcoholes
etoxilados ramificados (Madsen y col., 2001).
Compuesto
Tipo de ensayo
Resultado
Oxo-C13-15 EO3-12
Ensayo OECD, 28 d
75% COD
Referencia
Schöberl y col., 1988
C10-14 EO7 (átomo de C cuaternario)
BOD, 30 d
40% DTO
Kravetz y col., 1991
Oxo-C12 EO5
Evolución CO2, 28 d
C11-15 EO7 (átomo de C cuaternario)
Evolución CO2, 28 d
> 60% DTCO2 Marcomini y col., 2000a
40-50% DTO Kravetz y col., 1991
Iso-C10 EO7-8
Ensayo de agua de río, 28 d
90% COD
Oxo-C11 EO7-8
Ensayo de agua de río, 28 d
100% COD
Iso-C13 EO7-8 (3 grupos –CH3)
Ensayo de agua de río, 28 d
100% COD
Iso-C13 EO7-8 (4 grupos –CH3)
Ensayo de agua de río, 28 d
62% COD
C13 EO7-8 (10% ramificación)
Ensayo de agua de río, 28 d
95% COD
C13 EO7-8 (25% ramificación)
Ensayo de agua de río, 28 d
95% COD
C13 EO7-8(46% ramificación)
Ensayo de agua de río, 28 d
50% COD
Oxo-C13-15 EO7-8
Ensayo de agua de río, 28 d
100% COD
Oxo-C14-15 EO9-20
Ensayo de agua de río, 28 d
65-75% COD
Kaluza y Taeger, 1996
Schöberl y col., 1988
Kaluza y Taeger, 1996
C15 EO7-8
Ensayo de agua de río, 28 d 100% COD
DTO= demanda teórica de oxígeno, DTCO2=demanda teórica de dióxido de carbono; COD= carbono orgánico
disuelto
VI-6
Alcoholes etoxilados
La biodegradabilidad de los AE depende principalmente de la estructura de la
cadena alquílica y, en menor medida, de su longitud así como del número de unidades
etoxiladas presentes en la molécula (Dorn y col., 1993). De manera general, los alcoholes
grasos lineales presentan un mayor grado de biodegradabilidad que los alcoholes
ramificados (Tabla VI.1, Tabla VI.2).
En el caso de alcoholes etoxilados ramificados, uno de los principales factores que
afectan a la biodegradabilidad de estos compuestos es el número de ramificaciones
presentes en la cadena alquílica. Kaluza y Taegar (1996), usando alcoholes etoxilados
ramificados de similar número de átomos de carbono en la cadena alquílica pero con
diferente grado de ramificación (C13 EO7-8), encontraron porcentajes de mineralización
menores para aquellos que presentaban mayor grado de ramificación (Tabla VI.2). También
observaron una disminución de la biodegradabilidad de los AE ramificados (Iso-C13 EO7-8)
a medida que aumentaba el número de grupos metilos en la cadena alquílica. Por otro lado,
la ramificación de la cadena alquílica no sólo se ha demostrado afectar a la extensión de la
biodegradación sino también a su velocidad, siendo más lenta cuanto mayor es el grado de
ramificación (Holt y col., 1992; Balson y Felix, 1995).
También se ha demostrado que la presencia de átomos de carbono cuaternarios en
la molécula afecta negativamente a la biodegradabilidad de estos tensioactivos. Así, por
ejemplo, estudios realizados por Kravetz y col. (1991) encontraron porcentajes de
mineralización muy bajos (40-50%) para los alcoholes etoxilados que presentan átomos de
carbono cuaternarios en la cadena alquílica en comparación con otros alcoholes etoxilados
ramificados (Tabla VI.2).
En lo que respecta a la longitud de la cadena etoxilada, ésta influye en la
hidrofobicidad del AE influyendo así en la biodegradabilidad en términos de
biodisponibilidad. Así, a medida que aumenta la longitud de la cadena etoxilada disminuye
la biodisponibilidad del tensioactivo como consecuencia de un descenso de la
hidrofobicidad y un aumento del tamaño molecular, limitando el transporte de la molécula a
través de la pared celular (Balson y Felix, 1995). En aquellos alcoholes etoxilados
compuestos por más de 20 unidades etoxiladas, se ha observado una disminución de su
velocidad de degradación (Scharer y col., 1979; Holt y col., 1992), mientras que en aquellos
con más de 50 unidades etoxiladas se ha encontrado un aumento del porcentaje de
biodegradación primaria (Birch, 1984).
Toxicidad de los alcoholes etoxilados en el medio acuático
La evaluación de la toxicidad, tanto aguda como crónica, de los alcoholes
etoxilados ha sido objeto de estudio de diversos autores. Existe una amplia bibliografía
acerca de la toxicidad de estos compuestos sobre diferentes grupos taxonómicos: bacterias,
VI-7
Capítulo 6
algas, insectos, moluscos, crustáceos, peces y plantas acuáticas. No obstante, cabe destacar
que la mayoría de estos estudios se han llevado a cabo sobre especies de agua dulce, siendo,
por lo tanto, bastante limitada la bibliografía existente en relación a la toxicidad de estos
tensioactivos sobre especies marinas.
El mecanismo de toxicidad de los AE consiste en una narcosis de tipo no polar,
caracterizado por la interacción entre el tensioactivo y las membranas biológicas de los
organismos (Roberts, 1991; Boeije y col., 2006). Sin embargo, el efecto tóxico de estos
contaminantes está claramente relacionado con su hidrofobicidad. En general, los
homólogos de AE de mayor cadena alquílica y, por tanto más hidrófobos, pueden penetrar
en la pared celular con mayor eficiencia, siendo, por lo tanto, más tóxicos (Boeije y col.,
2006). Sin embargo, estos homólogos deben de ser, a su vez, lo suficientemente solubles
para permitir entrar en contacto con el organismo (biodisponibilidad). Así, por ejemplo, en
el caso de alcoholes etoxilados con cadena alquílica igual o superior a 15 átomos de
carbono, para los cuales cabe esperar una toxicidad elevada, ésta disminuye como
consecuencia de su baja solubilidad (SIAR, 2006).
Los datos recogidos en la bibliografía en torno a la toxicidad de los AE, tanto
lineales como ramificados, sobre organismos acuáticos, en general, presentan una elevada
variabilidad inter- e intra-especifica (Tablas VI.3 y VI.4). Van de Plassche y col. (1999)
establecieron que esta elevada variabilidad puede ser debido a la heterogeneidad que
presentan la mayoría de las formulaciones de los AE de uso comercial, las cuales suelen
estar constituidos por mezclas de varias longitudes de cadena alquílica y número de
unidades etoxiladas. Otra posible fuente de variabilidad en los datos de toxicidad radica en
la presencia de un 2-5 % de alcohol no etoxilado y entre un 0,5 y 2 % de polietilenglicol en
muchas de las formulaciones comerciales (Van de Plassche y col., 1999). Otros autores
defienden que estas diferencias también pueden deberse a las diferentes condiciones usadas
en los ensayos (HERA, 2007).
En general, los valores de toxicidad (EC50) de los AE sobre microalgas varían
entre 0,05 y 50 mg L-1, mientras que para el caso de invertebrados los valores de efectos
tóxicos agudos (EC50) suelen estar comprendidos entre 0,1 y >100 mg L-1, para AE lineales
y, entre 0,5 y 50 mg L-1, para el caso de AE ramificados (D. EPA, 2001). Asimismo, Lewis
y Suprenant (1983), para el caso de invertebrados, obtuvieron para un mismo alcohol
etoxilado valores de toxicidad (LC50, 48-h) comprendidos entre 0,29 y 270 mg L-1,
dependiendo de la especie ensayada.
VI-8
Alcoholes etoxilados
Tabla VI.3. Resumen de datos de toxicidad aguda (EC50) de alcoholes etoxilados lineales
y ramificados sobre microalgas.
Especie
AE
Selenastrum capricornutum
C12-14 EO4
Scenedesmus subspicatus
Microcystis aeruginosa
EC50
(mg L-1)
2-4
Periodo
Referencia
48 h
Yamane y col., 1984
C12-14 EO9
4-8
48 h
C12-14 EO13
10
48 h
C12-15 EO9
0,7
96 h
C13 EO7
7,5
96 h
C11-15 EO7
10,0
96 h
C12-15 EO7
0,85
72 h
C14-15 EO6
0,09
96 h
Lewis y Hamm, 1986
C13 EO7-8
0,5
72 h
Kaluza y Taeger, 1996
C15 EO7-8
0,05
72 h
C12-14 EO7
0,5
72 h
Iso-C10 EO7-8
50
72 h
Iso-C13 EO7-8
5
72 h
C13-15 EO7-8
0,5
72 h
Oxo-C13-15 EO7-8
0,5
72 h
C12-14 EO9
10-50
72 h
Dorn y col., 1993
Madsen y col., 1996
Yamane y col., 1984
C14-15 EO6
0,60
96 h
Lewis y Hamm, 1986
Nitzschia fonticola
C12-14 EO9
5-10
48 h
Yamane y col., 1984
Navicula pelliculosa
C14-15 EO6
0,28
96 h
Lewis y Hamm, 1986
Estudios realizados por Yamane y col. (1984) sobre la microalga S. capricornutum
y AE lineales de igual longitud de cadena alquílica (C12-14) mostraron que la toxicidad de
los alcoholes etoxilados lineales disminuye a medida que aumenta el numero de unidades
etoxiladas (Tabla VI.3). En el caso de crustáceos, este hecho ha sido puesto de manifiesto
en los ensayos realizados por Maki y Bishop (1979) y posteriormente Wong y col. (1997)
sobre la especie D. magna (Tabla VI.4).
Por otro lado, Kaluza y Taeger (1996), en ensayo de toxicidad con S. subspicatus
obtuvieron valores de EC50 de 0,5 y 0,05 mg L-1 para los tensioactivos C13 EO7-8 y C15 EO78, lo cual supone un aumento de la toxicidad a medida que aumenta la longitud de la cadena
hidrocarbonada (Tabla VI.3). Sin embargo, para el crustáceo D. magna estos autores
(Kaluza y Taeger, 1996) no observaron diferencias significativas en los efectos adversos
producidos por ambos tensioactivos (Tabla VI.4). En el caso de alcoholes etoxilados
ramificados también se ha observado un incremento de la toxicidad sobre microalgas al
aumentar el número de átomos de carbono de la cadena hidrocarbonada (Kaluza y Taeger,
VI-9
Capítulo 6
1996). Estudios llevado a cabo por la Agencia de Protección Ambiental de Dinamarca (D.
EPA, 2001) mostraron que un aumento en el grado de ramificación de la cadena alquílica
de los AE provoca una disminución de la toxicidad de estos tensioactivos tanto en
microalgas como en invertebrados acuáticos.
Tabla VI.4. Resumen de datos de toxicidad aguda (LC50/EC50 a las 48 horas) de alcoholes
etoxilados lineales y ramificados sobre invertebrados.
AE
Mysidopsis bahia
C10 EO4
C13 EO10
2,2
Daphnia magna
C12-13 EO5
0,46
C12-13 EO4.5-6
0,59
C12-13 EO6.5
0,74
C14-15 EO13
1,2
Daphnia pulex
VI-10
EC50 (48-h)
(mg L-1)
5,6
Especie
C15 EO7-8
0,5
C12-14 EO7-8
0,5
Referencia
Hall y col., 1989
Wong y col., 1997
Kaluza y Taeger, 1996
C13 EO7-8
0,5
C13-15 EO7-8
0,5
C12-15 EO7
1,0-2,0
C12-15 EO9
1,3
Dorn y col., 1993
C14-15 EO7
0,29-0,4
Lewis y Perry, 1981
C14 EO1
0,83
Maki y Bishop, 1979
C14 EO2
1,53
C14 EO3
0,73
C14 EO4
1,76
C14 EO6
4,17
C14 EO9
10,07
C16-18 EO18
20
C16-18 EO30
18
Madsen y col., 1996
Talmage, 1994
C12-15 EO7
0,76
Salanitro y col., 1988
C14 EO1
0,10
Maki y Bishop, 1979
C14 EO4
0,21
Paratanytarus
parthenogenica
Gammarus sp.
C14-15 EO7
23
C14-15 EO7
3,3
Asellus sp.
C14-15 EO7
270
Lewis y Suprenant, 1983
Alcoholes etoxilados
2. Materiales
A continuación se detallan las principales características del tensioactivo así como
del medio de ensayo empleado en los estudios de biodegradación y ecotoxicidad.
Tensioactivo ensayado
El tensioactivo no-iónico ensayado fue un alcohol etoxilado conocido
comercialmente como Findet®1214N/23 y suministrado por Kao Corporation, S. A.
(Barcelona). El tensioactivo consiste en una mezcla de homólogos de cadena alquílica
lineal de entre 12 y 14 átomos de carbono, en una proporción aproximada de 70% y 30%,
respectivamente, y un valor medio de 11 unidades etoxiladas. Posee una pureza aproximada
del 100 %, una densidad de 1,007 g cm-3 y una elevada solubilidad en agua. El peso
molecular medio estimado es de 630 g mol-1 (Sabahi, 2004).
Medio de ensayo
El medio de ensayo empleado en los ensayos de biodegradación y toxicidad del
alcohol etoxilado fue el mismo que el utilizado en los ensayos con el tensioactivo alquil
etoxisulfato (capítulo 5). No obstante, al objeto de facilitar la lectura del presente trabajo se
resumen las principales características físico-químicas y biológicas del agua de mar
empleada en los ensayos de biodegradación y toxicidad (Tabla VI.5).
Tabla VI.5. Características del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradación y
toxicidad del tensioactivo no-iónico Findet®1214N/23.
Parámetro
Unidades
Valor
Parámetro
Unidades
-1
Valor
-
Oxígeno disuelto
% saturación
92,7 ± 1,8
Nitrato
mg L NO3
Temperatura
ºC
12,5 ± 0,3
Amonio
mg L-1 NH4+
< 0,007
Conductividad
mS cm-1
50,9 ± 0,2
Fosfato
mg L-1 PO43-
< 0,015
pH
-
8,14 ± 0,04
Silicato
mg L-1 Si
0,021 ± 0,003
Salinidad
-
38,5 ± 0,5
Dureza total
mg L-1 Ca2+
418 ± 14
Carbono total
mg L-1 C
26,9 ± 0,5
Clorofila a
mg m-3 Cl a
0,73 ± 0,12
Carbono inorgánico
mg L-1 C
26,4 ± 0,5
Estreptococos fecales
UFC·100mL-1
No detectado
-1
0,033 ± 0,009
Carbono orgánico
mg L C
0,50 ± 0,01
Coliformes fecales
UFC·100mL-1
No detectado
Nitrito
mg L-1 NO2-
< 0,015
Enterococos
UFC·100mL-1
No detectado
VI-11
Capítulo 6
3. Resultados y discusión
En el siguiente apartado se exponen los resultados obtenidos en los ensayos de
biodegradación, de toxicidad con microalgas y crustáceos marinos y en los ensayos
combinados de toxicidad durante el experimento de biodegradación.
3.1. Ensayos de biodegradación
Parámetros de control
Al objeto de comprobar que durante el ensayo se daban unas condiciones no
limitantes para la proliferación y desarrollo de las poblaciones bacterianas originarias, se
llevó a cabo un control de los parámetros físico-químicos pH, oxígeno disuelto y
temperatura en los ensayos de biodegradación, referencia, abiótico y control.
En la Figura VI.3 se recogen la evolución del pH y oxígeno disuelto en los
ensayos de biodegradación y en el control.
100
8,2
80
O2 (%saturación)
8,4
pH
8,0
7,8
CO4
AE1
AE2
AE3
7,6
7,4
60
40
CO4
AE1
AE2
AE3
20
0
0
20
40
60
Tiempo (d)
80
100
120
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (d)
Figura VI.3. Evolución del pH y oxígeno disuelto en el ensayo control (CO4) y los ensayos
de biodegradación con AE (AE1, AE2 y AE3).
Se puede apreciar como los valores de pH se mantienen prácticamente constantes a
lo largo del experimento tanto en los ensayos de biodegradación como en el ensayo control,
alcanzando valores medios similares (valor medio ± DE) de 8,03 ± 0,1 y 8,05 ± 0,1,
respectivamente. Por otro lado, se observa que los valores de oxígeno disuelto en los
ensayos de biodegradación y el control se encuentran, de manera general, por encima de un
80% de saturación, mostrando porcentajes medios de 87,76 ± 0,26% y 87,9 ± 3,2%,
respectivamente.
VI-12
Alcoholes etoxilados
En el caso de la temperatura, los valores medios registrados durante el
experimento fueron de 19,9 ± 0,15 °C y 19,8 ± 0,4 ºC, para los ensayos de biodegradación
y control, respectivamente. Respecto al ensayo de referencia (benzoato sódico), los valores
de pH, temperatura y oxígeno disuelto estuvieron comprendidos entre 8,00 ± 0,1; 20,5 ±
0,05 ºC y 85,5 ± 13,97 % de saturación, respectivamente.
Los resultados obtenidos en este apartado indican claramente que el experimento
de biodegradación del tensioactivo no-iónico Findet®1214N/23 se llevó a cabo bajo
condiciones experimentales no limitantes para el desarrollo óptimo de la microbiota
responsable de la actividad degradativa.
Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos control, referencia y abiótico
Concentración (mg COD L-1)
La evolución del carbono orgánico disuelto (COD) en los ensayos control, referencia
(benzoato sódico) y abiótico (Findet®1214N/23 + HgCl2) se representa gráficamente en la
Figura VI.4.
20
15
10
REF4
AB4
CO4
5
0
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (d)
Figura VI.4. Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos control (CO4),
referencia (REF4) y abiótico (AB4) a lo largo del proceso de
biodegradación.
Se puede apreciar como en el caso del ensayo control y abiótico, la concentración
de COD permanece prácticamente constante a lo largo del experimento, alcanzando valores
medios de 0,72 ± 0,3 y 16,27 ± 0,6 mg L-1 COD (valor medio ± DE), respectivamente. En
el caso del ensayo abiótico, estos valores suponen una mineralización del tensioactivo del
VI-13
Capítulo 6
2,3 ± 2,5%, lo que viene a indicar que la aportación de procesos no biológicos en la
eliminación del tensioactivo no iónico Findet®1214N/23 es prácticamente despreciable.
En el caso del ensayo de referencia, cabe destacar que se emplearon los resultados
obtenidos para el tensioactivo alquil etoxisulfato (capítulo 5), dado que las muestras de
agua de mar fueron tomadas al mismo tiempo y en el mismo lugar. Al objeto de facilitar la
lectura del presente capítulo se han representado los datos en la Figura VI.4, observándose
porcentajes de biodegradación superiores al 50% y 90% al cabo de 6 y 9 días de ensayo,
respectivamente. Tal y como se comentó en el capítulo anterior, estos valores indican que la
población microbiana presente en el medio de ensayo presenta una actividad dentro de la
normalidad.
Evolución del carbono orgánico disuelto en los ensayos con tensioactivo
En la Figura VI.5 se representan los valores de concentración de Findet®1214N/23
(mg L COD) a lo largo del proceso de mineralización para los tres ensayos de
biodegradación realizados. Los puntos indican los valores medios experimentales, mientras
que las barras de error denotan la desviación estándar (n=3).
-1
Concentración (mg COD L )
-1
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (d)
Figura VI.5. Evolución de la concentración residual de Findet®1214N/23 (mg COD L-1) en
los ensayos de biodegradación. La línea continua corresponde al ajuste de los
valores experimentales a un modelo cinético de orden cero.
En la Figura VI.5, se observa una disminución de la concentración de carbono
orgánico disuelto (COD) a lo largo del experimento, alcanzando valores medios de COD de
11,5, 7,5 y 0,81 mg L-1 al cabo de 22, 60 y 108 días de ensayo, respectivamente, esto es,
porcentajes de mineralización del 25, 55 y 90%. Atendiendo a los criterios establecido en la
VI-14
Alcoholes etoxilados
directriz OPPTS 835.3160 “Biodegradabilidad en agua de mar” (USEPA, 1998), los valores
obtenidos en el presente experimento (eliminación de COD inferior al 70 % al cabo de 60
días de ensayo) no descartan la existencia de un potencial para la mineralización de estos
compuestos en el medio ambiente marino, aunque sugieren la realización de nuevos
experimentos de biodegradación (por ejemplo, empleando concentraciones más próximas a
las ambientales) para corroborar esta hipótesis. Sin embargo, los altos niveles de
biodegradación alcanzados en el medio, hacen pensar que realmente existe un potencial
para la degradación de estos tensioactivos, aunque a una baja velocidad de degradación.
Otro de los aspectos importantes que se desprende de la Figura VI.5 es la ausencia
de una fase de adaptación o inducción por parte de los microorganismos responsables del
proceso biodegradativo a la nueva fuente de carbono. Esto puede ser debido a que, dado
que se trata de un alcohol etoxilado de cadena alquílica lineal, las enzimas que intervienen
en el mecanismo de degradación son fundamentalmente de tipo hidrolíticas (mecanismo a,
Figura VI.2), las cuales podrían ser más frecuentes en el sistema enzimático de la
microbiota natural o bien ser sintetizadas rápidamente (Manzano y col., 1998).
Modelización cinética
Siguiendo el planteamiento seguido en los anteriores capítulos, se ha modelizado
la cinética de mineralización del tensioactivo Findet®1214N/23 en los tres ensayos de
biodegradación, empleando diversos modelos cinéticos de consumo de sustrato recogidos
en la bibliografía (Simkins y Alexander, 1984; Quiroga y col., 1999). Los parámetros
cinéticos y estadísticos calculados para cada uno de los modelos estudiados se recogen en la
Tabla VI.6.
En primer lugar se comprueba que todos los modelos estudiados presentan un buen
ajuste, si bien en el caso del modelo de primer orden se obtiene un valor del coeficiente de
determinación ligeramente inferior (R2= 0,9186). Sin embargo, un estudio más detallado de
los valores de los parámetros cinéticos obtenidos demuestra que sólo en el caso de los
modelos cinéticos de orden cero, primer orden y logístico, se obtiene parámetros con
valores coherentes de S0 (concentración inicial de substrato). Así, por ejemplo, en el caso
del modelo de Quiroga, Sales y Romero (Q-S-R), se obtiene un valor negativo de
concentración de substrato no biodegradable (Snb), mientras que el valor de la
concentración inicial estimada (S0) es muy superior a la concentración real ensayada. En el
caso del modelo logístico, a pesar de obtener una buena correlación con los datos
experimentales y un valor coherente de S0, el valor calculado de B0 (cantidad de sustrato
necesaria para producir la concentración inicial de sustrato) resulta injustificablemente alto
en comparación con los obtenidos por otros autores (Perales y col., 2001). Estos resultados
parecen razonables ya que dichos modelos contemplan una fase de latencia o aclimatación,
la cual no ha sido observada en nuestro estudio.
VI-15
Capítulo 6
Al objeto de seleccionar cual de los dos modelos restantes (orden cero o primer
orden) es el más apropiado para describir la cinética de mineralización del tensioactivo se
recurre al análisis de la chi-cuadrada (χ2). Si atendemos a los valores obtenidos para el
parámetro estadístico Q (probabilidad de que la chi-cuadrado exceda al azar un
determinado valor χ2 teórico) se observa que en el caso del modelo de orden cero el valor
de Q se encuentra más próximo a la unidad, lo que viene a indicar que las posibles
variaciones entre los valores experimentales y los obtenidos por el modelo pueden estar
debidos a fluctuaciones experimentales y no a una falta de ajuste de los datos
experimentales al modelo. Se puede concluir, por tanto, que el modelo cinético que mejor
describe la mineralización del tensioactivo no-iónico AE en el medio marino y bajo las
condiciones ensayadas es el modelo de orden cero. En la Figura VI.5 se representa
mediante una línea continua los valores obtenidos al ajustar los valores experimentales al
modelo cinético de orden cero.
Tabla VI.6. Parámetros cinéticos y estadísticos correspondientes a los resultados de
biodegradación de AE en agua de mar.
Modelo
Orden cero
(Simkins y
Alexander, 1984)
Primer-orden
(Simkins y
Alexander, 1984)
Logístico
(Simkins y
Alexander, 1984)
Q-S-R
(Quiroga y col.,
1999)
a
Parámetro cinético
-1
Valor a
S0 (mg COD L )
14,48 ± 1,92
K0 (mg COD L-1 d-1)
0,12 ± 0,03
S0 (mg COD L-1)
15,76 ± 2,95
-1
K1 (d )
0,016 ± 0,06
S0 (mg COD L-1)
14,43 ± 2,81
B0 (mg COD L-1)
-1
3,66 ± 0,94
-1
KLg (mg COD L d )
0,002 ± 0,002
S0 (mg COD L-1)
46,33 ± 415
Sto (mg COD L-1)
23,03 ± 72,06
Snb (mg COD L-1)
-3,23 ± 37,41
μmax (d-1)
0,022 ± 0,101
Parámetros estadísticos
R2
χ2
ν
Q
0,94
55,37
50
0,279
0,92
152,81
50
2,4E-12
0,94
67,16
49
0,043
0,94
860,85
48
1,8E-149
Datos presentados como valor medio ± DE (n=3)
El tiempo de latencia (tL), t50 (el tiempo necesario para alcanzar un 50% de
biodegradación, sin considerar el tiempo de latencia), y el tiempo de vida media (t1/2) se
calcularon a partir de la ecuación integrada del modelo cinético de orden cero (véase
capítulo 1). Los valores obtenidos fueron 11,5, 43,5 y 56,8 días, respectivamente. Cabe
destacar que aunque desde un punto de vista cualitativo en la Figura VI.5 no se observa una
fase inicial de aclimatación o latencia, con fines comparativos frente a otros tensioactivos,
VI-16
Alcoholes etoxilados
se ha tomado como valor del tiempo de latencia, el periodo transcurrido hasta lanzar una
degradación del 10%, si bien este valor es tan elevado (11,5 días) debido a la lentitud del
proceso.
Lechuga (2005), empleando un medio mineralizado inoculado con
microorganismos procedente de una EDAR, encontró un elevado grado de biodegradación
primaria (>80%) y velocidad de degradación (t1/2 entre 19,7 y 30,7 horas) para el mismo
tensioactivo que en el presente estudio (Findet®1214N/23, C12EO11) y utilizando
concentraciones iniciales comprendida entre 5 y 50 mg L-1. Por el contrario, estudios
llevados a cabo por Kravetz y col. (2001) mostraron velocidades de mineralización muy
inferiores para el tensioactivo C12EO9 y el mismo medio de ensayo (inóculo procedente de
una unidad de lodos activos). Dependiendo de si el inoculo estaba previamente aclimatado
o no al tensioactivo, estos autores, empleando una concentración inicial de 10-20 mg C L-1,
obtuvieron valores de mineralización superiores al 80% al cabo de 30 días de ensayo
(inóculo aclimatado) y comprendidos entre un 64 y 79% al cabo de 28 días (inóculo sin
aclimatar). Estos valores resultan similares a los obtenidos por Madsen (1996) en una
unidad de lodos activos y en el efluente secundario de una EDAR. Así, para el tensioactivo
C12-15EO7 y en la unidad de lodos activos, obtuvo una mineralización del 82% al cabo de 28
días mientras en el efluente el porcentaje de mineralización alcanzado para el mismo
tensioactivo fue del 60% al cabo de 28 días. En el caso de agua de río, también se ha puesto
de manifiesto una elevada biodegradabilidad de estos compuestos, con velocidades de
biodegradación comparables a los obtenidos en medios minerales inoculados. Así, por
ejemplo, Kaluza y Taeger (1996), en ensayos de biodegradación realizados en agua de río y
empleando una concentración inicial superior a 10 mg L-1, obtuvo una completa
mineralización del tensioactivo C12-14EO7-8 al cabo de 28 días de ensayos.
La comparación de estos datos con los obtenidos en el presente capítulo (90%
mineralización en 108 días, tiempo de vida media= 56,8 días) parecen indicar que el medio
de ensayo juega un papel fundamental en la velocidad de degradación de los AE, siendo
ésta muy inferior en el medio marino. Diversos estudios también han puesto de manifiesto
la menor velocidad de degradación de diferentes compuestos en el medio acuático marino
en comparación con medios de agua dulce. Así, por ejemplo, Perales y col. (2007),
obtuvieron una menor biodegradación primaria del tensioactivo aniónico lineal alquil
benceno sulfonatos (LAS) en agua de mar que en agua de río bajo las mismas condiciones
experimentales. Jeong-Hun y Fusao (2005) mostraron también diferencias significativas en
la velocidad de degradación del compuesto fenólico bisfenol A, siendo menor en agua de
mar. Resultados similares se han obtenido para otras sustancias químicas tales como la
benzo(a)pirina (Kot-Wasik y col., 2004) y el homopolímero (poli-3-hidroxibutirato)
(Kasuya y col., 1998).
VI-17
Capítulo 6
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estándar
Ensayos de toxicidad con microalgas marinas
En la Figura VI.6 se muestra la evolución temporal de la concentración neta de
biomasa (densidad óptica neta, DOn = DOt=t – DOt=0) para diferentes concentraciones de
exposición de Findet®1214N/23 en los ensayos estándar de toxicidad con microalgas.
Como puede observarse en dicha figura, los cultivos de microalgas respondieron
de manera diferente a la presencia del tensioactivo Findet®1214N/23. De manera general,
se aprecia una disminución de la biomasa de microalgas con respecto al ensayo control a
medida que aumenta la concentración de tensioactivo. Así, la microalga D. salina
experimenta efectos sobre el crecimiento a concentraciones superiores a 12 mg L-1,
mientras que T. chuii e I. galbana muestran diferencias significativas con respecto al
ensayo control a concentraciones superiores de 8 mg L-1. Por el contrario, se puede
observar como el tensioactivo tiene un mayor efecto tóxico sobre las microalgas N.
gaditana y C. gracilis, para las cuales se observan efectos inhibitorios sobre el crecimiento
a concentraciones iguales o superiores a 4 y 6 mg L-1, respectivamente. Por otro lado, se
puede observar que en el caso de las microalgas I. galbana, C. gracilis y D. salina se
obtienen valores de DOn (690 nm) negativos a concentraciones superiores a 10 y 14 mg L-1,
respectivamente, lo indica no sólo efectos inhibitorios sino letales sobre estos cultivos de
microalgas. Sin embargo, podemos apreciar como I. galbana y C. gracilis después de un
periodo de 48-h experimentan una recuperación del cultivo para los ensayos realizados con
10 y 6 mg L-1 de tensioactivo, respectivamente.
VI-18
Alcoholes etoxilados
1,0
0,6
10 mg L-1
0,4
0,2
0,0
I. galbana
0
2
4
6
8
1,0
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
0,8
1,2
N. gaditana
0
2
4
6
8
0,8
10 mg L-1
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,2
0
20
40
60
80
100
0
20
Tiempo (h)
0,4
60
80
100
80
100
C. gracilis
0
2
4
6
8
0,3
DOn (690 nm)
40
Tiempo (h)
0,2
10 mg L-1
0,1
0,0
-0,1
-0,2
0
20
40
60
80
100
Tiempo (h)
2,5
1,5
14 mg L-1
1,0
0,5
0,0
T. chuii
0
4
8
16
28
1,2
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
2,0
1,4
D. salina
0
4
8
10
12
1,0
0,8
36 mg L-1
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,5
-0,2
0
20
40
60
Tiempo (h)
80
100
0
20
40
60
Tiempo (h)
Figura VI.6. Evolución de la concentración de biomasa normalizada en el ensayo estándar.
Las barras de error denotan las desviaciones estándares (n=3)
VI-19
Capítulo 6
En la Tabla VI.7 se recogen los valores de las concentraciones de inhibición del
crecimiento (IC50), NOEC y LOEC para cada una de las microalgas ensayadas y un periodo
de exposición de 96 horas.
Tabla VI.7. Valores de IC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estándar
con microalgas marinas y el tensioactivo Findet®1214N/23.
Organismo
Efecto tóxico
Concentración (mg L-1)
N. gaditana
96-h IC50
5,84 (5,52-6,19)a
96-h NOEC
2,0b
96-h LOEC
4,0b
96-h IC50
9,08 (8,69-9,42)a
96-h NOEC
6,0b
96-h LOEC
8,0b
96-h IC50
5,00 (4,70-5,42)a
96-h NOEC
4,0b
96-h LOEC
6,0b
96-h IC50
11,58 (8,84-13,42)a
96-h NOEC
10,0b
96-h LOEC
12,0b
96-h IC50
35,03 (33,16-36,44)a
96-h NOEC
4,0b
I. galbana
C. gracilis
D. salina
T. chuii
96-h LOEC
8,0b
Concentración, valor medio (Intervalo de confianza, 95%)
b
Concentración de efecto basado en concentraciones experimentales
a
A la vista de los valores mostrados en la Tabla VI.7, se puede comprobar la
existencia de distintas sensibilidades hacia el tensioactivo no-iónico Findet®1214N/23 por
las distintas especies de microalgas. Así, se puede observar como las especies N. gaditana y
C. gracilis resultan especialmente sensibles a la presencia del agente de superficie, con
valores similares de IC50. Por el contrario, I. galbana y D. salina presentan una toxicidad
ligeramente menor que las microalgas anteriores. Finalmente, la microalga T. chuii presenta
una resistencia mucho mayor que el resto. Sin embargo, atendiendo a los valores de
concentración de no efecto (NOEC), podemos observar como el rango de sensibilidades
varía ligeramente. Así, N. gaditana resulta la especie con una menor concentración de no
efecto; le sigue C. gracilis y T. chuii, ambas mostrando valores similares de NOEC. Por el
contrario, el crecimiento de las microalgas I. galbana y D. salina se ve afectado a mayores
concentraciones de tensioactivos que el resto.
VI-20
Alcoholes etoxilados
No se han encontrado referencias bibliográficas relativas a la toxicidad del
tensioactivo Findet®1214N/23 y, en general, de los alcoholes etoxilados sobre especies de
microalgas marinas. Respecto a especies de agua dulce, se han encontrado datos de
toxicidad relativas a otros alcoholes etoxilados, algunos con semejantes longitud de cadena
alquílica y número de unidades etoxiladas que el tensioactivo estudiado. Comparando los
valores obtenidos en el presente trabajo con los encontrados para otros alcoholes etoxilados
de semejante estructura química, los datos resultan del mismo orden de magnitud a los
obtenidos con otras especies de agua dulce. Así, por ejemplo, Yamane y col. (1984)
encontraron valores de EC50 de 4-8, 5-10 y 10-50 mg L-1 C12-14EO9 para las microalgas de
agua dulce S. capricornutum, N. fonticola y M. aeruginosa, respectivamente. Por otro lado,
estudios de toxicidad aguda del alcohol etoxilado lineal C12-15EO9 sobre Selenastrum
capricornutum describieron valores de EC50 de 7,5 mg L-1 (Dorn et al., 1993).
Ensayos de toxicidad con Artemia franciscana
En este apartado se muestran los resultados de toxicidad obtenidos para el
crustáceo A. franciscana expuesto a crecientes concentraciones de Findet®1214N/23. La
Figura VI.8 recoge el porcentaje de supervivientes obtenidos para periodos de exposición
de 48 y 72 horas.
A. franciscana
Supervivientes (%)
100
80
60
40
20
48h
72h
0
0
10
20
30
40
Concentración (mg L-1)
Figura VI.8. Efecto del alcohol etoxilado Findet®1214N/23 sobre A. franciscana a las 48
y 72 horas de exposición. Los datos se representan como valor medio ± DE
(n=5).
Se puede apreciar un drástico aumento de la mortalidad de la población de
nauplios en un rango de concentraciones comprendido entre 20 y 30 mg L-1
Findet®1214N/23. Cabe hacer notar que las primeras concentraciones de tóxico y el control
VI-21
Capítulo 6
presentaron una mortalidad inferior al 15%, si bien en el ensayo control no se observó
mortalidad alguna en ninguna de las réplicas al cabo de 72 horas. Por el contrario, a
concentraciones superiores a 30 mg L-1 el efecto letal observado fue del 100% en todas las
replicas ensayadas. Por otro lado, de la Figura VI.8 se desprende que los efectos letales
observados a periodos de exposición de 48 y 72 horas son prácticamente similares.
Los valores de los parámetros de toxicidad LC50, NOEC y LOEC calculados para
un periodo de exposición de 48 y 72 horas se recogen en la Tabla VI.8.
Tabla VI.8. Valores de LC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estándar
con crustáceos y el tensioactivo Findet®1214N/23.
Organismo
Efecto tóxico
Concentración (mg L-1)
A. franciscana
48-h LC50
23,82 (23,04-24,60)a
72-h LC50
23,33 (22,52-24,13)a
48-h NOEC
20,0b
48-h LOEC
24,0b
72-h NOEC
20,0b
72-h LOEC
24,0b
Concentración, valor medio (Intervalo de confianza, 95%)
b
Concentración de efecto basado en concentraciones experimentales
a
Comparando estos resultados con los datos bibliográficos (Tabla VI.4) se obtienen
valores ligeramente superiores a los obtenidos con otros crustáceos marinos y alcoholes
etoxilados de semejante estructura química (longitud de cadena alquílica y número de
unidades etoxiladas). En relación con el camarón Mysidopsis bahia, Hall y col. (1989)
determinaron un valor de EC50 (48-h) de 2,2 mg L-1 para el alcohol etoxilado C13EO10,
mientras que para C10EO4 obtuvieron un valor de de EC50 de 5,6 mg L-1. En el caso de
especies de agua dulce, los valores obtenidos en el presente estudio resultan
significativamente superiores a los encontrados en la bibliografía. Así, por ejemplo, Kaluza
y Taeger (1996) determinaron valores de EC50 (48-h) para el crustáceo Daphnia magna de
1,2 mg L-1 para el tensioactivo C12-15EO7-8, mientras que para el alcohol etoxilado C12-1
15EO7-8 fue de 1,3 mg L (Kravetz y col., 1991; Dorn y col., 1993). Por otro lado, Wong y
col. (1997), para el mismo crustáceo y el alcohol etoxilado C14-15EO13 obtuvieron valores de
EC50 (48-h) de 0,5 mg L-1. No obstante, estudios realizados por Lewis y Suprenant (1983)
sobre la toxicidad de alcoholes etoxilados en diversas especies de invertebrados de agua
dulce, obtuvieron un rango de concentraciones EC50 comprendido entre 0,29 y 270 mg L-1,
lo que viene a indicar la gran variabilidad inter-específica que presentan estos tensioactivos.
VI-22
Alcoholes etoxilados
Respecto a las concentraciones de no efecto (NOEC), esto es, la máxima
concentración que no provoca un efecto observable, en nuestro caso inhibición del
crecimiento y mortalidad, se puede apreciar que los valores calculados en el presente
estudio, tanto para las microalgas como para el crustáceo marino (NOEC= 2-20 mg L-1),
resultan 3-4 órdenes de magnitud superior a las concentraciones ambientales encontradas en
la bibliografía (<40 µg L-1 en efluentes de EDARs y <4 µg L-1 en ríos). Atendiendo a estos
resultados, podemos concluir que las concentraciones de alcoholes etoxilados presentes en
el medio acuático no plantean, en principio, un riesgo ecológico para estos organismos. Sin
embargo, al igual que ocurre con los otros tensioactivos estudiados, son escasos los datos
disponibles, por lo que sería necesario realizar un mayor número estudios de toxicidad
incluyendo un mayor número de especies así como un programa de monitoreo costero para
poder corroborar esta suposición.
3.3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación
El presente apartado tiene como objetivo el estudio de la evolución de la toxicidad
del medio de ensayo a lo largo del proceso degradativo, con el fin de determinar si el
tensioactivo estudiado presenta una biodegradación ambientalmente aceptable, esto es, que
durante la biodegradación del tensioactivo se produce una detoxificación como
consecuencia de la formación de metabolitos menos tóxicos (en naturaleza y/ó cantidad) al
tensioactivo original.
En la Figura VI.9 se representa la evolución temporal de la toxicidad del medio de
ensayo (% inhibición del crecimiento/mortalidad) y grado de mineralización (%) durante el
ensayo de biodegradación del tensioactivo no-iónico Findet®1214N/23.
VI-23
Capítulo 6
80
60
60
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
0
20
20
40
60
80
60
60
40
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
20
0
0
0
80
20
80
80
60
60
40
40
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
0
20
0
0
20
40
60
80
80
60
60
40
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
20
0
20
40
40
IC, 96-h (%)
Biodegradación (%)
0
20
0
80
100
Mortalidad, 72-h (%)
60
Biodegradación (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
60
60
40
60
80
20
100
A. franciscana
100
100
80
40
40
0
0
80
Tiempo (días)
100
80
100
T. chuii
20
100
Tiempo (días)
100
0
80
D. salina
Tiempo (días)
20
60
100
Inh. crecimiento, 96-h (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
100
Biodegradación (%)
C. gracilis
20
40
Tiempo (días)
Tiempo (días)
100
20
0
0
100
40
Biodegradación (%)
20
40
80
100
80
80
60
60
40
40
LC,72-h (%)
Biodegradación (%)
20
0
20
Biodegradación (%)
40
100
Biodegradación (%)
80
I. galbana
100
Biodegradación (%)
Inh. crecimiento, 96-h (%)
100
Inh. crecimiento, 96-h (%)
N. gaditana
100
0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (días)
Figura VI.9. Evolución del efecto tóxico del medio de ensayo (%) y porcentaje de
mineralización (%) durante el experimento de biodegradación de
Findet®1214N/23.
Observando los resultados mostrados en la Figura VI.9, se puede apreciar como
durante la mineralización del tensioactivo ensayado tiene lugar una clara detoxificación del
medio de ensayo (caso a, ver capítulo 3, apartado 3.3). Así, en el caso de las microalgas N.
VI-24
Alcoholes etoxilados
gaditana e I. galbana tiene lugar una detoxificación del medio de ensayo del 100% al cabo
de 36 días de ensayo. Por el contrario, en el caso de C. gracilis y D. salina esta disminución
(100% detoxificación) tiene lugar al cabo de 17 días. Respecto a la microalga T. chuii y el
crustáceo A. franciscana, para los que se observaron una toxicidad inicial (0%
biodegradación) del 20 y 70%, respectivamente, se observa también una completa
detoxificación al cabo de 17 días de ensayos.
Para la mayoría de las especies ensayadas se observa una completa detoxificación
del medio cuando se ha alcanzado tan sólo un 20% de mineralización del tensioactivo.
Como consecuencia, resulta difícil establecer un grado de sensibilidad al medio de ensayo;
si bien N. gaditana e I. galbana resultan las más sensibles al medio de ensayo mostrando
una completa detoxificación a porcentajes de mineralización iguales o superiores al 37%.
Podemos concluir, por lo tanto, que durante el proceso de mineralización del
tensioactivo no-iónico Findet®1214N/23 tiene lugar una clara detoxificación del medio sin
formación de metabolitos más tóxicos (en cantidad y/ó naturaleza) que el tensioactivo
original y por lo tanto, que el tensioactivo ensayado presenta una biodegradación
ambientalmente aceptable.
VI-25
Capítulo 6
4. Conclusiones
Las principales conclusiones obtenidas en el presente capítulo son las siguientes:
•
El tensioactivo no-iónico Findet®1214N/23 presenta una elevada biodegrabilidad
(porcentaje de mineralización superior al 90%) en el medio acuático marino bajo las
condiciones ensayadas, aunque a una velocidad de biodegradación inferior a la
observada en aguas continentales y otros medios sintéticos.
•
La cinética de biodegradación final o mineralización del tensioactivo no-iónico en agua
de mar bajo las condiciones ensayadas sigue un modelo cinético de orden cero.
•
La toxicidad del tensioactivo Findet®1214N/23 depende significativamente del tipo de
organismo ensayado. Así, de las diferentes especies de microalgas estudiadas, C.
gracilis y N. gaditana son las más sensibles al tensioactivo, mientras que T. chuii se
muestra como la especie más resistente. En el caso del crustáceo marino A.
franciscana, a pesar de que los efectos estudiados han sido diferentes a los de las
microalgas, los valores de efecto obtenidos resultan inferiores a los obtenidos para la
microalga T. chuii, lo cual podría indicar una mayor sensibilidad al AE.
•
Los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad con microalgas y crustáceos
marinos junto con los datos disponibles de niveles ambientales de AE parecen indicar
que las concentraciones de AE presentes en el medio acuático marino no suponen un
riesgo ambiental.
•
Las medidas de toxicidad obtenidas en los ensayos combinados de toxicidad con el
experimento de biodegradación indican una clara detoxificación del medio durante el
proceso de mineralización del tensioactivo no-iónico Findet®1214N/23 sin producción
de intermediatos más tóxicos (en cantidad y/ó naturaleza) que el tensioactivo original.
Estos resultados permiten clasificar al tensioactivos ensayado como un compuesto de
biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
VI-26
Alcoholes etoxilados
Referencias
Ahel, M., Giger, W., Koch, M., 1994. Behavior of alkylphenol polyethoxylate surfactants in the aquatic
environment. I. Occurrence and transformation in seawage treatment. Water Res 28, 1131-1142.
Ahel, M., Schaffner, C., Giger, W., 1996. Behavior of alkylphenol polyethoxylate surfactants in the aquatic
environment. III. Occurrence and elimination of their persistent metabolites during infiltration of river
water to groundwater. Water Res 30, 37-46.
Ahel, M., Giger, W., Molnar, E., Ibric, S., 2000. Determination of nonylphenol polyethoxylates and their
lipophilic metabolites in sewage effluents by normal-phase high-performance liquid chromatography and
fluorescence detection. Croatica Chemica Acta 73, 209-227.
Balson, T., Felix, M.S.B., 1995. Biodegradability of non-ionic surfactants. En: Porter, D.R.K.a.M.R. (Ed.).
Biodegradability of Surfactants. Blackie Academic & Professional, Glasgow, United Kingdom, pp. 204230.
Birch, R.R., 1984. Biodegradation of nonionic surfactants. J. Am. Oil Chem. Soc. 62.
Boeije, G.M., Cano, M.L., Marshall, S.J., Belanger, S.E., Van Compernolle, R., Dorn, P.B., Gumbel, H., Toy, R.,
Wind, T., 2006. Ecotoxicity quantitative structure-activity relationships for alcohol ethoxylate mixtures
based on substance-specific toxicity predictions. Ecotoxicol Environ Saf 64, 75-84.
Dorn, P.B., Salanitro, J.P., Evans, S.H., Kravetz, L., 1993. Assessing the aquatic hazard of some branched and
linear non-ionic surfactants by biodegradation and toxicity. Toxicol Chem 12, 1751-1762.
Hall, W.S., Patoczka, J.B., Mirenda, R.J., Porter, B.A., Miller, E., 1989. Acute toxicity of industrial surfactants to
Mysidopsis bahia. Arch Environ Contam Toxicol 18, 765-772.
Hauthal, H.G., 2004. CESIO 2004-dynamic surfactants and nanostructured surfaces for an innovative industry.
SÖFW J. 130, 3-17.
HERA, 2007. Alcohol ethoxylates (AE). Human and Environmental Risk Assessment on ingredients of European
household
cleaning
products.
http://www.heraproject.com/files/34-F-HERA-AEHH+ENV%20Final%20Draft%20Report_01-05-07.pdf.
Holt, M.S., Mitchell, G.C., Watkinson, R.J., 1992. The environmental chemistry, fate and effects of nonionic
surfactants. En: Oude, N.T.d. (Ed.). Detergents, The Handbook of Environmental Chemistry. SpringerVerlag, Berlin Heidelberg, Germany, pp. 89-144.
Huber, M., Ulrich, M., Rys, P., 2000. Biodegradation Mechanisms of Linear Alcohol Ethoxylates under Anaerobic
Conditions. Environ. Sci. Technol. 34, 1737-1741.
Jeong-Hun, K., Fusao, K., 2005. Bisphenol A degradation in sea water is different from that in river water.
Chemosphere 60(9), 1288–1292.
Jobling, S., Sumpter, J.P., 1993. Detergent components in sewage effluent are weakly estrogenic to fish: An in
vitro study using rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes. Aquatic Toxicology 27, 361-372.
VI-27
Capítulo 6
Kaluza, U., Taeger, K., 1996. Einfluss der chemischen Struktur auf ökotoxikologische Eigenschaften von AlkanolEthoxylaten (en alemán). [Effect of chemical structure on the ecotoxicological properties of alcanol
ethoxylates]. Tenside Surfactants Detergents 33, 46-51.
Kasuya, K., Takagi, K., Ishiwatari, S., Yoshida, Y., Doi, Y., 1998. Biodegradabilities of various aliphatic
polyesters in natural waters. Polym. Degrad. Stab. 59(1–3), 327–332.
Kot-Wasik, A., Dbrowska, D., Namienik, J., 2004. Photodegradation and biodegradation study of benzo(a)pyrene
in different liquid media. J. Photochem. Photobiol. A, Chem. 168(1–2), 109–115.
Kravetz, L., Salanitro, J.P., Dorn, P.B., Guin, K.F., 1991. Influence of hydrophobe type and extent of branching on
environmental response factors on nonionic surfactants. J Am Oil Chem Soc 68, 610-618.
Lechuga, 2005. Biodegradación y toxicidad de tensioactivos comerciales. Tesis Doctoral. Departamento de
Ingeniería Química. Universidad de Granada.
Lewis, M.A., Hamm, B.G., 1986. Environmental modification of the photosynthetic response of lake plankton to
surfactants and significance to a laboratory - field comparison. Water Res. 20, 1575-1582.
Lewis, M.A., Perry, R.L., 1981. Acute toxicities of equimolar and ecotoxic surfactant mixtures to Daphnia magna
and Lepomis macrochirus. En: Aquatic Toxicology and Hazard Assessment. American Society for
Testing and Materials, United States, pp. 401-418.
Lewis, M.A., Suprenant, D., 1983. Comparative acute toxicities of surfactants to aquatic invertebrates. Ecotoxicol
Environ Saf 7, 313-322.
Madsen, T., Boyd, H.B., Nylén, D., Pedersen, A.R., Petersen, G.I., Simonsen, F., 2001. Environmental and health
assessment of substances in household detergents and cosmetic detergents and cosmetic detergent
products. DK-EPA, Denmark.
Madsen, T., Damborg, A., Rasmussen, H.B., Seiero, C., 1994. Evaluation of methods for screening surfactants.
Ultimate aerobic and anaerobic biodegradability. En: Danish Environmental Protection Agency (Ed.).
Working Report No. 38. Ministry of Environment, Copenhagen, Denmark.
Madsen, T., Petersen, G., Seiero, C., Torslov, J., 1996. Biodegradability and aquatic toxicity of glycoside
surfactants and a nonionic alcohol ethoxylate. J. Am. Oil Chem. Soc. 73, 929-933.
Maki, A.W., Bishop, W.E., 1979. Acute toxicity studies of surfactants to Daphnia magna and Daphnia pulex.
Arch Environ Contam Toxicol 8, 599-612.
Manzano, M.A., Perales, J.A., Sales, D., Quiroga, J.M., 1998. Effect of concentration on the biodegradation of a
nonylphenol polyethoxylate in river water. Bull Environ Contam Toxicol 61, 489-496.
Marcomini, A., Pojana, G., Carrer, C., Cavalli, L., Cassani, G., Lazzarin, M., 2000a. Aerobic biodegradation of
monobranched aliphatic alcohol polyethoxylates. Environ. Toxicol. Chem. 19, 555-560.
Marcomini, A., Zanette, M., Pojana, G., Suter, M.J.F., 2000b. Behaviour of aliphatic alcohol polyethoxylates and
their metabolites under standardized aerobic biodegradation conditions. Environ. Toxicol. Chem. 19,
549-554.
VI-28
Alcoholes etoxilados
Matthijs, E., Holt, M.S., Kiewiet, A.T., Rijs, G.B., 1999. Environmental monitoring for linear alkylbenzene
sulfonate, alcohol ethoxylate, alcohol ethoxy sulfate and soap. Environ Toxicol Chem 18, 2634-2644.
Mezzanotte, V., Bolzacchini, E., Orlandi, M., Rozzi, A., Rullo, S., 2002. Anaerobic removal of linear alcohol
ethoxylates. Bioresour Technol 82, 151-156.
Naylor, C.G., Mieure, J.P., Adams, J.A., Weeks, J.A., Ctaldi, F.J., Ogle, L.E., Romano, R.R., 1992. Alkylphenol
ethoxylates in the environment. J Am Oil Chem Soc 59, 695-703.
Nyholm, N., Kristensen, P., 1992. Screening methods for assessment of biodegradability of chemicals in seawater-results from a ring test. Ecotoxicol Environ Saf 23, 161-172.
Osburn, Q.H., Benedict, J.H., 1966. Polyethoxylates alkylphenol: relationship of structure biodegradation
mechanism. J Am Oil Chem Soc 43, 141-146.
Patterson, S. J., Scott, C. C., Tucker, B. E., 1970. Nonionic detergent degradation: III. Initial mechanism of the
degradation. The journal of the American Oil Chemists’s Society 47, 37-41.
Perales, J.A., Manzano, M.A., Sales, D., Quiroga, J.M., 1999. Biodegradation kinetics of LAS in river water.
International Biodeterioration & Biodegradation 43, 155-160.
Perales, J.A., Manzano, M.A., Garrido, M.C., Sales, D., Quiroga, J.M., 2007. Biodegradation kinetics of linear
alkylbenzene sulphonates in sea water. Biodegradation 18, 63-70.
Pollard, P.C., 2006. A quantitative measure of nitrifying bacterial growth. Water research 40, 1569 – 1576.
Reynolds, P.J., Young, W., Mascarenhas, R., 1997. Study on the possible problems for the aquatic environment
related to surfactants in detergents. ECC report No. EC 4294, 66.
Roberts, D.W., 1991. QSAR issues in aquatic toxicity of surfactants. Sci Total Environ 109-110, 557-568.
Sabahi, N., 2004. Caracterización de tensioactivos: poder espumante y tensiones superficiales. Tesis Doctoral.
Departamento de Ingerniería Química. Universidad de Granada
Salanitro, J.P., Langston, G.C., Dorn, P.B., Kravetz, L., 1988. Activated sludge treatment of ethoxylate surfactants
at high industrial use concentrations. Presented at the International Conference on Water and Wastewater
Microbiology, Newport Beach, Calif., February 8-11.
Scott, M.J., Jones, M.N., 2000. The biodegradation of surfactants in the environment. Biochim Biophys Acta
1508, 235-251.
Scharer, D.H., Kravetz, L., Carr, J.B., 1979. Biodegradation of nonionic surfactants. Tappi 62, 75-78.
Schöberl, P., Bock, K.J., Huber, L., 1988. Ökologisch relevanten Daten von Tensiden in Wasch- und
Reinigungsmitteln (en alemán) [Ecologically relevant data for surfactants in laundry detergents and
cleaning agents]. Tenside Surfactants Detergents 25, 86-98.
Shimp, R., 1989. LAS biodegradation in estuaries. Tenside Surfactant Deterg 26, 390-393.
SIAR, 2006. SIDS Initial Assessment Report for Long Chain Alcohols. Versión final: 15 May 2006.
Staples, C.A., Naylor, C.G., Williams, J.B., Gledhill, W.E., 2001. Ultimate biodegradation of alkylphenol
ethoxylate surfactants and their biodegradation intermediates. Environ Toxicol Chem 20, 2450-2455.
VI-29
Capítulo 6
Swisher, R.D., 1987. The analytical methods in surfactants biodegradation. Surfactant biodegradation, 2nd Edition,
47, M. Dekker, New York.
Talmage, S.S., 1994. Environmental and human safety of major surfactants: alcohol ethoxylates and alkylphenol
ethoxylates. A Report to the Soap and Detergent Association. Boca Raton, FL: Lewis Publishers.
USEPA, 1998. Fate, transport and transformation test guidelines. OPPTS. "Biodegradability in Sea Water"
835.3160. EPA 712–C–98–351 The Federal Bulletin Board. U.S. Government Printing Office
Washington, DC.
Van de Plassche, E.J., De Bruijn, J.H.M., Stephenson, R.R., Marshall, S.J., Feijtel, T.C.J., Belanger, S.E., 1999.
Predicted no-effect concentrations and risk characterization of four surfactants: linear alkyl benzene
sulfonate, alcohol ethoxylates, alcohol ethoxylated sulfates, and soap. Environmental Toxicology and
Chemistry 18, 2653–2663.
Wang, Z., Fingas, M., 1993. Rapid separation of non-ionic surfactants of polyethoxylated octylphenol and
determination of ethylene oxide oligomer distribution by C1 column reversed-phase liquid
chromatography Journal of Chromatography 673, 145-156.
White, R., Jobling, S., Hoare, S.A., Sumpter, J.P., Parker, M.G., 1994. Environmentally persistent alkylphenolic
compounds are estrogenic. Endocrinology 135, 175-182.
Wind, T., Belanger, S.E., 2006. Acute and chronic toxicity of alcohol ethoxylates to the green alga, Desmodesmus
(=Scenedesmus) subspicatus, and the subsequent development of structure activity relationships. Bull
Environ Contam Toxicol 76, 218-225.
Wong, D.C.L., Dorn, P.B., Chai, E.Y., 1997. Acute toxicity and structure–activity relationships of nine alcohol
ethoxylate surfactants to fathead minnow and Daphnia magna. Environmental Toxicology and Chemistry
16, 1970–1976.
Yamane, A.N., Okada, M., Sudo, R., 1984. The growth inhibition of planktonic algae due to surfactants used in
washing agents. Water Res. 8, 1101-1105.
Ying, G.G., 2006. Fate, behavior and effects of surfactants and their degradation products in the environment.
Environ Int 32, 417-431.
VI-30
Capítulo 7
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA BIODEGRADABILIDAD Y
ECOTOXICIDAD DE LOS TENSIOACTIVOS
Resumen
En el siguiente capítulo se realiza un análisis comparativo de los resultados obtenidos en los
ensayos de biodegradación y ecotoxicidad con los diferentes tensioactivos.
Capítulo 7
1. Biodegradabilidad de los tensioactivos estudiados en el medio acuático marino
En el siguiente apartado se compara la biodegradabilidad en agua de mar de los
diferentes tensioactivos estudiados en los capítulos anteriores, esto es, sal de alquil trimetil
amonio (ATMAC), nonilfenol etoxilado (NPEO), alquil etoxisulfato (AES) y alcohol
etoxilado (AE).
En la Figura VII.1A se ha representado la evolución del porcentaje de substrato
residual (100% de biodegradación) a lo largo del ensayo de biodegradación para los 4
tensioactivos. Los puntos representan los porcentajes medios experimentales, mientras que
las líneas continuas representan los valores obtenidos a partir de los modelos cinéticos
correspondientes.
100
A
100
80
80
ATMAC
NPEO
AES
AE
60
40
20
Tiempo (días)
Concentración residual (%)
La Figura VII.1B muestra los valores medios del tiempo de latencia (tiempo
necesario para alcanzar un 10% de biodegradación, t10), t50 (tiempo transcurrido hasta
alcanzar un 50% de biodegradación, sin considerar la fase de latencia) y t70 (tiempo
transcurrido hasta alcanzar un 70% de biodegradación, considerando la fase de latencia).
B
t10
t50
t70
60
40
20
0
0
0
20
40
60
80
100
120
ATMAC NPEO
AES
AE
Tiempo (d)
Figura VII.1. Comparación de los resultados obtenidos en los experimentos de
biodegradación de los diferentes tensioactivos estudiados: (A) evolución del
porcentaje medio de tensioactivo residual (%), (B) tiempos de latencia (t10),
t50 y t70 (ATMAC, sal de alquil trimetil amonio; NPEO, nonilfenol etoxilado;
AES, alquil etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
Cabe hacer notar que los valores de t70 han sido calculados análogamente a los
valores de t10 y t50, esto es, a partir de los modelos de mejor ajustes obtenidos en cada caso.
En el caso del AES, donde la curva de biodegradación presenta dos etapas (A y B), se han
VII-2
Estudio comparativo…
calculado los valores de t10, t50 y t70 del proceso global. Así, para el cálculo de t10 y t50 se ha
empleando el modelo cinético correspondiente a la etapa A (modelo de primer orden, 060% biodegradación) mientras que, para t70 se ha utilizado el modelo cinético
correspondiente a la etapa B, esto es, el modelo logístico (60-95% biodegradación).
Se puede apreciar en la Figura VII.1A como sólo el tensioactivo catiónico
ATMAC presenta una fase previa de aclimatación de los microorganismos (t10= 15,17 días,
Figura VII.1.B) mientras que para el resto de tensioactivos el proceso de biodegradación
comienza rápidamente, mostrando bajos tiempos de latencia (t10= 3,51 días para NPEO y
3,33 días para AES, Figura VII.1.B). En el caso del tensioactivo no-iónico AE, a pesar de
que en la Figura VII.1A no se observa una fase de aclimatación, de manera cuantitativa
obtenemos un tiempo de latencia de 11,5 días (Figura VII.1B), fruto de la baja velocidad
de degradación que presenta el tensioactivo.
Estas diferencias pueden justificarse atendiendo a la estructura química de los
diferentes tensioactivos, la cual determina el mecanismo del proceso biodegradativo de los
mismos. Si bien, todos los tensioactivos se caracterizan por presentar una cadena alquílica
de longitud variable (grupo hidrófobo), sólo los tensioactivos NPEO, AES y AE presentan
cadena etoxilada, y son éstos precisamente los que presentan unas curvas de biodegradación
sin aclimatación inicial (Fig. VII.1A), siendo los modelos cinéticos que mejor describen
estos procesos de orden cero (AE) y primer orden (NPEO, AES). Por el contrario, el único
tensioactivo que no presenta unidades etoxiladas en su estructura (ATMAC) es el que
presenta un modelo cinético de biodegradación logístico con una marcada fase de latencia.
Este hecho parece indicar que cuando en el proceso de biodegradación no se aprecia una
fase de latencia (NPEO, AES y AE), el número de microorganismos inicialmente presentes
en el medio con capacidad para llevar a cabo estas reacciones (hidrólisis) es mayor que
aquellos con sistemas enzimáticos capacitados para realizar ω-β oxidaciones (ATMAC).
Estos resultados están acordes a los descritos por otros autores para diversos
tensioactivos y medios de ensayo. Así, por ejemplo, Manzano y col. (1998), para un
tensioactivo NPEO, en los que la principal ruta de biodegradación consiste en el
acortamiento hidrolítico de la cadena etoxilada, encontraron tiempos de latencia
comprendidos entre 1 y 3 días en agua de río prístina y empleando concentraciones iniciales
de tensioactivos de entre 2,5 y 10 mg L-1. Por el contrario, Perales y col. (2007), obtuvieron
valores de tiempo de latencia muy superiores (tiempo de latencia entre 6,06 y 7,27 días) en
agua de mar prístina y a una concentración inicial de tensioactivo de 20 mg L-1.
Al objeto de analizar y comparar la velocidad del proceso de los diferentes
tensioactivos, se ha calculado el parámetro t50 (tiempo transcurrido hasta alcanzar un 50%
de biodegradación, sin considerar la fase de latencia) para cada uno de los tensioactivos.
Atendiendo al histograma y la gráfica de biodegradación representadas en las Figuras
VII-3
Capítulo 7
VII.1A y VII.1B, podemos observar como los tensioactivos DTMAC y NPEO son los que
se degradan a mayor velocidad, si bien el catiónico DTMAC parece degradarse ligeramente
mas rápido (menor t50, mayor pendiente de la curva), mostrando valores de t50 de 12 y 17
días, respectivamente. Por el contrario, los tensioactivos AES y AE presentan bajas
velocidades de degradación en el medio marino, mostrando valores de t50 de 30 y 41 días,
respectivamente.
Debido a que la directriz OPPTS 835.3160 “Biodegradabilidad en agua de mar”
(USEPA, 1998) establece como criterio para determinar la existencia de un potencial para
la biodegradación de un determinado substrato en el medio ambiente marino su
biodegradación en un porcentaje superior al 70% en un periodo de tiempo inferior a 60
días, en la Figura VII.1B se han representado los valores de tiempo estimado en alcanzar un
70% de mineralización, incluyendo el periodo de latencia (t70). Asimismo, se indica
mediante una línea horizontal el valor límite establecido por dicha directriz. Se puede
apreciar que en el caso de los tensioactivos DTMAC y NPEO existe un potencial para la
biodegradabilidad de estos tensioactivos en el medio marino. Por el contrario, los
tensioactivos AES y AE muestran valores muy superiores a este límite, lo cual no descarta
la posibilidad de que existan un potencial para su biodegradabilidad pero se precisan
nuevos estudios, por ejemplo, empleando concentraciones de tensioactivos inferiores, para
poder afirmar que existe este potencial (USEPA, 1998). Sin embargo, si atendemos a los
resultados obtenidos en la Figura VII.1A se puede observar que a pesar de estas bajas
velocidades de biodegradación se alcanzan altos porcentajes de biodegradación final, lo
cual parece indicar que efectivamente existe un potencial para la biodegradabilidad de estos
tensioactivos en el medio marino.
VII-4
Estudio comparativo…
2. Toxicidad aguda de los tensioactivos estudiados sobre organismos marinos
Los valores de las concentraciones de inhibición del crecimiento (IC50, 96-h) ó
mortalidad (LC50, 72-h) y de no efectos observables (NOEC) para los diferentes organismos
marinos ensayados se presentan en la Figura VII.2.
Observamos como el crustáceo A. franciscana presenta los valores más bajos de
toxicidad para todos los tensioactivos, a excepción del alcohol etoxilado (AE). A pesar de
que el efecto tóxico estudiado en el crustáceo (mortalidad) es diferente al empleado para las
microalgas (inhibición de crecimiento), estos resultados parecen indicar que el crustáceo es,
en general, más tolerante a estos tensioactivos que las microalgas. Por otro lado, los valores
de IC50 obtenidos muestran como, dentro del grupo de las microalgas, la especie T. chuii
parece ser la más resistente al tensioactivo, mostrando valores de efecto superiores al resto
de las microalgas para todos los tensioactivos estudiados, a excepción del AES donde se
obtuvieron valores similares a las microalgas N. gaditana e I. galbana.
En cuanto a la sensibilidad de los tensioactivos ensayados y a la vista de los
resultados mostrados en la Figura VII.2, no podemos afirmar que exista una especie
claramente más sensible que el resto, pues la toxicidad varía significativamente en función
del tensioactivo. Así, por ejemplo, la microalga D. salina es claramente más sensible que el
resto a la exposición del tensioactivo aniónico AES, mientras que por el contrario para el
tensioactivo no-iónico NPEO experimenta una toxicidad menor que N. gaditana, I. galbana
y C. gracilis. No obstante, se puede apreciar un comportamiento análogo en las microalgas
N. gaditana, I. galbana y C. gracilis, las cuales no sólo presentan el mismo orden de
sensibilidad a los tensioactivos (ATMAC > NPEO > AE > AES) sino que la relación entre
ellos también es similar, siendo la toxicidad del tensioactivo AES muy inferior a los otros
tres.
Al igual que no hay un comportamiento general en cuanto a la sensibilidad de los
organismos frente a los cuatro tensioactivos estudiados, tampoco se puede realizar de forma
categórica una ordenación de los tensioactivos acorde a su toxicidad. Así, se puede apreciar
como el tensioactivo catiónico ATMAC presenta un evidente mayor efecto tóxico que el
resto de los tensioactivos para todos los organismos ensayados, a excepción del crustáceo
marino, para el que sorprendentemente muestra una menor toxicidad que el resto de
tensioactivos (Figura VII.2). Por el contrario, el tensioactivo AES experimenta una baja
toxicidad para cuatro de las microalgas estudiadas, mientras que para D. salina el efecto
tóxico es muy acusado.
VII-5
30
IC50
NOEC
20
10
0
Concentración tensioactivo (mg L-1)
ATMAC
40
AES
IC50
NOEC
20
10
0
40
AES
30
IC50
NOEC
20
10
0
ATMAC
NPEO
AES
30
AE
IC50
NOEC
20
10
0
40
NPEO
AES
AE
D. salina
30
IC50
NOEC
20
10
0
AE
T. chuii
I. galbana
ATMAC
30
NPEO
40
AE
C. gracilis
ATMAC
Concentración tensioactivo (mg L-1)
NPEO
Concentración tensioactivo (mg L-1)
N. gaditana
Concentración tensioactivo (mg L-1)
40
ATMAC
Concentración tensioactivo (mg L-1)
Concentración tensioactivo (mg L-1)
Capítulo 7
40
NPEO
AES
AE
A. franciscana
LC50
NOEC
30
20
10
0
ATMAC
NPEO
AES
AE
Figura VII.2. Valores de IC50 (96-h), LC50 (72-h) y NOEC para diferentes organismos
marinos. Las barras de los histogramas muestran los valores medios,
mientras que las barras de error denotan el intervalo de confianza al 95%
(ATMAC, sal de alquil trimetil amonio; NPEO, nonilfenol etoxilado; AES,
alquil etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
VII-6
Estudio comparativo…
Variabilidad de los valores de efectos (EC50/LC50)
En las Figuras VII.3A y VII.3B se han representado los valores de los coeficientes
de variación (porcentaje que supone la desviación estándar de una muestra frente al valor
medio), de los datos de toxicidad (IC50 o LC50), agrupados de diferente forma. En la Figura
VII.3A se recoge el grado de dispersión para cada organismo de los datos de toxicidad de
los cuatro tensioactivos ensayados, mientras que en la Figura VII.3B se presentan los
coeficientes de variación para cada tensioactivo de los datos de toxicidad obtenidos con los
diferentes organismos. Cabe destacar que en este caso, se ha representado la variabilidad
considerando los valores de efectos obtenidos para las microalgas y crustáceos (color verde
oscuro) así como considerando exclusivamente los valores obtenidos para las microalgas
(color verde claro).
A
120
100
80
60
40
20
0
NG
IG
CG
DS
TC
AF
180
Coeficiente de variación (%)
Coeficiente de variación (%)
140
B
160
140
Microalgas + crustáceo
Microalgas
120
100
80
60
40
20
0
ATMAC NPEO
AES
AE
Figura VII.3. Coeficiente de variación (%) de los valores de efectos (IC50 para las
microalgas y LC50 para el crustáceo) obtenidos para los diferentes
tensioactivos y especies. (A) Variabilidad por especie ensayada (NG= N.
gaditana, IG= I. galbana, CG= C. gracilis, DS= D. salina, TC=. T. chuii,
AF= A. franciscana); (B) variabilidad por tensioactivo estudiado (ATMAC,
sal de alquil trimetil amonio; NPEO, nonilfenol etoxilado; AES, alquil
etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
Los resultados presentados en la Figura VII.3A muestran como las diferencias
encontradas en la toxicidad de los diferentes tensioactivos estudiados depende en gran
medida del taxón y/o del efecto estudiado. Como se puede observar en la Figura VII.3A, la
artemia presenta una variabilidad muy inferior al de las microalgas, esto es, que el efecto de
los diferentes tensioactivos sobre el crustáceo ha sido muy similar. En el caso de las
microalgas, se observa asimismo que la variabilidad de los resultados no es homogénea,
siendo la microalga C. gracilis la que muestra mayores diferencias entre los efectos entre
los tensioactivos (120%) y la microalga T. chuii la que menos (53%). Este hecho parece
VII-7
Capítulo 7
indicar que la especie utilizada en los ensayos no sólo ha de ser considerada a la hora de
ordenar los tensioactivos en función de su toxicidad, como se ha visto anteriormente, sino
que las diferencias entre las toxicidades de los compuestos también dependen del
organismo usado y/o del efecto medido.
Respecto a la Figura VII.3B, se puede apreciar, en primer lugar, como la
variabilidad obtenida considerando ambos taxones resulta muy similar en todos casos a los
obtenidos considerando exclusivamente el taxón algas, a excepción del tensioactivo
catiónico ATMAC. Si bien esto es debido a la elevada diferencia observada en los valores
de efectos de las microalgas (IC50 entre 0,69 y 6,34 mg L-1) y el crustáceo (LC50= 34,19 mg
L-1). Por otro lado, se observa como, de manera análoga a la Figura VII.3A, el coeficiente
de variabilidad no presenta valores homogéneos. Así, las diferencias entre los valores de
toxicidad de las diversas microalgas cuando se ensayó la toxicidad con AES, resultan ser
menores que la de los efectos observados para el resto de tensioactivos, que presenta una
variabilidad similar en torno al 80%. Este resultado parece sugerir que el compuesto
ensayado también, en ocasiones, puede influir en las diferencias observadas entre los
diferentes organismos ensayados, aunque no en sus sensibilidades, esto es, que no sólo para
cada tensioactivo se ha observado un orden de sensibilidades que no necesariamente ha sido
el mismo, sino que además en el caso del AES, las diferencias entre las sensibilidades de
las diferentes microalgas han sido menores.
Si se analizan en su conjunto los resultados obtenidos se puede observar que tanto
como para el organismo más tolerante (Artemia franciscana) como para el tensioactivo que
con mayor frecuencia ha sido el menos tóxico (AES), la dispersión de resultados obtenida
es mucho menor que en el caso de la microalga que con mayor frecuencia ha sido la más
sensible (C. gracilis) y el tensioactivo que con mayor frecuencia ha sido el más tóxico
(ATMAC).
Como conclusión de este apartado se puede afirmar que las diferencias
encontradas entre los efectos tóxicos para los tensioactivos y especies estudiadas no
solamente se deben a la naturaleza del compuesto ensayado, sino también al amplio grado
de sensibilidad que muestran los diferentes organismos cuando son expuestos a estos
agentes de superficie.
VII-8
Estudio comparativo…
3. Evolución de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradación de los
diferentes tensioactivos estudiados
La evolución de la toxicidad del medio de ensayo (% efecto) para las diferentes
especies ensayadas (N. gaditana, I. galbana, C. gracilis, D. salina, T. chuii y A.
franciscana) a lo largo de los experimentos de biodegradación realizados se muestran en la
Figura VII.4.
Se puede observar como para todos los tensioactivos tiene lugar una detoxificación
del medio de ensayo a medida que avanza el proceso biodegradativo, a excepción del
tensioactivo no-iónico NPEO para el que se observa un claro aumento de la toxicidad del
medio en la fase inicial del experimento para el crustáceo y las microalgas D. salina y T.
chuii. Este comportamiento no se ha observado para las microalgas N. gaditana, I. galbana
y C. gracilis dada la elevada sensibilidad de estas tres microalgas al tensioactivo y a la
elevada concentración inicial empleada en los ensayos de biodegradación.
Por otro lado, la Figura VII.4 muestra una completa detoxificación del medio de
ensayo para los tensioactivos AES y AE, mientras que para el tensioactivo NPEO la
detoxificación es del 100% en todos lo casos, a excepción de las microalgas I. galbana y D.
salina (75% de detoxificación, aproximadamente). Asimismo, en el caso del tensioactivo
catiónico ATMAC se observa un porcentaje residual de efecto comprendido entre el 20 y
10% para todas las especies, a excepción de D. salina y A. franciscana para la que se
obtiene una completa detoxificación.
Si se comparan los valores de velocidad de detoxificación de los diferentes medios
de ensayos para cada una de las especies, se observa que éstas siguen un patrón común. Así,
se puede apreciar como en todos los organismos el orden de detoxificación es el siguiente:
AE > ATMAC > NPEO ≈ AES, siendo el medio de ensayo correspondiente al tensioactivo
no–iónico AE el primero en detoxificarse. En términos de porcentajes de mineralización, se
obtiene que en el caso del alcohol etoxilado (AE) se produce una completa detoxificación
cuando se alcanza porcentajes de mineralización comprendidos entre el 19 y 37%, mientras
que para el tensioactivo catiónico (ATMAC) la máxima detoxificación tiene lugar a
porcentajes de biodegradación del 81-95%. Respecto al NPEO y AES la detoxificación del
medio tiene lugar cuando el tensioactivo ha sido mineralizado un 92 y 78-98%,
respectivamente.
VII-9
Capítulo 7
N. gaditana
80
60
ATMAC
NPEO
AES
AE
40
20
100
I. galbana
80
Efecto tóxico (%)
Efecto tóxico (%)
100
60
ATMAC
NPEO
AES
AE
40
20
0
0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
Tiempo (d)
C. gracilis
80
100
120
60
ATMAC
NPEO
AES
AE
40
20
D. salina
80
60
ATMAC
NPEO
AES
AE
40
20
0
0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
Tiempo (d)
60
80
100
120
Tiempo (d)
T. chuii
80
60
ATMAC
NPEO
AES
AE
40
20
0
100
Efecto tóxico (%)
100
Efecto tóxico (%)
80
100
Efecto tóxico (%)
Efecto tóxico (%)
100
60
Tiempo (d)
A. franciscana
80
60
ATMAC
NPEO
AES
AE
40
20
0
0
20
40
60
80
Tiempo (d)
100
120
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (d)
Figura VII.4. Evolución del efecto tóxico del medio de ensayo (%) de cada uno de los
organismos ensayados a lo largo del experimento de biodegradación de los
diferentes tensioactivos (ATMAC, sal de alquil trimetil amonio; NPEO,
nonilfenol etoxilado; AES, alquil etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
VII-10
Estudio comparativo…
En la Tabla VII.1 se muestran los valores de tiempo de vida media del proceso de
mineralización (t1/2), esto es el tiempo necesario para alcanzar un porcentaje de
mineralización del 50%, y tiempo de vida media del proceso de detoxificación (t1/2*), es
decir, el tiempo necesario para alcanzar un porcentaje de detoxificación del 50%, para cada
uno de los tensioactivos estudiados.
Tabla VII.1. Valores de tiempo de vida media del proceso biodegradativo (t1/2) y de
detoxificación (t1/2*) para los diferentes tensioactivos estudiados (ATMAC, sal
de alquil trimetil amonio; NPEO, nonilfenol etoxilado; AES, alquil
etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
Tensioactivo
ATMAC
a
Tiempo de vida media
mineralización (t1/2)
(días)
26,9
Tiempo de vida media
detoxificación (t1/2*)
(días)
18-35
NPEO
23,1
43-61
AES
35,0
25-35 (70a)
AE
56,8
Valor obtenido para la microalga D. salina
10-23
Los resultados mostrados en la Tabla VII.1 reflejan tres comportamientos
diferentes. Así, en el caso del tensioactivo AE, a pesar de presentar un elevado valor de t1/2
(56,8 días) se obtiene el menor valor de t1/2* (10-23 días), lo que viene a indicar una rápida
velocidad de detoxificación del medio de ensayo con formación de metabolitos menos
tóxicos que el tensioactivo original. Por el contrario, se puede apreciar como NPEO, a pesar
de presentar el menor valor de t1/2 (23,10 días), alcanza tiempos de vida media de
detoxificación muy superiores (t1/2*= 43-61 días), lo cual indica que la velocidad de
detoxificación del proceso es muy inferior a la de mineralización. Este hecho puede deberse
a la formación de metabolitos más tóxicos durante la biodegradación del tensioactivo, tal y
como se comentó en el capítulo 4, indicando así su biodegradabilidad ambientalmente no
aceptable. Por otro lado, el tensioactivo ATMAC presenta tiempos de vida media de
mineralización y detoxificación similares, lo que implica una detoxificación del medio de
ensayo con formación de metabolitos menos tóxicos o de igual toxicidad que el
tensioactivo original. Cabe resaltar el amplio intervalo de tiempos de vida media
observados para el tensioactivo AES y los diferentes organismos (t1/2*= 25-70 días); si bien
para todas las especies estos valores están comprendidos entre 25 y 35 días a excepción de
la microalga D. salina.
VII-11
CONCLUSIONES GENERALES
Conclusiones generales
En los capítulos anteriores aparecen recogidas las conclusiones más importantes
obtenidas a partir de los ensayos de biodegradación, toxicidad y estudios combinados de
toxicidad y biodegradación para cada uno de los tensioactivos estudiados. En este apartado,
se enumeran las conclusiones generales más relevantes obtenidas a partir de los resultados
mostrados y de las consideraciones realizadas a lo largo del desarrollo de la presente Tesis
Doctoral.
1. Para la evaluación del riesgo ambiental de tensioactivos en el medio marino resulta
necesario realizar ensayos de biodegradación en agua de mar puesto que se han
encontrado diferencias en las velocidades de biodegradación obtenidas en este medio
frente a las aportadas por otros autores para otros medios de ensayo, si bien los datos
bibliográficos disponibles para poder realizar comparaciones son escasos.
2. La modelización cinética del proceso biodegradativo se muestra como una alternativa
válida frente al procedimiento tradicional propuesto por diferentes organismos tales
como la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA), la
Organización para la Cooperación Económica y el Desarrollo (OECD), etc. El uso de
modelos no sólo permite caracterizar la cinética de biodegradación del compuesto sino
también calcular de una forma más rigurosa los valores que definen la cinética del
proceso, como por ejemplo, el tiempo de latencia y vida media.
3. El uso de forma generalista del periodo necesario en alcanzar una biodegradación del
10% como tiempo de latencia puede inducir en ocasiones a error, indicando la presencia
de una fase de aclimatación en procesos degradativos lentos en los que claramente ésta
no se observa. Por ello se propone una modificación del tratamiento de datos consistente
en el cálculo del periodo de latencia solo en aquellos casos en los que el modelo cinético
de mejor ajuste contemple esta fase.
4. En aquellos casos en los que no se cumpla el criterio establecido por la Agencia de
Protección Ambiental de los Estados Unidos (biodegradación superior al 70% en un
tiempo inferior a 60 días) pero se observe una clara tendencia descendente en la
concentración residual de substrato transcurridos 60 días, se propone prolongar la
duración del ensayo. En estos casos, si la curva de biodegradación se asintotiza en
valores superiores o iguales al 70%, se puede afirmar que existe un potencial para la
biodegradación del compuesto en el medio marino, mientras que valores inferiores
requerirían estudios adicionales.
5. Su facilidad de cultivo, disponibilidad, relevancia ecológica y sensibilidad hacen de las
microalgas marinas N. gaditana, I. galbana, C. gracilis, D. salina y T. chuii especies
recomendables en ensayos ecotoxicológicos estándares en el medio acuático marino.
CG-2
Conclusiones generales
6. La elevada tolerancia observada en los ensayos con Artemia franciscana ponen en
entredicho la utilización de ensayos de mortalidad del crustáceo para la evaluación del
riesgo ambiental de los tensioactivos en el medio marino. No obstante, dada las
numerosas ventajas que presentan estos organismos (fácil manipulación, disponibilidad,
etc.) resultaría conveniente desarrollar ensayos de toxicidad estándar a nivel subletal
empleando estos crustáceos.
7. Los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad presentan diferencias importantes
dependiendo del taxón, especie y efecto estudiado, lo que pone de manifiesto la
necesidad de realizar múltiples ensayos empleando diversas especies correspondientes a
diferentes taxones para poder tomar decisiones sobre criterios de calidad y/o
limitaciones de utilización, tal y como contempla la Directiva Marco de Aguas y la Guía
Técnica para la Evaluación de Riesgos de la Comisión Europea.
8. En los protocolos de evaluación de riesgo ambiental los ensayos combinados de
toxicidad y biodegradación constituyen una herramienta útil pues permiten determinar
de manera rápida y sencilla, si durante el proceso de biodegradación se generan
metabolitos más tóxicos que el compuesto ensayado, o si por el contrario, éste presenta
una biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
Como consecuencia de los resultados obtenidos, se han generado nuevas líneas de
actuación que deberían ser consideradas en futuros trabajos:
* Realización de ensayos de biodegradación primaria y mineralización de los diferentes
tensioactivos empleando concentraciones iniciales de tensioactivos reales, al objeto de
conocer la cinética real del proceso biodegradativo.
* Realización de ensayos de toxicidad aguda estándar a nivel letal y subletal empleando un
mayor número de especies así como organismos pertenecientes a otros grupos
taxonómicos, como por ejemplo, peces y anfibios.
* Realización de un programa de monitoreo ambiental para establecer las concentraciones
de estos tensioactivos en aguas residuales que permitan, en un primer nivel, estimar las
concentraciones ambientales (PEC), y si esto no fuese suficiente, determinar los niveles
de estos tensioactivos en el medio marino.
* Determinación de los valores de no efecto (NOEC) para diferentes estadíos del proceso
biodegradativo.
CG-3
GENERAL CONCLUSIONS
General conclusions
The general conclusions obtained from the present Doctoral Thesis are:
1. Conducting biodegradation studies using natural sea water is extremely necessary in
order to assess the risk of surfactants in the marine aquatic environment. Although
literature concerning the biodegradation of these compounds in natural environment is
very scarce, significant differences have been found between the biodegradation rates
obtained in this work and those described by several authors in other test media.
2. Kinetic modelling of the biodegradative process is a scientifically valid alternative to the
traditional procedure included in the guidelines proposed by different organisations such
as the United States Environmental Protection Agency (USEPA) and Organisation for
Economic Co-operation and Development (OECD). These models not only make it
possible to characterise the chemical biodegradation kinetic but also to estimate the
kinetic parameters such as the lag and half-life times accurately.
3. The general use of the parameter lag time (time needed to reach 10% of biodegradation)
may be inappropriate in certain cases, as in some processes with a very slow
biodegradation rates where this phase does not really exist. For this reason, we propose a
modification consisting of the calculation of this parameter only in those cases where the
fitted kinetic model considers it.
4. In cases where a negative result (<70% DOC removal before 60 days) and a clearly
decreasing tendency of the residual substrate concentration are observed, we propose to
increase the maximum test duration (60 days). Whether the biodegradation percentage is
equal or higher than 70%, it may be concluded that there is a potential fro
biodegradation in the marine environment. However, a negative result (<70%) does not
preclude such potential but indicates that further study is necessary.
5. We recommend using the marine microalgae N. gaditana, I. galbana, C. gracilis, D.
salina and T. chuii as standard toxicity tests organisms in the marine environment
because of their ease of culture, commercial availability, ecological relevance and
sensitivity.
6. Since the high surfactant tolerance of the marine crustacean A. franciscana, mortality
tests using these organisms are not suitable in the assessment of the environmental risk
of surfactants in the marine environment. Nevertheless, their numerous advantages (ease
of culture, short generation time, cosmopolitan distribution and commercial availability
of the cysts) suggest considering these organisms as a test species in sub-lethal toxicity
tests.
GC-2
General conclusions
7. The results obtained from the acute toxicity tests show significant differences depending
on the taxonomic group, species and effects tested. These results support the Water
Framework Directive and the Technical Guidance Document of the European
Commission, indicating the necessity of carrying out multiple toxicity tests using several
species from different taxonomic groups in order to establish quality criteria or phase out
the use of these compounds.
8. Combined toxicity and biodegradation tests are a useful tool for the assessment of the
environmental risk procedures. These tests make it possible to determine whether during
the biodegradation process, generated metabolites are more toxic than the parent
compound or the compound shows an acceptable environmental biodegradability.
Based on the results obtained from this investigation, the following recommendations
should be considered for further researches:
* Conduct additional primary and ultimate biodegradation tests of different surfactants
using real environmental concentrations in order to determine the real kinetic of the
biodegradative process.
* Conduct additional lethal and sub-lethal acute toxicity tests including different species as
well as organisms from other taxonomic groups such as fishes or amphibious.
* Conduct an environmental monitoring program in order to estimate the environmental
predicted concentration (PEC). In a first tier, the concentrations should be determined in
wastewater treatment plants, and if it were necessary (tier 2) an additional monitoring
should be carried out in the marine environment.
* Estimate no-effect-observed concentration values (NOEC) at different stages of the
biodegradative process.
GC-3