ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA SANGUÍNEA
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Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA SANGUÍNEA Objetivos Al finalizar el trabajo práctico los alumnos estarán en capacidad de: - Conocer la forma y condiciones para obtener un preparado de catalasa sanguínea. - Verificar el efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad de la catalasa sanguínea. - Reconocer el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. - Demostrar la influencia del pH sobre la actividad enzimática. - Probar el efecto de la concentración de substrato sobre la actividad de la catalasa sanguínea. - Verificar la influencia de un inhibidor sobre la actividad enzimática. Introducción El metabolismo celular de los tejidos animales y vegetales genera peróxido de hidrógeno (H2O2) molécula que resulta tóxica para la célula. A través de la evolución estos organismos han desarrollado sistemas enzimáticos que descomponen este peróxido y evitan daños a la célula. Uno de estos sistemas enzimáticos lo representa la catalasa. La catalasa es una cromoproteína porfirínica cuya masa molecular es de 225.000 kDa, contiene cuatro grupos hemo por molécula y su contenido de hierro es 0.9%. Esta proteína presenta actividad enzimática del tipo oxido-reductasa sobre el peróxido de hidrógeno (H2O2) el cuál constituye el sustrato para esta enzima y lo descompone en oxígeno y dos moléculas de agua Su nombre sistemático de acuerdo a la Unión Internacional de Bioquímica es H2O2 oxidoreductasa y cataliza la siguiente reacción: 1 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea Catalasa 2H2O2 O2 + 2H2O Peroxido de hidrógeno En los mamíferos esta enzima se encuentra en todo tipo de células, siendo su actividad mayor en el hígado, riñón y eritrocitos. Un mol de catalasa puede descomponer 5.000.000 de moléculas de H2O2 por minuto a 37°C, esto se conoce como número de recambio y representa uno de los más altos de toda la enzimología. La actividad de la catalasa de los eritrocitos puede determinarse mediante algunos principios bioquímicos de los cuales los más sencillos están basados en la desaparición del H2O2 al incubarlos con preparaciones crudas o purificadas de la enzima. A su vez la desaparición del H2O2 puede estimarse por varios métodos, uno de ellos es el método titrimétrico por permanganimetría. En este método una preparación de catalasa se incuba con una concentración conocida de peróxido de hidrógeno durante cierto tiempo y en condiciones adecuadas. Al cabo de este tiempo, la reacción se detiene por adición de H2SO4 2N y luego se titula con una solución de permanganato de potasio (KMnO4). La reacción de peróxido de hidrógeno con el permanganato de potasio en medio ácido es la siguiente: K2SO4 + 2 MnSO4 + 8 H2O + 5 O2 2 KMnO4 + 3 H2SO4 + 5 H2O2 Esta reacción constituye una típica titulación de oxidación-reducción, la cual se hace en proporciones estequiométricas entre el permanganato y el peróxido de hidrógeno. Los experimentos que se realizarán en este trabajo práctico, se basarán en el método titrimétrico por permanganimetría y en cada uno de ellos se realizará la titulación de un tubo control, el cuál constituye una medida de peróxido presente al comienzo del experimento. La titulación de los tubos experimentales representa la medida del peróxido remanente después que la enzima ha actuado sobre el sustrato. La diferencia entre las dos titulaciones (control – experimental) representa la cantidad de peróxido descompuesto en una unidad de tiempo, es decir, la velocidad de la reacción. 2 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea MATERIALES Y REACTIVOS - Matraces erlenmeyer - Tubos de ensayo - Embudo - Bureta y soporte universal - Gradilla - Baños de calentamiento - Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL. - H2SO4 2 N - Buffer fosfato 0,01 M, pH 3, 7 y 8. Debe contener H2O2 para gastar aproximadamente 15 mL de KMnO4 0,012 N. - KMnO4 0,012 N - Soluciones de KCN 10-2 M., 10-3 M., 10-4 M a pH 7 las cuales deben ser preparadas el día de su uso. Obtención de un preparado de catalasa sanguínea: (será preparada con anticipación por el docente). Para obtener una preparación cruda y altamente activa de la enzima se sigue el siguiente procedimiento: 1.- Pipetear 25 mL de agua destilada en un tubo de ensayo grande y enfriarla sobre hielo picado. 2.- Con ayuda de una lanceta estéril, extraer sangre capilar (del dedo pulgar), descartar la primera gota de sangre y luego pipetear 0,02 mL de sangre con una pipeta de Shalli. 3.- Agregar los 0.02 mL de sangre en los 25 mL de agua destilada fría. Lavar varias veces la pipeta en el agua. 4.- Mantener la preparación de enzima en baño de agua helada con suficiente hielo para prevenir el deterioro de la enzima. 3 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea Experimentos. Se estudiarán los siguientes factores que modifican la actividad enzimática: a. Concentración de enzima. b. Concentración de substrato. c. Temperatura. d. pH. e. Efectos de inhibidor: concentración progresiva de inhibidor y concentración progresiva de substrato con concentración fija del inhibidor. PRIMERA PARTE (Semana 1) Experimento 1 Efecto de la concentración de enzima La velocidad de reacción es afectada por la concentración de enzima presente en el medio de incubación. A medida que se incrementa la concentración de enzima, la velocidad de la reacción es mayor. En este experimento se variará la concentración de enzima y se mantienen constantes todos los demás factores. a. Tomar 5 frascos erlenmeyer de 125 mL c/u; rotularlos del 1 al 5 y proceder a agregar las cantidades que indica la siguiente tabla: Frasco N° H2O2 pH 7 Enzima Tiempo en min H2SO4 2N 1 2 3 4 5* 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 0,1 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,8 mL ----- 5' 5' 5' 5' 5' 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL mL gastados KmnO4 *Tubo control. 4 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea b. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reacción con ácido sulfúrico (en todos los frascos). c. Titule los frascos con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. d. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales Volumen de enzima 0,1 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,8 mL Concentración de Enzima (UI) 2 x 10-3 4 x 10-3 8 x 10-3 1,6 x 10-2 Velocidad de reacción (Calculada) e. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la concentración de la enzima. Nota: usar papel milimetrado. Experimento 2 Efecto de la temperatura. Toda reacción enzimática presenta una temperatura óptima la cuál es definida como la temperatura a la cual la velocidad de la reacción es mayor, manteniendo constante los otros factores. En este experimento se utilizaran tres temperaturas diferentes para observar el efecto de la misma sobre la actividad de la catalasa. a. Preparar tres series de tubos de ensayo (cada serie consta de dos tubos). b. Proceder a rotular los tubos de la siguiente manera: - 1era serie: tubos 1A y 1B. - 2da serie: tubos 2A y 2B. - 3era serie: tubos 3A y 3B. Los tubos "A" serán controles y los "B" experimentales. c. Agregar a cada uno de los tubos los reactivos y volúmenes indicados en la siguiente tabla: 5 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea Tubo Nº H2 O2 pH 7 Temperatura Enzima Tiempo H2SO4 2N 1A 1B 2A 2B 3A 3B 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 10°C 10°C 37°C 37°C 60°C 60°C -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5 mL 5 mL 5 mlL 5 mL 5 mL 5 mL mL gastados KmnO4 d. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reacción con ácido sulfúrico. e. Transfiera el contenido de los tubos a frascos erlenmeyer y titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. f. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales Temperatura °C Velocidad de reacción (calculada) 10 37 60 g. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la temperatura. Nota: usar papel milimetrado. Experimento 3 Efecto del pH La mayoría de las enzimas muestran su máximo de actividad en un rango limitado de pH. Es conocido que la conformación del sitio activo y su relación con el sustrato son afectadas por este factor. Esto es el resultado de la suma de una serie de factores tales como: ionización de la enzima, ionización del substrato, difusión de productos, etc. 6 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea En este experimento se determinará la actividad de la catalasa a diferentes valores de pH, para observar el efecto de este importante factor sobre la velocidad de la reacción. a. Rotular tres series de erlenmeyer al igual que en el experimento anterior. b. Adicione los reactivos y sus cantidades según la siguiente tabla: Frasco N° H2 O2 pH 3 H2O2 pH 7 H2 O2 pH 8 Enzima Tiempo H2SO4 2N 1A 1B 2A 2B 3A 3B 5 mL 5 mL ----- --5 mL 5 mL --- -------5 mL 5 mL -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL 5' 5' 5' 5’ 5’ 5’ 5 mL 5 mL 5 mlL 5 mL 5 mL 5 mL mL gastados KmnO4 c. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reacción con ácido sulfúrico. d. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. e. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales pH Velocidad de reacción (calculada) 3 7 8 f. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y el pH. Nota: usar papel milimetrado. 7 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea SEGUNDA PARTE (Semana 2) Experimento 4 Efecto de la concentración del substrato A medida que aumenta la concentración del sustrato, la velocidad de reacción aumenta. El aumento en la concentración de sustrato puede llegar a sobrepasar la capacidad de la enzima de convertirlo en producto, llegando esta a la velocidad conocida como máxima. (Vmax) En este experimento se aumentará progresivamente la concentración de peróxido de hidrógeno con el objetivo de determinar la velocidad máxima (Vmax) Procedimiento: a. Rotular tres series de erlenmeyer al igual que en el experimento anterior. b. Adicione los reactivos y sus cantidades según la siguiente tabla: Frasco No. H2 O2 pH 7 H2O destilada Enzima Tiempo H2SO4 2N 1A 1B 2A 2B 3A 3B 1,25 mL 1,25 mL 2,50 mL 2,50 mL 5 mL 5 mL 3,75 mL 3,75 mL 2,50 mL 2,50 mL ----- -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL mL gastados KmnO4 c. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reacción con ácido sulfúrico. d. Titular con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. e. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales 8 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Volumen de sustrato 1,25 mL 2,5 mL 5 mL Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea Concentración de Sustrato 1,25 x 10-2 M 2,5 x 10-2 M 5 x 10-2 M Velocidad de reacción (calculada) f. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la concentración de sustrato. Nota: usar papel milimetrado. Efectos del inhibidor. La actividad de la catalasa es fuertemente inhibida por agentes capaces de combinarse con el hierro de su grupo prostético porfirínico, tales como el KCN. Indudablemente la mayor parte de los efectos letales del cianuro se deben a la inhibición de enzimas ferroporfirínicas como la catalasa, citrocromo-oxidasa, etc. En este experimento se demostrará el efecto inhibitorio de concentraciones progresivas de cianuro sobre la velocidad de reacción enzimática. Se hará también la reacción con una sola concentración de cianuro y dosis progresivas de substrato, para determinar el tipo de inhibición producida por el cianuro sobre la enzima. Experimento 5 Efecto de la concentración progresiva del substrato sobre una sola concentración del inhibidor a. Rotular tres series de erlenmeyer al igual que en el experimento anterior. b. Proceder de igual forma al experimento N° 4. La única diferencia entre ambos experimentos es la presencia en todos los tubos de KCN. Contrastando los datos con los del experimento 4, podremos determinar que tipo de inhibición lleva a cabo el cianuro de potasio sobre la catalasa sanguínea. c. Coloque en los frascos lo que se indica en la tabla siguiente: 9 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Frasco N° H2O2 pH 7 1A 1B 2A 2B 3A 3B 1,25 mL 1,25 mL 2,50 mL 2,50 mL 5 mL 5 mL Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea H2 O KNC -3 10 M Enzima Tiempo H2SO4 2N 3,75 mL 3,75 mL 2,50 mL 2,50 mL --- 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL -0,5 mL 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL mL gastados KmnO4 d. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reacción con ácido sulfúrico. e. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. f. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales, así como los inversos de las velocidades 1/[V] y de las concentraciones de sustrato 1/[S] de los experimentos N° 4 y 6 (gráfico de los inversos recíprocos) Volumen de sustrato 1,25 mL 2,5 mL 5 mL Concentración de sustrato Velocidad de reacción 1 / [S] Exp 4 1 / [S] Exp 5 1 / [V] Exp 4 1 / [V] Exp 5 g. Construya un gráfico que muestre la relación entre el inverso de la velocidad de reacción y el inverso de la concentración de sustrato en presencia o no del inhibidor. Nota: usar papel milimetrado. Experimento 6 Efecto de la concentración progresiva de cianuro a. Tomar 5 erlenmeyer de 125 mL y roturarlos del 1 al 5. b. Agregar a cada uno de los erlenmeyer lo que se indica en la siguiente tabla: 10 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Frasco Nº 1 2 3 4 5 H2 O2 pH 7 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea KNC 10-4 M KNC 10-3 M KNC 10-2 M Enzima Tiempo H2SO4 2N 0,5 mL ----- -0,5 mL ---- --0,5 mL --- 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL --- 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL mL gastados KmnO4 c. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco para luego detener la reacción con ácido sulfúrico. d. Titular con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco. e. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales Concentración de Inhibidor (M) 0 10-4 10-3 10-2 Velocidad de reacción (calculada) f. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la concentración de la enzima. Nota: usar papel milimetrado. Cálculos de la velocidad de reacción La velocidad de reacción para cualquier tubo experimental se expresa en la siguiente unidad: ν= mmoles de H2O2 destruidos / minuto Para obtener el resultado de velocidad expresado en esa unidad deben realizarse los siguientes cálculos siguiendo esta secuencia: a. mEq de KmnO4 = N KMnO4 x Volumen gastado (mL) b. mEq de H2O2 = mEq de KmnO4 c. mmoles de H2O2 = mEq de H2O2 / N° de hidrógenos (2) d. mmoles destruidos de H2O2 = mmoles totales (control) – mmoles remanentes (experimental) 11 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea e. ν (velocidad de reacción) = mmoles destruidos de H2O2 / tiempo de reacción (5 minutos) Los cálculos deberán realizarse para cada tubo experimental en todos los experimentos. Construya las siguientes gráficas: a. Concentración enzimática contra velocidad de reacción (Experimento 1) b. Temperatura contra velocidad de reacción (Experimento 2) c. pH contra velocidad de reacción (Experimento 3) d. Concentración de sustrato contra velocidad de reacción (Experimento 4) e. Inverso de la concentración de sustrato contra inverso de la velocidad de reacción con y sin inhibidor (Experimentos 4 y 5) f. Concentración progresiva de inhibidor contra velocidad de reacción (Experimento 6) Auto evaluación 1. ¿Como cree usted que será el efecto de las temperaturas 15°C, 37°C y 60°C sobre la actividad enzimática de la catalasa sanguínea? 2. Explique que diferencia existe entre los tubos controles y experimentales de esta práctica. 3. ¿En que se basa el método titrimétrico por permanganimetría? 4. Que función cumple el H2SO4 N en los experimentos de esta práctica. Bibliografía Plummer, David. Bioquímica práctica. Mc Graw Hill. 1981. Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987. Universidad Simón Bolívar. Prácticas de Bioquímica I: BC-3181. Departamento de Biología Celular. 1999. 12 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now.
