INSTITUTO CONMEMORATIVO GORGAS DE ESTUDIOS DE LA SALUD DIRECCIÓN GENERAL OFICINA DE PLANIFICACIÓN INFORME DE CIERRE DE PROYECTO 2015 El objetivo del informe de cierre el proyecto es presentar los resultados e información relevante de la culminación del o los proyectos, comparándolo con la información prevista en el proyecto aprobado por el Ministerio de Economía y Finanzas (MEF) u otra fuente de financiamiento. Debe ser elaborado por el o los responsables del proyecto al finalizar la ejecución del mismo. Área de Trabajo: Dirección/Depto./Sección/Unidad: Edificio de Investigación 2 piso del laboratorio de Genómica y Proteómica Código SINIP:009044.025 Partida Presupuestaria:111.1.3703001117 Nombre completo del Proyecto: Diagnóstico Molecular de Cáncer Responsable del proyecto: Dr. Juan Miguel Pascale Co-investigadores: Yamitzel Zaldivar, Alexander Martínez, David Cardenas Tipo de Investigación: Especialidad vinculada: SALUD Patrocinador o financiador: MEF Principales aliados y/o colaboradores del proyecto internos: Principales aliados o colaboradores del INSTITUTO ONCOLÓGICO proyecto Externos: Fecha Inicio del Proyecto: Fecha de Período del Informe: 2009 Culminación del 2015 Proyecto:2016 Proyecto de continuidad SI /_X__/ No/__X___/ Si la respuesta es afirmativa cuando inicio /_2009I__/ cuando termina /__2018__/ COMPLETAR EN CASO DE QUE EL PROYECTO SEA DE CONTINUIDAD: ¿Existe algún factor que ponga en riesgo la sostenibilidad del proyecto? Si /____ / No /__X__/ Explique: OBJETIVOS: Objetivo General: Implementar un centro de diagnóstico molecular del cáncer en Panamá. Objetivos Específicos: Capacitar a los tecnólogos médicos en el uso de técnicas moleculares para el diagnóstico, tratamiento, seguimiento y pronóstico de los pacientes con Cáncer en Panamá. Contribuir al desarrollo de un nuevo algoritmo de diagnóstico y tratamiento para los pacientes con sospecha de Cáncer en Panamá. Contribuir a mejorar el pronóstico de los pacientes con Cáncer en Panamá. Reducir los costos de atención. Estandarizar las pruebas diagnósticas para los diferentes Cánceres en Panamá y así asegurar una calidad en la atención de nuestros pacientes. EJECUCION FINANCIERA Monto total del proyecto: 100,000.00 Monto total ejecutado: 98,898.34 Avance Físico 70% LISTE LAS PRINCIPALES METAS DEL PROYECTO: Las principales metas están incluídas en los objetivos específicos del proyecto. PRINCIPALES RESULTADOS OBTENIDOS CON EL PROYECTO DE ACUERDO CON LAS METAS PLANTEADAS (Breve resumen de los progresos, hallazgos, publicaciones, presentaciones realizadas) En 2015, se realizaron los siguientes items: Logros: Realización de la prueba de detección de mutaciones en el gen Kras a 134 personas con cancer colorectal de diversos hospitales de Panamá (ver Grafica #1 Anexo 1) Se ha realizado la transferencia de la metodología de detección de mutacion en el gen Kras al Hospital Oncológico Nacional (Figura #1 a 2 Anexo 1). Se ha realizado la transferencia de la metodología de detección de mutacion en el gen ckit al Hospital Oncológico Nacional. Se capacitó a personal técnico para la realización de nuevas estandarizaciones. Adquisición de reactivos especializados para la evaluación de una técnica de patrones de metilación y expresión del gen PSA3 en sujetos sometidos a tacto prostático (Anexo 2). Principales Resultados de Impacto: Transferencia de la técnica de detección de mutaciones en el gen k-ras al Instituto Oncológico Nacional. Estandarización de la técnica de detección de mutaciones en el gen c-kit. Estandarización de la extracción de ADN a partir de tejido embebido en parafina. Respuesta diagnóstica para la detección de mutaciones a nivel de los genes c-kit y k-ras al Instituto Oncológico Nacional. Retos para periodo 2016: Culminar con la estandarización e implementación de una metodología para monitoreo de cancer de prostata. Retos para periodo 2017-2018: Implementación de metodologías geneticas de diagnóstico temprano de cancer de mama en población de alto riesgo. Implementación de metodologías geneticas de diagnóstico temprano de cancer de prostata en población de alto riesgo. ¿Cómo esta almacenada la información recolectada? (base de datos, informes, otros? Base de datos (excel y EpiInfo) en una computadora con clave (contraseña). EXPLIQUE: ¿El proyecto se realizó de acuerdo a lo planificado? SI ___X__ / NO _____ Nota: En el caso de proyectos de investigación referirse al protocolo y respecto a infraestructura y equipamiento referirse al pliego y/o especificaciones/contrato En caso que la respuesta sea negativa, explique porque: ¿Se han requeridos enmiendas al Proyecto original? SI/______/ No/__X__/ ¿Si su respuesta es afirmativa favor dar detalle del número de enmiendas o cambios al proyecto y mencione las fechas de aprobación? LECCIONES APRENDIDAS: (señale brevemente y de forma objetiva y crítica las lecciones aprendidas del proceso seguido en la ejecución del proyecto). Las lecciones tienen relación con las preguntas ¿el diseño fue el adecuado?; ¿la estrategia de ejecución fue eficiente? ¿Qué cosas se hicieron bien? La elección de colaboradores claves en el Instituto Oncológico permitió la realización de transferencia de metodologías, y la aplicación de pruebas moleculares a los pacientes que presentaron cancer colon-rectal ¿Qué se podría haber realizado mejor? Mejorar la logística y el número de colaboradores dentro del Instituto Oncológico capacitados y orientados al uso de las aplicaciones que se estan implementando en el proyecto. ¿Qué se hizo mal? Enfocar el abordarje a los tipos de cancer más frecuentes en Panamá, como lo son Cancer de mama y de prostata. En el periodo 2017 y 2018 se propone realizar estos objetivos prioritarios luego de una estandarización de metodologías que estamos realizando en el 2016. ¿Qué haría diferente si trabajara en el mismo proyecto? Enfocar el trabajo a los tipos de cancer que más afectan a la población Panameña, como lo son el cancer de mama y el de prostata, evaluando además nuevas metodologías que permitan un diagnóstico temprano de recurrencia o recrudecencia de la enfermedad. ¿Qué recomendaciones haría a futuros proyectos? Incluir la evaluación de canceres gastroinstestinales, y canceres provocados por agentes infecciosos como lo son el cancer de higado, de cervix. SEÑALE LOS PRINCIPALES PROBLEMAS O LIMITACIONES EN LA EJECUCIÓN DEL PROYECTO: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Deficiencia en el diseño del proyecto de inversión: Deficiencias en el área administrativa: Desinterés de los beneficiarios: Deficiencia en la asignación de recursos presupuestarios: Falta de capacitación de la unidad ejecutora: Deficiente calidad de los equipos /insumos: Problemas climatológicos/físicos/geográficos: Deficiente desempeño de contratistas/consultores: Limitaciones de carácter legal: Deficiencia en los arreglos institucionales: Ingreso tardío del protocolo a Bioética: Otra especifique: Certifico que el estudio se realizó en estricta conformidad de acuerdo a lo indicado en el protocolo aprobado del Proyecto. Responsable de la Unidad Ejecutora: Nombre: Alexander Martínez Firma Fecha: 16-03-2016____ Teléfono: 527-4821__________Correo electrónico: almartinez@gorgas.gob.pa Responsable de la elaboración del Informe: Nombre:______________________Firma____________________Fecha:_____ Teléfono: ___________________Correo electrónico: _____________________ PARA USO DE LA EXCLUSIVO DE LA OFICINA DE PLANIFICACIÓN Observaciones: ANEXO 1 Resultados del análisis de mutaciones asociadas a Kras. Gráfica #1. Distribución de las muestras realizadas en la determinación de mutaciones del gen Kras. Gráfica #2. Número de muestras procesadas gen Kras. Gráfica #2. Mutaciones asociadas a Resistencia del tratamiento en el gen Kras. Figura #1 Resultado de amplificación de pacientes analizados. ANEXO 2 Proyecto “Desarrollo de una prueba molecular para la detección de cáncer de próstata a partir de orina”. Investigador principal David Cárdenas Co-investigadores: Juan Miguel Pascale Yamitzel Zaldívar Fuente de financiamiento: Ministerio de Economía y Finanzas Instituciones asociadas: Instituto Oncólogico Nacional (ION) Hospital Santo Tomás (HST) Complejo Hospitalario Dr. Arnulfo Arias Madrid (CHAAM) Período de ejecución: 2013-2015 Breve resumen del proyecto El Cáncer es una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial. En Panamá, según estadísticas del Instituto Oncológico Nacional (ION), durante el 2008 se registraron unos 2,411 casos de Cáncer en general Las estadísticas del año 2010 de la Contraloría General de la Nación indicaron que los tumores malignos ocupan la primera causa de defunciones en el país, dando a conocer el alto número de personas que mueren de ésta patología cada año. En nuestro país, de acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS) y su Agencia Internacional de Investigación del Cáncer (IARC), se destacaron entre los cánceres más frecuentes durante el año 2008, el Cáncer de próstata, mama, cérvix, colorrectal, estómago y pulmón. Este grupo de enfermedades tiene un impacto social y económico de importancia para nuestro país. Por muchos años, el cáncer se ha estudiado rigurosamente, pero, a pesar de que se tienen enumerados cuales son los factores de riesgo implicados en su aparición, aún no se ha encontrado una cura específica. Debido a esto, los científicos deben seguir inclinándose a realizar un diagnóstico temprano de la enfermedad, que sea rápido, confiable y que brinde beneficios directos al paciente. En este año se inició la fase de estandarización y validación de la prueba que busca detectar células cancerosas a partir de orina de pacientes con cáncer de próstata. Principales Avances y Logros El proyecto “Desarrollo de una prueba molecular para la detección de cáncer de próstata a partir de orina” fue aprobado a mediados del año 2015 por el Comité de Bioética de la Investigación del Instituto Conmemorativo Gorgas. Hasta la fecha se ha logrado recolectar la orina de 34 pacientes, de los cuales 13 son pacientes retrospectivos y 21 son pacientes prospectivos. En el caso de los pacientes retrospectivos, el 77% corresponde a personas diagnosticadas con cáncer de próstata mientras que el 23% restante corresponde a personas cuya biopsia prostática inicial y/o repetida resultó negativa. Como se mencionó en el informe anterior, la falta de la detección reproducible del biomarcador PCA3 (a pesar de que se incorporó un paso de preamplificación en la metodología) en las muestras de mRNA de los primeros 6 pacientes retrospectivos nos llevó a pensar que en dichas muestras hay presencia de inhibidores de la RTqPCR o que hay muy poca cantidad de mRNA por su susceptibilidad a la degradación. Por ello, se decidió extraer RNA total a partir de las próximas muestras por su mayor estabilidad en comparación con el RNA mensajero. Utilizando una muestra comercial de RNA total de próstata humana se probaron varias condiciones de transcripción en reversa y se seleccionó la más conveniente. Posteriormente, se realizó un ensayo para verificar que las condiciones del paso de transcripción en reversa eran reproducibles y mantenían la alta eficiencia de la qPCR de PSA y PCA3. Para ello, se realizó una RT-qPCR para ambos genes con y sin preamplificación a partir de diluciones seriadas desde 20 ng a 625 pg del RNA total de próstata comercial. Los resultados mostraron una buena reproducibilidad y una eficiencia por arriba del 90% para la detección de ambos genes, tanto incorporando como sin incorporar un paso de preamplificación en la metodología. El siguiente paso fue probar las condiciones de ambos ensayos RT-qPCR en 3 muestras de RNA total de pacientes. Desafortunadamente, sólo se pudo detectar la presencia de PSA (con y sin preamplificación) en niveles por debajo de 10 copias en el tubo de reacción. Es posible que esta baja sensibilidad sea debida a que se partió de muy poca cantidad de RNA total para la transcripción en reversa o que la cantidad de RNA total de próstata en la muestra es tan pequeña o ausente que dificulta la detección de PSA y PCA3 a partir de la cantidad de RNA total ensayada. Es necesario realizar más pruebas con mayor cantidad de RNA total para verificar una presencia significativa y, por lo tanto, obtener una cuantificación confiable del biomarcador en las muestras de pacientes. Además del análisis de PCA3 como biomarcador, también se ha considerado analizar la expresión de otros 2 biomarcadores a nivel de mRNA en las mismas muestras. Se trata de las fusiones génicas TMPRSS2-ERG y TMPRSS2-ETV1, cuyas expresiones también se han asociado ampliamente en la literatura con la presencia de cáncer de próstata. Ensayo RT-qPCR de PSA. RT-qPCR a partir de diluciones seriadas de 2 (20 – 0.625 ng) sin incorporar (curvas rojo a púrpura) e incorporando (curvas azul a verde) un paso de preamplificación de 16 ciclos previo a la qPCR. Con respecto a GSTP1, debido a los problemas de inespecificidad cruzada que hemos tenido con las 2 parejas de primers que se han ensayado previamente, se utilizará una nueva pareja de primers, descrita en un artículo reciente, que amplifica la forma metilada del promotor de GSTP1. Al igual que en el caso de PCA3, también se consideró analizar la expresión de otros 2 biomarcadores epigenéticos a partir del DNA genómico de las mismas muestras: la forma metilada del promotor de los genes APC y RARB2, cuya hipermetilación en su región promotora también se han asociado frecuentemente en la literatura con la aparición de cáncer de próstata. En resumen, los ensayos RT-qPCR para los biomarcadores PSA y PCA3 parecen funcionar eficientemente ya que se establecieron condiciones de ensayo que muestran una eficiencia de amplificación por arriba del 90% (con y sin el paso de preamplificación). En el caso de GSTP1, se ensayará la nueva pareja de primers para evaluar su especificidad por la forma metilada del promotor y poder ser usada para la cuantificación de su expresión en las muestras de los pacientes. Finalmente, se espera que el uso de los biomarcadores adicionales amplíe y haga más robusto el estudio que estamos realizando actualmente. 40 35 y = -1.009x + 29.689 R² = 0.991 Mean Cq 30 E = 98.77% 25 20 15 y = -1.0753x + 20.513 R² = 0.9956 10 E = 90.52% 5 0 -1 0 1 2 3 4 5 log2 total RNA Eficiencia de la RT-qPCR de PSA. Curva estándar de las diluciones seriadas de 2 (20 – 0.625 ng) sin incorporar (curva azul) e incorporando (curva roja) un paso de preamplificación de 16 ciclos previo a la qPCR. Ambas curvas presentan una eficiencia por arriba de 90%. 40 y = -0.972x + 33.657 R² = 0.9876 35 E = 104.03% Mean Cq 30 25 20 15 y = -1.0095x + 24.567 R² = 0.9981 10 E = 98.7% 5 0 -1 0 1 2 3 4 5 log2 total RNA Eficiencia de la RT-qPCR de PCA3. Curva estándar de las diluciones seriadas de 2 (20 – 0.625 ng) sin incorporar (curva azul) e incorporando (curva roja) un paso de preamplificación de 16 ciclos previo a la qPCR. Ambas curvas presentan una eficiencia por arriba de 90%.