PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BUSQUEDA DE HONGOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) Y PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE DIFERENTES AMBIENTES JUAN PABLO ROSAS MORALES JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el título de MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL Bogotá D.C. 2010 BUSQUEDA DE HONGOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) Y PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE DIFERENTES AMBIENTES JUAN PABLO ROSAS MORALES JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA APROBADO _______________________ INGRID SCHULER Ph.D Decana académica ______________________ JANETH ARIAS M. Sc Directora de Carrera 2 BUSQUEDA DE HONGOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) Y PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE DIFERENTES AMBIENTES JUAN PABLO ROSAS MORALES JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA APROBADO ______________________ FABIO ROLDAN Ph.D Microbiólogo Director _______________________ AURA MARINA PEDROZA Ph.D Bacterióloga Jurado TABLA DE CONTENIDO 1. RESUMEN………………………………………………………………………………………………..6 2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………8 3. JUSTIFICACIÓN.........................................................................................................................9 4. MARCO TEORICO…………………………………………………………………...........................10 5. OBJETIVOS…………………………………………………………………………...........................14 5.1. Objetivo General……………………………………………………………………………………14 5.2. Objetivo Especifico ……………………………………………………………..........................14 6. MATERIALES Y METODOS………….......................................................................................15 6.1. Origen de las muestras………………………………………………………...........................15 6.1.1. Muestras impactadas con explosivos…………………………………………………….15 6.1.2.Muestras no impactadas con explosivos…………………………………………………15 6.1.3.Cepas de colección…………………………………………………………………………15 6.2. Aislamiento de hongos de suelo……………………………………………………..………….16 6.3. Aislamiento de hongos a partir de muestras no impactadas…………………….….……....16 6.4. Conservación de las cepas………………………………………………………………………16 6.5. Pruebas de tolerancia a explosivos………………………………………………….………….16 6.6. Pruebas de degradación ………….……………………………………………………..………16 6.7. Extraccion de los explosivos y analisis cromatografico………………………………………17 7. DISCUSION Y RESULTADOS…………………………………………………………………..……18 7.1. Aislamiento de hongos a aprtir de muestras impactadas…………………………………….18 7.2. Aislamiento de hongos apartir de muestras no impactadas………………………………...20 7.3. Tolerancia a los explosivos……………………………………………………………………...20 7.4. Degradacion de los Explosivos………………………………………………………………….24 7.4.1.Degradacion de TNT………………………………………………………………………..24 7.4.2.Degradacion de PETN……………………………………………………………………...26 7.4.3.Degradacion de Pentolita…………………………………………………………………..27 8. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………29 9. RECOMENDACIONES……………………………………...…………………………………………30 10. BIBLIOGRAFIA………………………………………………………………………………………….31 11. ANEXOS………………………………………………………………………………………………...32 Anexo 1………………………………………………………………………………………………………………………………………32 Anexo 2………………………………………………………………………………………………………………………………………35 Anexo 3………………………………………………………………………………………………………………………………………36 Anexo 4………………………………………………………………………………………………………………………………………37 Anexo 5………………………………………………………………………………………………………………………………………38 4 Anexo 6………………………………………………………………………………………………………………………………………39 Anexo 7………………………………………………………………………………………………………………………………………40 1. RESUMEN La fabricación de explosivos con fines militares y mineros, ha hecho que este tipo de moléculas altamente persistentes lleguen al ambiente y sea necesario diseñar estrategias con el fin de remediar sitios contaminados. Dentro de estas tecnologías se encuentra la biorremediación con hongos, en especial de la podredumbre blanca, por su capacidad de mineralizar eficientemente el TNT convirtiéndolo a CO2 y agua. Son muy pocos los estudios que se han llevado a cabo con hongos de suelo y por esto el objetivo del presente estudio fue aislar y evaluar hongos degradadores de TNT y PETN a partir de diferentes ambientes. Se recolectaron muestras de suelo impactadas con TNT y PETN, a las cuales se realizaron recuentos de hongos utilizando agar Extracto de Malta (MEA) suplementado con TNT, PETN y Pentolita a 50, 100 y 300 mg/L. Se obtuvieron recuentos en el orden de 103 UFC/g para todas las concentraciones de PETN evaluadas, para TNT se obtuvieron recuentos en el orden de 10-102 UFC/g en las concentraciones probadas y para Pentolita se obtuvieron recuentos en el orden de 101-102 en las concentraciones de 50 y 100 mg/L mientras que en 300 mg/L no se observó crecimiento. Se seleccionaron 25 morfotipos macroscópicamente diferentes que crecieron en las concentraciones evaluadas más altas. Se aislaron 5 cepas a partir de muestras no impactadas con explosivos y se obtuvieron 2 cepas de colección. A todos las cepas seleccionadas se evaluó la capacidad de crecer en diferentes concentraciones (100, 300 y 500 mg/L) de TNT, PETN y Pentolita, midiendo el crecimiento radial diariamente. Se observó que el TNT causa una fuerte inhibición sobre el crecimiento, al igual que la pentolita; efecto que no se observo con PETN. La formación de cristales con 500 mg/L de TNT permitió observar la posible biotransformacion del explosivo por medio de la formación de halos de solubilización y coloración del agar en la cepa H10. Se seleccionaron las cepas S2, S3, S4 y H10 por presentar el menor porcentaje de inhibición y como los mejores candidatos para las pruebas de degradación y la cepa S24 que presento altos porcentajes de inhibición en TNT. A estas cinco cepas se les evaluó la capacidad de degradar 100 mg/L de explosivo en el medio de cultivo YMG. Todas las cepas removieron de 60 a 70% del TNT y 100% del TNT cuando estaba mezclado con PETN (Pentolita 50 mgL1 de TNT y 50 mg/L de PETN). Durante el estudio se detecto la 6 formación de metabolitos de la degradación de TNT como aminodinitrotoluenos (ADNTs) y dinitrotoluenos (DNTs) lo que indicaría la habilidad de las cepas de degradar el TNT por la vía Hidroxilaminodinitrotolueno (OHADNTs) y/o por la formación del complejo Meisenheimer. No queda claro si las cepas evaluadas degradan el PETN ya que los datos presentaron alta variabilidad al igual que los controles, debido a la naturaleza del explosivo. En conclusión se aislaron 5 cepas capaces de crecer en altas concentraciones de TNT, PETN y Pentolita, con la capacidad de alcanzar altos porcentajes de degradación de TNT. 1. INTRODUCCIÓN Los explosivos son compuestos químicos, que pueden liberar una gran cantidad de energía en forma de gas, y por esta razón son ampliamente utilizados en la industria militar y civil (1). El incremento de la producción de este tipo de sustancias se dio con el inicio de la primera guerra mundial y la creación de fábricas únicamente dedicadas a su producción. El 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) y pentaeritritol tetranitrato (PETN) son compuestos explosivos y altamente persistentes, que pueden llegar a contaminar suelos y aguas subterráneas, en especial el TNT posee una toxicidad alta para la mayoría de los organismos, debido su carácter citotóxico y mutagénico (1), por otro lado no se ha podido establecer si el PETN es igualmente toxico (2). Se han desarrollado diferentes estrategias con el objetivo de remediar sitios contaminados con explosivos, como la adsorción a matrices de carbón activado, procesos de oxidación avanzada, biorremediación, fitorremediación e incineración siendo ésta ultima la más usada, sin embargo ha resultado altamente costosa debido a la extracción, transporte y energía requerida (3-5). La biorremediación presenta ventajas debido a su bajo costo, facilidad en las operaciones, y por ser ambientalmente amigable, por lo que se han encaminado esfuerzos tanto por buscar cepas capaces de degradar o transformar los explosivos como por elucidar las rutas metabólicas encargadas de su degradación (6). En bacterias se conoce las rutas metabólicas capaces de degradar TNT y PETN pero con el gran limitante de que no los mineralizan completamente y en algunos casos con la producción de compuestos más tóxicos que los propios explosivos, es por esto que en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) se han desarrollados estudios con el fin de aislar bacterias capaces de degradar tanto TNT como PETN (78). Pero se ha despertado un interés en los hongos ya que se encuentran reportes de la habilidad de estos organismos de transformar el TNT y en algunos casos llevar a cabo mineralización de manera eficiente, además que no existen reportes en la literatura de la degradación de PETN por hongos. Por esta razón el objetivo del presente estudio fue aislar y evaluar hongos degradadores de TNT y PETN a partir de ambientes contaminados y no contaminados. 8 2. JUSTIFICACIÓN El TNT es un compuesto xenobiótico, posiblemente carcinogénico y mutagénico, altamente persistente en el suelo y en el agua subterránea. Por otro lado, el PETN además de ser usado como explosivo se ha empleado como medicamento para el tratamiento de la angina; sin embargo, algunos autores lo consideran potencialmente toxico a diferentes niveles tróficos lo que hace importante su estudio. La biodegradación de estos compuestos es considerada como una de las mejores alternativas para remediar ambientes contaminados con explosivos debido a su bajo costo y a la posibilidad de llevar a cabo procesos de mineralización completa. Otras tecnologías como la incineración, vertimientos a cuerpos de agua y confinamiento en rellenos, son soluciones temporales y costosas que simplemente transfieren el problema a un ambiente diferente. Se ha reportado ampliamente la capacidad de los hongos para degradar el TNT, en especial hongos de la podredumbre blanca, los cuales liberan enzimas extracelulares inespecíficas capaces de degradar compuestos aromáticos similares a los encontrados en la lignina. La degradación de PETN por hongos, en nuestro conocimiento no se encuentra reportada en la literatura, por lo que su estudio despierta gran interés debido al desconocimiento del metabolismo empleado para su degradación. Por lo anterior resulta pertinente la búsqueda de hongos nativos degradadores de TNT y PETN que permitan futuras investigaciones que promuevan el desarrollo de tecnologías para la remediación de suelos contaminados y que sean económicamente sostenibles y ambientalmente amigables. 3. MARCO TEÓRICO Un explosivo es un compuesto químico que bajo la influencia de un choque térmico o químico se descompone rápidamente con la generación de grandes cantidades de gas y energía térmica (1). Desde el surgimiento de la química orgánica en 1830 se han logrado sintetizar algunos compuestos por nitración como el TNT y el PETN, que por sus propiedades explosivas se han usado con propósitos militares y civiles. El TNT es un compuesto nitroaromático producto de la nitración del tolueno. Esta nitración se da mediante una reacción de sustitución electrofílica, la cual requiere la presencia de ácidos nítrico y sulfúrico altamente concentrados (9). El PETN es un compuesto, siendo el más estable de los esteres de nitrato, el cual es sintetizado en dos pasos principales de condensación y esterificación (10). (Figura 1) (Tabla 1). TNT 2,4,6-trinitrotoluneno PETN Pentaeritritol tetranitrato Figura 1. Estructura química del TNT y PETN El TNT es un compuesto química y térmicamente estable, con un bajo punto de fusión y como la mayoría de nitroaromaticos presenta baja solubilidad en el agua, además de una baja volatilidad expresada en los valores de presión de vapor y constante de Henry (11). Por otro lado el coeficiente de partición octanol/agua muestra que no se asocia fuertemente al suelo, por lo que presenta gran movilidad en el ambiente. El PETN es un compuesto altamente hidrofóbico, insoluble en agua, presenta un valor de log Kow de 1.6, lo que sugiere que se adsorbe débilmente al suelo con una consecuente movilidad en el ambiente (10). (Tabla 1). El TNT y PETN llegan al ambiente por las aguas residuales y desechos sólidos producidos durante su fabricación, procesamiento, destrucción y reciclaje de explosivos. Una vez en el ambiente estos compuestos pueden sufrir distintos procesos en los que se incluyen, disolución, adsorción, volatilización, transformación, 10 degradación biótica o abiótica y bioacumulación (1). La permanencia en el ambiente de estos explosivos o de sus subproductos puede generar un peligro potencial para los diferentes niveles tróficos como para la salud humana, por lo que la Agencia de Protección Ambiental (EPA del inglés Envinronmental Protection Agency) de los Estados Unidos, incluye dentro de su lista de prioridades nacionales aquellos sitos en los que exista contaminación con TNT. Adicionalmente clasifica al TNT en el grupo C: (compuesto posiblemente carcinogénico) (12). Estudios con PETN muestran que es un compuesto con una toxicidad baja y sin efectos cancerígenos en modelos animales, además la EPA no lo clasifica como un compuesto potencialmente toxico, ni tampoco incluye sitios contaminados con PETN dentro de la NPL. Tabla 1. Algunas Propiedades Físico químicas del TNT y PETN Propiedad fisicoquímicas TNT PETN 227.13 316.17 Punto de Fusión (ºC) 80.1 143.3 Solubilidad en agua a 25 ºC (mg.L-1) 130 43 coeficiente octanol/agua (Log Kow) 1.6 3.71 Constante de Henrry`s (Atm.m3. mol-1) 4.57 × 10–7 1.7 × 10–9 Presión de vapor a 25ºC (mm Hg) 1.99 × 10–4 5.38 × 10–9 Peso molecular (gmol-1) Tomada de: Rivera y colaboradores, 2009 Los riesgos potenciales para los ecosistemas y el hombre, han creado la necesidad de buscar métodos efectivos y ambientalmente amigables que permitan remediar ambientes impactados con TNT y/o PETN. Algunos métodos usados frecuentemente para el tratamiento de aguas residuales y suelos contaminados con explosivos incluyen filtración, coagulación, fotolísis, adsorción a matrices de carbón activado e incineración(3, 5, 13). El costo de estas tecnologías y el incremento de la contaminación de algunas de ellas ha motivado a muchos investigadores en las últimas décadas a buscar sistemas biológicos como una alternativa para la eliminación de éstos contaminantes en el suelo y aguas (6), pues representa ventajas en cuanto a costos, seguridad y efectividad frente a los otros métodos. Durante los últimos 25 años se ha investigado sobre las rutas de degradación y los organismos involucrados en la degradación de explosivos. La degradación de TNT en condiciones aerobias ha sido ampliamente reportada por cepas del genero Pseudomonas sp, mostrando la capacidad de reducir el TNT a ADNTs o por la remoción de grupos NO2 por medio de nitroreductasas (14). Además se conocen otras vías que pueden transformar el TNT de manera oxidativa produciendo acido 4amino-2,6- dinitrobenzoico. Por otro lado, en condiciones anaerobias es más frecuente encontrar microorganismos que puedan llevar a cabo transformaciones del TNT debido al carácter electronegativo de la molécula, siendo así el triaminotolueno el principal producto de degradación (15). Diferentes estudios cometabolismo han demostrado que los hongos degradan TNT por siendo capaces primero de reducir uno o dos grupos nitro del compuesto. El principal producto de esta reducción son los aminodinitrotoluenos (ADNTs) y sus intermediaros son nitrosodinitrotolueno (NODNTs) y hidroxilaminadinitrotolueno (OHADNTs) (16-17). La subsecuente transformación de los compuestos dependerá de la especie del hongo, las condiciones de cultivo y el tiempo de incubación (18). Los productos de la reducción del TNT por hongos son bien conocidos, pero los mecanismos por los cuales se lleva a cabo están aún en discusión. Se ha propuesto que la membrana celular forma un sistema de reducción el cual está relacionado con el sistema de secreción de protones (19). Por lo anterior se plantea que las enzimas ligninolíticas no están involucradas en los primeros pasos de la reducción del explosivo ya que hongos no ligninoliticos pueden llevar a cabo estas primeras reducciones. Las enzimas que por cometabolismo se encuentran relacionadas con la oxidación del TNT son sintetizadas por los hongos con el fin de romper el polímero de la lignina y sustancias húmicas, por eso son llamadas enzimas lignonolíticas. Estas enzimas son la lignino peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa y lacasa, las cuales catalizan la 12 oxidación de un electrón de compuestos fenólicos y no fenólicos. La enzima lacasa oxida moléculas con bajo potencial de reducción (E0= 780 Mv), a diferencia LiP y MnP que tienden a oxidar compuestos con un alto potencial de reducción (E0= 1100-1500 Mv (20). Acorde con la estructura de diferentes sustratos, estas enzimas no son específicas y pueden oxidar un amplio rango de moléculas. Basados en el producto de las enzimas ligninolíticas estas se pueden clasificar en tres grupos de hongos de la podredumbre blanca, grupo LiP-MnP, el más eficiente degradador de lignina, el grupo LiP-Lacasa y el grupo MnP-Lacasa. Recientemente se han propuesto diferentes técnicas de biorremediación de ambientes con TNT, una de éstas es el uso de hongos ligninoíiticos, la cual se basa en la combinación de bioaumentación y bioestimulación. Para este tipo de tecnologías se ha usado Phanerochaete chrysosporium con el cual se ha demostrado en condiciones de laboratorio y a escala piloto que la biorremediación de suelos contaminados es posible. Sin embargo, es importante distinguir entre la mineralización y la transformación de los compuestos, ya que experimentos muestran que el 85% del TNT inicial ha sido transformado durante un periodo de 30 a 90 días, pero sólo del 5 a 20% fue mineralizado (21-22) . Por lo tanto es necesario enfocar esfuerzos en aislar organismos capaces de llevar eficientemente procesos de transformación y mineralización de estos explosivos. La degradación de PETN ha sido reportada por la cepa Enterobacter cloacae PB2, la cual fue aislada de suelos contaminados con explosivos, es capaz de de usar el PETN como fuente de nitrógeno ya que posee la enzima nitrato ester redusctasa que lleva a cabo la remoción secuencial de dos grupos nitro (23). Sin embargo, en nuestro conocimiento no existen estudios en la literatura sobre la degradación de PETN por hongos, pero cabe mencionar los ensayos sobre la degradación del glicerol tetranitrato (GNT) un explosivo con similares características estructurales debido a que tiene el grupo ester de nitrato (C-O-NO2) al igual que PETN. Los hongos Geotrichum candidum y P. chrysosporium han mostrado la remoción secuencial de dos grupos nitro con la respectiva formación de gicerol dinitrato y glicerol mononitrato (24-25). 4. OBJETIVOS 5.1 Objetivo general Aislar hongos degradadores de TNT y PETN a partir de diversos ambientes. 5.2 Objetivos específicos • Establecer las condiciones para la recuperación de los hongos posibles degradadores de TNT y PETN. • Seleccionar los hongos capaces de crecer en altas concentraciones de TNT y PETN. • Evaluar la capacidad degradadora de TNT y PETN de los hongos seleccionados. 14 5. MATERIALES Y METODOS 6.1 Origen de las muestras. 6.1.3 Muestras impactadas con explosivos Se recolectaron tres muestras en una planta de fabricación de explosivos en Sibate, Cundinamarca, Colombia. La muestras corresponden la zona de Fitorremediación (M1), campo de prueba de la planta (M2) y al canal de cristalización de la misma (M3) (7, 26). Tabla 2. Características fisicoquímicas de las muestras impactas. Muestra Con. TNT (mg/Kg) Con. PETN (mg/Kg) pH Salinidad (mg/L) M1 N.D* 35,3± 30,7 7,42 0.47 M2 1,0 ± 0,1 3,1 ± 2,8 7,88 0.63 M3 5,2 ±1,2 0,0 7,34 0.22 *Concentración no determinada 6.1.2 Muestras no impactadas con explosivos Se recolectaron de forma oportunista trozos de madera de arboles en estado de descomposición en la hacienda la Victoria Ubicada en la Dorada, Caldas. Las muestras se transportaron al laboratorio dentro de bolsas humedecidas y se mantuvieron en refrigeración hasta el procesamiento de las muestras. 6.1.3 Cepas de colección Dos cepas, Trametes sp y Earliella sp fueron suministradas por la doctora Amanda Varela del laboratorio de Ecología de Suelos y hongos Tropicales (LESYHT) de la Pontificia Universidad Javeriana. 6.2 Aislamiento de hongos de suelo Se tomaron 10 g de suelo y se suspendieron en 90 mL de solución salina al 0,9%, y se realizaron diluciones seriadas hasta 10-3. Se inocularon 0,1 mL de cada una de las soluciones en Agar Extracto de Malta (MEA) (Oxoid) suplementado con 200 mg L-1 de Penicilina G y 200 mg L-1 de Estreptomicina sulfatada (Aldrich, Sigma) (27). Se adicionaron TNT, PETN o Pentolita (TNT-PETN, 1:1) a concentraciones de 0, 50, 100 y 300 mg/L. Después de 8 días de incubación a 24±1,4°C se realizaron los recuentos de UFC/g de cada muestra. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. 6.3 Aislamiento de hongos a partir de muestras no impactadas Las muestras de madera se desinfectaron con alcohol etílico (70%) y se sembraron en MEA con antibióticos. Se incubaron a 24±1,4°C duran te 8 días. Posteriormente se realizaron aislamientos con el fin de purificar los hongos obtenidos (28). 6.4 Conservación de las cepas Las cepas fueron conservadas usando un disco de agar colonizado con micelio, suspendido en 1 mL de agua estéril, mantenidos a una temperatura de 4°C (29) y almacenados en el cepario de USBA. 6.5 Pruebas de Tolerancia a explosivos La cepas seleccionadas se sembraron utilizando discos de agar colonizado con micelio en MEA suplementado con antibióticos, más TNT, PETN o Pentolita (TNT – PETN, 1:1) a concentraciones de 0, 100, 300, 500 mg/L y se incubaron durante 12 días a 24±1,4°C. Diariamente se realizó seguimiento del crecimiento radial de las cepas en cada una de las concentraciones probadas, mediante la medición del diámetro de la colonia en milímetros(27, 29). Todos los ensayos se realizaron por duplicado. 6.6 Pruebas de degradación Las cepas que presentaron la menor inhibición de crecimiento fueron seleccionadas para evaluar su capacidad degradadora. Las cepas seleccionadas se inocularon 16 utilizando 4 discos de agar colonizados con micelio en 120 mL de caldo YMG (Extracto de Malta 10 g/L, Extracto de Levadura 4 g/L Y Glucosa 4 g/L) (Oxoid) preparado por componentes y suplementado con antibióticos. Luego de 4 días de incubación se adicionaron 100 mg/L de TNT, PENT o Pentolita. Los caldos de cultivo se agitaron a 110 rpm, a 24±1,4°C en oscuridad. Se tomaron muestras de cada unidad experimental a las 0, 4, 8, 22, y 30 h. se realizo control de adsorción bajo el mismo procedimiento anterior, esterilizando la biomasa por autoclave a 121°C a 15 psi durante 15 min antes de adicionar los explosivos y para el control abiótico se utilizo el caldo de cultivo sin inocular. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. 6.7 Extracción y análisis de los explosivos por HPLC Para la determinación de los explosivos se siguió el método 8330B de la EPA (30). Para la extracción se tomaron 5 mL del caldo de cultivo los cuales se mezclaron con 5 mL de Acetonitrilo a 200 rpm durante 15 min. Las muestras se pasaron por filtros de Nylon (0.22µm) y se analizaron por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) (Prominence 20-A, Shimadzu) utilizado una columna C-18 de fase reversa (5µm x 4,6mm x 250mm, Shimadzu Co.), fase móvil metanol-agua 1:1 con gradiente lineal, flujo de 1,2 mL/min y temperatura de 40°C en la col umna. Los compuestos: TNT, PETN, ADNT y DNT fueron monitoreados con un detector de Arreglo de Diodos (PDA) a 210nm y sus tiempos de retención fueron comparados contra patrones primarios (AccuStandard®). Se utilizaron curvas patrón para cuantificar los compuestos. (Anexo 1). 7 RESULTADOS y DISCUSIÓN 7.1 Aislamiento de hongos a partir de muestras impactadas No se observaron recuentos significativamente diferentes entre las muestras de suelo con PETN (50, 100 y 300 mg/L) o control, encontrándose ambos en el orden de 103 UFC/g (Figura 2A, 2B, 2C). En presencia de TNT y Pentolita a las concentraciones probadas, se observan diferencias significativas de los recuentos frente al control. A una concentración de 300 mg/L de TNT y Pentolita se recuperó solo una colonia a partir de la muestra M2 y a concentraciones de 100 y 50 mg/L se obtuvieron recuentos entre el orden de 10-1 a 10-2 UFC/g de suelo para todas las muestras (Figura 2A, 2B, 2C) (Anexo 2). La relación entre la concentración de TNT y el número de colonias, muestra que a mayor concentración en el medio menor es el número de colonias que es posible recuperar, posiblemente debido al carácter citotoxico y mutagénico del TNT. Según Weber y colaboradores (2002), existe un mayor efecto inhibitorio del TNT sobre la germinación de esporas fúngicas que sobre el crecimiento miceliar, ya que de 71 cepas evaluadas 50 de ellas presentaron una fuerte inhibición (27). Por otro lado, en el presente estudio la concentración de PETN no mostró un efecto negativo sobre la recuperación de colonias respecto al control debido a su bajo carácter toxico, aunque algunos autores lo consideran potencialmente toxico debido a que se ha demostrado que afecta a bacterias pero no a células animales (2). 5 5 B 4 4 3 3 Log UFC/g Log UFC/g A 2 2 1 1 0 0 0 50 100 mg / L 300 0 50 100 300 mg / L Control Pentolita PETN TNT 18 5 C Log UFC/g 4 3 2 1 0 0 50 100 300 mg / L Figura 2. Recuentos de hongos en TNT, PETN y Pentolita a concentraciones de 50, 100 y 300 mg/L para las muestras (A) Fitorremediacion (M1) (B) Campo de Prueba (M2) y (C) Canal PC (M3). Medios de cultivo ricos en nutrientes, como el agar Extracto de Malta (MEA) suplementado con explosivos, han sido utilizado por casi todos los autores para la búsqueda de hongos degradadores de TNT ya que permiten una mayor recuperación de diferentes morfotipos en comparación con medios minerales (sin fuente de carbono ni nitrógeno) debido que el mecanismo de degradación de TNT por hongos se da por cometabolismo (27). Por lo tanto en el presente estudio se llevó a cabo la misma aproximación para PETN y Pentolita ya que en nuestro conocimiento no existen reportes de aislamiento de hongos degradadores de estos dos explosivos. En total se aislaron 25 morfotipos denominados con la letra S, macroscópicamente diferentes los cuales se recuperaron a partir de las concentraciones más altas probadas de los tres explosivos en las que eran capaces de crecer. Se seleccionaron 7 cepas a partir de TNT a concentraciones de 50 y 100 mg/L, 13 corresponden a PETN a 300mg/L y 5 a Pentolita a concentraciones de 50 y 100 mg/L (Anexo 3). De manera similar Weber y colaboradores (2002) seleccionaron 52 morfotipos diferentes a partir de suelos impactados con explosivos, utilizando únicamente 50 mg/L de TNT en MEA. Bennett (1995) seleccionó 4 morfotipos diferentes a partir de un compostaje contaminado con explosivos utilizando agar V8RBS (Jugo V8, Rosa de Bengala y Estreptomicina) y SIRBD (medio para el aislamiento en suelo con rosa de bengala y dicloran) suplementado con 100mg/L de TNT (6), al igual en el presente estudio concentraciones de 50 y 100 mg/L de TNT permitieron la recuperación de hongos. Por otro lado, en nuestro conocimiento no hay estudios en los cuales se hayan recuperado hongos utilizando PETN y Pentolita por lo que el presente estudio es el primer reporte en el que se aislaron y seleccionan hongos utilizando agar rico en nutrientes suplementado con PETN y Pentolita. 7.2 Aislamiento de muestras no impactadas De las 12 muestras de madera recolectadas en La Dorada, Caldas se aislaron 5 hongos los cuales se denominaron con la letra H. La metodología de aislamiento no fue altamente selectiva para encontrar hongos de grupos fisiológicos específicos, como lo son hongos de podredumbre blanca, café, hongos saprofitos, o ectomicorrizicos debido a no se realizaron pruebas que confirmaran la producción de enzimas implicadas en la degradación de madera. Aunque se pretendía encontrar hongos relacionados con la degradación de madera debido a que han sido reportados como capaces de mineralizar el TNT (18). 7.3 Tolerancia a los explosivos En total 31 cepas fueron evaluadas por su tolerancia a los explosivos, de las cuales 24 correspondieron a aislamientos de muestras de suelo impactado, 5 de muestras no impactadas y 2 cepas de colección (Trametes sp y Earliella sp). 15 de las cepas evaluadas crecieron en la concentración de 100mg/L de TNT durante el tiempo que el control (medio sin explosivo) logro su máximo crecimiento en caja de petri (85mm) y solo 12 de éstas fueron capaces de crecer sobre los cristales del explosivo que se forman a una concentración de 500 mg/L en el agar. Únicamente la cepa H10 presento solubilización de los cristales y la formación de un halo color café alrededor de la colonia (figura 3A). Weber y col. (2002) mostraron que de 71 cepas seleccionadas y evaluadas, 33 presentaron crecimiento en una concentración de 100 mg/L, de las cuales 21 cepas poseen la capacidad de crecer sobre los cristales de TNT que se forman a 1000 mg/L, donde se visualizó la biotransformación del 20 explosivo losivo mediante la solubilizac solubilización de los cristales y la aparición de un halo color café en el agar , lo que fue asociado a los géneros Absidia, Cunninghamella, Acremonium, Cylindrocarpon, Fusarium, Gliocladium y Trichoderma (27).. En el presente estudio se observo rvo biotransformacion de TNT en agar a una menor concentración que la anteriormente reportada. Las 31 cepas evaluadas presentaron crecimiento en las concentraciones de PETN probadas,, en las cuales no se observo la formación de cristales, por lo que no fue posible evidenciar visualmente la biotransformación del explosivo por la producción de halos de solubilización, n, ni la producción del color café en el agar. A B Figura 3. Pruebas de tolerancia a explosivos de la cepa H10 (A) formación de halo de solubilizacón en MEA suplementado con 500 mg/L de TNT (B) Crecimiento recimiento radial en TNT, PETN y Pentolita a 100, 300 y 500 mg/L. El PETN no presento una inhibición significativamente diferente en el crecimiento radial frente al control de los hongos ya que la m máxima áxima inhibición que se presentó fue alrededor del 30% a una concentración de 500 mg/L (Anexo 4B). Por or otro lado el TNT mostró una inhibición significativamente mayor al control sobre el crecimiento radial ya que se obtuvieron porcentajes de inhibición entre el 38 y 100% a 500 mg/L del explosivo (Anexo 4A),, el mismo efecto sobre el crecimiento radial ial se observó con la A B Pentolita, ya que las cepas se inhiben entre 41 y 100% a 500 mg/L de explosivo. explosivo (Anexo 4C) Se e esperaba que la inhibición sobre el crecimiento radial por la Pentolita fuera aproximadamente la mitad del causado por el TNT debido a la composición del explosivo, por lo que no queda claro por qué en algunos de los hongos la inhibición a altas concentraciones de Pentolita es más fuerte, posiblemente la mezcla de los dos explosivos tiene un efecto sinérgico en la inhibición del crecimiento radial. Excepto para la cepa S5, S10 y S11, el aumento en la concentración de PETN no mostró un efecto significativo sobre el porcentaje de inhibición de todas las cepas (Anexo 4B, 6). Para TNT, a una concentración de 300 y 500 mg/L no existen diferencias significativas en los porcentajes de inhibición, sin embargo entre 0, 100 y 300 mg/L existen diferencias significativas sobre los porcentajes de inhibición de las cepas evaluadas, otras pruebas de tolerancia a los explosivos realizadas con los hongos más resistentes corroboraron que este efecto no se presenta en el rango de 300 a 1000 mg/L de TNT (Figura 4). Un tendencia similar se observó en pentolita, posiblemente porque la concentración teórica agregada no es representativa a la que se encuentra disuelta en el agar debido a la baja solubilidad de estos explosivos, de este modo el microorganismo no estará en contacto con la concentración total teórica (27). Bayman y Radkar (1996) reportaron que el TNT causa una inhibición del crecimiento radial mayor al 50% a una concentración de 100mg/L del explosivo (29), a diferencia en el presente estudio 5 de las cepas evaluadas (S2, S3, S4, S23 y H10) se inhiben menos del 60% a una concentración de 500 mg/L (Figura 4) (Anexo 4), lo que hace que estas cepas sean de gran interés ya que toleran mayores concentraciones de los explosivos que las cepas anteriormente reportadas (29). El hecho de que las cepas S2, S3, S4 y S23 hayan sido aisladas de muestras contaminadas con explosivos no está relacionado con su capacidad de tolerar o transformar el TNT, pues la cepa H10 que posee esta misma capacidad fue aislada de muestras no impactadas con el explosivo. Algunos estudios han demostrado que no hay diferencia con respecto a la tolerancia del TNT de actinomycetes aislados de suelo contaminados y no contaminados (31) 22 120 120 B 100 80 80 %inhibicion % inhibicion A 100 60 40 60 40 | S2 S 24 S4 S3 H10 20 20 0 0 100 300 500 700 900 1100 100 300 mg / L 500 700 900 1100 mg / L 120 100 % inhibicion 80 60 40 20 C 0 100 300 500 700 900 1100 mg / L Figura 4. Inhibición del crecimiento radial de las cepas S2, S3, S4, S24 y H10 por (A) TNT, (B) PETN y (C) Pentolita a 100, 300, 500 y 1000 mg/L. Se confirmó la tolerancia a los explosivos de 5 cepas (S2, S3,S4, S24 y H10) aumentando la concentración hasta 1000 mg/L, únicamente con los hongos considerados más resistentes, con excepción de la cepa S24 utilizada como control, debido a su baja tolerancia a TNT (100% de inhibición a 300 mg/L) (Figura 4), se observó una tendencia similar a la primera prueba para todos los explosivos. Se considero que la cepa S2 era la más tolerante a TNT en las diferentes concentraciones, seguida de S4, H10, S3 y S24 consecutivamente. (Tabla 3). Tabla 3. Porcentajes de inhibición de 5 hongos seleccionados para pruebas de degradación % de Inhibición a 500 mg/L Cepa TNT PETN Pentolita S2 43,7 0 100 S3 75 19,4 88,3 S4 64,3 0 85 S24 100 32,2 100 H10 73 26 66,7 7.4 Degradación de los Explosivos 7.4.1 Degradación de TNT Se mostró la capacidad de degradación de TNT, PETN y Pentolita de las 5 cepas, 4 de ellas fueron seleccionadas por presentar la menor inhibición de su crecimiento (S2, S3, S4 y H10) y una usada como control (S24), durante 30 horas en medio YMG a una concentración inicial 100 mg/L-1 del explosivo. Todas las cepas fueron capaces de degradar el TNT, obteniendo porcentajes entre el 58 -71%. Igualmente se observo la producción de metabolitos, detectándose ADNTs y DNTs, en donde la concentración final de ADNTs fue considerablemente mayor que la concentración de DNT´s para todas las cepas (Tabla 4) (Anexo 5).Durante las primeras 8 horas se obtuvo una alta tasa de degradación de TNT, mientas que en las horas siguientes no se evidenciaron cambios significativos en la concentración, encontrándose alrededor de 38 mg/L-1 para la cepa H10 (Figura 5.), resultados similares se presentaron para las demás cepas. La reducción de TNT estuvo acompañada por la producción de ADNTs , lo que sugiere que la reducción de este explosivo se da por medio de la vía propuesta por Michael y Gottschalk, (1994) en donde el TNT es reducido a NODNT, OHADNT, ADNT y DNT secuencialmente (32), siempre y cuando el micelio se encuentre intacto, por una nitroreductasa asociada a la membrana (33) y/o una oxidoreductasa intracelular dependiente de NADPH (19). Esto último se confirmo con los controles de absorción, en donde no fue detectada la producción de metabolitos originados durante la reducción de esta molécula, ni un cambio significativo en la concentración de TNT (Figura 5). 24 Tabla 4. Degradación de TNT por los 5 hongos seleccionados en medio YMG después de 30 h. de incubación. Concentración inicial de TNT 100 mg/L. Cepa % remoción TNT Concentración ADNT (mg/L) Concentración DNT (mg/L) S2 S3 S4 S24 60.2 71.2 57.5 59.6 36.14 7.74 30.57 51.50 9.35 12.75 9.79 9.27 H10 64.1 23.36 9.51 140 Concentración (mg / L) 120 100 TNT ADNTs DNTs Control Adsorción Control Abiotico 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 tiempo (horas) Figura 5. Degradación de TNT y formación de metabolitos en medio de cultivo YMG con 100 mg/L del explosivo por la cepa H10. Durante las primeras 8 h las cepas S2, S4 y H10 produjeron una coloraciòn roja oscura que luego desapareció en los siguientes muestreos. Este fenómeno y la detección de DNTs durante el ensayo podría sugerir que la degradación de TNT no solo se da por la vía OHADNTs sino también por la formación del complejo Meisenheimer, en donde se remueve un grupo nitro y se observan estos pigmentos. Estos resultados son muy interesantes ya que ésta vía de degradación ha sido ampliamente reportada en bacterias pero únicamente en el hongo Irpex lacteus (19, 34). Después de 30 horas no se logro una degradación completa del TNT, posiblemente a que cuando la transformación de TNT se realiza de manera reductiva con la formación ADNTs, algunos intermediarios como NODNTs y OHADNTs, pueden llegar a inhibir la degradación de TNT (36). La cepa S24, que presento altos porcentajes de inhibición en concentraciones de 300, 500 y 1000 mg/L de TNT, mostró una remoción del 56.9% y la mayor producción de ADNTs al cabo de 30h, por otro lado la cepa S2, que presento los menores porcentajes de inhibición a las mismas concentraciones (Tabla 3), no tuvo el mayor porcentaje de remoción del explosivo ni la mayor producción de ADNTs, mientras que la cepa S3 que se inhibe más del 80% a 500 mg/L del explosivo es la que mayor porcentaje de remoción alcanza. No queda claro si existe una relación entre la capacidad de tolerar altas concentraciones del explosivo con la habilidad de degradarlo. 7.4.2 Degradación de PETN Los resultados obtenidos para PETN presentaron una alta variabilidad que se refleja en una alta dispersión de los datos. Este fenómeno fue asociado a la baja solubilidad del explosivo y que es posible observar en las curvas de degradación. Los datos que se presentan son los datos crudos y no permitirían asegurar que los hongos evaluados poseen la capacidad de degradar PETN bajo las condiciones del experimento. La extracción del control abiótico muestra un porcentaje de recuperación alrededor del 60% (Figura 6), debido posiblemente a la baja solubilidad del explosivo (43 mg/L) (11), a pesar que este fue previamente disuelto en acetonitrilo, solvente miscible con el agua, lo que permite una mayor solubilidad . Sin embargo, no se observò una degradación significativa a través del tiempo ni variabilidad en el control. Tanto el tratamiento como el control de adsorción para todas las cepas presentaron una alta variabilidad entre las unidades experimentales, posiblemente porque el explosivo es adsorbido o presenta otros procesos de sorción y desorción con la biomasa (Anexo 6). La cepa S24, tanto en caja como en medio líquido presento la mayor producción de micelio, adicionalmente se observó la mayor pérdida de PETN 26 posiblemente por adsorción tanto en el control como en el tratamiento, lo que indicaría que la biomasa es un interferente para la recuperación del explosivo (Figura 6). 140 PETN Control Adsorción Control Abiotico 120 mg/L 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 tiempo (horas) Figura 6. Degradación de PETN en medio de cultivo YMG suplementado con 100mg/L del explosivo por la cepa H10. 7.4.3 Degradación de Pentolita La concentración inicial de los explosivos afecta la capacidad de los hongos para degradarlos, ya que en los experimentos realizados a una concentración inicial de 100 mg/L de TNT, ninguna de las cepas evaluadas degradaron el 100% del explosivo en un periodo de 30 h, mientras que a una concentración inicial de 50 mg/L de TNT, todas las cepas evaluadas degradan el 100% (Tabla 5) del explosivo durante el mismo periodo de tiempo, con la subsecuente producción de ADNTs, posiblemente porque la biomasa obtenida en los 4 días de inoculo no alcanza a ser lo suficientemente abundante para evitar la inhibición que causa el TNT en la respiración de los hongos, como habían reportado anteriormente Stahl y Aust (1993) (37). No se detecto la presencia de DNTs durante las 30 horas a pesar que se produjo una coloración roja oscura en las cepas S2, S4, H10, posiblemente porque la concentración de DNTs es inferior al límite de detección (≤ 5 mg/L) (Anexo 7), ya que en los experimentos con TNT a 100 mg/L, la máxima concentración de DNTs está alrededor de 9 mg/L para todas las cepas evaluadas. Tabla 4. Degradación de Pentolita (TNT + PETN*) por 5 hongos en medio YMG a las 30 h. de incubación. Concentración inicial de Pentolita 100 mg/L. Cepa % remoción TNT Concentración ADNT (mg/L) Concentración DNT (mg/L) S2 100 23,85 0 S3 100 8,23 0 S4 100 44,15 0 S24 100 51,3 0 H10 100 18,63 0 *Los datos para PETN no fueron calculados 140 140 A B 120 TNT ADNTs ADNT Control Adsorsión Control Abiotico 100 80 Concentración (mg/L) Concentración (mg/L) 120 60 40 PETN Control Adsorsión Control Abiotico 100 80 60 40 20 20 0 0 5 10 15 20 tiempo (horas) 25 30 35 0 0 5 10 15 20 25 30 35 tiempo (horas) Figura 6. Degradación de (A) TNT en presencia de (B) PETN y sus metabolitos en medio de cultivo YMG suplementado con 50 mg/L de los explosivo por la cepa H10. 28 8 CONCLUSIONES • El uso de un agar rico en nutrientes como el agar Extracto de Malta (MEA) suplementado con 50 y 100 mg/L de TNT o Pentolita permitió la recuperación de hongos con capacidad de degradar TNT. • El rango de concentraciones de lo explosivos (TNT y Pentolita) evaluado en la prueba de tolerancia permitió seleccionar los hongos con menor inhibición sobre su crecimiento. Por otro lado, para PENT no se observo inhibición del crecimiento radial en el rango seleccionado De las 31 cepas evaluadas provenientes de ambientes impactados y no impactados con explosivos se seleccionaron las 5 cepas (S2, S3, S4, S23 y H10) que presentaron la mayor tolerancia (menor inhibición). Estas cepas fueron aisladas principalmente en suelos impactados (4 de 5) y en medios con TNT y Pentolita • Todas las cepas seleccionadas mostraron degradación de TNT con la consecuente producción de ADNTs y DNTs, mientras que la degradación de PETN no se logro determinar bajo las condiciones experimentales empleadas. Factores como la solubilidad y la metodología de extracción pueden estar afectando la correcta determinación de este explosivo. Es necesario realizar un análisis de los resultados en mayor detalle. 9 RECOMENDACIONES • Evaluar concentraciones más elevadas de PETN tanto para la recuperación de cepas y pruebas de tolerancia. • Buscar una metodología que permita aumentar la solubilidad del PETN en los medios de cultivo (p.e:uso de surfactantes). • Evaluar si la degradación es llevada a cabo por enzimas asociadas a la membrana o por enzimas extracelulares • Evaluar la capacidad de degradar explosivos en liquido de hongos de la podredumbre blanca como Trametes sp y Earliella sp. Realizar curvas de calibración para la cuantificación de metabolitos relacionados en la degradación de PETN. • Implementar una metodología de extracción para muestras con bajas concentraciones de explosivos, para realizar la cuantificación de metabolitos que se producen en baja proporción. 30 10 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. BIBLIOGRAFÍA Juhasz AL, Naidu R. 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ANEXO 1 Curvas patrón para (A) TNT, (B) PETN, (C) 2,6-DNT, (D) 2,4-DNT, (E) 2,4-ADNT 8743291.5 A ABS a 210mn 7451278.2 5648910.9 3662553.3 1962965.3 336295.0 f(x) = 2.7782e -005 * x - 1.58685 130373.8 R 2 = 0.9971130 5.000 20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000 Concentración TNT (mg/L) 3937858.1 B ABS a 210mn 3142652.7 2507374.8 1608802.1 873389.0 256070.6 f(x) = 6.27409 e -005 x - 0.201485 48727.3 R 2 = 0.9978325 5.000 20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000 Concentración PETN (mg/L) 34 C 7949122.5 ABS a 210mn 6736287.0 5093297.9 3302858.0 1774392.7 281124.7 f(x) = 3.06038e -005 x - 1.131 118506.8 R 2 = 0.9975525 5.000 20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000 Concentración 2,6-DNT (mg/L) D ABS a 210mn 7791258.4 6368327.2 4459109.5 3231581.8 141568.2 f(x) = 3.19856e -005 x + 0.597591 R 2 = 0.9977671 5.000 100.00 150.000 200.000 Concentración 2,4-DNT (mg/L) 250.000 9244107.8 E ABS a 210mn 7613821.9 5322639.3 3827733.2 1973352.6 310176.8 f(x) = 2.68625e-005 * x + 0.0806649 165459.6 R 2 = 0.9982847 5.000 20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000 Concentración 2,4-ADNT (mg/L) 36 ANEXO 2. Recuentos de hongos en agar MEA Suplementado con antibióticos de las muestras M1, M2 y M3. Muestra Explosivo Replica 50 mg/L 100 mg/L 300mg/L A 5x10 1 1x101 0 B 3x10 1 1x101 0 A 5x103 4x103 4x103 B 4x103 4x103 5x103 A 1x102 0 0 B 7x102 1x101 0 A 3x102 1x101 0 B 1x102 0 1x101 A 7x103 6x103 5x103 B 9x103 11x103 6x103 A 2x101 1x101 0 B 2x102 2101 0 A 1x101 0 0 B 1x101 0 0 A 2x103 1x103 1x103 B 4x103 3x103 1x103 A 1x101 0 0 B 3x101 1x101 0 TNT MI PETN Pentolita TNT M2 PETN Pentolita TNT M3 PETN Pentolita 0 mg/L 6x103 9x103 11x103 7x103 1x103 3x103 Anexo 3. Origen de las cepas S1-S25, aisladas de muestras impactadas con explosivos. Muestra Explosivo S1 M2 PENTOLITA Concentración (mg/L) 100 S2 M1 PENTOLITA 100 S3 M1 PENTOLITA 50 S4 M3 PENTOLITA 100 S5 M2 PENTOLITA 100 S6 M1 PETN 300 S7 M1 PETN 300 S8 M1 PETN 300 S9 M2 PETN 300 S10 M2 PETN 300 S11 M1 PETN 300 S12 M1 PETN 300 S13 M2 PETN 300 S14 M3 PETN 300 S15 M3 PETN 300 S16 M3 PETN 300 S17 M3 PETN 300 S18 M3 PETN 300 S19 M3 TNT 50 S20 M2 TNT 300 S21 M1 TNT 100 S22 M1 TNT 50 S23 M3 TNT 50 S24 M2 TNT 100 S25 M1 TNT 50 Cepa 38 ANEXO 4. Graficas integradas de las pruebas de tolerancia representadas en porcentaje de inhibición, para todas las cepas evaluadas 120 100 % inhibiciòn 80 60 40 20 0 0 A 100 200 300 400 500 600 400 500 600 500 600 mg / L 120 100 % inhibiciòn 80 60 40 20 0 0 100 200 B 300 mg / L 120 100 % inhibiciòn 80 60 40 20 0 C 0 100 200 300 mg / L 400 Anexo 5. 140 140 120 120 Concentración (mg/L) Concentración (mg/L) Cinéticas de degradación de TNT, para los 5 hongos evaluados, (A) S2, (B) S3, (C) S4, (D) S24 (E) H10 100 80 60 40 20 80 60 40 20 0 0 0 5 A 10 15 20 25 30 35 0 5 D tiempo (horas) 140 140 120 120 Concentración (mg / L) Concentración (mg/L) 100 100 80 60 40 20 10 15 20 25 30 35 30 35 tiempo (horas) 100 80 60 40 20 0 0 0 5 B 10 15 20 25 30 35 0 E tiempo (horas) 5 10 15 20 25 tiempo (horas) 140 TNT ADNTs DNTs Control de Adsorción Control Abiotico Concentración (mg/L) 120 100 80 60 40 20 0 0 C 5 10 15 20 25 30 35 tiempo (horas) 40 Anexo 6. 140 140 120 120 Concentración (mg/L) Concentración (mg/L) Cinéticas de degradación de PETN, para los 5 hongos evaluados, (A) S2, (B) S3, (C) S4, (D) S24 (E) H10 100 80 60 40 20 80 60 40 20 0 0 0 5 10 A 15 20 25 30 35 0 5 10 D tiempo (días) 140 140 120 120 Cocentracion (mg/L) Concentracion (mg/L) 100 100 80 60 40 20 15 20 25 30 35 25 30 35 tiempo (días) 100 80 60 40 20 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 tiempo (días) B 0 E 5 10 15 20 tiempo (horas) 140 PETN Control Adsroción Control Abiotico Concentración (mg/L) 120 100 80 60 40 20 0 0 C 5 10 15 20 tiempo (días) 25 30 35 Anexo 7. Cinéticas de degradación de Pentolita, para los 5 hongos evaluados, (A) S2, (B) S3, (C) S4, (D) S24 (E) H10. Columna derecha TNT, columna izquierda PETN. 140 140 TNT ADNTs DNTs Control Adsorción Control Abiotico 100 80 60 40 20 80 60 40 0 0 5 A 10 15 20 25 30 35 0 5 10 tiempo (horas) 140 140 120 120 100 80 60 40 20 20 25 30 35 25 30 35 25 30 35 100 80 60 40 20 0 0 0 5 B 10 15 20 25 30 35 0 5 10 tiempo (horas) 15 20 tiempo (días) 140 120 120 Concentracion (mg/L) 140 100 80 60 40 20 100 80 60 40 20 0 0 0 C 15 tiempo (días) Concentracion (mg/L) Concentración (mg/L) 100 20 0 Concentración (mg/L) PETN Control Adsorción Control Abiotico 120 Concentracion (mg/L) Concentración (mg/L) 120 5 10 15 20 25 tiempo (horas) 30 35 0 5 10 15 20 tiempo (días) 42 140 140 100 80 60 40 20 100 80 60 40 20 0 0 0 5 10 D 15 20 25 30 35 0 5 10 tiempo (horas) 15 20 25 30 35 25 30 35 tiempo (días) 140 140 120 120 Concentración (mg/L) Concentración (mg/L) PETN Control Adsorción Control Abiotico 120 TNT ADNT Control Adsorsión Control Abiotico Concentracion (mg/L) Concentración (mg/L) 120 100 80 60 40 20 100 80 60 40 20 0 0 0 E 5 10 15 20 tiempo (horas) 25 30 35 0 5 10 15 20 tiempo (horas)