Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Escuela de Biología Análisis Del Efecto De La Pérdida De Función De Rac1 Sobre El Citoesqueleto De Actina En El Desarrollo Embrionario Temprano Del Pez Cebra Tesis para obtener el título de Biólogo Presenta: Jorge Medel Medel Asesor: Dr. Enrique Salas Vidal PUEBLA, PUE., AGOSTO, 2011 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Modelo de estudio: Danio rerio 1.2. Etapas del desarrollo temprano del pez cebra (Danio rerio) 1.3. Las Rho GTPasas 1.4. Citoesqueleto de Actina 1.5. Genes y proteínas afectadas en el knockdown de rac1 en pez cebra 2. HIPÓTESIS 3. OBJETIVO GENERAL 4. OBJETIVOS PARTICULARES 5. MATERIAL Y METODOS 5.1. Mantenimiento de peces 5.2. Cruzas y recuperación de embriones 5.3. Microinyección y tinciones 5.4. Clonación de secuencias genéticas: PCRs, ligaciones, electroporaciones, cultivo celular, MiniPrep, digestiones y electroforesis 6. RESULTADOS 6.1. Etapas del desarrollo embrionario del pez cebra en las primeras 24 horas 6.2. Patrón de distribución de los filamentos de actina y de distribución celular en las primeras 24 horas del desarrollo embrionario del pez cebra 6.3. Periodo de cigoto y primeras divisiones 6.4. Periodo de blástula 6.5. Periodo de gástrula 6.6. Periodo de segmentación 6.7. Efecto de la pérdida de función de Rac1 sobre los filamentos de actina en embriones de pez cebra (Danio rerio) 6.8. Clonación de secuencias genéticas de proteínas afectadas en el knockdown de rac1 en pez cebra 7. DISCUSIÓN 7.1. Distribución de los F-actina en embriones de pez cebra 7.2. Rac1 durante la gastrulación 7.3. Miogénesis 7.4. Moléculas participantes en la miogénesis 7.5. Miogénesis en pez cebra 7.6. Rac1 durante la miogénesis 8. CONCLUSIONES 9. PERSPECTIVAS 10. BLIBLIOGRAFÍA 11. APÉNDICE 11.1. Elaboración de cajas para montaje de embriones 11.2. Electroporación 11.3. Ligación 11.4. Oligos sintetizados en la unidad de síntesis y secuenciación (IBT-UNAM) 11.5. PCRs de las Digestiones del Plásmido con las secuencias genéticas 11.6. PCRs 11.7. Purificación de Plásmido por lisis alcalina 11.8. Tratamiento con RNasa para la visualización de núcleos celulares RESUMEN Durante el desarrollo embrionario del pez cebra ocurren múltiples procesos celulares y moleculares que contribuyen a que se formen todas las estructuras que lo caracterizan. Se sabe que durante la embriogénesis, el citoesqueleto de actina participa de manera importante en los distintos comportamientos celulares como migración, convergencia, movimientos de epibolia; así como en la formación de proyecciones de la membrana celular y cambios en la forma de las células. Varios de estos procesos son modulados por miembros de la familia de Rho GTPasas mediante la modulación de la dinámica del citoesqueleto de actina. Una de las cuales es la Rho GTPasa Rac1, la cual tiene una participación importante durante el desarrollo embrionario modulando el citoesqueleto de actina y distintos comportamientos celulares. En el presente trabajo, primeramente se muestra el patrón de distribución de los filamentos de actina (F-actina) y el patrón de distribución celular durante las primeras 24 hrs del desarrollo temprano del pez cebra en embriones de tipo silvestre. Posteriormente, se muestra los efectos que tiene la pérdida de función de Rac1 sobre el citoesqueleto de actina; sobre todo en la formación de algunas estructuras durante la gastrulación y en la etapa de 24 hpf durante la miogénesis. Los resultados muestran que durante la gastrulación concretamente en las etapas de 70 y 90% de epibolia- no ocurren cambios significativos en el patrón de distribución de los F-actina. Los efectos son apreciables en la etapa de 24 hpf ya que son muy diferentes en tamaño los embriones Rac1MO, así como la morfología de los miotomos, distribución y número de miofilamentos; comparados con los embriones inyectados con el morfolino control (CoMO).