Application Note 5 Uso de materiales de referencia certificados para la cuantificación de OMG respecto al cociente del número de copias de ADN Noviembre 2007 Autor: Philippe Corbisier Comisión Europea – Centro Común de Investigación – Instituto de Medidas y Materiales de Referencia (IRMM) Retieseweg 111, 2440 Geel, Bélgica La presente nota de aplicación orienta sobre el uso correcto de los E-mail: philippe.corbisier@ec.europa.eu materiales de referencia europeos certificados en cuanto a su fracción del www.erm-crm.org número de copias MG (modificadas genéticamente) correspondientes a un determinado evento de MG. Los detalles que se dan a continuación se refieren particularmente al uso de los MRC ERM-BF413d y ERM-AD413 y a los próximos MRC certificados en cuanto a su cociente del número de copias. INTRODUCCIÓN El JRC-IRMM ha desarrollado recientemente dos nuevos tipos de materiales de referencia certificados (MRC) de OMG, que permiten la correcta aplicación de la Recomendación 2004/787/CE [1] mediante el uso de un sistema rastreable metrológicamente. La presente nota da instrucciones sobre la forma de aplicar los nuevos MRC. CARACTERÍSTICAS DE LOS NUEVOS MRC DE OMG A. Nuevos MRC matriciales de OMG Los valores certificados se basan en dos unidades de medición diferentes. Además de un valor certificado de la fracción másica de un evento de modificación genética específico (véase la nota de aplicación 4), el nuevo MRC se certifica en cuanto al cociente del número de copias de ADN. Este parámetro, expresado en %, se calcula de la forma siguiente: nº copias ADN MG [cp] coc. nº copias ADN [%] = nº copias ADN específico del taxón diana [cp] x 100 La certificación se basa en mediciones de la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real. (RCP-TR). Estas mediciones se calibran mediante un calibrador de ADN plasmídico específico, certificado respecto a que cada plásmido contiene una sola copia tanto de la secuencia MG como de la secuencia específica del taxón diana (véase la parte B). Por tanto, el cociente del número de copias de ADN de maíz MG está relacionado directamente con el evento de MG analizado. Por otra parte, en el ejemplo siguiente, el MRC ERM-BF413d sólo debe utilizarse junto con el calibrador plasmídico ERM-AD413 y el método de detección específico de MON 810 [2]. El cociente certificado del número de copias de ADN de MON 810 (0,57 %) es distinto de la fracción másica certificada (10,0 g/kg o 1,0 %) ya que el cociente certificado del número de copias de MON 810 tiene en cuenta la situación en cuanto a la cigosidad, la ploidía y la endorreduplicación de las semillas utilizadas para producir este material. El MRC matricial se destina al control de calidad de los métodos analíticos, incluidas la extracción y purificación de ADN, así como las fases de medición de la RCP en relación con un evento concreto de MG. B. Nuevos MRC plasmídicos de OMG Los calibradores certificados contienen un determinado fragmento de ADN específico de una modificación genética, así como un determinado fragmento de ADN específico del taxón analizado. Estos plásmidos contienen un fragmento de 170 pares de bases (pb) de la unión 5' plant-P35S de MON 810 y un fragmento de 351 pb del gen del grupo de alta movilidad endógeno del maíz (hmg). Los valores certificados son el número de fragmentos de ADN MG clonado y el de fragmentos de ADN específico del taxón, por cada plásmido. El cociente entre los números de estos dos fragmentos de ADN se da como valor indicativo obtenido mediante RCP simple y doble en tiempo real. USO DEL CALIBRADOR PLASMÍDICO MG El calibrador ha de utilizarse junto con un método de RCP-TR definido [1]. Cada calibrador se entrega en un tubo de plástico cerrado, en nieve carbónica, y debe mantenerse a 20 °C hasta su utilización. El contenido debe descongelarse antes de homogeneizarse, y finalmente abrirse y diluirse bajo flujo laminar para reducir el riesgo de contaminación. Cada tubo contiene alrededor 6 de 2 x 10 copias (cp) de plásmido por µL y el volumen recomendado inicial para la serie de diluciones es de 50 µL. Debe seguirse el protocolo de dilución indicado en el certificado. No se proporciona el amortiguador de dilución. La serie de diluciones debe estar siempre recién preparada y los eventuales restos se desechan en tubos cerrados. La serie de diluciones se utiliza para preparar dos curvas de calibración (CC), una del transgén y otra del gen específico del taxón; cada curva cuenta con 5 puntos, cada uno de ellos medido por triplicado en la RCP (véase el ejemplo). Un tubo proporciona suficiente calibrador para preparar 10 CC de ambas dianas, lo que significa que pueden cuantificarse con un solo tubo hasta 100 o 250 muestras. La dosis recomendada de muestra para la RCP-TR es de 5 µL de ADN molde en cada pocillo de RCP. Los valores umbral de fluorescencia medidos (valores Ct) deben representarse frente al número teórico de © Comunidades Europeas, 2007. Reproducción autorizada con indicación de la fuente. Ni la Comisión Europea ni cualquier persona que actúe en nombre de la Comisión se responsabilizan del uso que pueda hacerse de la información contenida en esta nota de aplicación Página 1 de 2 copias de ambos fragmentos, para obtener dos CC. Estas CC se utilizan para cuantificar la diana MG en relación con la diana específica del taxón en una muestra problema. Los resultados pueden calcularse a continuación como el cociente de ambas dianas y expresarse en porcentaje según la Recomendación 2004/787/CE. Puede hacerse una RCP de control de calidad interno, calculando el cociente medio de los valores Ct medidos relativos a la diana específica del taxón y la transgénica, en los puntos de calibración correspondientes a 2 000 cp/µL. Ese cociente debe concordar con el 1,04 % (incertidumbre ampliada del 0,06 %) en caso de RCP simple, según indica el informe de certificación (véase asimismo la nota de aplicación de MRC 1). EJEMPLO El ADN genómico extraído de una muestra problema y de ERMBF413d utilizado como material de control de calidad se analiza mediante RCP-TR, con ERM-AD413 como calibrador. Se obtienen los valores Ct correspondientes al calibrador ERM-AD413 previa amplificación de los fragmentos hmg y MON 810 (Cuadro 1). Se obtienen los valores medios de Ct de 32,76 y 25,44 para la amplificación de los fragmentos MON 810 y hmg, respectivamente, en la muestra problema. En cuanto al material de control de calidad, se obtienen los valores de Ct medios de 31,22 y 22,20 para los fragmentos MON 810 y hmg, respectivamente. Hay que determinar las pendientes y las ordenadas en el origen de las dos curvas de calibración para calcular el contenido de MON810 en ambas muestras, suponiendo que la función más adecuada es una recta. Para calcular las pendientes y las ordenadas en el origen pueden utilizarse los módulos incorporados en MicrosoftExcel o en cualquier otro programa disponible de determinación/calibración. Las pendientes (b) de las dos rectas de regresión lineal pueden calcularse con esta fórmula: b= Número total de cp del fragmento MON 810 50000 10000 1000 100 25 NTC Número total de cp del fragmento hmg 500000 100000 10000 5000 1000 NTC Valor 1 25,30 27,57 31,19 33,99 35,79 45,00 Valores Ct medidos Valor 2 Valor 3 25,19 25,15 27,62 27,66 30,89 31,14 35,12 34,80 35,67 36,37 45,00 45,00 20,76 22,92 26,39 27,31 29,38 45,00 20,67 23,00 26,36 27,29 29,19 45,00 20,63 23,04 26,33 27,37 29,57 45,00 Ct medio 25,21 27,62 31,07 34,64 35,95 45,00 20,69 22,99 26,36 27,32 29,38 45,00 Cuadro 1: Ejemplo de valores Ct experimentales obtenidos con ERM-AD413 como calibrador. NTC1 = sin control de molde. ∑ (log( x) − log( x))( y − y ) , ∑ (log( x) − log( x)) 2 donde x representa el número de copias del fragmento amplificado e y representa el valor Ct correspondiente. Las pendientes de las curvas de calibración de los fragmentos hmg y MON 810 que se recogen en el Cuadro 1 son respectivamente de -3,25 y -3,32. Las ordenadas en el origen (a) de las rectas de regresión se calculan con la fórmula: a = y − bx cuando log (x) = 0. En nuestro ejemplo, los valores a de las rectas de regresión de hmg y MON 810 son 39,26 y 40,93, respectivamente. Estos valores representan los valores Ct teóricos correspondientes a 1 cp de ambos fragmentos. La pendiente sirve para calcular la eficiencia de la RCP (ε) con la fórmula: ε = (10-1/b - 1)*100. En nuestro ejemplo, las eficiencias de la RCP son 99,7 % y 103,1 % en la amplificación de los fragmentos MON 810 y hmg, respectivamente. El número de copias (cp) de MON 810 presentes en la muestra problema se calcula con esta fórmula: Ct MON 810 − a MON 810 bMON 810 , cpMON810 = 10 donde CtMON810, aMON810 y bMON810 son los valores Ct, la ordenada en el origen y la pendiente obtenidos en la amplificación de MON 810. Se hace el mismo cálculo para determinar el número de copias del fragmento hmg con la fórmula: cphmg = 10 Ct hmg − a hmg bhmg . En nuestro ejemplo, la media estimada del número de copias de los fragmentos MON810 y hmg presentes en la muestra problema es 289 y 17 878 cp, respectivamente. El contenido de MON 810 de la muestra problema, expresado en porcentaje, es por tanto igual a: 289 cpMON 810 . Se hace el mismo cálculo para el material de * 100 = 1,62 % 17878 cphmg control de calidad, que contiene un: 841 cpMON 810 * 100 = 0,47 % de MON 810. Teniendo en cuenta la incertidumbre asociada con el 177513 cphmg ERM-BF413d y la incertidumbre de la medición (véase la nota de aplicación de ERM 1), puede comprobarse que el valor medido se ajusta a los valores certificados de ERM-BF413d. En el ejemplo anterior, el cociente de los valores Ct medios (1,05) obtenido con 10 000 cp (5 µL de ERM-AD413 de 2 000 cp/µL) está de acuerdo con el valor indicativo de 1,04 ± 0,06 comunicado en el certificado de ERM-AD413, lo que significa que esta cuantificación de la MG está controlada. [1] Recomendación 2004/787/CE de la Comisión, de 4 de octubre de 2004, relativa a las directrices técnicas de muestreo y detección de organismos modificados genéticamente y de material producido a partir de organismos modificados genéticamente, como productos o incorporados a productos, en el marco del Reglamento (CE) nº 1830/2003 (DO L 348 de 24.11.2004, p.18). [2] ISO 21570:2005 Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products Quantitative nucleic based methods. Annex D2 Event-specific method for the relative quantitation of maize line MON 810 DNA using real-time PCR. 93-99. 1 Debe sospecharse que hay contaminación cruzada o amplificación inespecífica si los valores Ct en la situación NTC difieren del número de ciclos de RCP realizados. . Página 2 de 2