manual de laboratorio hongos entomopatogenos

MANUAL DE LABORATORIO
MANEJO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
En los primeros años del Siglo XXI, las proyecciones sobre el incremento
poblacional indican que en las décadas venideras habrá necesidad de
producir más y mejores alimentos para satisfacer la demanda mundial.
Sin embargo, este reto es amenazado por las plagas, que representan un
serio problema para los agricultores, reduciendo su rentabilidad y
competitividad. Por otro lado, actualmente existe evidencia de que un uso
irracional de plaguicidas para controlar las plagas puede generar serios
problemas relacionados con el medio ambiente o la salud de las
personas.
Por esta razón, se requiere de trabajos de investigación para encontrar métodos
alternativos para el control de plagas. Entre estos métodos innovadores se incluye
el uso de enemigos naturales, como los hongos entomopatógenos, una de cuyas
ventajas es reducir el riesgo de causar efectos negativos en el ambiente o en las
personas. Sin embargo, hay aún mucho trabajo por hacer para tener
bioplaguicidas eficientes basados en hongos, siendo el primer paso la
colección, aislamiento, caracterización y multiplicación de estos
microorganismos. Esta etapa de la investigación debe realizarse
correctamente, para establecer bases sólidas para el futuro desarrollo de
Bioplaguicidas, ya que se requiere conocer muy bien al agente
entomopatógeno para poder multiplicarlo y evaluarlo como potencial
control biológico.
INTRODUCCIÓN
La mayor parte de los insectos que atacan a las plantas cultivadas tienen
enemigos naturales que los parasitan y matan, produciendo así una
reducción
considerable
en
su
población.
El
uso
de
hongos
entomopatógenos para la exterminación de tales insectos constituye, por
lo tanto, un componente importante de control, siendo muchos los
hongos mencionados en diversos estudios que se usan para este
propósito. La gran mayoría de cultivos son infestados
por diversos
insectos que destruyen la planta, durante su permanencia en el campo.
A su vez, hongos como Beauveria spp., Metarhizium anisopliae,
Lecanicillium (Verticillium) lecanii y Paecilomyces spp., son comunes
en el campo. Estos hongos tienen un amplio rango de hospedantes y han
sido utilizados para controlar diversas plagas en diferentes lugares. En el
Perú se ha trabajado en programas para el control del gorgojo de los
Andes principalmente. También se han controlado nematodos utilizando
Paecilomyces lilacinus.
Debido a la importancia de determinados grupos de hongos tienen en
nuestro medio para el control de insectos que atacan a los cultivos se ha
preparado el presente manual, para que sirva de guía en los trabajos de
investigación y propagación de hongos con fines de control.
Las indicaciones que se dan están al alcance incluso de laboratorios no
muy bien equipados, pues los métodos descritos se pueden llevar a cabo
en condiciones austeras. Los lineamientos generales que se dan aquí
para la preparación del sustrato para la propagación de los hongos, tan
importante para la inoculación en el campo y en el almacén, pueden ser
modificados de acuerdo a las condiciones de cada lugar y a los insumos
con que se cuente.
GENERALIDADES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
Uno de los factores que limita la producción de los cultivos son las plagas
agrícolas. El uso indiscriminado de insecticidas orgánicos sintéticos ha
traído como consecuencia la selección de individuos resistentes, la
resurgencia de nuevas plagas y la contaminación ambiental y del
hombre.
Estos factores han hecho posible el surgimiento de sistemas nuevos de
producción agrícola, como la producción orgánica; han creado la
necesidad de obtener productos inofensivos para otros organismos no
perjudiciales (entomófagos) y han obligado a legislar más estrictamente
sobre la presencia de residuos en los productos agropecuarios.
El manejo integrado de plagas (MIP), que se basa en principios
totalmente ecológicos, considera todo el Agroecosistema en su conjunto.
Como tal, comprende la aplicación armónica de diferentes métodos de
control, como la lucha biológica y las prácticas culturales que requiere el
cultivo, teniendo en cuenta los niveles poblacionales de las plagas y
enfermedades a controlar, la presencia de los Biorreguladores naturales,
las etapas fenológicas del cultivo y las condiciones ambientales
presentes.
Uno de los componentes del MIP es el control biológico de las plagas
agrícolas mediante parasitoides, predadores (entomófagos) y organismos
entomopatógenos que pueden ser hongos, bacterias, virus, nematodos y
protozoarios. Los hongos entomopatógenos son los que han recibido
mayor atención por la gran variedad de especies y amplio rango de
hospedantes así como por su crecimiento microscópico sobre la
superficie de su huésped. Todos los insectos son susceptibles de ser
afectados por algún hongo.
Ciertos hongos poseen características muy especiales que les permiten
sobrevivir en forma parasítica sobre los insectos y en forma saprofita
sobre material vegetal en descomposición. El crecimiento saprofito puede
dar como resultado la producción de conidióforos, conidias y desarrollo
miceliano. Esta característica permite que el hongo pueda ser cultivado
en el laboratorio utilizando técnicas de producción en masa de bajo
costo.
Los hongos tienen un gran potencial para ser empleados como
Biocontroladores. Entre los principales hongos que presentan estas
características están: Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces.
Las principales ventajas de estos hongos son:
1. Presentan grados variables de especificidad, pueden ser específicos a
nivel de familia o especies muy relacionadas. En el caso de las cepas,
pueden ser específicas a nivel de especie, sin afectar a los enemigos
naturales.
2. Si el entomopatógeno encuentra las condiciones adecuadas para
introducirse y colonizar un ecosistema, se reproduce y renueva en forma
continua, es decir, se vuelve persistente, haciendo innecesarias nuevas
aplicaciones.
3. Se pueden aplicar mezclas de hongos entomopatógenos con dosis
subletales de insecticidas para lograr efectos sinérgicos superiores a los
logrados con aplicaciones de cada producto por separado.
4. No contaminan el medio ambiente ni afectan al hombre u otros
animales superiores.
5. Cuando el hongo no llega a causar la muerte directamente, se
presentan efectos secundarios que alteran el normal desarrollo del ciclo
de vida del insecto.
Pero también presentan algunas desventajas, como:
1. Sensibilidad a la variación de las condiciones climáticas como
temperaturas extremas, desecación y luz ultravioleta. Estas limitantes
están siendo contrarrestadas mediante el uso de aditivos (protectores
solares, aceites, antidesecantes).
2. Requieren de condiciones de almacenamiento más exigentes que las
moléculas inorgánicas, para evitar que pierdan su patogenicidad.
3. En general, los insecticidas biológicos no matan instantáneamente.
Alcanzan buenos niveles de control entre una y tres semanas después
de la aplicación, dependiendo de la plaga y del ambiente. Sin embargo,
el insecto deja de ser plaga al ser parasitado por el hongo, deja de
alimentarse mucho antes de morir, disminuyendo el daño.
Clasificación de los hongos entomopatógenos
De acuerdo a la clasificación realizada por Ainsworth (1973), los hongos
son separados en dos divisiones: Myxomycota, aquellos que forman
plasmodios, y Eumycota, aquellos que no forman plasmodios y son
frecuentemente
micelianos.
Los
hongos
entomopatógenos
se
encuentran en la división Eumycota dentro de cinco subdivisiones:
 Mastigomycotina (forman zoosporas, oosporas y presentan estado
perfecto).
 Zygomycotina (no presentan zoosporas, presentan estado perfecto
y forman zygosporas).
 Ascomycotina (presentan estado perfecto y forman ascosporas).
 Basidiomycotina
(presentan
estado
perfecto
forman
basiodiosporas) y,
 Deuteromycotina (no presentan estado perfecto ni zoosporas y
forman conidias).
Las clases de mayor importancia desde el punto de vista del control de
plagas agrícolas son Zygomycetes e Hyphomycetes (Tanada y Kaya,
1993).
Muchos hongos entomopatógenos se encuentran en:
Subdivisión Zygomycotina
Clase Zygomycetes
Orden Entomophthorales
Subdivisión Ascomycotina
Clase Pyrenomycetes
Orden Sphaeriales
Clase Laboulbeniomycetes
Orden Laboulbeniales
Subdivición Deuteromycotina,
Clase Hyphomycetes,
Orden Moniliales
Mecanismo de infección de los hongos entomopatógenos
La enfermedad producida por hongos se llama micosis. Tanada y Kaya
(1993) mencionan que el desarrollo de la micosis puede ser separado en
tres fases:
1. Adhesión y germinación de la espora en la cutícula del insecto: El
proceso de adhesión, dependiendo del hongo, puede ser un fenómeno
específico o no específico. Mientras que la germinación de las esporas
es un proceso mediante el cual una espora emite uno o varios pequeños
tubos germinativos que al crecer y alargarse da origen a las hifas, este
proceso depende de las condiciones de humedad y temperatura
ambiental. En menor grado la luz condiciona el ambiente alimenticio. La
espora que germina en el insecto forma un tubo germinativo el cual
funciona como una hifa de penetración de la cutícula. También puede
producir una estructura llamada apresorio, la cual ayuda a la adhesión de
la espora. El éxito de la germinación y penetración no dependen
necesariamente del porcentaje de germinación sino del tiempo de
duración de la germinación, modo de germinación, agresividad del
hongo, tipo de espora y susceptibilidad del hospedante (Samson, et al,
1988).
Los hongos, además, pueden infectar a los insectos a través de las
aberturas corporales como son cavidad bucal, espiráculos y otras
aberturas externas. Las esporas pueden germinar rápidamente en estos
ambientes por ser húmedos. Cuando lo hacen en los fluidos digestivos,
pueden destruir a la hifa germinativa. En este caso, el insecto no muere
de micosis sino a causa de las toxinas.
2. Penetración dentro del hemocele: Esta penetración por parte de la hifa
es el resultado de la degradación enzimática de la cutícula y la presión
mecánica ejercida por el tubo germinativo. Además, depende de las
propiedades de la cutícula, grosor, esclerotización, presencia de
sustancias nutricionales y antifungosas (Charnley, 1984) y estado de
desarrollo del insecto. La digestión del integumento se produce mediante
las enzimas (proteasas, aminopeptidasas, lipasas, esterasas y
quitinasas). Cuando la hifa ha llegado al hemocele, se pueden producir
diferentes reacciones de defensa del insecto frente a un cuerpo extraño:
la fagocitosis, encapsulación celular y la formación de compuestos
antimicrobianos como las lisozimas, aglutininas y melanización. En este
caso, el hongo debe vencer el sistema inmunológico del hospedante
antes de entrar a la hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto.
3. Desarrollo del hongo que resulta en la muerte del insecto: Luego
de que llegue al hemocele, el hongo puede evitar la defensa inmune del
insecto
produciendo
células
parecidas
a
levaduras,
llamadas
blastosporas, que se multiplican y dispersan rápidamente, desarrollando
protoplastos, elementos discretos ameboideos, sin pared celular que no
son reconocidos por los hemocitos del hospedante (Pérez, 2004) y
produciendo micotoxinas (Tanada y Kaya, 1993). La dispersión de éstos
en el hemocele depende de la especie del hongo.
Las toxinas producidas juegan un rol muy importante en el modo de
acción de los hongos entomopatógenos. La muerte del insecto se
produce con mayor rapidez cuando es afectado por un hongo
entomopatógeno que produce cantidades considerables de toxinas, ya
que se adiciona la toxemia a la destrucción de los tejidos y a las
deficiencias nutricionales.
A continuación del crecimiento del hongo en el hemocele, se producen
los síntomas fisiológicos del insecto afectado como convulsiones,
carencia de coordinación y comportamientos alterados (deja de
alimentarse, reduce su movimiento), entra en un estado letárgico y
finalmente muere, lo que puede ocurrir relativamente rápido o en unos
cuantos días. Ocurre una competencia entre el hongo y la flora intestinal.
Los hongos pueden producir sustancias antibacterianas que alteran la
coloración del cadáver (Ferrón, 1978). Con la muerte del insecto termina
el desarrollo parasítico del hongo y empieza la fase saprofítica: el hongo
crece en el hemocele formando masas micelianas que salen al exterior
fundamentalmente por las regiones intersegmentales–esporulando sobre
el cadáver y produciendo inóculo para infectar a otros insectos– y por las
aberturas naturales (espiráculos, boca y ano). La gran dependencia de la
humedad es el mayor factor limitante que presentan los hongos, ya que
para que se produzca la germinación y esporulación fuera del
hospedante se requieren valores de humedad relativa superiores a 90%.
Control de asepsia en Laboratorio
Mantener el mayor cuidado en la limpieza del material y del laboratorio
mismo es fundamental para realizar trabajos confiables. El medio
ambiente se encuentra, por lo general, cargado de microorganismos
diversos que pueden contaminar el ámbito de trabajo, por ello es
conveniente no descuidar la limpieza de los materiales, instrumentos y
equipo necesario para el trabajo. Los materiales de vidrio y cualquier otro
elemento deben estar profundamente limpios antes de comenzar el
trabajo.
Lavado
Durante los trabajos con microorganismos, específicamente hongos, es
necesario y fundamental trabajar con mucha asepsia, debido a que es
indispensable el mantenimiento de los cultivos puros. Por lo tanto, es
conveniente que luego de lavar todo el material de vidrio, éste sea
enjuagado dos veces con agua destilada, para eliminar todo residuo de
detergente antes de ser esterilizado.
Esterilización
La esterilización de los materiales de vidrio y medios de cultivo nos
asegura un estado de asepsia que permite trabajar sin dificultades
cuando se ejecuta en forma eficiente. La forma más común de
esterilización es por medio del calor seco o húmedo.
La esterilización por calor seco se consigue con el uso de un horno o
estufa y es útil en el caso de esterilizar placas petri y otros materiales de
vidrio. La temperatura a la que se somete el material durante 90 a 120
minutos debe fluctuar entre 160 y 180°C. Es eficaz, siempre y cuando se
deje espacio libre para que el aire caliente circule alrededor de los
materiales.
La esterilización por calor húmedo o a presión de vapor de agua se
consigue con el uso de una autoclave (Figura 2). Se encuentran de
varios modelos y tamaños, pero todas tienen el mismo principio de
funcionamiento. A mayor presión, mayor es la temperatura de ebullición
del agua; cuando la presión aumenta a 15 libras (dos atmósferas), la
temperatura llega a 121.6°C. No existe microorganismo que tolere esta
temperatura durante 15 minutos. El tiempo es el factor que permite que el
calor penetre en la masa de esterilización y se absorba. Cuando se
esterilizan medios de cultivo en frascos de vidrio, se debe asegurar que
éstos ocupen no más de las tres cuartas partes del frasco para permitir
una ligera ebullición sin derramarse, por lo mismo, las tapas deben
colocarse ligeramente sueltas. Los frascos Erlen_meyer se deben
taponar con algodón para permitir la circulación del vapor. Los tubos de
ensayo conteniendo medio, se deben colocar en una gradilla o rejilla. El
uso de los rayos de luz ultravioleta (U.V.) es eficaz para eliminar
organismos que se encuentran sobre superficies, ya que este tipo de luz
tiene poca penetración.
DESINFECCIÓN DEL AMBIENTE
(LABORATORIO Y ALMACENAMIENTO)
Como ya se ha dicho, cuando se trabaja con hongos entomopatógenos
es necesario tener los ambientes de trabajo así como los utensilios,
materiales de vidrio, etc. en completo estado de asepsia. Existe un
conjunto de procedimientos para eliminar o reducir la contaminación por
microorganismos ya sean hongos entomopatógenos, fitopatógenos,
patógenos del hombre, saprofitos, etc. que puedan interferir con el
trabajo que se desea realizar. Éstos pueden estar flotando en el aire,
depositados sobre las superficies de trabajo y del ambiente como
paredes, techos, estantes, entre otros.
El alcohol es muy utilizado en trabajos de laboratorio para desinfectar la
superficie de la cámara de flujo laminar así como las superficies de
trabajo.
Los alcoholes actúan desnaturalizando las proteínas, disolviendo las
capas lipídicas y como agentes deshidratantes.
Para reducir la contaminación en el ambiente de trabajo, se pueden
realizar aplicaciones de sustancias antisépticas como el Timol.
Preparación:
Preparar una solución de 1 gramo de Timol en 1 litro de agua
Esta solución se asperja sobre muebles, paredes, etc. y todo
aquello que forma parte del interior del laboratorio.
Precauciones al aplicar:
� Evitar que caiga sobre la piel y los ojos, de ser así lavar bien
con agua corriente.
� Evitar inhalarlo.
� Luego de aplicar, dejar la habitación totalmente cerrada.
� No aplicar sobre alimentos.
� Aplicar sobre toda superficie del laboratorio: paredes, muebles,
pisos, zócalos, etc.
� El operador debe estar provisto de máscara, guantes y toda
protección posible.
La operación de aplicación no debe durar más de 10 minutos.