Técnica de Cribado de residuos antibacterianos con 5

TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS DE
RESIDUOS INHIBIDORES
Xornada técnica do leite
12 de Noviembre de 2007
Mª Teresa Fernández Fernández
Laboratorio de Salud Pública de Lugo
Conselleria de Sanidade
¿Cuál es la justificación del control
de residuos en leche?
Residuos
y
Salud pública
Residuos
y
Industria Láctea
Residuos
y
Productor
EFECTOS
EFECTOS
TECNOLÓGICO
ECONÓMICOS
EFECTOS
TOXICOLÓGICOS
v Resistencias
microbianas
v Alergias
v Toxicidad
v Efectos sobre la
flora intestinal
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12 de Noviembre de 2007
qInhibición bacteriana:
Efectos sobre las
características organolépticas
del producto
qEnmascaramiento de los
controles microbiológicos:
fallan los controles
qTermorresistencia:superan
las barreras térmicas
(pasteurización,UHT,etc.)
ECONÓMICOS
Ø Sanciones
Ø Pago por calidad
Ø Descarte de leche
§ Contaminación
cisterna-silo
¿Cuáles son los posibles residuos y
contaminantes en la leche?
vResiduos de medicamentos veterinarios
vSustancias anabolizantes
vDetergentes y desinfectantes.
vPesticidas
vMicotoxinas
vPCBs, Dioxinas, metales pesados,etc.
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12 de Noviembre de 2007
DEFINICIONES
Residuo
(Codex Alimentarius)
(P.N.I.R.)
Residuo de:
Define los residuos de
medicamentos veterinarios
como los productos
originales y sus metabolitos
en cualquier porción
comestible del producto
animal
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•Sustancias de acción farmacológica
•Sus productos de transformación
•Otras sustancias
que se transmitan a los
productos animales y que
puedan resultar nocivos para la
salud humana
DEFINICIONES
Promotor de crecimiento
Sustancia que en sí misma proporciona el
crecimiento del animal
(Clembuterol,Hormonas)
Precursor de crecimiento
Sustancia que favorece las condiciones del
entorno del animal para favorecer su
crecimiento
(antibióticos , vitaminas,tranquilizantes,etc.)
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DEFINICIONES
LMR = Limite Máximo de Residuo
(µg/kg = ppb)
Es el contenido de un determinado
producto veterinario que se considera
admisible en un producto alimenticio;
este límite se basará en el tipo y en la
cantidad de residuos que se consideren
no constituyen ningún riesgo
toxicológico para la salud humana
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12 de Noviembre de 2007
DEFINICIONES
• Antibiótico: (1942) •
compuestos químicos
de origen microbiano
,con actividad
antimicrobiana.
• Quimioterápico:
•
compuestos de
síntesis (distinción con
los de origen natural)
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Antibacteriano: Para
distinguir los
antimicrobianos activos
frente a bacterias de los
activos frente a hongos
(Antifúngicos).
Inhibidor: Se denominan
así a los residuos de
antibióticos detectados
mediante técnicas
microbiológicas
Normativa sobre residuos de medicamentos
veterinarios
(Reglamento UE 2377/90)
ØAnexo I: Lista de sustancias farmacológicas activas,
cuyos LMR se han fijado definitivamente (medicamentos
con limitación de uso)
ØAnexo II: Lista de sustancias que no están sujetas a
LMR (medicamentos de libre uso)
ØAnexo III: Lista de sustancias para las que se han
fijado LMR provisionales (medicamentos con limitación de
uso provisional)
ØAnexo IV: Lista de sustancias para las que no se
pueden establecer LMR (medicamentos prohibidos)
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Grupos antibióticos
Tetraciclinas
Macrólidos y Lincosaminas
Clortetraciclina
Epiramicina
Oxitetraciclina
Kitasamicina
Tetraciclina
Lincomicinsa
Doxiciclina
Tilosina
Rolitetraciclina
etc.
Penicilinas
Amoxicilina
Ampicilina
Bencilpenicilina
:
Cloxacilina
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Oxacilina,etc.
Grupos antibióticos
Cefalosporinas
Cefalotina
Cefaloxina
Cefoperazona
Cefuroxima
Cefazolina
etc.
Aminoglucósidos
Espectinomicina
Estreptomicina
Tianfenicol
Fluorfenicol.
Gentamicina
Quinolonas
etc.
Cirofloxacino
Enrofloxaino
Ac Nalidíxico
Furaltadona
:
Furazolidona
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Cloranfenicol
Kanamicina
Nitrofuranos
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Anfenicoles
Grupos antibióticos
Ionóforos
Monensina
Salinomicina
Lasalocid
Otros
Peptídicos
Novoviocina
Bacitracina
A.Fusidico
Colistina
Trimetroprima
Polimixina B
Dimetridazol
Avoparcina
Griseofulvina
Virgiamicina
Nistatina
Gramicidina
Carbadox
Ronidazol
Metronidazol
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Dapsona
etc.
Propiedades de los métodos de
detección
Falsos Positivos
ØSelectividad
Falsos Negativos
ØLímites de detección
ØSensibilidad para los LMRs
ØReproducibilidad, Precisión, Exactitud
OBJETIVO DEL MÉTODO DE CONTROL
ELEGIREMOS EL MÉTODO DE DETECCIÓN
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¿Cuál sería el método ideal?
ü Detecta todos los residuos posibles
üCon sensibilidad alrededor de los LMRs
üPocos resultados falsos negativos
(protección del consumidor)
üPocos resultados falsos positivos
(protección del productor y del comercio
nacional e internacional)
üEconómico y de fácil uso
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ESTRATEGÍA ANALÍTICA
Técnicas
de
Técnicas
Técnicas
Cribado
de
de
o de
Post-Cribado
Confirmación
Screening
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Propiedades de los métodos de
detección: Fundamento
Técnicas
de
Cribado
o de
Screening
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Microbiológicas
Propiedades de los métodos de
detección: Fundamento
Técnicas
de
Post-Cribado
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Ø Inhibición microbiana: PostCribado
Ø HPTLC(Cromatografía de capa
fina)
Ø Inmuno-enzimáticos:
*Inmunológicos (ELISA, RIA,etc.).
*Enzymáticos (Pezym)
Ø De Unión a Receptores:
*Receptores microbiológicos
(Charm).
*Receptores proteicos (Beta-star,
Snap)
Propiedades de los métodos de
detección: Fundamento Cromatografía
Técnicas
de
Confirmación
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Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
HPLC/UV
HPLC/DAD
HPLC/FLUO
HPLC/MS-MS
GS
GS/MS
etc.
TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS
DE
Screening o Cribado
Todas se basan en el cultivo de un microorganismo en
agar que tiene resistencia o sensibilidad frente a un
antibiótico o grupos antibióticos determinados que se
ecuentran como residuos en los tejidos de origen animal
o en sus productos .
Para conseguir un amplio espectro de identificación , se
juega con la siembra en agares de distinta composición y
pH.
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TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS
de Screening o Cribado
qTécnica de Cribado de residuos antibacterianos
con 5 placas
qTécnica Stop (“Swab test on premises”)
qTécnica STAR (“screening test for antibiotic
residues”)
qTécnica de cribado de residuos antibacterianos en
leche por inhibiciónde B. stearotermóphilus:
* En placa.
* Delvotest.
* Eclipse 50
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Técnica de Cribado de residuos
antibacterianos con 5 placas
Ph 6
30ml de
agar
+
DST(pH7,4)
30ml de agar+
solución de
Trimetoprima
+
Ph 8
30ml de
agar
+
Ph 8
30ml de
agar
+
B. subtilis
B. subtilis
B. subtilis
Kocuria
rhizophila
30ºC
30ºC
30ºC
37ºC
Disco control
Bencilpenicilina
0,01 UI /disco
Disco control
Sulfadimidina
0,5 µg/disco
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Disco control
Estreptomicina
0,5 µg/disco
Disco control
Estreptomicina
0,5 µg/disco
DST ó PH 8
30ml de
agar
+
E. coli
30ºC
Disco control
Ciprofloxacino
0,003 µg/disco
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12 de Noviembre de 2007
Xornada técnica do leite
12 de Noviembre de 2007
Leche cruda
En baño a 80ºC
durante 10 mit
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Medida con calibre de los halos
de inhibición
Positivas las muestras con
halos
mayores ó iguales 2mm
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Técnica Stop (“Swab test on premises”)
Johnston et al. 1981
Utilizada por su sencillez en mataderos sin necesidad de
remitir muestras al laboratorio en EEUU y países de
influencia
Agar nº 5
Disco control
de Neomicina
+
B. subtilis
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(V. Calderón)
Técnica STAR (“screening test
for antibiotic residues”)
Fué una de las propuestas del laboratorio Comunitario de
Referencia en atención a las necesidades de los planes de
residuos
MEDIO
MICROORGANISMO
Tª
DISCO
CONTROL
Medio pH 6
B. cereus
30ºC
Clortetraciclina
B. stearotermóphilus
55ºC
Sulfadimidina
Medio pH 7,2
B. subtilis
30ºC
Estreptomicina
Medio pH 8
E. coli
37ºC
Ciprofloxacino
Medio pH 8
M. Luteus
37ºC
Tilosina
Medio DST
pH 7,4
+
Trimetoprima
Técnica de Post-cribado
de residuos de antibióticos por
bioensayo múltiple
Es una técnica con la que se pretende
identificar el grupo de antibióticos
al que podría pertenecer el residuo
Se utiliza desde hace tiempo en EEUU y
su puesta a punto para el PNIR fué a
cargo del Centro Nacional de Referencia
de Majadahonda (V. Calderón)
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PREPARACIÓN DE PLACAS
PLACA
MEDIO
MICROORGANISMO
PENICILASA HEPARINA
A
Nº 8
B. cereus CECT 193
200 UI/ml
NO
a
Nº 8
B. cereus CECT 5314
200 UI/ml
NO
B
Nº 2
Kocuria rhizophila CECT 4070
NO
NO
C
Nº 2
Kocuria rhizophila CECT 4070
200 UI/ml
NO
D
Nº 5
B. subtilis CECT 356
200 UI/ml
NO
d
Nº 5
B. subtilis CECT 356
200 UI/ml
40 mg/ ml
E
Nº 11
Kocuria rhizophila CECT 4070
200 UI/ml
NO
F
Nº11
Kocuria rhizophila CECT4093
200 UI/ml
NO
G
Nº 11
S. epidermidis CECT 231
200 UI/ml
NO
?
Nº 11
S. epidermidis CECT 231
200 UI/ml
40 mg/ ml
Q
Nº 7,4
E. coli CECT 4201
200 UI/ml
NO
K
Nº 7,4
E. coli CECT 4201
200 UI/ml
40 mg/ ml
Leche cruda
A 80º C
durante 10 mit
para inactivar
los posibles
inhibidores
naturales
cilindros de 8 mm
de Ø externo y 10
mm de altura
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Técnica de Post-cribado de residuos de
antibióticos por bioensayo múltiple
Lectura de resultados
ØPlacas A y a: Detección de Tetraciclinas
ØPlaca B y C: Detección de ß-lactámicos
ØPlaca D: Detección de aminoglucósidos
(estreptomicina)
ØPlacas E y F : Detección de macrólidos (eritromicina)
ØPlaca G: Detección de aminoglucósidos (Neomicina
y Gentamicina)
ØPlaca Q: Detección de Quinolonas
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Técnica de Post-cribado de residuos de
antibióticos por bioensayo múltiple
Informe de resultados
Si no se puede interpretar el resultado
Si no se detecta el halo
Se detecta una inhibición
con el grupo....
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12 de Noviembre de 2007
Inhibidor no identificable
Negativo
Actividad antibacteriana concordante
Técnica de cribado de residuos antibacterianos en leche por
inhibiciónde B. stearotermóphilus en placa
( método de Kundrat)
Agar Nº 2 adicionado con 1 g de D(+) Glucosa+
Púrpura de Bromocresol
+
suspensión de esporas B. stearothermophilus
+
solución de Trimetoprima
En ausencia de sustancias inhibidoras
el germen se desarrolla en el curso de la
incubación, fermentando la glucosa
presente en el medio, formando ácido,
el cual hará virar a amarillo el Púrpura
de bromocresol (violeta) de todo el agar
de la placa o del tubo.
disco control de 0,01 UI de penicilina G
Tª de incubación 64ºC durante 3h - 4h
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Delvotest y test Eclipse 50
Añadir una tableta
nutritiva (solo en
el Delvotest)
Tapar los viales
e incubar a
64ºC± 2ºC
Leer los resultados
aproximadamente
3h
Eclipse 50
Xornada técnica do leite
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Añadir 100 µl de
muestra en Delvotest
y 50 µl en el Eclipse 50
Delvotest
Fundamento de la técnica del Delvotest y Test Eclipse 50
ØSon tests que vienen preparados para su utilización en
tubo. Se basa igualmente que el anterior en la inhibición o no
del desarrollo de Bacillus stearothermophilus(var.
calidolactis) a 64ºC, en un agar compuesto de nutrientes
seleccionados y con un indicador de color que hará virar el
medio a amarillo en caso de ausencia de sustancias
inhibidoras debido a la formación de ácido por parte del
germen que se ha desarrollado en el medio, y permanecerá
con el color violeta original del medio, en el caso de la
presencia de sustancias inhibidoras, que no permitirán el
desarrollo del germen.
ØNegativo cuando en todo el agar del tubo hay un cambio de
color manifiesto de violeta a amarillo.
ØPositivo cuando veamos con claridad que se mantienen el
color violeta original del medio
Xornada técnica do leite
12 de Noviembre de 2007
Xornada técnica do leite
12 de Noviembre de 2007
ØUn buen diagnóstico:
ØNos lleva a la
elección del mejor
tratamiento
ØLa adecuada
duración del
tratamiento
ØLa mejor dosificación
ØElección del
mejor producto
ØY en consecuencia
ØLa favorable evolución del
proceso patológico a curar