análisis de las proteínas - TÉCNICAS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL I

ANÁLISIS DE LAS PROTEÍNAS
CONSIDERACIONES
GENERALES
PROTEÍNAS
• SON COMPONENTES ABUNDANTES EN TODAS LAS
CÉLULAS.
• CASI TODAS (EXCEPTO LAS DE ALMACENAMIENTO)
SON IMPORTANTES PARA LAS FUNCIONES
BIOLÓGICAS Y/O LA ESTRUCTURA CELULAR.
• LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS SON MUY
COMPLEJAS.
COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS
• ESTÁN CONSTITUÍDAS POR: HIDRÓGENO, CARBONO,
NITRÓGENO, OXÍGENO Y AZÚFRE.
• LOS “BLOQUES DE CONSTRUCCIÓN” DE LAS
PROTEÍNAS SON 20
∞-AMINOÁCIDOS.
• LAS UNIONES ENTRE RESIDUOS DE AMINOÁCIDOS
EN UNA PROTEÍNA SON ENLACES PEPTÍDICOS.
COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS
• EL NITRÓGENO ES EL ELEMENTO MÁS DISTINTIVO PRESENTE
EN LAS PROTEÍNAS.
• GENERALMENTE LAS PROTEÍNAS RICAS EN AMINOÁCIDOS
BÁSICOS CONTIENEN MÁS NITRÓGENO.
• SIN EMBARGO, EL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN VARIAS
PROTEÍNAS ALIMENTICIAS VARÍA DE 13.4 19.1% DEBIDO A LA
VARIACIÓN EN LA COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS
ESPECÍFICA DE LAS PROTEÍNAS.
ESTEREOQUÍMICA DE LOS AMINOÁCIDOS
Los aa son estructuras tetraédricas
ISÓMEROS
“Bioquímica” Stryer, Berg y Tymoczko
Ed. Reverté, S.A. 2003
La estructura tridimensional es de crucial importancia para la
función
Representación:
a) Tridimensional
b) En perspectiva
“Bioquímica” Mathews, van Holde y Ahern Addison Wesley 2002
Representación:
c) En proyección
Alanina (Ala, A)
3.- CLASIFICACIÓN
• Diversa: Elevado número y diversidad de propiedades
• Se basa en cuatro criterios:
• Químico (composición)
• Simples
• Conjugadas
(holoproteína = apoproteína + grupo prostético)
- Glico-, lipo-, nucleoproteínas
- metalo-, hemo-, flavo-proteínas
• Estructural (forma)
• Globulares
• Fibrosas
• Función
• Físico (solubilidad)
NECDESIDAD DEL ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS
• CONTENIDO PROTÉICO TOTAL
• COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS
• CONTENIDO DE ALGUNA PROTEÍNA PARTICULAR EN
UNA MEZCLA
• CONTENIDO PORTEÍCO DURANTE EL AISLAMIENTO Y
PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
• NITRÓGENO NO PROTÉICO
• VALOR NUTRITIVO DE UNA (DIGESTIBILIDAD,
BALANCE PROTÉICO)
CONTENIDO PROTÉICO
EN LOS ALIMENTOS
• PRODUCTOS LÁCTEOS
LECHE ENTERA
3.5%
LECHE DESHIDRATADA DESGRASADA 35.9%
QUESO CHEDDAR
25%
• HUEVOS
12.9%
CONTENIDO PROTÉICO EN LOS
ALIMENTOS
• CARNES
RES, BISTEAK, MAGRO CON GRASA 28.6%
PUERCO, MAGRO CON GRASA, DESHUESADO
17.1%
PECHUGA DE POLLO
27.3%
• PESCADO
BACALAO COCINADO
28.5%
ATÚN EN ACEITE ENLATADO
24.2%
CONTENIDO PROTÉICO EN
LOS ALIMENTOS
• CEREALES
ARROZ, INTEGRAL, CRUDO
ARROZ REFINADO, CRUDO
HARINA DE TRIGO INTEGRAL
HARINA DE MAÍZ
SPAGHETTI, SECO
ALMIDÓN DE MAÍZ
7.5%
6.7%
13.3%
7.8%
12.5%
0.3%
CONTENIDO PROTÉICO EN
LOS ALIMENTOS
• FRUTAS Y VEGETALES
PAPA ENTERA, CRUDA
1.6%
ESPÁRRAGOS VERDES
2.5%
TAPIOCA
0.6%
FRIJOLES, SECOS, TODAS LAS VARIEDADES
22.3%
SOYA SECA
34.1%
CONTENIDO PROTÉICO EN LOS
ALIMENTOS
• FRUTAS Y SEMILLAS
MANZANA ENTERA, CRUDA
ALMENDRAS ENTERAS
0.2%
18.6%
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
DE PROTEÍNAS
•
•
•
•
•
•
•
•
•
MÉTODO DE KJELDAHL
MÉTODO DE BIURET
MÉTODO DE LOWRY
MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
MÉTODO DE ABSORCIÓN UV A 280nm
MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE
MÉTODO DE BRADFORD
MÉTODO DE LA NINHIDRINA
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
MÉTODO DE KJELDAHL
(JOHANN KJELDAHL, 1883)
• DIGESTIÓN CON H2SO4 CON LA ADICIÓN DE PERMANGANATO
DE POTASIO PARA COMPLETAR LA OXIDACIÓN Y CONVERSIÓN
DEL NITRÓGENO A SULFATO DE AMONIO.
• NEUTRANLIZACIÓN DE LA DIGESTA DILUIDA, SEGUIDA DE
UNA DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE ÁCIDO
ESTÁNDAR CON UN CONTENIDO DE IODURO DE POTASIO E
YODATO.
• TITULACIÓN DEL YODO LIBERADO CON TIOSULFATO DE SODIO
ESTÁNDAR
MODIFICACIONES PARA EL
MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE
KJELDAHL
• SE HAN AÑADIDO CATALIZADORES COMO: Hg,
Cu, Se, Ti AL H2SO4 PARA LOGRAR UNA
DIGESTIÓN COMPLETA.
EL DIÓXIDO DE SELENIO Y EL SULFATO DE
COBRE EN PROPORCIÓN 3:1 SON MUY
EFECTIVOS EN LA DIGESTIÓN.
MODIFICACIONES PARA EL
MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE
KJELDAHL
• EL SULFATO DE POTASIO SE UTILIZA PARA AUMENTAR
EL PUNTO DE EBULLICIÓN DEL ÁCIDO SULFÚRICO
PARA ACELERAR LA DIGESTIÓN.
• EL SULFURO O TIOSULFATO DE SODIO SE AÑADEN A
LA DIGESTA DILUIDA PARA AYUDAR A LIBERAR EL
NITRÓGENO DEL Hg EL CUAL TIENDE A ADHERIR
AMONIO.
MODIFICACIONES PARA EL
MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE
KJELDAHL
• EL AMONIACO SE DESTILA DIRECTAMENTE EN UNA
SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO Y ES SEGUIDO DE UNA
TITULACIÓN CON UN ÁCIDO ESTÁNDAR.
• SE UTILIZAN LA COLORIMETRÍA Y LA
CROMATOGRAFÍA IÓNICA PARA DETERMINAR EL
CONTENIDO DE NITRÓGENO POSTERIOR A LA
DIGESTIÓN.
PROCEDIMIENTO GENERAL
Y REACCIONES
• DIGESTIÓN
EL SULFATO DE AMONIO NO VOLÁTIL SE FORMA DE LA
REACCIÓN DEL NITRÓGENO Y EL ÁCIDO SULFÚRICO.
DURANTE LA DIGESTIÓN SE LIBERA EL NITRÓGENO PROTÉICO
PARA FORMAR IONES DE AMONIO.
EL ÁCIDO SULFÚRICO OXIDA LA MATERIA ORGÁNICA Y SE
COMBINA CON EL AMONIO FORMADO.
DIGESTIÓN
• LOS ELEMENTOS CARBONO E HIDRÓGENO SE
CONVIERTEN EN DIÓXIDO DE CARBONO Y
AGUA
PROTEÍNA
Ácido Sulfúrico
Calor, catalizador
(NH4)2 SO4
NEUTRALIZACIÓN Y
DESTILACIÓN
• LA MUESTRA DIGERIDA SE DILUYE CON AGUA.
• SE AÑADE EL ÁLCALI QUE CONTIENE TIOSULFATO DE
SODIO PARA NEUTRALIZAR AL ÁCIDO SULFÚRICO.
• EL AMONÍACO FORMADO SE DESTILA EN UNA
SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO QUE CONTIENE LOS
INDICADORES AZÚL DE METILENO Y ROJO DE
METILO.
REACCIONES DE LA
NEUTRALIZACIÓN Y LA DESTILACIÓN
(NH)2SO4+ 2NaOH → 2NH3+Na2SO4+2H2O
NH3+ H3BO3 →
(ácido bórico)
NH4 + H2BO3(ión borato)
REACCIONES DE LA
TITULACIÓN
• EL ANIÓN BORATO (PROPORCIONAL A LA
CANTIDAD DE NITRÓGENO) SE TITULA CON
HCl ESTANDARIZADO:
H2BO3- + H+ → H3BO3
CÁLCULOS
MOLES DE HCl = MOLES DE NH3 = MOLES DE
NITRÓGENO EN LA MUESTRA
FUNCIÓN DEL BLANCO EN LA
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
• SE DEBE UTILIZAR UN BLANCO CON
REACTIVOS PARA SUSTRAER EL NITRÓGENO
REACTIVO DEL NITRÓGENO DE LA MUESTRA.
• N HCl = NORMALIDAD DEL HCl EN MOLES /1000 mL
• VOL. ÁCIDO CORREGIDO = mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR PARA LA
MUESTRA) – (mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR PARA EL BLANCO)
• 14 =
PESO ATÓMICO DEL NITRÓGENO
%N = N HCl X VOLUMEN DE ÁCIDCORR. X 14g N2 x 100
g. DE MUESTRA
1 mol
FACTOR
• SE UTILIZA UN FACTOR DE CONVERSIÓN DE % DE N2 A % DE
PROTEÍNA CRUDA.
• LA MAYORÍA DE LAS PROTEÍNAS CONTIENEN 16% DE N2
• EL FACTOR DE CONVERSIÓN ES:
6.25 (100/16 = 6.25)
%N2 X 6.25 = %PROTEÍNA
%N2 = %PROTEÍNA x 0.16
FACTORES DE CONVERSIÓN
PARA ALGUNOS ALIMENTOS
ALIMENTO
%N2PROTEÍNA
HUEVO O
16
CARNE, MAÍZ
LECHE
15.7
TRIGO
18
SOYA
17.51
AVENA
17.15
FACTOR
6.25
6.38
5.7
5.71
5.83
EJEMPLO: CÁLCULOS
PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE
DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
• NESSLERIZACIÓN
NH4OH + 2HgI2+ 2KI + 3KOH → NH4Hg2I +
7KI + 4H2O ( rojo-naranja, 440nm)
RÁPIDO Y FÁCIL PERO EL IODURO
DIMERCÚRICO DE AMONIO ES COLOIDE
Y EL COLOR ES INESTABLE
PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE
DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
• MEDICIÓN DEL pH POSTERIOR A LA
DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE
ÁCIDO BÓRICO
• MEDICIÓN DIRECTA DEL AMONÍACO,
MEDIANTE EL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA
IÓNICA
VENTAJAS DEL MÉTODO DE
KJELDAHL
•
•
•
•
•
APLICABLE A TODO TIPO DE ALIMENTOS
RELATIVAMENTE SIMPLE
BARATO
PRECISO
ES EL MÉTODO OFICIAL PARA MEDIR EL
CONTENIDO DE PROTEÍNA CRUDA
DESVENTAJAS DEL MÉTODO
DE KJELDAHL
• MIDE EL NITRÓGENO ORGÁNICO TOTAL, NO
SÓLO EL NITRÓGENO PROTÉICO
• CONSUME MUCHO TIEMPO (AL MENOS 2
HORAS PARA COMPLETARSE)
• PRECISIÓN MÁS POBRE QUE EL MÉTODO DE
BIURET
• USA REACTIVOS CORROSIVOS
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
POR EL MÉTODO DE BIURET
• FUNDAMENTO
AL FORMAR COMPLEJOS LOS IONES CÚPRICOS CON LOS ENLACES
PEPTÍDICOS DE LAS PROTEÍNAS SE PRODUCE UN COLOR VIOLETAMORADO BAJO CONDICIONES ALCALINAS.
LA ABSORBANCIA DEL COLOR PRODUCIDO ES LEÍDO A 540nm.
LA INTENSIDAD DEL COLOR (ABSORBANCIA) ES PROPORCIONAL AL
CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA.
PROCEDIMIENTO PARA EL
MÉTODO DE BIURET
• 5 mL DE REACTIVO DE BIURET SE MEZCLA CON 1mL
DE SOLUCIÓN PROTÉICA (1-10 mg DE
PROTEÍNA/mL).
EL REACTIVO INCLUYE SULFATO DE COBRE, NaOH, Y
TARTRATO DE SODIO Y POTASIO EL CUAL SE UTILIZA
PARA ESTABILIZAR EL IÓN COBRE EN LA SOLUCIÓN
ALCALINA
PROCEDIMIENTO PARA EL
MÉTODO DE BIURET
• DESPUÉS DE REPOSO A TEMPERATURA AMBIENTE
DURANTE 15 A 30 MINUTOS, SE LEE LA
ABSORBANCIA A 540nm CONTRA UN BLANCO CON
SÓLO REACTIVO.
• SI LA REACCIÓN NO ES CLARA DEBE CENTRIFUGARSE
LA MUESTRA PREVIO A LA LECTURA DE LA
ABSORBANCIA
PROCEDIMIENTO PARA EL
MÉTODO DE BIURET
• SE DEBE ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR DE
CONCENTRACIÓN VS ABSORBANCIA
UTILIZANDO ALBÚMINA DE SUERO DE
BOVINO (BSA) PARA COMPARACIÓN CON LA
MUESTRA BAJO ESTUDIO
VENTAJAS DEL MÉTODO DE
BIURET
•
•
•
•
•
MENOS CARO QUE EL MÉTODO DE KJELDAHL
RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30 MINUTOS)
ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE COLOR
POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN CON LA
REACCIÓN DE BIURET
• NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO PEPTÍDICAS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
BIURET
• NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO DE
LOWRY
• REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR PRUEBA
• LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO
INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
• PUEDE OCURRIR OPALESCENCIA EN LA SOLUCIÓN FINAL SI
ESTÁN PRESENTES ALTAS CONCENTRACIONES DE LÍPIDOS O
CARBOHIDRATOS
• DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE CANTIDADES DE
PROTEÍNA CONOCIDAS
MÉTODO DE LOWRY
• FUNDAMENTO
COMBINA LA REACCIÓN DE BIURET CON LA
REDUCCIÓN DEL REACTIVO DE FENOL FOLINCIOCALTEAU (ÁCIDO FOSFOMOLÍBDICOFOSFOTÚNGSTICO) POR LOS RESIDUOS DE TIROSINA
Y TRIPTOFANO DE LAS PROTEÍNAS. EL COLOR
AZULOSO DESARROLLADO ES LEÍDO A 750nm (ALTA
SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIÓN
PROTÉICA BAJA) O A 500nm (ALTA SENSIBILIDAD
PARA UNA CONCENTRACIÓN PROTÉICA ALTA)
VENTAJAS DEL MÉTODO DE
LOWRY
• MUY SENSIBLE
• MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE LA
MUESTRA
• MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE LOS
OTROS MÉTODOS
• RELATIVAMENTE SIMPLE
• SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORAS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
LOWRY
• EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL MÉTODO DE
BIURET)
• EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN
DE PROTEÍNAS
• LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y
HEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
• LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES, SULFATO DE
AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFHIDRILO INTERFIEREN CON LA
REACCIÓN
MÉTODO DEL ÁCIDO
BICINCONÍNICO (BCA)
• FUNDAMENTO
SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LAS PROTEÍNAS
REDUCEN LOS IONES CÚPRICOS A IONES CUPROSOS
BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LOS IONES
CUPROSOS REACCIONAN CON EL BCA (VERDOSO)
PARA FORMAR UN COLOR MORADO. EL COLOR
FORMADO ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO
PROTÉICO DE LA MUESTRA
VENTAJAS DEL MÉTODO DEL
ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
• SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MÉTODO DE LOWRY (0.5mg a 10mg)
• LA MEZCLA EN UN PASO ES MÁS FÁCIL QUE EN EL MÉTODO DE LOWRY
• EL REACTIVO ES MÁS ESTABLE QUE EL REACTIVO DE LOWRY
• LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO IÓNICO NO INTERFIEREN CON LA
REACCIÓN
• LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS DESNATURALIZANTES
NO INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O UREA 3M)
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DEL
ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
• EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE NECESITA
CONTROLAR CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO ENTRE EL
ANÁLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA.
• LOS AZÚCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.
• ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO
INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.
• LA RESPUESTA EN LA ABSORBANCIA NO ES LINEAL
MÉTODO DE ABSORCIÓN EN
ULTRAVIOLETA A 280nm
• FUNDAMENTO
LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE
ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE DEBIDO
PRINCIPALMENTE A LOS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA
TIROSINA DE LAS PROTEÍNAS. YA QUE LAS CONCENTRACIONES
DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS PROTEÍNAS ES
FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE UTILIZAR LA
ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN
DE PROTEÍNAS USANDO LA LEY DE BEER
MÉTODO DE ABSORCIÓN EN
ULTRAVIOLETA A 280nm
• FUNDAMENTO
DADO QUE CADA PROTEÍNA TIENE UNA
COMPOASICIÓN ÚNICA DE AMINOÁCIDOS
AROMÁTICOS, EL COEFICIENTE DE EXTINCIÓN (E280) O
SU ABSORTIVIDAD MOLAR (Em) DEBEN SER
DETERMINADOS PARA PROTEÍNAS INDIVIDUALES
PARA LA ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO PROTÉICO
VENTAJAS DEL MÉTODO DE
ABSORCIÓN EN UV (280nm)
• MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE
(VARIAS VECES MÁS SENSIBLE QUE EL MÉTODO DE
BIURET)
• NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO
Y OTRAS SALES BUFFER
• MÉTODO NO DESTRUCTIVO
• UTILIZADO EN DETECCIÓN POST-COLUMNA DE LAS
PROTEÍNAS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
ABSORCIÓN EN EL UV (280nm)
• LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN EN LA
REGIÓN DE 280nm
• EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS
DIFIERE CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS
PROTEÍNAS.
• LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA
TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRÁTICOS
• SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE PURO
PARA UTILIZAR ESTE MÉTODO
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS POR ADHESIÓN DE UN
COLORANTE
• ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO
• MÉTODO DE BRADFORD
ADHESIÓN DE COLORANTE
ANIÓNICO
• FUNDAMENTO
LA MUESTRA PROTÉICA SE MEZCLA CON UNA
CANTIDAD EXCESIVA CONOCIDA DE UN COLORANTE
ANIÓNICO EN UNA SOLUCIÓN BUFFER.
LAS PROTEÍNAS SE UNEN AL COLORANTE PARA
FORMAR UN COMPLEJO INSOLUBLE.
ADHESIÓN DE COLORANTE
ANIÓNICO
• FUNDAMENTO
SE MIDE EL COLORANTE NO ADHERIDO, SOLUBLE
POSTERIOR A LA EQUILIBRACIÓN DE LA REACCIÓN Y
LA REMOCIÓN DEL COMPLEJO INSOLUBLE POR
CENTRIFUGACIÓN Y FILTRACIÓN.
EL COLORANTE NO ADHERIDO ESTÁ INVERSAMENTE
RELACIONADO AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA
MUESTRA
ADHESIÓN DE COLORANTE
ANIÓNICO
• FUNDAMENTO
PROTEÍNA + EXCESO DE COLORANTE →
COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE
INSOLUBLE + COLORANTE NO
ADHERIDO SOLUBLE
COLORANTES UTILIZADOS EN ESTE
MÉTODO
• ÁCIDO SULFÓNICO ANIÓNICO
NARANJA ÁCIDO 12
NARANJA G
NEGRO AMIDO 10B
UNEN GRUPOS CATIÓNICOS DE LOS RESIDUOS
BÁSICOS DE AMINOÁCIDOS (IMIDASOL DE LA
HISTIDINA, GUANIDINA DE LA ARGININA Y EL GRUPO
ε-AMINO DE LA LISINA) Y EL GRUPO LIBRE TERMINAL
AMINO DE LAS PROTEÍNAS.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE ADHESIÓN
DE COLORANTE ANIÓNICO
• MÉTODO RÁPIDO (15 MINUTOS O MENOS)
• BARATO
• RELATIVAMENTE EXACTO PARA EL ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS EN ALIMENTOS
• PUEDE UTILIZARSE PARA ESTIMAR LOS CAMBIOS EN
EL CONTENIDO DE LISINA DISPONIBLE DE LOS
CEREALES DURANTE SU PROCESAMIENTO.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE ADHESIÓN
DE COLORANTE ANIÓNICO
• NO UTILIZA REACTIVOS CORROSIVOS
• NO MIDE NITRÓGENO NO PROTÉICO
• MÁS PRECISO QUE EL MÉTODO KJELDAHL
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA
ADHESIÓN DEL COLORANTE ANIÓNICO
• LAS PROTEÍNAS DIFIEREN EN SU CONTENIDO DE
AMINOÁCIDOS BÁSICOS DIFIEREN EN SU CAPACIDAD DE
ADHESIÓN DEL COLORANTE
• SE NECESITA ELABORAR CURVA DE CALIBRACIÓN
• MUCHOS COMPONENTES NO PROTÉICOS TAMBIÉN SE
PUEDEN ADHERIR AL COLORANTE (ALMIDÒN), METALES (Ca O
P) Y CAUSAR ERRORES EN LOS RESULTADOS
MÉTODO DE BRADFORD
• FUNDAMENTO
EL AZÚL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE ADHIERE A
LA PROTEÍNA, EL COLORANTE SE TORNA DE ROJIZO A
AZULADO YE L MÁXIMO DE ABSORCIÓN DEL
COLORANTE CAMBIA DE 465 A 595nm. EL CAMBIO
EN LA ABSORBANCIA A 595nm ES PROPORCIONAL A
LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN LA MUESTRA.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE
BRADFORD
• MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE PUEDE
COMPLETAR EN 2 MINUTOS)
• REPRODUCIBLE
• SENSIBLE (MUCHO MÁS QUE EL MÉTODO DE
LOWRY)
• NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES COMO K+,
Na+, Y Mg+
VENTAJAS DEL MÉTODO DE
BRADFORD
• NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO
• NO EXISTE INTERFERENCIA DE LOS POLIFENOLES NI
CARBOHIDRATOS COMO LA SACAROSA
• MIDE PROTEÍNA O PÉPTIDOS CON UNA MASA
MOLECULAR APROXIMADAMENTE IGUAL O MAYOR
DE 4 000 DALTONS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
BRADFORD
• EL COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE FORMADO PUEDE
UNIRSE A LAS CELDAS DE CUARZO
• EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES TIPOS DE PROTEÍNAS.
• LA PROTEÍNA ESTÁNDAR DEBE SELECCIONARSE CON MUCHO
CUIDADO
• INTERFERENCIA CON DETERGENTES.
MÉTODO DE LA NINHIDRINA
• FUNDAMENTO
AL SER HERVIDOS EN UN BUFFER A UN pH DE
5.5 EN PRESENCIA DE NINHIDRINA E
HIDRINDANTINA, LOS AMINOÁCIDOS,
AMONÍACO, Y LOS GRUPOS AMINO
PRIMARIOS, ORIGINAN UN COLOR MORADO
RUHEMANN
VENTAJA DEL MÉTODO DE LA
NINHIDRINA
• MÉTODO RELATIVAMENTE RÁPIDO SI SE
COMPARA CON EL MÉTODO DE KJELDAHL
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA
NINHIDRINA
• LA PRESENCIA DE PEQUEÑAS CANTIDADES DE AMINOÁCIDOS,
PÉPTIDOS, AMINAS PRIMARIAS, Y AMONÍACO OCASIONA UNA
SOBREESTIMACIÓN DEL CONTENIDO PROTÉICO
• BAJA PRECISIÓN
• EL COLOR VARÍA CON LA DIFERENTE COMPOSICIÓN DE
AMINOÁCIDOS
• SE NECESITA ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR EN CADA
ANÁLISIS