Capítulo 3 Fermentación de productos industriales

Capítulo 3
Capítulo 3 Fermentación de
productos industriales
Propósito
Conocer y manejar los conceptos fundamentales de la
microbiología microbiana como base para los procesos
de fermentación.
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Capítulo 3
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Capítulo 3
Introducción
Las Fermentaciones de Productos Industriales comprenden un buen número
de procesos industriales que son utilizados por el hombre para producir
satisfactores para la salud y la alimentación.
Para poder aprovechar las fermentaciones se deben desarrollar tecnologías
que permitan fabricar productos en cantidades industriales para satisfacer
necesidades del hombre, tanto en el ámbito doméstico, como social y
comercial.
En el desarrollo de las tecnologías de las fermentaciones se debe buscar
siempre el bajo costo, de tal forma que compitan con los productos que
se usan actualmente.
Existen procesos fermentativos que se conocen desde la antigüedad, como
la fabricación del vino, la cerveza, etc. Tradicionalmente, la humanidad
utilizaba estos procesos fermentativos y se consumían sin considerar
que se podría desarrollar tecnológicamente a un costo más bajo y con
mejores resultados de calidad de los productos.
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Capítulo 3
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Capítulo 3
Unidad 1 Antecedentes de la microbiología industrial
1.1 RAP Identifica y maneja los conceptos fundamentales
de la microbiología industrial
1.1.1 Antecedentes históricos de la microbiología industrial
Es el estudio de la microbiología orientada a la producción de elementos de
interés industrial mediante procesos en los cuales interviene, en algún paso,
un microorganismo. Es el caso de la producción de alimentos (fermentación
del vino, pan o cerveza) y suplementos dietéticos (como los cultivos de algas,
vitaminas o aminoácidos) biopolímeros, como el xantano, alginato, celulosa, ácido
hialurónico, polihidroxialcanatos; biorremediación de entornos contaminados
o tratamiento de desechos, así como la producción de principios activos
de interés en medicina, como la insulina y hormona del crecimiento o de
sustancias implicadas en el diagnóstico, como las Taq polimerasas empleadas
en PCR cuantitativa.
Es tan antigua ésta, como la manipulación de alimentos fermentados como el
vino, pan o yogur. No obstante, durante el siglo XX su aplicación se diversificó
con el ánimo de generar un gran número de compuestos químicos complejos de
forma más sencilla y barata que mediante síntesis orgánica; este hecho se debe
a la enorme versatilidad metabólica de los microorganismos que, frecuentemente,
son capaces de producir los compuestos deseados o sus precursores. Así mismo,
ha sido clave en la producción de penicilinas, ya naturales, como la penicilina
G (esto es, producidas de forma totalmente microbiológica), ya semisintéticas,
como la meticilina, que requieren la purificación de un intermediario que luego
ha de modificarse química o enzimáticamente. Por último, la tecnología avocada
al estudio del ADN recombinante ha permitido, con un enfoque de ingeniería
genética, diversificar aún más la disciplina, llegando a producirse proteínas
humanas mediante microorganismos transformados con genes humanos.
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Capítulo 3
Los microorganismos pueden ser considerados en dos criterios. El primero corresponde a las actividades útiles que
tienen algunos para obtener bienes o servicios y el segundo, a los efectos perjudiciales que ocasionan, que están
generalmente asociados a la producción de enfermedades,
tanto en el hombre como en los animales, y que también se
pueden extender al deterioro producido sobre alimentos y
materiales diversos.
La Microbiología Industrial se ocupa fundamentalmente de
las actividades útiles de los microorganismos. El término
Cultivo de un Penicillium productor de penicilina microorganismo se aplica en este Manual, a los organisy estructura de la penicilina G.
mos tales como bacterias, hongos y levaduras, es decir
procariotes y eucariotes, con inclusión de algas microscópicas, pero que no comprende a los virus. Aunque existen
aplicaciones industriales de los virus como es el caso de
la producción de algunas vacunas, esos procesos quedan
excluidos de este Manual.
La biosíntesis de ácidos grasos,
ocurre a través de la condensación de unidades de dos carbonos, es el sentido opuesto a la
β oxidación.
Figura: diferencias entre las vías de oxidación de los ácidos grasos y su síntesis. Las diferencias se encuentran a
5 niveles: 1. localización celular; 2. acarreador del grupo
acilo; 3. pares dador/aceptor de electrones; 4. estereoquímica de la reacción de hidratación/deshidratación; y 5. la
forma en que las unidades C2 son producidas o donadas.
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Capítulo 3
Las aplicaciones de los microorganismos son de tiempo
inmemorial. El hombre inventó o descubrió al azar la manera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. La cerveza era
conocida antes del año 6000 a.C. por sumerios y babilonios, y en el antiguo Egipto existía ya verdadera producción
en el año 1700 a.C.; el vinagre se producía desde antes de
esa fecha y el vino es también muy antiguo, ya que existe
evidencia de su producción antes del año 2000 a.C. en
Egipto y China, y finalmente, el pan se conoce desde el año
4000 a.C. aproximadamente.
Evidencia de la producción de vino por los
egipcios antes del año
2000 a. c.
La fermentación es la parte principal
del proceso de la elaboración del vino,
tiene como principal efecto la conversión de los azúcares del mosto en
alcohol etílico.
Figura Producción de vino (Archivo:Red wine cap.jpg
En los comienzos del siglo XX existían muy pocos o ningún
control de los procedimientos utilizados para la elaboración de esos productos o alimentos. Se pueden fijar 4
grandes etapas en el desarrollo de la Microbiología Industrial: 1) hasta 1900; 2) 1900-1945; 3) 1945-1979 y 4) 1979
hasta el presente, y considerar el comienzo del siglo XXI
como el inicio de cierto control en los procesos de utilización de cultivos puros.
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Capítulo 3
Para 1900 comienza la etapa de producción de una serie de productos nuevos que se suman a los conocidos
desde la más remota antigüedad, y que son la levadura
de cerveza, glicerol, ácido láctico, acetona butanol y etanol. Hasta el 1945 el futuro de la Microbiología Industrial,
ya que solamente unos pocos productos eran fabricados
con microorganismos, y además varios de esos productos
podían obtenerse por otras vías, ya más convenientes por
razones económicas, como etanol, ácido láctico o acetona butanol. Con la aparición de la penicilina en 1945
y la necesidad de su producción, se produce un impacto
formidable sobre los procedimientos microbiológicos, ya
que se plantea el desafío de la producción en gran escala
en condiciones de mucho mayor control y con necesidad
de operaciones más complejas para la separación y purificación de los productos. Como consecuencia de los
avances logrados en esos desarrollos se produce en pocos
años la aparición de un gran número de nuevos productos,
como otros antibióticos, aminoácidos, esteroides, enzimas,
biomasa aplicada a la alimentación animal y humana (proteínas unicelulares), nucleótidos, etc.
La Microbiología Industrial para 1979 recibe un nuevo y notable impulso que se suma al anterior cuando se concretan
a nivel de procedimientos prácticos las posibilidades que
ofrece la ingeniería genética, disciplina surgida como consecuencia del avance de la Biología Molecular. Este nuevo
impulso posibilita la producción industrial, basada en la
utilización de microorganismos recombinantes, de sustancias nuevas nunca producidas antes por esa vía como la
insulina, hormona de crecimiento, interferón y otras de muy
reciente aparición en el mercado de productos relacionados con el área de la salud. A través de una evolución en
los conceptos, el avance de los conocimientos y sobre
todo, con la necesidad de resolver problemas de producción vinculados a procesos cada vez más complejos, se fue
haciendo necesaria la participación de ingenieros y bioquímicos además de los microbiólogos, y se fue produciendo
también la integración de conocimientos provenientes de
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Capítulo 3
varias disciplinas. Se fue profundizando, el estudio de
los microorganismos de interés industrial, no sólo en sus
aspectos microbiológicos, sino también en relación a los
requerimientos surgidos de las aplicaciones industriales
de los mismos. Si de esta manera diferenciando la metodología general empleada en la selección, mantenimiento
y mejoramiento de los microorganismos, estos aspectos
debían orientarse a los productos de interés y al aumento
de la productividad de las cepas empleadas.
La insulina humana ha sido el primer producto comercial de
la clonación de genes y su éxito ha sido debido al pequeño
tamaño de la molécula que hizo posible la síntesis química
de un gen.
Para llevar a cabo la producción de insulina humana recombinante, se sintetizaron químicamente las cadenas de
ADN con las secuencias correspondientes a las cadenas de
glicocola y fenilalanina, siendo necesarias 63 nucleótidos
para la primera y 90 para la segunda más un triplete para
señalar el fin de la traducción. Además. Para facilitar la
separación de los productos sintetizados, se añadió a cada
gen el triplete correspondiente a la metionina.
Figura
Producción de in-
sulina recombinante.
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Capítulo 3
A la par sucedió con los requerimientos de
los medios de producción que deben incluir
consideraciones económicas además de las
microbiológicas. Se produjeron en los aspectos tecnológicos, evoluciones necesarias, ya
que de las cubas clásicas de fermentación
construidas de materiales diversos y con
poca instrumentación se pasó a biorreactores de acero inoxidable muy instrumentados.
La evolución de los procesos en los reactores y la interacción microorganismo- medio
que en los mismos requirió aportes fundamentales de la Bioquímica y Fisiología
Microbiana, como el conocimiento de las
rutas metabólicas, cinética enzimática, mecanismos de Biorreactores de membrana
regulación y estudios acerca de la influencia del medio (Producto del desarrollo de la biotecnoambiente sobre la productividad del proceso. Con ello logía)
a la Tecnología se incorporaron conocimientos fundamentales de fenómenos de transporte como transferencia de materia, calor y cantidad de movimiento y
criterios de cambio de escala. Como consecuencia de
la contribución de otras disciplinas básicas como la
Química, se fueron incorporando también conceptos
de termodinámica y estequiometría que se integraron
con los de la cinética enzimática para ser aplicados al
crecimiento microbiano y a la formación de productos.
Todos esos conceptos de la Microbiología, Química,
Bioquímica y Tecnología, constituyeron las bases de la
Microbiología Industrial actual.
En ella se utilizan los términos fermentación y fermentaciones industriales, para caracterizar a los procesos o tecnologías basados en el uso de microorganismos.
La “fermentación”, que deriva del latín fermentar (hervir), inicialmente reservado a la actividad
microbiana anaerobia, se fue aplicando asimismo a procesos aerobios y finalmente también
a aquéllos que utilizan células animales y vegetales.
Los procesos de la Microbiología Industrial o las fermentaciones industriales, o los procesos
de fermentación, son o pueden considerarse como sinónimos.
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Capítulo 3
1.1.2 Identificación de microorganismos
Los criterios utilizados, en la elección de microorganismos deberán tener en
cuenta ciertos criterios generales como son:
• La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.
• Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo reducido.
• Debe ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo, sin pérdida
de sus características particulares.
• Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo
corto.
En un proceso si el objetivo es un producto, éste debería ser de alto rendimiento
y de fácil extracción del medio de cultivo. Los microorganismos que se utilizan
en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes
naturales o de una colección de cultivos. En la industria, en general, cada
firma posee su propia colección de organismos, muchos de los cuales han
sido mejorados a través de técnicas clásicas de mutación o de ingeniería
genética. En cambio, estas cepas sólo son empleadas por la industria que las
posee, debido al gran valor comercial de las mismas, por lo que hay casos
donde se dispone de organismos modificados genéticamente para llevar a
cabo reacciones específicas de biosíntesis, degradación o biocatálisis, los
cuales están protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje
de organismos aislados o modificados no son disponibles para uso general en
laboratorios.
A nivel mundial hay
un gran número de colecciones depositarias de
cultivos. Entre la diversidad de colecciones se destacan: “American Type
Culture Collection”, USA, la cual mantiene bacterias, levaduras, algas,
actinomycetes, mohos, protozoos, virus y líneas celulares; “Colletion
Nationale de Cultures de Microorganismes” del Institut Pasteur, Francia;
“Northern Regional Research Laboratory” (NRRL), de Peoria, USA, y “National
Collection of Type Cultures”, Londres, Inglaterra.
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Capítulo 3
1.1.3 Manejo de cepas microbianas
Al aislar un organismo de sus fuentes naturales como agua, suelo, plantas y
desechos, la elección del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta
que el organismo exprese en ese ambiente las propiedades que son de interés.
En el caso de suelos tratados con pesticidas se podrían encontrar organismos
adaptados a la degradación de estos productos químicos, o en larvas de insectos muertos y agentes causales de la muerte. Cuando se elige la fuente de
aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica elegida para el
mismo; en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, o b) enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.
Cuando se realiza el muestreo y selección (screening) para el aislamiento de
una cepa de interés, la misma deberá ser caracterizada. En este se debe tener
en cuenta que la composición química del material a partir del cual se va a
realizar el aislamiento comienza a variar desde el momento en que es tomada
la muestra; por lo tanto, ésta se debe procesar rápidamente, tratando de evitar
alteraciones que afecten a la población de interés.
a) Aislamiento directo: en este caso
es preferible que el medio que se utiliza permita la máxima expresión del
material genético del organismo. En el
caso un organismo con acción antimicrobiana, se puede crecer al potencial
productor, en una caja de petri en
presencia del o los organismos contra los cuales se requiere la acción
antimicrobiana, observándose la producción del inhibidor por las zonas Aislamiento vegetativo de cepas
de inhibición de crecimiento. Para la
detección de productores de factores de crecimiento tales como aminoácidos y nucleótidos se utiliza la estimulación del desarrollo de
bacterias auxótrofas por un lisado del organismo, pudiéndose llevar
a cabo en medios sólidos, en donde es una “réplica” de la caja por
ensayar. Al obtener el crecimiento en la primera caja, se replica a
una segunda, antes de “matar” las colonias con luz. U.V., por ejemplo.
Esta caja es luego cargada con agar conteniendo una suspensión del
organismo auxótrofo al producto buscado. Después de un período de
incubación se observa crecimiento en forma de halo alrededor de las
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Capítulo 3
colonias productoras, lo que permite
el aislamiento de este organismo de
la placa réplica.
b) Enriquecimiento del cultivo: consiste en incrementar en una población
mixta el número de organismos de
interés en relación con el resto, donde se busca favorecer el crecimiento
de un tipo dado de microorganismos
mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones
Aislamiento con esporas
inapropiadas para el desarrollo de
los otros. Con el empleo de sustratos específicos o ciertos inhibidores.
Para mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se modifica por el
crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos periódicos en
medio fresco. Conlleva a que el organismo de interés sea el dominante de
la población, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio sólido, considerando en este caso el efecto del medio sobre la velocidad específica
de crecimiento (µ). Para este procedimiento la selección de un organismo
depende del valor de (µ) comparado con los de los otros organismos. El
dominante de la población será el que posea el mayor valor de (µ) para las
condiciones de cultivo empleadas. Sin embargo, no necesariamente será
más útil un organismo de (µ) más alto; puede ser deseable uno con mayor
afinidad por el sustrato.
La problemática de selección puede ser superada empleando el sistema
de cultivo continuo, donde la fuerza de selección se mantiene en un nivel
constante y el organismo dominante será seleccionado por su afinidad por
el sustrato, más que por su (µ) máxima.
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Capítulo 3
Actividad 1
a) Hacer una Figura que muestre un modelo de competición entre dos organismos capaces de crecer en un
cultivo continuo enriquecido.
Práctica
b) Indica tres aspectos importantes que se deban tomar en cuenta para la conservación de cepas de uso
industrial: ___________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________.
C
C
c) ¿Cómo pueden conocerse las características de un
cultivo para aplicación industrial?
____________________________________________________
____________________________________________________
27,06
/ M 100 / Y 100 / N 27,84
____________________________________________________
____________________________________________________
19,61
/ M 10,98 / Y 19,61 / N 0
____________________________________________________
_______________________.
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
194
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Unidad 2 Desarrollo de las fermentaciones
2.1 RAP Identifica los requerimientos y procesos para el desarrollo
de las fermentaciones en la industria
La preparación de medios para el desarrollo de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios
constituyen los efectores externos de naturaleza química
que desempeñan un rol esencial en los procesos, ya que
deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y
de formación de productos y además suministrar energía
para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento
Preparación de medios de cultivo
celular. Los microorganismos suelen variar considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar; es posible efectuar la
distinción de las siguientes categorías de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro, que están representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca,
Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos
por litro y
c) Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por componentes
orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función
metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no
saturados, etc.
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los componentes, en:
1) Medios sintéticos o medios químicamente definidos, y
2) Medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal
o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja,
etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son químicamente indefinidas y de composición variable.
195
Capítulo 3
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer
lugar el diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los
mismos.
2.1.1 Diseño
Sistema de alimentación por lote
Tiene como finalidad, en un medio de fermentación la elección de
los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso por desarrollar. Se
deben tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con
el microorganismo, el proceso y los sustratos para ser empleados
como son los requerimientos nutricionales del microorganismo
y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los
componentes y consideraciones sobre las materias primas. También importantes son los que se refieren a todos los procesos y
operaciones previas y posteriores a la etapa de fermentación y al
conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de algunos productos, como es el caso de la importancia
del anión P04.
2.1.2 Requerimientos nutricionales
Están determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrófico, que
corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del C02 como las
algas y algunas bacterias, y los heterotróficos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono. Otro factor esencial son las condiciones del
cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 02 es uno de los oxidantes más comunes
en el metabolismo energético. En la ausencia del 02, el N03 o S04 son utilizados
como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias metanogénicas son auxótrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el C02 a CH4 y
obtener energía. Algunas protistas obtienen su energía, en condiciones anaerobias por reacción de óxido-reducción realizadas sobre compuestos orgánicos.
Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de energía.
Otro, está constituido por las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza
inorgánica u orgánica. El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas,
ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Para la síntesis de proteína se
requieren en general L-aminoácidos, aunque también son necesarios algunos
aminoácidos de la serie D como D-alanina y D-aspártico para su
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Capítulo 3
incorporación a la pared de la células. En algunos casos se requieren también
péptidos de histidina.
En el caso de macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de
HP04 y S04 (o aminoácidos azufrados). El fósforo se incorpora en ácidos nucleicos,
y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados,
y además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.
Por otro, lado el del K y Mg son también esenciales. Una parte importante del primero está unida al RNA, de manera que los requerimientos de K aumentan con los
factores que influyen en el aumento del RNA de las células, como la velocidad de
crecimiento. El ión K actúa como coenzima y probablemente actúa como catión en
la estructura aniónica de varios componentes celulares. El ión Mg es esencial para
la estabilidad de los ribosomas y actúa como cofactor en numerosas reacciones del
metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales
como fosfato y sulfato.
Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorías:
Elementos esenciales para el crecimiento
Elementos esenciales para el
crecimiento
Ca
Mn
Fe
Co
Cu
Zn
Oligoelementos esenciales para el crecimiento
Ba,
Na
Al
Si
Cl
V
Cr
Ni,
As
Se
Mo
Sn
I
En ocasiones es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente
está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los
requerimientos de estos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha
estado sujeto a “stress”, como por ejemplo, por aumento de temperatura por encima de un
valor óptimo.
De factores de crecimiento los requerimientos comprenden ciertos aminoácidos y vitaminas
del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido pantotético, niacina, etc., que representan para
muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce
crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de coenzimas. Otros
factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, etc.
197
Capítulo 3
Streptomyces Aureofaciens
En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, aparte de los nutrientes
requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos específicos del proceso
considerado. En el caso de los precursores que
constituyen la base de una molécula que debe ser
sintetizada por el microorganismo, como el ácido
fenil acético para la penicilina. Otro ejemplo es
Bordetella Pertussis
el agregado de ciclo dextrinas en procesos de
producción de Bordetella pertussis que puede actuar como complejante de inhibidores de
crecimiento celular.
El agregado de cloruros o bromuros en el caso de algunos
Producción de estreptomicina a partir
antibióticos como cloro y bromotetraciclinas, tetraciclidas
de Streptomyces griseus con agregado
producidas por el Streptomyces aureofaciens, responde
de mánanos y barbitúricos cultivada en
también a requerimientos específicos para inhibir la sínteuna caja de Petri
sis de productos no deseados, como ocurre también con
el agregado de mananos y barbitúricos en la producción
de estreptomicina por S. griseus. El agregado de sulfato,
en el proceso de fermentación alcohólica, que favorece la
formación de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento
específico. El diseño adecuado tiene que ver con las características bioquímicas propias y evolución de los parámetros
de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracterizado por
un descenso continuo de pH, debido al uso de una sal de
amonio como fuente de nitrógeno, obliga a considerar en su diseño algún agregado que no
corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del mismo. Son
efectuados por agregados al medio de agentes “buffer”
como mezclas de fosfatos o de carbonato de calcio o como Streptomyces Aureofaciens
más generalmente se hace, con agregados periódicos de
soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma más
conveniente mediante un control automático de pH. En un
medio específico el diseño para la producción de ácido
cítrico debe considerar la influencia negativa que para el
proceso tiene un exceso de hierro en su composición; por
lo tanto, dicho medio debe diseñarse de manera tal que su
preparación (a partir de diversas materias primas) considere una eliminación total del hierro y posterior agregado
del mismo en cantidades controladas.
198
Capítulo 3
2.1.3 Disponibilidad de los componentes
Independientemente de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes
deben estar disponibles para ser usados por la célula.
Es necesario mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metálicos cuya concentración es modificada por quelación, ya que muchos
constituyentes del medio y productos del metabolismo actúan como agentes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminoácidos, hidroxiácidos,
hidróxidos, y los aniones P04 y C03
Con el objeto de controlar su concentración y prevenir
la precipitación de los iones metálicos, es necesario o
esencial quelar el ion mediante algún agente quelante
agregado, como el EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético).
En medios complejos de uso industrial la situación es
aún más complicada, ya que existe una gran variedad
de sustancias orgánicas, las cuales pueden quelar,
secuestrar o absorber iones metálicos reduciendo la
concentración iónica disponible. Por ejemplo: aminoácidos, proteínas, ácidos orgánicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales. En el caso de material
insoluble presente en el medio de cultivo va a tener
una determinada capacidad de unión a elementos metálicos disminuyendo su concentración efectiva, como
ocurre también con los aminoácidos y proteínas que
Agente Quelante EDTA y los Aminopolitienen los grupos reactivos R-COO - , RHN- , RS- , O,
carboxilatos en la fermentación
que son los más importantes. La dinámica de formación del complejo está determinada por la constante
de equilibrio de formación del complejo metal- ligando, y por la velocidad
a la cual el equilibrio es obtenido. La constante de equilibrio para la formación del complejo del ión metálico (M) con el ligando (L) se expresa
de la siguiente forma:
[M L]
_________
K=
[M] [L]
199
Capítulo 3
Entonces las cargas del catión y ligando están omitidas. El valor de K es
prácticamente independiente de la naturaleza del ligando, que depende particularmente del ion metálico. Se puede hacer una lista de términos de valores
decrecientes de la constante de equilibrio como sigue:
Fe+3 > Pb+2 > Cu+2+ > Ni+2 > Co+3 > Zn+2 > Co+2 > Cd+2 > Fe+2 > Mn+2
> Mg+2> Ca+2 > Sr+2 > Ba+2> Na+1> K+1> y de la cual se puede deducir, por
ejemplo, que el ion Cu+2 estará fundamentalmente como complejo mientras que
Ca+2, Na+1 y K+1 estarán en forma de iones metálicos libres.
Por otro lado la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio tiene también una
serie de orden decreciente de velocidades de acuerdo al ion:
Sr+2 > Ca+2 > Zn+2 >Mn+2 > Fe+2> Co+2> Mg+2> Ni+2.
De ambas consideraciones surge por ejemplo que cuando se alcanza el equilibrio
el ion Ca +2 estará casi siempre libre para ser utilizado y si está complejado
se hará rápidamente disponible; en cambio, el Mg+2 estará generalmente libre,
pero si está complejado se hará disponible muy lentamente. En la misma forma
se puede deducir que el Co+2 estará fundamentalmente en forma complejada
siendo disponible además a muy baja velocidad. Por esa razón ese elemento es
potencialmente limitante.
Concluyendo, es importante tener en cuenta la naturaleza de los compuestos
orgánicos que tienen capacidad para actuar como ligandos y sobre todo el ion
metálico considerado, ya que la concentración libre de éste es lo que interesa.
2.1.4 Materias primas fundamentales
De los componentes empleados en las industrias de fermentación, es importante
considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad
y la estabilidad en su composición química. Si tenemos en cuenta que el costo
de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho
productos obtenidos por fermentación, se hace prioritario disminuir el costo
de los medios. Las materias primas más importantes corresponden a fuentes
de carbono y de nitrógeno.
Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hidratos de carbono como glucosa o
dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina; 2) Alcoholes como el glicerol y
manitol; y 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.
200
Capítulo 3
Son muy importantes también por su
disponibilidad y costo reducido otras materias
primas que contienen hidratos de carbono como
granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc.
También se pueden emplear otros subproductos
o efluentes de industrias que por su contenido
en fuentes de carbono son interesantes
para algunos procesos como las vinazas de
destilería, alpechín y residuos sulfíticos, que son
sin embargo solamente útiles para procesos de
producción de biomasa destinados al consumo
animal, ya que si bien contienen hidratos de
carbono y otras fuentes de carbono asimilables
por los microorganismos, también contienen
muchas impurezas que impiden su utilización
en otros procesos por las dificultades y costo
elevado que presentan las operaciones de
separación y purificación de los productos.
extracción acuosa y concentración posterior
variando su tipo de acuerdo con la calidad
de carne, tiempo de extracción y temperatura
de la misma.
3) Extracto de levadura, que es disponible
en forma de pasta o polvo, y puede ser
obtenida mediante autólisis o plasmólisis de
la levadura, es básicamente una mezcla de
aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en
H2O y carbohidratos.
4) Extracto de malta, que es el extracto
soluble en H2O de la malta de la cebada y
5) “Cornsteep”, el agua de maceración de la
industria del maíz tiene mucha importancia
por su utilización como componente esencial
de los medios para la producción de varios
antibióticos y enzimas.
Las fuentes de nitrógeno de naturaleza inorgánica
más comunes como el amoníaco o las sales de También es importante la correcta elección de
amonio. Las orgánicas están representadas por una determinada fuente cuando se presentan
varios productos, como:
varias alternativas posibles, considerándose
los costos, la disponibilidad y el problema de
1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) impurezas que puede acompañar a las distintas
que son obtenidas por hidrólisis ácida o materias primas utilizadas.
enzimática de distintas fuentes proteicas
como carne de diferentes órganos y animales, 2.1.5Formulación
pescado, caseína, gelatina, harina de soja,
algodón, girasol, etc.. Mediante ajuste de la Ésta tiene que ver con los aspectos cuantitativos
relación enzima-sustrato y variando tiempo de los medios, es decir, debe establecer las
de hidrólisis es posible variar el tamaño concentraciones de cada componente para ser
de la cadena de polipéptidos. Aparte de utilizadas. Una aproximación con respecto a las
su función como fuente nitrogenada, las cantidades por utilizar de las diversas fuentes
peptonas aportan algunas vitaminas y sales lo da el conocimiento de la composición de
inorgánicas como fosfatos y suministran biomasa del microorganismo al ser empleado.
también algunos micronutrientes como Ca, Una composición elemental y típica de la biomasa
Zn, Fe y Cu.
es (en porciento de peso seco): Carbono,
2) Extracto de carne, que se obtiene por
201
Capítulo 3
46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%. Es decir,
que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos promover las distintas fuentes que aseguren
como mínimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados.
Por el conocimiento de la estequiometría de crecimiento y de formación
del producto, es posible formular adecuadamente un medio. En general
puedes escribir para cualquier proceso de fermentación:
Fuente de C + fuente de N + 0 2 + minerales + nutrientes específicos
biomasa + productos + C02 + H20.
De la misma forma se pueden establecer balances de materia para otras
reacciones que incluyan productos y deducir de las mismas la cantidad de
biomasa y productos que se pueden obtener a partir de una determinada
cantidad de fuentes de carbono y de nitrógeno. Las otras fuentes de elementos menores y factores no son necesarias de incluir en las ecuaciones.
Con
este
criterio
podemos
establecer
entonces que para obtener una determinada
concentración de biomasa, por ejemplo 30
gl -1 , debemos formular el medio como
mínimo con 60 gl -1 de fuentes de carbono
asimilable, que es en el caso anterior la
sacarosa. Con respecto a las fuentes de
nitrógeno, ésta debe estar en concentración
tal, como para satisfacer la ecuación anterior,
que es 0.61 moles de NH3 o sea 10.37 g de
amoníaco, lo que representa 8.54 g de N2.
Ya tenemos por lo tanto, la cantidad de la
otra fuente fundamental para ser agregada. El
conocimiento de la composición centesimal de
otros componentes menores puede establecer
así las cantidades por agregar.
vitaminas del grupo B como la biotina, tiamina,
ácido pantoténico, etc. Esas vitaminas deben
estar por lo tanto presentes en el medio. Como
el proceso de producción de levadura es un
proceso industrial que interesa desarrollar con
costos de producción mínimos, es conveniente
estudiar las fuentes de carbono, nitrógeno y
de vitaminas y minerales más económicos y
disponibles que podamos encontrar. Surge así
la elección lógica de las melazas de caña de
azúcar o de remolacha que reúnen la mayor
parte de las condiciones. Del conocimiento
del efecto Crabtree y para evitar la formación
de alcohol y maximizar la producción de
biomasa surge la necesidad de implementar
una alimentación programada empleando
melaza como sustrato limitante, de lo cual
En este sentido, sabemos por otra parte que resulta la elección de un sistema de lotes
la levadura necesita para crecer algunas alimentado para la producción.
202
Capítulo 3
Al conocer los coeficientes de rendimiento para la formación de biomasa y
producto y los valores de la energía de mantenimiento será posible establecer
también los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular
un medio.
2.1.6Optimización
Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimización de los
medios de cultivo. Entre ellas podemos mencionar las siguientes:
1) No existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de
macro y microelementos para el cultivo del microorganismo determinado.
2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento.
3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de
los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.
4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto.
5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
La metodología más elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales
se varía la concentración del componente por ensayar, manteniéndose constante las concentraciones de los demás ingredientes. Para organismos aerobios
generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados. En este
caso, se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentración de biomasa obtenida.
Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace falta una
gran, cantidad de trabajo preliminar, ya que el operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante del crecimiento. Cuando son varios los posibles
nutrientes limitantes el método resulta poco práctico. Por otra parte, puede
ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentración de un componente
de los niveles de los otros, produzca interacción entre componentes. Se puede
mejorar mucho la optimización en un lote empleando técnicas estadísticas o
203
Capítulo 3
utilizando sistemas continuos con pulsos de componentes.
Utilizando cultivos continuos es posible obtener un cultivo limitado
por un sólo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento,
pudiéndose conocer por lo tanto el efecto que su variación ejerce
sobre el cultivo al mantenerse los demás componentes constantes.
2.1.7Esterilización
Esterilizador tipo Jané
Es conveniente, al tratar este tema, dar una definición clara del
término y de otros relacionados, ya que a veces suelen producirse
confusiones. Esterilización significa la eliminación de toda forma de
vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente
por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los
organismos por calor, productos químicos u otra vía.
Esta definición excluye por lo tanto
cualquier técnica que resulte solamente
en un daño a los microorganismos o
atenuación de la actividad de cualquier
tipo. La palabra desinfección se aplica a la
remoción o destrucción por cualquier vía
de organismos vivos que pueden causar
daño particular o infección. No significa
por lo tanto la destrucción de todos
los microorganismos, sino solamente
de aquellos que pueden producir un
resultado no deseado.
Autoclave para esterilizar alimentos y
otros productos
204
Un antiséptico es un desinfectante, o sea
un agente químico usado para destruir
microorganismos dañinos. Se utiliza en
general para agentes al ser aplicados en
animales o humanos.
Asepsia es la exclusión continuada de
microorganismos contaminantes. Así por ejemplo, el cultivo de
microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo asépticamente
como en muchas fermentaciones industriales. El medio de cultivo
es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado
con el cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se
mantiene en condiciones asépticas.
Capítulo 3
Pasteurización es el término aplicado al proceso que se
utiliza para la destrucción de algunos de los microorganismos
posiblemente presentes en materiales sensibles al calor
como la leche y cerveza. Consiste en calentar la leche,
por ejemplo a 62 °C, mantenerla a esta temperatura 30
minutos y después enfriarla lo más rápidamente posible.
Esta técnica no es de ninguna manera un procedimiento
de esterilización. Es solamente un método para destruir
organismos patógenos y al mismo tiempo disminuir el
nivel de aquellos organismos que más pueden deteriorar
la leche.
Pasteurizador en acero inoxidable
Pasteurizador de placas para la
industria de lácteos
Fundamentalmente para efectuar la esterilización en Microbiología Industrial es para evitar la competición por los
nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el cultivo
de microorganismos específicos que se utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos esperados en
biomasa y/o metabolitos específicos.
205
Capítulo 3
Métodos de esterilización
Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos:
a) Por destrucción total de microorganismos
b) Por muerte o inactivación; y
c) Por eliminación con medios físicos.
El proceso violento llamado destrucción total implica
calentamiento apreciable del material, como ocurre con
la aplicación de una llama, que es lo que hacemos en el
laboratorio cuando flameamos un ansa de platino o las
bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. Otra manera
de destruir contaminantes es con el uso de poderosos
agentes oxidantes. Por supuesto ésta metodología, aunque
es efectiva, está muy restringida en su empleo.
La muerte o inactivación implica la eliminación de
microorganismos sin que exista necesariamente
desintegración de las células. Se puede efectuar por
calentamiento, seco o húmedo, por radiaciones o por
agentes químicos. El calor húmedo, generalmente en forma
de vapor bajo presión, es muy útil y de gran valor en la
esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave,
o en la industria
206
Capítulo 3
Actividad 2
a)
Formular un medio para la producción
de biomasa de levadura de panificación. Considera la formación de 100
g de biomasa a partir de 200 g de
sacarosa.
Práctica
b)
¿Cómo se lleva a cabo la esterilización
de gases líquidos?
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
207
Capítulo 3
208
Capítulo 3
Unidad 3 Productos producidos por fermentación
3.1 RAP Conoce los productos producidos en la
industria a través de los procesos de fermentación
3.1.1 Diversidad de productos y su obtención
La gama de productos formados por los distintos tipos de microorganismos
es sumamente amplia, desde moléculas muy simples como el etanol hasta
las muy complejas, como pueden serlo una enzima o un antígeno.
Se pueden entonces clasificar los productos como:
1. Productos de bajo peso molecular. Estos incluyen a alcoholes, ácidos
carboxílicos, aminoácidos, nucleótidos, antibióticos, etc.
2. Productos de alto peso molecular, los que a su vez pueden dividirse en:
2.1. Componentes estructurales: Polisacáridos, proteínas, antígenos, etc.
2.2. Enzimas: Pudiendo ser éstas intra o extracelulares.
La industria química “compite con los microorganismos” tan sólo en
la obtención de algunos productos de bajo peso molecular, como por
ejemplo, el etanol o el butanol, siendo los demás de dominio exclusivo
de los microorganismos y, por otra parte, la única fuente disponible para
el hombre.
Cualquiera que sea el producto que se desee obtener, son varios los
aspectos que deben considerarse. Estos según Pirt, pueden resumirse
como:
I. Selección de una cepa microbiana apropiada.
II. Determinación de los valores óptimos de temperatura, pH, presión
osmótica.
209
Capítulo 3
En procesos aerobios, además, es de fundamental importancia conocer el
requerimiento de oxígeno a fin de poder satisfacerlo.
III. Determinación y optimización de los requerimientos nutricionales y de
la concentración de biomasa.
IV. Modificación del genoma tendiente para incrementar la formación del
producto deseado.
Figura 1. Diversos productos que se obtienen por fermentación.
210
Capítulo 3
La formación de biomasa y de un
producto son procesos contrapuestos
aunque el producto es una consecuencia
de la actividad de los microorganismos;
luego la presencia de éstos también
es importante.
Los productos de bajo peso molecular,
se pueden clasificar según la función
que cumplan dentro del metabolismo.
Se pueden distinguir así tres grupos:
I. Productos finales del metabolismo
energético. Son ejemplos de este
Favorecer el metabolismo energético, especialmente el de los
grupo el etanol, ácido láctico, acético,
ácidos grasos a nivel del ciclo de Krebs
butírico, butanol, y otros compuestos
asociados a procesos anaerobios. Su
formación es consecuencia directa de la degradación de la fuente de
carbono para obtener energía.
II. Productos intermedios de metabolismo primario. Pertenecen a este grupo
los aminoácidos, los nucleótidos, las vitaminas, los ácidos orgánicos, y
pueden incluirse también biopolímeros como enzimas.
III. Productos de metabolismo secundario. Pertenecen a este grupo los
antibióticos, las toxinas, los alcaloides y las giberelinas
La obtención de los productos finales del metabolismo energético consiste
en contar con una concentración celular elevada sometida a condiciones
tales que el mantenimiento sea grande, lo cual puede lograrse, aumentando
la tonicidad del medio y también modificando la temperatura. Existe otra
alternativa que consiste en limitar el cultivo en nitrógeno, de modo tal que
las células se vean impedidas de duplicarse al no poder sintetizar más
componentes estructurales, y la fuente de carbono se derive, principalmente
vía mantenimiento, hacia la formación del producto. Por ejemplo la
obtención del etanol por levadura puede dividirse en dos etapas: en la
primera el proceso es aerobio y el medio de cultivo contiene una relación
de fuente de carbono a fuente de nitrógeno apropiada para obtener un
buen crecimiento. La segunda etapa se realiza en condiciones anaerobias
y en un medio con escasa concentración de fuente de nitrógeno y elevada
concentración de fuente de carbono, la cual es convertida prácticamente
en un 90% en etanol y C02. En este caso la tolerancia de la levadura al
211
Capítulo 3
etanol es un aspecto importante por considerar.
Los procesos de obtención de los productos intermedios de metabolismo
primario son aerobios y la formación de estos productos ocurre
principalmente en organismos que han sido sometidos a mutaciones o
que se los hace crecer en medios deficientes. En cualquier caso, lo que
se pretende es lograr una regulación anormal del metabolismo tal, que la
fuente de carbono y energía se derive hacia la formación del producto
deseado. Por ejemplo, para la obtención de lisina se emplean cepas
de Corynebacteriuin glutamicum que carecen de la enzima Homoserina
deshidrogenasa, de este modo resulta ser auxotrofo para metionina y
Treonina. Además la enzima deshidroxipicolinato sintetasa no es inhibida
por lisina. Ésta conjuntamente con la treonina ejerce inhibición concentrada
sobre la Aspartatoquinasa de modo tal que aún en este mutante no se
acumulará lisina si en el medio de cultivo hay treonina libre.
La estrategia para obtener lisina consiste en realizar el cultivo en
condiciones tales que la concentración de treonina libre sea mínima, lo
cual se consigue alimentando el cultivo con este aminoácido y tratando
de mantener su concentración en valores muy pequeños. Así se evita la
inhibición concertada, con lo cual la lisina, al no ejercer retroinhibición
sobre la dihidroxipicolinato sintetasa, se acumula en el medio de cultivo.
En general, y a diferencia de los productos pertenecientes al primer grupo,
no existe una relación directa entre la generación de energía y la síntesis
de los productos de este grupo. Volviendo al ejemplo de la lisina, por
cada mol formado se forman cuatro de NADH y se consume uno de ATP,
por lo que la formación de lisina está asociada en una formación neta de
ATP si se tiene en cuenta el poder reductor acumulado.
La cinética de formación de estos productos es más compleja que los
del grupo I, y no existe hasta el momento ninguna expresión simple que
abarque a todos.
En los productos de metabolismo secundario, históricamente se han
considerado a los metabolitos secundarios como aquellos que no son
indispensables para las funciones vitales del microorganismo, a diferencia de
los metabolitos primarios, aunque tal afirmación se encuentre actualmente
en revisión. Cualquiera que sea el caso, existen algunas características que
diferencian a este grupo del anterior.
212
Capítulo 3
Frecuentemente los precursores específicos para la biosíntesis de estos
productos son obtenidos por modificación de metabolitos primarios. Así
muchos antibióticos contienen en su molécula aminoácidos infrecuentes
como D-aminoácidos, N-metil aminoácidos, B-aminoácidos o iminoácidos;
o azúcares modificados, bajo la forma de dimetil aminoazúcares.
Por otra parte, estos precursores suelen ser limitantes de la biosíntesis.
Por ejemplo la adición al medio de cultivo de ácido fenil acético estimula
la producción de Bencil penicilina, los ácidos a-aminobutírico y a,ydiaminobutírico son limitantes de la biosíntesis de colistina. En estos
casos, la supresión de los mecanismos de regulación de la síntesis de los
precursores puede resultar en un incremento en la producción.
La característica de algunas enzimas del metabolismo secundario no
poseen alta especificidad por el sustrato. Un ejemplo bien conocido es el
de la penicilina aciltransferasa del Penicillican chrysogenum, que cataliza
el intercambio del resto a-aminoadipil de la penicilina N (amino adipil
penicilina), por restos acídicos hidrofóbicos (ver Figura. 14). La enzima
es específica para uno de los sustratos, el ácido 6-amino-penicilánico,
mientras que es relativamente inespecífica para el precursor de la cadena
lateral, el cual debe poseer el grupo -CH2- COOH terminal para ser
incorporado.
Por último, la mayoría de los productos de este grupo comparten la
propiedad de formarse cuando los microorganismos crecen a bajos valores
de velocidad. Se cree que una de las causas sería el fenómeno conocido
como represión catabólica ya comentado, por el cual estaría reprimida la
biosíntesis de las enzimas asociadas al metabolismo secundario cuando el
crecimiento ocurre a valores de velocidad altos, mientras que dejaría de
reprimirse a valores de velocidad bajos.
Por años, se utilizó lactosa como fuente carbonada para la obtención de
penicilina porque daba mejores rendimientos que la glucosa. La diferencia
radicaba en que la lactosa era metabolizada lentamente por el hongo, y
la glucosa rápidamente.
Ésta última como fuente carbonada, pero suministrándola lentamente al
cultivo a fin de regular u a valores compatibles con la síntesis de penicilina.
En caso de los
productos del grupo III comparten con el anterior la
necesidad de un adecuado suministro de oxígeno para su formación.
Cuando este requisito no es satisfecho los rendimientos disminuyen.
213
Capítulo 3
Actividad es 3 y 4
Haz un esquema de la biosíntesis de la lisina, empleando cepas de Corynebacteriuin glutamicum
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
214
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Indica algunas fórmulas genéricas de las penicilinas que se usan más
frecuentemente en el mercado.
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Capítulo 3
Actividad 5
Indica ¿cómo es el proceso de obtención de la penicilina a partir del Penicillican
chrysogenum?
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Práctica
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C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
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C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
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217
Capítulo 3
Práctica 1
Equipo y material
- 1 litro de leche
- 3 cucharadas de yogur (entero
o descremado)
- 6 cucharadas de azúcar
- Termómetro
- Tiras para medir el pH.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
Procedimiento
1. Se colocan en un recipiente la leche con el azúcar.
C 44,71 / M 41,96 / Y2.100
/ N 16,86
Medir el pH y anotar.
C
C
3. Calentar (sin llegar a hervir) durante 5 minutos. Luego,
enfriar
69,02 / M 53,73 / Ydejar
34,51
/ Nhasta
10,2los 45°C aproximadamente y agregar
el resto de los ingredientes (yogur, gotas de vainilla).
Mezclar bien y colocar en un termo.
100 / M 90,98 / Y 32,55
/N
22,35
4. Dejar
reposar
durante 7 a 8 horas.
. Cumplidas las horas establecidas, se obtendrán 10
vasos de yogur.
6. Medir nuevamente el pH
7. Colocar de inmediato en la heladera.
La sesión tendrá una duración de cuatro horas, y se deberá tomar nota de todos los datos que se consideren
importantes e interesantes.
218
Capítulo 3
Cuestionario de la práctica
1) ¿Cuál será el objetivo de utilizar una cucharada de yogur en la elaboración casera de este producto? ¿Con qué etapa de la elaboración industrial se
podría comparar?
2) ¿Qué función cumplirá el azúcar adicionado a la leche?
3) ¿Qué diferencias se observan de pH durante la experiencia? ¿A qué se
deben?
4) ¿Por qué en esta experiencia no se realiza la etapa de calentamiento a
90°C, pero sí se incuba a 45°C?
219
Capítulo 3
220
Capítulo 3
Unidad 4 Organismos mutantes
4.1 RAP Conoce la variedad y posibilidades de las mutaciones
de los organismos y su utilidad en la industria
En general los organismos aislados de la naturaleza productores de metabolitos de interés industrial producen a los mismos en niveles muy bajos;
por lo tanto, se hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr
una mayor rentabilidad de los procesos.
Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimización del medio de cultivo y de las condiciones de operación, pero esto está limitado
por la capacidad de síntesis máxima del producto deseado que tiene el
organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento genético de la cepa.
En un organismo la productividad potencial es controlada por su genoma,
pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendimientos. La
forma de reexaminar un organismo modificado; son las condiciones del
cultivo para lograr nuevamente la máxima productividad. Entonces los programas de desarrollo involucran una continua modificación genética del
microorganismo, seguida por una readaptación del medio de cultivo a los
nuevos requerimientos, mejoras de las condiciones de operación y también
de los procesos de extracción y purificación.
La obtención de cepas modificadas genéticamente se puede realizar por:
1) Selección natural de variantes,
2) Mutación inducida, y
3) Recombinación genética.
221
Capítulo 3
4.1.1 Selección natural
Siempre se debe tener en cuenta que en cada división
celular hay una pequeña probabilidad de que ocurra
un cambio genético, por lo cual no es sorprendente
que en una gran masa celular la población sea heterogénea. Esta distribución puede presentar problemas
de rendimientos debido a que en general las variantes
tienen menores niveles de producción que la población
parental. Estas variaciones definitivas (mutaciones) se
deben distinguir de las variaciones fenotípicas que dependen de las condiciones ambientales y que tienen
lugar en todas las células de la población que expresan la misma modificación fisiológica, dentro de las variaciones permitidas por su genotipo. En las mutaciones
espontáneas el elemento responsable de la mutación
no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor
mutagénico se conoce) son estables y hereditarias y
tienen una frecuencia estadísticamente medible (tasa
de mutación).
La frecuencia de éstas últimas varía entre 10 -6 a 10
-9 mutaciones por genoma y por generación. Por lo
tanto si se considera un valor de 10 -7 se deberá estudiar un gran número de organismos (> 10 7 ) en la
búsqueda del tipo deseado.
En la selección de variantes naturales, una práctica
que todavía es utilizada se refiere a la observación
de las características morfológicas de las colonias, las
cuales, en manos de un operador avezado, se asocian
con mayor o menor productividad, lo que permite seleccionar y posteriormente estudiar los clones aislados.
Estas investigaciones involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos de evaluación del producto. Siendo más adecuado realizar las experiencias en
Erlenmeyers de hasta 500 ml, ya que si bien demanda
una considerable mano de obra, los resultados de en-
222
Capítulo 3
sayos en tubos o pequeños frascos son menos confiables.
A veces es posible el diseño de un procedimiento simple de “screening”
selectivo para un tipo particular de mutantes. Por ejemplo, células no mutadas que mueren en un plaqueo por selección de mutantes resistentes
a drogas, metales, etc. En estas condiciones se aíslan mutantes con un
esfuerzo mínimo aún de poblaciones donde la tasa de mutación es menor
a 1’000,000.
Cuando se comparan los aumentos en los rendimientos de cepas obtenidas por mutaciones naturales como las que resultan del empleo de un
agente tal como la luz ultravioleta, se observa, en general, que con agentes como el mencionado, los incrementos en productividad son superiores
y con una mayor tasa de mutación.
Las designaciones de las diversas partes que aparecen
en la ilustración muestran la
mutación del microorganismo, obtenida y adaptada por
el Grupo de Nanomáquinas
Protónicas (Protonic NanoMachine Group) de la Universidad de Osaka.
223
Capítulo 3
4.1.2 Mutación inducida
Transición inducida por
etilmetanosulfonato.
Este procedimiento es mediante
el empleo de un agente determinado que implica dos etapas, el
tratamiento de la población con el
mutágeno elegido y luego el aislamiento de los mutantes para su
posterior ensayo y selección. Empíricamente el empleo de diferentes
agentes resulta en el aislamiento
de distintos “espectros” de mutantes. La elección de un agente mutagénico depende en general
de consideraciones prácticas. En algunos de los casos es más
conveniente el empleo de más de uno en lugar del uso masivo
de uno solo. La técnica por emplear puede producir una alta
tasa de mutación o puede favorecer la separación de un número reducido de tipos deseables de un gran número de productores mediocres. Hasta donde sea posible el aislamiento del
mutante debería utilizar la característica mejorada del mismo
como factor de selección. El incremento de su productividad
podría ser el resultado de una modificación en los mecanismos
de control que limitan el nivel de producción y/o de una variación en los precursores que llevan al producto. Por lo que
el conocimiento de las rutas y mecanismos de control de la
biosíntesis de un producto facilitan la estrategia por seguir en
el aislamiento. En los programas de búsqueda y selección, es
importante tener una alta proporción de mutantes entre la población sobreviviente al tratamiento, debido a que sólo estos
individuos son los estudiados. Con el incremento de la dosis del
mutágeno en general se incrementa esta proporción, aunque
para cada mutágeno y cada organismo hay una dosis óptima.
Los agentes mutagénicos pueden ser agrupados en:
1) Físicos, como la luz ultravioleta, que es un mutágeno muy
conveniente. La longitud de onda puede variar de 200 a 300
nm y el tiempo de exposición entre 0.5 y 20 minutos, dependiendo de la sensibilidad del organismo y tratando de lograr
un porcentaje de muerte entre el 90 y 99.9%. Otros agentes
como rayos X y rayos V son actualmente poco utilizados.
224
Capítulo 3
4.1.3 Mutantes con niveles mejorados de metabolitos primarios
Representación esquemática de la síntesis de los meta-
Metabolitos primarios son aquellos esenciales para la vida de un microorganismo como
por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, ácidos orgánicos. Antes de considerar la selección de este tipo de mutantes,
es necesario conocer los mecanismos de
control involucrados en la biosíntesis de estos metabolitos. Las concentraciones de los
mismos están reguladas por sistemas de
control por retroalimentación “feed back”.
Los dos principales sistemas involucrados
son inhibición y represión “feed back”.
bolitos principales producidos por S. cerevisiae duran-
En el sistema de la inhibición, el producto
final de una vía metabólica inhibe la actividad de una enzima (normalmente la primera) de su vía de formación, cuando se ha
sobrepasado un valor máximo de concentración intracelular de dicho producto (caso de
biosíntesis de aminoácidos). La primera enzima de la vía es de tipo “alostérica”, lo que
significa que en este caso el producto final se une a ella en el centro regulador (no
compite con el sustrato por el centro activo, como en la llamada inhibición competitiva),
afectando la unión de la enzima al sustrato. Es un control fino y casi instantáneo.
te la fermentación alcohólica
En el sistema de la represión es aquel donde el producto final de una vía metabólica previene la
síntesis de una enzima o de todas las que catalizan la vía mencionada. Esto ocurre en el nivel
de ácido desoxirribonucleico (ADN), impidiendo la transcripción del gen a ácido ribonucleico
mensajero (ARNm). Este mecanismo es de acción más lenta que el anterior, ya que permite
actuar a las enzimas preformadas.
Los mecanismos de regulación son más complejos en caso de vías biosintéticas ramificadas
donde los productos de cada brazo son raramente requeridos por el organismo en igual proporción. Los procesos de control de estos son los siguientes:
a) isoenzimas
b) concertado o multivalente
c) cooperativo
d) acumulativo
e) secuencial.
225
Capítulo 3
debido a que los esporos germinados por su mayor
tamaño son retenidos en el filtro.
Los mutantes auxotróficos se utilizan para producir
grandes cantidades de muchas sustancias de interés,
los mismos no son adecuados para la obtención de
productos que controlan independientemente su síntesis. Un caso típico es el que figura a continuación,
donde se sintetiza un producto P.
Las letras minúsculas indican las enzimas que intervienen en el proceso. En este caso si P es el producto
requerido, no es apropiado tener un auxótrofo. La solución es modificar el organismo de tal forma que la
primera enzima (a) no reconozca la presencia de niveles inhibidores de P. El aislamiento de tales mutantes
se puede alcanzar a partir de mutantes resistentes a
metabolitos análogos y/o de revertantes.
Cuando metabolitos análogos (compuestos similares a
otros en su estructura) han ampliado el rango de inhibidores, se obtienen mutantes resistentes.
En el aislamiento de este tipo de mutantes se puede
emplear la técnica de gradiente en placa, en la cual
existe una variación en la concentración del análogo
en un sentido de la placa, presentando la misma, zonas de escaso crecimiento por altos niveles del análogo tóxico desde donde es posible aislar los mutantes
resistentes, para posteriormente ser estudiados en relación con la producción de un producto P.
Existe posibilidad de mejorar los rendimientos de este
tipo de productos es el empleo de revertantes. En este
caso, un mutante auxotrófico para P (no produce la
enzima “a”) es sometido a una segunda mutación con
el objeto de obtener revertantes que elaboran el producto final en mayores niveles (la enzima “a” producida
no reconoce en control de P).
226
Capítulo 3
Mutantes resistentes a análogos de aminoácidos han sido empleados en
procesos de mejoramiento de cepas, para la obtención de antibióticos.
Uno de los mejores ejemplos de mutantes modificados en la permeabilidad es el caso de la fermentación de ácido glutámico. Se ha aislado
un mutante de Corynebacterium glutamicum, cuya permeabilidad puede
ser modificada por el nivel de biotina. O sea la permeabilidad celular es
controlada por la composición del medio de cultivo; en esta forma el
organismo puede excretar glutamato (50 g) con bajas concentraciones de
biotina (5 µg). Esto sugiere la posibilidad de modificar genéticamente la
permeabilidad celular para incrementar la productividad.
4.1.4 Mutantes productores de enzimas de interés industrial
Se toman en cuenta las enzimas degradativas, cuya producción puede ser controlada por inducción, represión
“feed back” y/o represión catabólica.
Cuando pretenden alterar los mecanismos de inductor
y aún en presencia de represores, a esto le llamamos
técnica de mutación. Éstas pueden tener lugar en un
gen regulador, eliminando la producción de un represor
activo, o si se producen en el operador, se podría evitar
la unión del represor. Cuando se producen enzimas inducibles en ausencia de inductor se denominan mutantes
constitutivos. Los mismos pueden ser aislados a partir de
un cultivo continuo en el cual el sustrato inductor esté en
concentraciones limitantes, lo cual favorece el desarrollo
de los mutantes constitutivos sobre la población inducible; empleando inductores débiles o utilizando ciclos con
y sin inductor, tratando de favorecer el enriquecimiento
en la población del mutante constitutivo, ya que al transferir a un medio con inductor, el tipo inducible requiere
un tiempo de inducción que no lo requiere el constitutivo.
Para la selección de mutantes resistentes a la represión
catabólica pueden aprovecharse las posibilidades del sistema continuo empleando un medio de cultivo con el
sustrato de la enzima y el represor catabólico. En estas
condiciones, el organismo capaz de emplear ambos sus
227
Capítulo 3
tratos tendría una ventaja competitiva y podría ser seleccionado a una determinada velocidad de dilución.
4.1.5 Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos secundarios
Las sustancias como los metabolitos secundarios no imprescindibles para las
funciones vitales, como por ejemplo alcaloides, toxinas, antibióticos, giberelinas, etc. La relación entre metabolito primario y secundario presenta todavía
numerosos interrogantes en relación con los mecanismos que controlan la
síntesis de estos últimos. En ciertas fermentaciones de antibióticos la velocidad
de crecimiento regula la formación de enzimas biosintéticas. En el caso de la
gramicidina S (GS), las GS sintetasas se forman en la última parte de la fase de
crecimiento exponencial. Las enzimas, después de alcanzar un pico en sus actividades específicas, desaparecen rápidamente al entrar la población en fase
estacionaria. Los estudios de este producto en cultivo continuo permitieron
establecer una
La glucosa y la fuente de nitrógeno (en especial amonio) si es rápidamente
metabolizada ejerce represión catabólica. Un ejemplo es la producción de cafalosporinas por Streptomyces clavuligerus, la cual es suprimida por amonio.
Debido a que la producción de estos metabolitos es afectada por mecanismos
de control genéticamente determinados, las mutaciones pueden tener efectos
importantes en el mejoramiento de cepas. Los programas iniciales en la industria de antibióticos inducían mutaciones sobre células o esporos mediante
el empleo de agentes físicos y químicos. Si uno repasa el caso típico de la
penicilina en el cual las primeras cepas de Penicill um chrysogenum producían
alrededor de 20 unidades por ml ,(20 U /ml), se observa que las técnicas de
mutación clásica han permitido obtener mutantes adecuados para la aplicación
posterior de técnicas más recientes como la fusión de protoplastos y las de
clonaje de genes.
En general, en un programa de mejoramiento, en que los saltos en la producción
al inicio del programa son importantes, después la selección de mutantes super
productores se vuelve cada vez más difícil. Con referencia a los estudios de
“screening” en placas, un factor importante es la composición del medio sólido
para lograr que la cepa pueda expresar toda su capacidad productora. En algunos casos las condiciones de limitaciones de nutrientes, que favorecen el
228
Capítulo 3
comienzo de la producción de antibióticos en medio líquido no son alcanzadas en medio sólido; sin embargo, esto se puede corregir suprimiendo
la principal fuente de carbono y reduciendo, por ejemplo, el contenido de
agua de macerado de maíz, como en el caso de penicilina.
Con base en la experiencia adquirida en el curso de los trabajos de
mutagénesis-selección, establecer una correlación entre los caracteres
fisiológicos o bioquímicos y la producción del microorganismo, en este
sentido pueden a veces intervenir en la selección en medios sólidos criterios morfológicos, pigmentación de colonias, resistencia al antibiótico
producido, etc.
4.1.6 Recombinación genética
Para la amejora de una cepa industrial empleando técnicas de mutagénesis selección conduce a la creación de líneas divergentes. Una forma más
lógica en tal programa de mejoramiento sería reagrupar las potencialidades de distintas variantes con el objeto de seleccionar la mejor combinación de genes responsables de codificar la producción de determinado
metabolito.
Los trabajos de Hopwood (1977) muestran que es posible lograr la recombinación genética, definiendo por tal a cualquier proceso que genere
nuevas combinaciones de genes los cuales estaban originalmente en individuos diferentes. Todos los procesos no meióticos en células vegetativas
que llevan a recombinación son llamados parasexuales y aparecen, tanto
en organismos procariotes como eucariotes.
Pueden intercambiar los virus material genético entre cepas heterogénicas
después de una infección mixta en el mismo huésped. El fenómeno de
recombinación en bacterias se observa en: 1) conjugación, en donde la
transferencia de material genético se realiza a través de pilis, teniendo
algunas características de un proceso sexual; 2) transducción, en el que
la transferencia de ADN de una célula a otra se realiza mediante una
partícula viral que actúa como vector; y 3) transformación, donde la recombinación puede ocurrir después de la inserción experimental de un
ADN aislado, a una bacteria receptora.
El material genético entre diferentes especies puede intercambiarse también alcanzando la fusión celular. En este caso, lo primero es la preparación de protoplastos, los cuales son células que han perdido su pared
celular externa y son limitadas solamente por su membrana, sometiendo
una suspensión celular a la acción de enzimas degradativas de la pared
229
Capítulo 3
(lisozima) en un medio isotónico, para minimizar la ruptura por efectos
osmóticos. Los protoplastos de los cultivos que se desea fusionar, son
mezclados y fusionados en presencia de un agente inductor (polietilenglicol 50%) y de dimetil sulfóxido en algunos casos, luego de lo cual se
siembran rápidamente en un medio completo para regenerar las células.
La incubación de protoplastos resulta en regeneración de la pared celular
y reversión a una célula de morfología normal, lo cual es una propiedad
crítica, ya que después de la fusión se desea recuperar un organismo, el
cual pueda ser cultivado normalmente en pequeña y gran escala. La fusión
celular es seguida por fusión nuclear.
La técnica de fusión celular se emplea en la obtención de hibridomas
que son células que se obtienen por fusión de linfocitos con células de
mieloma (cáncer de piel) de ratón u otro animal. Cada célula de hibridoma sintetiza una sola especie molecular de anticuerpo. El cultivo de este
tipo de células produce anticuerpos monoclonales, los cuales tienen una
enorme importancia en reactivos de diagnóstico, en la purificación de moléculas por su alta afinidad específica y como vectores de drogas u otros
reactivos para combatir tumores.
4.1.7 Obtención de nuevas cepas por ingeniería genética
La unión entre las técnicas bioquímicas (1970) para manipular el ADN in vitro
con las técnicas genéticas para transferir el ADN de una célula a otra, es la
nueva metodología resultante conocida con el nombre de ingeniería genética
que ha revolucionado el campo específico de la Biotecnología.
Por medio del procedimiento de clonado de ADN, genes de cualquier
tipo pueden ser tomados de su ambiente natural, analizados, alterados y
reinsertados en el mismo tipo de organismo o en otro diferente. Así que la
producción de solventes, productos químicos, hormonas, antígenos, enzimas
y otras sustancias de interés farmacológico puede realizarse en grandes
cantidades, a través del clonado de genes específicos en organismos que
pueden ser desarrollados en escala industrial. En una fermentación, su éxito
se da con base en el incremento del rendimiento de un producto; aumentar
su velocidad de formación, eliminar productos indeseables o la inhibición
por un producto final, se puede alcanzar, al menos en principio, mediante
el empleo de técnicas genéticas y estrategias que involucran metodología
de ADN recombinante in vitro. Esta metodología ha contribuído además al
conocimiento de las funciones del ADN, a la organización de los genes, a la
regulación de la expresión y a la estructura primaria de proteínas.
230
Capítulo 3
El principal aspecto del clonado es la propagación de un fragmento determinado
de ADN en una línea celular en crecimiento. Este fragmento, para poder
propagarse, debe ser unido a una molécula transportadora o vector, el cual
sí es capaz de multiplicarse en el huésped.
El clonado de genes ha sido gracias a una serie de descubrimientos
fundamentales. Como la puesta en evidencia de enzimas denominadas
endonucleasas de restricción, las cuales reconocen y cortan el ADN en sitios
bien definidos, generando fragmentos de distintos tamaños, determinados por
la distancia que separa cada sitio de restricción ubicado al azar sobre el
genoma.
Entonces es necesario hablar de distintos tipos de enzimas de restricción. Las
de tipo II, catalizan la ruptura de dobles hebras en sitios donde reconocen
secuencias de 4 o 6 bases de longitud. Se ha encontrado que los sitios de
reconocimiento se leen igual en ambas hebras de ADN. En algunos casos la
ruptura del ADN se produce en sitios opuestos de las dos hebras rindiendo
fragmentos romos (Hae III), mientras que en otras ocasiones la ruptura se
produce en forma de escalones, dejando extremos “cohesivos” (Eco RI). En
todos los casos la enzima hidroliza enlaces fosfo-diester en el lado 3’ dejando
extremos libres 3’ -OH y 5’ -fosfatos. Los extremos romos resultantes de
un corte pueden transformarse en cohesivos añadiendo a los extremos 3’,
nucleótidos (poli “A” a uno y poli “T” al otro) por acción de una transferasa
terminal.
Clononado de genes a través
de enzimas endonucleasas
restricción
231
de
Capítulo 3
Actividad es 6, 7 y 8
Hacer un esquema empleando dos técnicas de
selección al azar, de mutantes obtenidos después de un tratamiento.
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
232
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Uno de los avances fundamentales en la Ingeniería Genética fue el descubrimiento de
enzimas que pueden unir extremos libres de
hebras de ADN.
¿Cómo pueden ser ligadas moléculas separadas de ADN de doble hebra?
¿Qué se requiere para la transferencia y expresión de un ADN “extraño” en una célula
huésped?
233
Capítulo 3
234
Capítulo 3
Unidad 5 Métodos de conservación y preservación de cepas microbianas
5.1 RAP Conoce y maneja los métodos de conservación y
preservación de cepas microbianas
Los métodos de conservación y preservación de microorganismos, se llevan a
cabo por la importancia que tienen estos microorganismos para la sociedad;
se expone la importancia de los microorganismos para la sociedad, los objetivos de un buen método de preservación y los criterios por considerar para
la elección de la(s) técnica(s) más apropiada(s).
5.1.1 Métodos de elección o de conservación a largo, mediano y
corto plazo
Desde la antigüedad los microorganismos han sido empleados como materiales esenciales de trabajo en la obtención de medicamentos (antibióticos,
vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones.
El aumento en el uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la
protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos, de manera que las propiedades que los hacen importantes
permanezcan estables.
No es tarea fácil la preservación de cepas microbianas, ya que deben garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos, características
que coinciden con los objetivos de un buen método de conservación. El conocimiento de las peculiaridades de estas técnicas de preservación existentes
para su correcta aplicación, así como el seguimiento de las propiedades de
las cepas, propician su empleo como inóculo confiable en la industria, la docencia y la investigación.
Muy a menudo la elección de la técnica más adecuada para conservar cultivos microbianos resulta difícil, pues deben tomarse en consideración los criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos,
número
235
Capítulo 3
y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, así como
la frecuencia del uso de los cultivos.
El método que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos el
70 % de las células por un período considerable de tiempo, de forma tal
que la población sobreviviente se asemeje a la original como sea posible,
conserve las propiedades de importancia de los cultivos y minimice la
ocurrencia de los eventos genéticos. De igual manera debe reducir al
mínimo el riesgo de contaminación y permitir que la pureza del cultivo
permanezca inalterable.
En relación con el número y valor de los cultivos, debe considerarse
el tiempo para ser empledo por los curadores en la preservación
inicial, manipulación y control periódico de las cepas, el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia, al ser empleadas en su
mayoría como materiales de referencia en el aseguramiento de la calidad
microbiológica. Es recomendable entonces la selección de al menos 2
métodos de conservación que brinden seguridad y reduzcan los riesgos
de pérdida durante el almacenamiento.
En cuanto al costo de la conservación de cepas se incluyen los costos de personal,
equipos y su mantenimiento, materiales y facilidades generales (almacenamiento
y poder de abastecimiento). A esto se le suma la distribución, para la cual
se necesitarán réplicas conservadas y empaquetadas convenientemente que
permitan la llegada al lugar de destino en las mejores condiciones. Los
microorganismos son enviados por varios medios: correo aéreo, postal o a través
de las manos, de un laboratorio a otro dentro de un mismo país y con frecuencia
a través de las fronteras o continentes. Su distribución y manipulación está
regulada en el ámbito internacional y nacional,
y para su transportación es necesario el uso
del “triple” empaque para asegurar que todo
el personal involucrado en este proceso esté
protegido de la exposición a cualquier agente
contenido en el envase. Algunos cultivos son
empleados como cepas controles, cepas de
ensayo, cepas de producción industrial
236
Colocación de cajas Petri dentro de la estufa la cual se mantiene a temperatura constante
para el control de cepas donde
se ubican cepas de ensayo y
cepas de producción industrial.
Capítulo 3
y pueden ser utilizadas frecuentemente en un laboratorio. En estos casos,
la facilidad del recobrado y el riesgo de contaminación de los cultivos
necesitan ser considerados.
Se encuentran disponibles variadas técnicas para la conservación de
microorganismos y para eso debe considerarse lo recomendado por la
Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC, siglas en inglés), en
sus guías generales, la cual enuncia que por seguridad y para minimizar
la probabilidad de pérdida de las cepas, cada una debe ser mantenida
por al menos 2 procedimientos diferentes. En general, existen 3 categorías
en las que se agrupan los métodos de preservación, según el tiempo en
que permanecen viables las células conservadas, que son los métodos de
conservación a largo, mediano y corto plazos.
Una de las categorías es la congelación (a –70 °C y –196 °C) y la
liofilización como técnicas que minimizan al máximo el riesgo de cambio
genético en las células y las mantienen viables por 10 años o más,
ventajas que han condicionado su extensa utilización para conservar
disímiles materiales biológicos (cultivos de hongos, bacterias y levaduras,
algas, suero, células sanguíneas, entre otros) y que sean reconocidas
como técnicas de elección. Su costo es alto por los equipos que emplean
estos métodos, dificulta su implementación en muchas instituciones, las
que en ocasiones hacen uso del servicio de mantenimiento y conservación
mediante estos, los cuales brindan colecciones de cultivos reconocidas.
Las de mediano plazo, son las técnicas con las que se logran mantener
la viabilidad de los cultivos entre 2 y 5 años. En este grupo se destacan:
la desecación en diferentes soportes (arena, sílica gel, perlas de vidrio)
donde la paralización del crecimiento se produce por eliminación del agua
disponible), el almacenamiento en tierra, parafina líquida y la suspensión
en agua estéril (destilada o de mar), métodos bien documentados en
especial para los hongos.
En el caso de la resiembra periódica, ésta permite la supervivencia de
los cultivos en cortos períodos de tiempo, por eso se reconoce como
un método de conservación a corto plazo. En ésta transfiere el cultivo
del medio seco a uno fresco proporcionándole las condiciones óptimas
de crecimiento, lo que condiciona el elevado riesgo de contaminación y
variabilidad de las características de las cepas, las cuales constituyen sus
principales desventajas.
237
Capítulo 3
5.1.2 Métodos alternativos
Se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por
carecer de los equipos necesarios o porque la cepa microbiana no resiste los
tratamientos de la conservación por estos métodos. Se recomienda tener en
cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que es mejor
conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.
a). Conservación por transferencia periódica.
Se guarda la cepa microbiana en forma de cultivo activo en
el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas
células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo
tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del
metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento
y muerte celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro
tubo con medio de cultivo fresco. No es el mejor método
para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar
las células creciendo hay una alternancia de generaciones,
y al cabo del tiempo las células que se están guardando
serán descendientes lejanas de las células iniciales y es
posible que ya no conserven algunas de sus características.
Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el
envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras.
Se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo:
disminuyendo la cantidad de inóculo; rebajando la proporción
de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en
picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos,
ya que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido
y origina productos generalmente tóxicos; y almacenando los
cultivos a 4ºC - 8ºC. A veces también se suele recubrir el
crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con esto
se consigue también evitar en la medida de lo posible la
desecación del medio de cultivo, que podría ser tóxico para
las células al aumentar su concentración. Hay que tener en
cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por
ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden guardar en
tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente
que tiene la transferencia periódica es
238
Capítulo 3
que la contaminación de los cultivos resulta más fácil
al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo
y también por la posibilidad de entrada de ácaros en
los mismos.
b). Conservación por suspensión en agua destilada o
en agua de mar estéril.
Es un método alternativo y que da altos porcentajes
de viabilidad en diversos tipos de microorganismos,
tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas
bacterias. Aquí se suspenden en agua estéril unas
cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se
prepara en criotubos donde la concentración celular no
debe ser superior a 104 - 105 células/ml en el caso
de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos
que no esporulan, se pueden poner en suspensión
trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el
caso de microorganismos marinos, la suspensión se
hace en agua de mar diluida.
Los resultados obtenidos en la conservación de
microorganismos por este método muestran altos
porcentajes de viabilidad en períodos a veces superiores
a 5 años. La estabilidad para caracteres morfológicos
y fisiológicos es buena, pero no se ha comprobado
para caracteres específicos como la virulencia, el poder
fermentativo, etc.
239
Capítulo 3
Práctica 2
Determinar la influencia de la actividad del agua, pH y temperatura en el crecimiento de aspergillus penicillioides y a. Terreus aislados de la carne seca y
salada de atún listado (katsuwonus pelamis).
Para la realización de esta práctica se utilizan dos especies de hongos pertenecientes al género Aspergillus, identificados como A.penicillioides y A.terreus,
ambos mohos se escogieron por su predominancia y efecto de deterioro en la
carne seco-salada del atún listado (Katsuwonus pelamis), Para su aislamiento
se emplean como medio de cultivo el agar MEA (Malt Estract Agar, Merck) con
20% de sacarosa y NaCl (5%) y Potato Dextrosa Agar (PDA, Merck) acidificado
con 2 gotas de ácido tartárico al 10%. A todos los medios se les determina la
aw, empleándose un medidor del punto de rocío (Decagon, cx-2) previamente
calibrado con una batería de soluciones salinas saturadas.
de los
CIdentificación
27,06 / M 100
/ Y hongos
100 / N 27,84
Se efectúa a partir de cultivos puros, utilizándose como
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
medios Agar Czapek, Agar DG 18 (Dichloran 18% Glicerol
Agar, para especies xerofílicas) y PDA acidificado. Se realizan montajes
Para la
identificaC húmedos
44,71 / yMmicrocultivos.
41,96 / Y 100
/N
16,86
ción hasta el nivel de especie se deben considerar en forma
minuciosa las características macroscópicas de cada uno
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
de los hongos.
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
Conservación de las cepas aisladas
Las cepas de mohos aisladas se pueden resembrar en tubos de ensayos
con el medio PDA inclinado con adición de 20% de sacarosa y NaCl al 5%.
Se deben incubar a 25°/± 1°C hasta la
aparición de colonias bien formadas y
se conservan en refrigeración a 5°C ±
1°C hasta su posterior utilización.
240
Capítulo 3
En las siguientes figuras se tiene en A)
se tiene la colonia de aspergillus penicillioides, y en B) se tiene la morfología microscópica típica mostrando la
cabeza conidial columnar uniseriada
las demás figuras muestran cómo se
desarrolla el aspergillus penicillioides
en medios de cultivo en cajas Petri.
Aspergillus Penicillioides
241
Capítulo 3
5.1.3 Métodos restringidos
No son los más empleados, pero a los que es necesario recurrir para
conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten
bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los
géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los
cuatro métodos que vamos a citar se basan en la
paralización del crecimiento por eliminación del
agua disponible para las células.
a).-Desecación en papel de filtro.
Se usa un papel bastante absorbente
(Whatmann nº 3) que se impregna con una
solución muy densa de células y se deja
secar al aire (en condiciones estériles). Hay
posibilidad de desecarlos por el procedimiento
que se llama desecación líquida (L-Dry) porque
se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que
haya habido congelación previa de las células.
El vacío producido por el liofilizador deseca las
células, pero hay que evitar que un vacío excesivo
provoque evaporación brusca con ebullición o que la
temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelación
incontrolada de las células.
b).-Desecación en suelo, arena, sílica - gel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar.
Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante
bastante tiempo por este método.
c).-Desecación en bolitas de alginato.
. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación
del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y
posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en
agua, lo cual resulta ser bastante eficaz. Estas bolitas de alginato se pueden
conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC
y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajo contenido en
agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato.
Se está utilizando incluso para la conservación de algas y células vegetales.
242
Capítulo 3
d).-Desecación en cloruro de sodio de cristal grueso para halobacterias.
Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y
se dejan desecar espontáneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal,
la desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser
insuficiente el nivel de agua disponible.
5.1.4 Consideraciones generales en la conservación de cepas
Cualquiera que haya sido el método empleado en la conservación de las
cepas microbianas, cuando éstas se recuperan para hacer nuevos lotes
para su conservación o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar
directamente las células que se han estado guardando, porque éstas
vienen de una situación de estrés más o menos fuerte (sobre todo cuando
se han conservado por liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para
ningún tipo de prueba. Primero habría que revitalizarlas o rejuvenecerlas
sembrándolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure
lo más posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya
se puede trabajar con ellas, cultivándolas en medios selectivos cuando
sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme
diversidad microbiana, cada microorganismo soportará determinados
métodos de conservación mejor que otros, o será necesario tomar
precauciones especiales en su conservación. Como ya dijimos al comienzo,
no existe un método general de conservación de los microorganismos,
aunque no resulta difícil determinar el más aconsejable en cada caso. La
mayoría de microorganismos de interés sanitario pueden conservarse a
largo plazo con los métodos generales de congelación y/o liofilización, y
para períodos cortos pueden mantenerse vivos por alguno de los métodos
alternativos si se hace en las condiciones adecuadas y bien controlados
por un microbiólogo.
Por último, es frecuente encontrar que una técnica de preservación
resulte más efectiva para un grupo microbiano que para otro, lo que
indica que además de considerar los aspectos anteriores es necesario
revisar la literatura disponible sobre los microorganismos en cuestión y las
alternativas de mantenimiento utilizadas, y adecuarlas a la situación real
de la organización. Podemos entonces resaltar que no existe una técnica
universal para conservar adecuadamente todos los microorganismos.
243
Capítulo 3
Práctica 3
Comparación de dos métodos de conservación de cepas
Para llevar a cabo esta práctica se utilizarán cepas de las familias de Enterobacteriaceae y
Pseudomonadaceae para ser conservadas por los métodos de semistock en papel filtro y el método
stock de criopreservación. La eficacia de los métodos de preservación se realiza mediante la
evaluación de la viabilidad a las 24 horas de conservación y se calcula el porcentaje de recuperación.
En conclusión, la preservación en papel filtro y criopreservación son métodos adecuados; ya que el
73.7% de los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae y el 82.3% de los microorganismos
de la familia Pseudomonadaceae, presentaron un porcentaje de recuperación mayor al 50%.
Materiales y métodos
Primera etapa
asépticamente durante treinta minutos; posteSelección de los Microorganismos:
riormente se dispensan 0.5ml de la suspensión en
Las cepas microbianas se seleccionan de ban5 ml de caldo BHI y se incubaron a 37°C por 24 h.
co de cepas C
y genes,
el mé-/ N 27,84
En el caso de las cepas conservadas a -70°C, los
27,06conservadas
/ M 100 /por
Y 100
todo de criopreservación a -70°C, y a 4°C en viales se descongelan lentamente y se mantienen
condiciones de liofilización y papel filtro.
en baño de hielo, para tomar 0.1ml del cultivo e
19,61
/ M 10,98 / Y 19,61 inocularlo
/ N 0 en 5 ml de Caldo BHI, y luego se incuba
IdentificaciónCde
los microorganismos:
En esta primera etapa se efectúa una idena 37°C por 24 h.
tificación de los microorganismos del banco,
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
los cuales se estratifican según el método y
la temperatura de conservación. Debido a la
C 69,02
/M
/ Y 34,51
gran cantidad
de cepas
de 53,73
Escherichia
coli, / N 10,2
este género se debe separar de la familia Enterobacteriaceae para facilitar el análisis de
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
los resultados.
Segunda etapa
Muestra un camino con
Recuperación de los microorganismos:
Se lleva a cabo una recuperación de los microorganismos, teniendo en cuenta el esquema
propuesto por Espitia y Díaz. Para la recuperación de los microorganismos conservados a
4°C, los viales fueron rehidratados con 1.5 ml
de un caldo BHI (Brain Heat Infusión Oxoid Ò)
sus
244
ramificaciones
para
llegar a un destino Esquema de Espitia y Díaz (vías
pecuarias).
Capítulo 3
Tercera etapa
Con el fin de observar las características
macro y microscópicas, los cultivos se
siembran en Agar BHI, e incubados a
37°C por 24h. Para descartar posibles
contaminaciones se realizan repiques
sucesivos de la colonia característica.
Al cultivo puro se le debe realizar,
para la caracterización morfológica y
bioquímica, la prueba de la coloración
de Gram, pruebas bioquímicas y siembra
en Agar Mac Conkey (MERCK ®) en
el caso de las enterobacterias; y en
agar Cetrimide (Pseudomonas Cetrimide
Agar USP, OXOID ®), en el caso de
Pseudomonas.
Finalmente, se realizan repiques del
cultivo puro en Agar LB (Lurian Bertain:
triptona 10g/l, extracto de levadura
5g/l, NaCl 10g/l), para su posterior
conservación.
Cuarta etapa
Determinación
de
los
microorganismos por conservar:
Luego
de
aislados
los
microorganismos,
los
que
se
encuentran a 4°C y a -70°C, se
les determina la cantidad de
microorganismos
por
conservar.
En seguida, se clasifican las cepas
según los métodos de conservación
más adecuados y se establece la
conservación por el método Stock
de Criopreservación a -70°C y por
el método Semistock en papel filtro.
Quinta etapa
Conservación de los microorganismos:
La conservación por el método Semistock en papel filtro
se realiza, basada en el protocolo propuesto por Kirsop.
Este método mantiene la viabilidad de los microorganismos
trabajados (Enterobacterias y Pseudomonas) en un intervalo.
Para esta prueba se toman 4 viales de 2 ml por cada cepa
por conservar que corresponden a la viabilidad de 24 horas,
2 meses, 6 meses y un año; y se le adicionan a cada uno
15 discos de papel filtro Whatman N°4 de 5 mm, los cuales
se deben esterilizar a 121°C por 15 minutos.
Se lleva a cabo un cultivo en caldo BHI incubado a 37°C en
agitación a 200 rpm y con una densidad óptica de 0.4-0.5
leído en un espectrofotómetro (Spectronic 2000) a 600nm.
Se toman 0.1ml de cada uno de los cultivos y se agregan
a los viales, previamente preparados realizando una buena
homogenización y se almacenan a 4°C. La criopreservación
a .70°C se selecciona como método stock, debido a que a
diferencia de la liofilización, éste es un proceso rápido, con
baja contaminación, poco laborioso, económico y mantiene las
propiedades genéticas de los microorganismos que contienen
plásmidos. El proceso se realiza según lo propuesto por Frank
P. Se preparan cinco viales por cada cepa que corresponden
a la viabilidad de 24 horas, 6 meses, 1 año, 2 años y 5 años,
en los cuales se dispensa 0.8 ml de medio de preservación
recomendado por MacFaddin y Gherna
(Caldo Tripticasa
de Soya 3g, Glucosa 0.5g, Leche descremada en polvo 2g,
Agente crioprotector (Glicerol 10 ml), Agua destilada 990
ml; esterilizado a 10 libras de presión por 10 min); con
modificación en el agente crioprotector para E.coli, usando
Dimetilsulfóxido (DMSO), según lo recomendado por Sharp.
245
Capítulo 3
Posteriormente, de cada una de las cepas se realiza un
cultivo en caldo BHI incubado a 37°C con agitación de
200 rpm, hasta alcanzar una densidad óptica de 0.8 a 600
nm, leído en un espectrofotómetro (Spectronic 200); de este
cultivo se toman 0.8 ml que se suspenden en 0.8 ml del
medio de preservación previamente preparado en los viales,
realizándose luego una homogenización por vortex durante
10 seg. Finalmente, los viales se refrigeran a 4°C por 15
minutos para un periodo de equilibración e inmediatamente
congelados a -70°C.
Sexta etapa
Eficacia del método de conservación:
Con el objetivo de evaluar la eficacia
del método de conservación se debe
realizar un recuento inicial de cultivo
y un recuento a las 24 horas de conservación, con los cuales se calcula el
porcentaje.
En la siguiente figura se indica el porcentaje de recuperación y pérdida de los
microorganismos que están conservados a 4°C en papel filtro y liofilización.
Para la realización de esta práctica se requiere un acondicionamiento especial de los laboratorios
del plantel, disponer del Nitrógeno líquido y de equipo relativamente especializado. Si el plantel
no cuenta con estas condiciones, se puede acudir a alguna empresa de producción de cepas los
cuales en general son anuentes a ser visitados y a permitir que se realicen prácticas de conservación de cepas.
Microorganismos que se encontraban conservados 4°C y a –70°C.
246
Capítulo 3
Actividad es 9 y 10
Indica los métodos más importantes para la conservación de cepas microbianas.
Práctica
Indica los tres objetivos principales para una correcta conservación de cepas
de interés industrial.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
247
Capítulo 3
248
Capítulo 3
Unidad 6 Cinética de fermentación
6.1 RAP Identifica en procesos fermentativos los inóculos,
levaduras y enzima que aceleran estos procesos
La cinética de los procesos fermentativos es gobernada por diversos factores,
tales como la naturaleza de los inóculos, levaduras y la presencia de enzimas
que aceleran las fermentaciones.
Los inóculos se utilizan actualmente en el procesado de alimentos para
inducir diversos cambios en sus propiedades, tales como la modificación de
la textura, la conservación, el desarrollo de aromas o la mejora nutricional.
La utilización de estos cultivos debe tener en cuenta estos efectos, cumpliendo
a su vez con la exigencia de la automatización del proceso, calidad del
producto y reproducibilidad. Lo que lleva consigo la producción de cultivos
con una actividad definida en términos de viabilidad, eficacia y vida útil.
Las principales aplicaciones de los inóculos se encuentran en las industrias
de panadería y lechería, aunque también existen levaduras destinadas a la
fermentación de bebidas alcohólicas y a la producción de alcohol industrial.
El proceso de producción de estas últimas es similar al efectuado en la
manufactura de levaduras de panadería, que además se utilizan con frecuencia
en las fermentaciones alcohólicas.
Las levaduras Saccharomyce crevisiae, utilizadas en la elaboración del pan
degradan los azúcares a una mezcla de alcohol y de dióxido de carbono
gaseoso que queda retenido en la masa. Con la excreción de compuestos
como cisteína y glutatión que rompen los puentes disulfuro intramoleculares
y con la producción de gas, las levaduras actúan modificando química y
mecánicamente el gluten, que es la proteína mayoritaria del trigo.
249
Capítulo 3
6.1.1 Fermentaciones con levaduras
Aproximadamente el 96% de la fermentación del etanol se
lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyce crevisiae o
especies relacionadas; entre éstas S. Uvarum el etanol se
produce en la ruta Embden Meyerhof Parnas en la que el piruvato producido durante la glicosilizacion se convierte en
Acetaldehído y etanol la reacción global es la siguiente:
Glucosa + 2 ADP 2 Etanol + 2 CO2 + 2ATP
El rendimiento teórico de un gramo de glucosa es de 0.51
gr. de etanol y 0.49 gr. de CO2; sin embargo, en la práctica
aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en
biomasa y el rendimiento de etanol y CO2 alcanzan el 90%
del valor teórico.
La levadura incluye en su envoltura de la célula una
membrana plástica, un espacio periplásmico y una pared
celular constituida principalmente por polisacáridos y una
pequeña cantidad de péptidos.
La pared tiene una estructura semirígida permeable al
soluto que proporciona a las levaduras una considerable fuerza de compresión y de tensión. Los grupos
carbóxilos de los péptidos de la pared celular confieren a las levaduras utilizadas en la elaboración de
cerveza una capacidad de floculación importante, lo
que permite la separación sólido-líquido; después de la
fermentación se cree que la floculación se debe a la
formación de puentes salinos entre los iones calcio y
estos grupos carbóxilos de la pared celular.
La importación de la densidad celular es que nos ayuda a
lograr óptimos resultados en la fermentación, ya que nos
ayuda a predecir la cinética de crecimiento y por medio de
esto puedes determinar en cuanto tiempo podrás obtener
los metabolitos deseados.
250
Capítulo 3
6.1.2 Factores que afectan la velocidad de fermentación
Es bien conocido que existe un cierto número de factores que determinan si
una reacción se producirá o no, si será lenta o rápida, o si absorberá o liberará calor. Hay sin embargo otros factores que determinan la velocidad de la
reacción; estos son:
Temperatura:
Cuando temperatura aumenta, lógicamente, la energía cinética de las moléculas reaccionantes, con lo que habrá un mayor número de moléculas
con una energía igual o superior a la de activación. Esto se describe normalmente mediante una regla según la cual cada aumento en 10° C de
temperatura hace que se duplique la velocidad de la reacción. Sin embargo,
esto no quiere decir que la energía cinética de las moléculas se haya hecho el doble. Por supuesto, cuando se disminuye la temperatura ocurre lo
inverso.
Concentración y presión:
El aumento de la concentración de uno de los reactantes quiere decir que
habrá más moléculas presentes y que en esta forma aumentará el número
de colisiones. Por tanto, también se elevará el número de interacciones
favorables por unidad de tiempo.
Otra manera de enfocar el problema es considerando que aunque permanece
igual la proporción de moléculas que tienen la energía de activación requerida,
por existir más moléculas presentes al aumentar la concentración, hay un mayor número de ellas capaces de reaccionar.
Catálisis
En ciertos casos, como en el de las proteínas, pueden incrementar la velocidad
de las reacciones. Estos se le conocen con el nombre de catalizadores, y en el
caso de las proteínas se llaman enzimas. (Los compuestos que hacen disminuir
las velocidades de reacción se llaman inhibidores). Los catalizadores son capaces de alguna manera de reducir la energía de activación a un nivel inferior al
de la reacción no catalizada. Al ser incrementado el número de colisiones favorables entre las moléculas reaccionantes, es decir, favorecen la geometría
251
Capítulo 3
de colisión, en tal forma que sea mayor el número de choques efectivos. Ello se
convierte en una mayor facilidad de reacción con una menor energía de activación. Ambas reacciones, catalizadas o no, proceden al mismo tiempo.
Se creyó que el catalizador no intervenía en la reacción, pero ahora se sabe que
juega un papel importante y que en algunos casos resulta químicamente alterado
en la reacción, aunque no obstante se regenera antes de que la reacción se haya
completado. En la mayoría de los casos no se conoce el mecanismo de acción.
Por lo que hay reacciones como la de descomposición del ácido fórmico en agua
y monóxido de carbono, que están catalizadas por un ácido y que han sido estudiadas con cierto detalle.
Muy lentamente el ácido fórmico se descompondrá por sí mismo, pero si se añade ácido sulfúrico la solución burbujea violentamente gracias al gas desalojado.
La reacción transcurre en tres etapas. Primeramente se dona un protón desde el
ácido a la molécula del ácido fórmico dejando, en el caso del sulfúrico, un ión
sulfato de hidrógeno:
El ácido fórmico protonado es inestable y se rompe para formar agua y una molécula de HCO.
La molécula intermedia HCO es inestable y pierde un protón para formar monóxido de carbono. El protón es a continuación devuelto a la molécula de sulfato de
hidrógeno para originar el catalizador ácido sulfúrico original.
H+ + HS04 - H2SO4
Se puede observar que el catalizador sufrió un cambio químico al comienzo de la
reacción. Donó un protón al ácido fórmico, aunque éste fue devuelto de nuevo al
ión sulfato hidrógeno al final de la reacción.
En cada una de las etapas de la reacción tendrán su propia energía de activación,
pero ninguna será superior a la energía de activación de la reacción no catalizada.
Con las enzimas quimotripsina, lisozima (enzima presente en las lágrimas, clara de
huevo, y producida por algunos virus) y papaína, se sabe algo de su mecanismo
de acción, gracias a investigaciones recientes llevadas a cabo por bioquímicos y
cristalógrafos. Basándose en la actividad de las enzimas se pueden emplear test
sensibles para estudiar tejidos dañados, por ejemplo, para determinar la presencia
de sangre en laboratorios médicos forenses.
252
Capítulo 3
Catalizadores
El mecanismo que hace cambiar de una reacción química es el catalizador. En
presencia de éste la reacción avanza a través de etapas sucesivas más rápidas
y la constante de velocidad adquiere un valor más alto. En la ecuación de
Arrhenius se llega a la conclusión que la presencia de un catalizador tiene que
traer como resultado una reducción en la energía de activación porque de otra
manera no podría explicarse cómo puede aumentar el valor de la constante
de velocidad en comparación con la de la reacción no catalizada ya que en
la ecuación de Arrhenius a temperatura constante A, R y T son constantes,
de modo que la única forma de hacer que K aumente es que disminuya Ea.
Desde el punto de vista de la ecuación de Arrhenius, el efecto que produce un
catalizador consiste en reducir la energía de activación a la vez que aumenta,
tanto la fracción activada de moléculas como la velocidad de la reacción.
K = A exp (Ea/RT)
Sin embargo, los catalizadores afectan a la velocidad de una reacción, no
tienen influencia alguna sobre la posición de equilibrio de la reacción. Esto es
explicable si tenemos en cuenta que los catalizadores ejercen su acción sobre
ambas reacciones, la directa y la inversa. Así, la velocidad de la reacción en
su conjunto estará aumentada sin que se afecte la posición del equilibrio.
En el principio general un aumento de la temperatura modificará la posición
de equilibrio, de tal manera que el efecto que produzca ese aumento será
contrarrestado por el sistema.
Catálisis enzimática
La cinética química ha sido aplicada con gran éxito en el desarrollo de rápidos y
económicos métodos de producción de muchos materiales. Pero en años recientes
los investigadores en cinética química se han ocupado con creciente interés en el
estudio de las reacciones catalizadas por enzimas que ocurren en las células vivas;
éste es uno de los campos más fascinantes de la investigación química moderna. Las enzimas son polipéptidos gigantes cuyo peso molecular llega a 20.000 o
más. Cada fragmento peptídico lleva consigo un sustituyente orgánico o grupo R.
Cuando la enzima se pliega para formar su estructura terciaria, los grupos polares
R quedan sobresaliendo como puntas dentro del medio acuoso de la célula. Se
cree que el efecto catalítico de las enzimas se debe a la manera como se hallan
dispuestos tales grupos R sobre
253
Capítulo 3
zona de la superficie de la enzima plegada. El sustrato, o
sea la molécula pequeña sobre la cual actúa la enzima, se
adhiere a la superficie de la enzima por medio de enlaces
de hidrógeno que lo ligan a los grupos R.
La diferencia entre catalizadores y enzimas es la siguiente:
Catalizador: es un metal o elemento que actúa como
acelerador de una reacción química sin modificarse en el
transcurso de la misma. Son cuerpos que por su presencia
hacen variar la velocidad de una reacción. Mientras que las
Enzimas son proteínas que actúan como catalizadores.
Enzimas
Entre los diversos tipos de proteínas, las enzimas son las
que cumplen una función más específica: modifican la velocidad de las reacciones que se producen en un ser vivo,
en la gran mayoría de los casos, acelerándolas. De esta
manera estamos definiendo las enzimas como proteínas
que actúan como catalizadores.
Las enzimas facilitan el curso de las reacciones disminuyendo la energía de activación de modo tal que se pueden
producir simultáneamente y en un tiempo brevísimo la gran
cantidad de reacciones que posibilitan la vida.
Al cumplir su función, las enzimas no son alteradas por
las reacciones que promueven. La especificidad de una
enzima le permite distinguir con gran selectividad entre
diferentes sustancias y aún entre isómeros ópticos.
Algunas enzimas son proteínas simples constituidas
sólo por aminoácidos. Las hidrolasas, en general son
proteínas simples. Muchas están formadas por asociación de varias unidades o cadenas polipeptídicas.
Hay enzimas que sólo pueden realizar su función catalítica
en asociación con otra molécula no proteica, de tamaño
254
Capítulo 3
relativamente pequeño, a la cual se le denomina coenzima. La coenzima puede
estar firmemente unida a la enzima por uniones covalentes u otro tipo de enlace
fuerte, formando un complejo que no se separa fácilmente.
Entonces el catalizador es un cuerpo que puede producir aceleración o retardo
de una reacción química por presencia de una sustancia que permanece aparentemente intacta sin destruirse ni inactivarse en el proceso.
Algunas reacciones se aceleran bajo la influencia ejercida por algunas sustancias que al término del proceso resultan inalteradas. Estas sustancias se
denominan catalizadores y el efecto que producen es la catálisis.
Cuando actúan como catalizador negativo disminuyendo la velocidad del proceso, reciben el nombre de inhibidores.
1 No se altera la composición de los catalizadores en las reacciones químicas en que intervienen.
2. Pequeñas cantidades de catalizadores bastan para acelerar el proceso
de grandes cantidades de sustancias reaccionantes.
3. Los catalizadores sólo pueden modificar, disminuir o aumentar la velocidad de reacción, pero son incapaces de provocar una reacción.
4. Los catalizadores son específicos de la reacción de que se trate.
255
Capítulo 3
Actividad 11
Describe la metodología que permite contar bacterias en
cámara de Neubauer.
Práctica
Cámara de Neubauer
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
256
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
•Cámaras de recuento
DIN 12847
•Cajita individual con 2
cubre. Objetos de 0,4
mm.
Capítulo 3
Práctica 4
Estudio de la cinética de la fermentación in vitro y del residuo
no fermentado de un forraje consumido por vacas lecheras.
En la presente Práctica se utiliza la técnica in vitro de producción periódica de biogás, con el objeto
de estudiar la producción de este biogás y la fermentación de la materia seca, en muestras provenientes de un forraje disponible a ras de suelo consumido por vacas lecheras.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
La práctica se lleva a cabo en un biodigestor piloto, como lo muestra la
siguiente figura, en la cual se lleva a
cabo la fermentación anaeróbica del
sustrato, produciendo biogás que se
recolecta en recipientes herméticos de
plástico.
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
Biodigestor piloto para la
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86 producción de biogas
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100
/M
90,98
/ Y 32,55
/ N de
22,35
El experimento
se lleva
a cabo
tomando
muestras
forraje compuesta principalmente de gramíneas perennes (Lolium perenne), bajo un sistema de pastoreo continuo controlado, consumido por
vacas lecheras. La muestra se obtiene cortando y colectando el forraje inmediatamente adyacente
a aquel forraje consumido por el animal en pastoreo. Este proceso de selección del forraje se realiza
siguiendo a las vacas en los lugares de pastoreo. Las muestras compuestas deben secarse a 60° C
en una estufa con circulación de aire por 48 horas, y luego se muelen en un molino de cuchillos con
una criba de 1 mm. Las determinaciones se realizan en la materia seca (MS), proteína cruda (PC) y
cenizas totales (CT) (A.O.A.C. 1980), fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA), y
celulasa neutro detergente (CND), para determinar la energía metabolizable (EM).
257
Capítulo 3
Dos ovinos canulados ruminalmente pueden ser usados para suplir de líquido ruminal. Los animales
deben recibir una ración de heno de pradera permanente y un concentrado comercial (220 g PC/kg
MS y 13,2 MJ / kg MS) en una proporción aproximada de 3:1. Las raciones se calculan para lograr
un consumo diario de 1.0 a 1.5 veces el nivel de mantenimiento. A los alimentos se les deben dar
dos raciones iguales durante el día y disponer de libre acceso al agua.
La técnica de producción de biogás se realiza usando 1 g de sustrato (± 0.002 g) (base seca) por
tratamiento y en triplicado. Cada muestra se fermenta en forma independiente.
Preparación de las botellas: El medio se hierve y luego
se enfría permitiendo la gasificación con CO2. Se coloca
en botellas con capacidad de 125 ml, bajo continua gasificación con CO2. Una vez llenas, éstas deben sellarse con
tapas de goma y luego almacenarlas a 4° C por 60 horas.
Posteriormente, los sustratos a incubar se deben transferir
a las botellas que contengan el medio. Se les permite la
gasificación con CO2 y deben sellarse nuevamente con
tapón de goma, y ponerlas a incubar a 4° C por 10 horas,
para posteriormente pasar a temperatura de incubación
de 39° C.
La inoculación. El fluido ruminal se obtiene de dos ovejas
usando una bomba aspiradora y guardado en termos a
temperatura de 39° C. El líquido ruminal se filtra a través
de 4 capas de muselina y se almacena bajo una atmósfera
de CO2.
258
Capítulo 3
Inoculación de las botellas. Mientras el inóculo está
siendo preparado, las botellas cerradas se ajustan a la
presión atmosférica. Posteriormente, se inyectan 10 ml de
inóculo a cada botella mediante una jeringa. Luego las
botellas deben agitarse y devueltas a la estufa de incubación a 39° C, momento en que se considera el comienzo
del experimento (tiempo cero = 0). Las lecturas se llevan a
cabo a los siguientes tiempos, después del tiempo cero: 3,
6, 9, 12, 15, 21, 27, 33, 39, 48, 60, 72 y 96 h.
259
Capítulo 3
260
Capítulo 3
Unidad 7 Fermentadores industriales y procesos microbiológicos
7.1 RAP Conoce los fermentadores industriales, su función,
métodos y procesos implicados en los procesos microbiológicos
Fermentador industrial en acero inoxidable multifuncional para la
industria cervecera
7.1.1 Fermentadores y tipos de fermentaciones
Huelga decir que la fermentación es un proceso mediante el cual ocurren reacciones químicas debido a la presencia de microorganismos o enzimas de éstas. En
los procesos industriales, las fermentaciones se llevan a cabo en un reactor que
se conoce como fermentador. De la forma más general, se puede decir que un
fermentador, es aquél lugar donde ocurre la fermentación. Esta definición provee
para considerar un fermentador tanto aquel que está equipado con modernos
sistemas computadorizados de control de parámetros (tales como el pH y la temperatura), como un envase simple de yougurt donde se fermente este producto.
Los fermentadores pueden utilizarse en uno de tres modos comunes de operación.
El más común es el fermentador por lotes (batch), en el cual una
261
Capítulo 3
cantidad fija de materia prima se prepara y se introduce en el fermentador.
El fermentador se inocula
con el microorganismo seleccionado y el proceso de
fermentación ocurre durante un período de tiempo
específico.
Luego de terminada la fermentación, el
producto fermentado se extrae del mismo finalizando
el proceso.
Las fermentaciones por lotes se pueden
realizar generalmente en una de dos formas: con agitación y sin agitación.
por lotes
alimentación
alimentación y
por lotes
producción continua
Figura 5. Modos de fermentación.
262
El segundo modo de operación es conocido en inglés como
“fed-batch”. En estas fermentaciones se introduce parte
de la materia prima por procesarse al principio del proceso.
Se inocula la misma con el microorganismo seleccionado
comenzando el proceso de la fermentación. Posteriormente y utilizando un criterio preestablecido para la razón
de alimentación, el resto de la materia prima se añade
durante el tiempo de la fermentación. Dentro de esta
modalidad de fermentación existen dos tipos principales:
la incremental y la de volumen fijo. En la incremental, la
concentración de sustrato de la alimentación es igual o
mayor a la concentración que había en el fermentador al
comienzo del proceso. El volumen del medio dentro del
fermentador aumenta significativamente durante el proceso de alimentación y de ahí el nombre de fermentación
“incremental”. En las fermentaciones “fed-batch” de volumen fijo, la concentración de sustrato en la alimentación
es tan alta que no hay que añadir grandes cantidades de
ésta, lo que resulta que no ocurran cambios significativos
Capítulo 3
de volumen. En la fermentación “fed-batch” de volumen fijo, moléculas de
sustrato van ocupando los espacios vacios disponibles entre las moléculas de
soluto en la mezcla que se fermenta.
El tercer modo de fermentaciones es el modo continuo. En este modo
de operación, se opera el fermentador con una razón de alimentación de
sustrato de igual magnitud a la razón de extracción de producto, por lo
cual el volumen de operación del reactor se mantiene constante.
Esto
permite operar el fermentador por prolongados períodos de tiempo sin
la necesidad de preparar inóculos continuamente y eliminando repetidos
períodos de propagación de masa celular que consumen gran cantidad
de tiempo.
Existen fermentadores especialmente diseñados para operar de forma
continua, como lo son el fermentador de torre (tower fermentor) y el de
células inmovilidas. El fermentador de torre (ilustrado en la Figura No )
es un tubo que se extiende longitudinalmente hacia arriba y posee diámetros diferentes en algunas partes del cilindro.
El microorganismo por
utilizarse en este tipo de fermentadores debe ser capaz de sedimentar rápidamente. La alimentación en este tipo de fermentadores se realiza por
la parte inferior y el producto se extrae del tope del mismo. La diferencia en diámetros y una razón de alimentación adecuada permiten que el
microorganismo sedimente manteniéndose en la parte inferior del mismo.
Figura 6: Algunos tipos de fermentadores continuos.
El fermentador de células inmovilizadas es uno usualmente en forma tubular (ver la Figura No superior
derecha) con una matriz porosa en su interior, la cual
es tratada químicamente para que las células del microorganismo seleccionado se adhieran a las paredes
de los poros. Luego de permitir el crecimiento de las
células de microorganismo dentro de la matriz, la alimentación se introduce al reactor y la misma mantiene
contacto con las células de microorganismo mientras
ésta pasa a través de los poros.
La velocidad de la
alimentación debe ser adecuada para que el sustrato
mantenga suficientemente tiempo de contacto con las
células adheridas y reaccione totalmente.
263
Capítulo 3
Sistemas de control de temperatura, pH y otros parámetros
Los fermentadores pueden estar equipados con diversos mecanismos de
control que permiten mantener las condiciones adecuadas para que las
enzimas de los microorganismos operen en condiciones óptimas.
Los
parámetros comunes que usualmente se controlan en los fermentadores
son la temperatura, el pH y la razón de oxígeno disuelto. A continuación
se ilustra un sistema de control de temperatura típico de un fermentador.
Figura 7. Fermentador con control de temperatura
264
Capítulo 3
El fermentador está rodeado de una chaqueta que junto a un sistema de
mezclado permite una distribución de temperaturas similar en todas las
partes del líquido fermentándose. En este sistema, un sensor se utiliza
para medir la temperatura dentro del fermentador. La señal eléctrica es
recibida por una unidad de control que determina si la temperatura está
dentro de un rango adecuado o si la misma está más alta o más baja de
lo previsto. Dentro de unos parámetros establecidos para la desviación,
el controlador activará la válvula de vapor en caso de requerirse aumentar
la temperatura; si se requiere una disminución de temperatura, se activará
la válvula que permite el paso de agua fría; por último, en el caso en que
la temperatura se encuentre dentro del rango aceptable, tanto la válvula
de vapor como la de agua fría permanecerán cerradas.
De igual forma se ilustra a continuación un sistema de control de pH.
Observa que un sensor se utiliza para establecer la medida de pH.
La
señal eléctrica del sensor es recibida por el controlador que determina la
acción por seguir, según el valor de pH y el rango de operación de esta
variable de control. Si el pH es más bajo que el permitido en la lógica de
control, el controlador activará la bomba de base introduciendo un medio
alcalino que permita subir el pH. En el caso de que el pH sea más alto
de lo establecido en el criterio de control, se activará la bomba de ácido
y el pH bajará. En el caso de que el pH esté dentro del rango permitido,
ambas bombas permanecerán desactivadas.
Figura 8.
Fermentador con control de
pH.
265
Capítulo 3
Similar a lo establecido anteriormente funcionan otros sistemas de control.
Por ejemplo, en ocasiones es necesario que el fermentador tenga algún tipo
de sistema que controle la formación de espuma (antifoam control system).
Estos sistemas pueden ser mecánicos o pueden añadir algún compuesto químico (antiespumante) que disminuya la tensión superficial del medio en que
se fermenta, evitando la acumulación de espuma.
En el caso en que una fermentación sea aeróbica, se requiere un sistema de
control para el oxígeno disuelto. Los sistemas de control de oxígeno disuelto
tienen un sensor y un controlador al igual que otros sistemas de control. En
estos casos se establece una cantidad mínima de oxígeno disuelto, en la cual
se activarán elementos de control para aumentar la cantidad de oxígeno presente en el medio. Estos elementos pueden ser compresores o válvulas de
aire. También los sistemas de control de oxígeno disuelto pueden aumentar
la velocidad de agitación, causando turbulencia, lo que ayuda a exponer más
área de superficie del líquido al aire y así aumentar la transferencia de oxígeno
al medio.
Figura 9: Fermentador con control de oxígeno disuelto.
266
Capítulo 3
7.1.2 Etapas para llevar a cabo el diseño de un fermentador
1. Control de la entrada y salida
de microorganismos, nutrientes y
productos de la fermentación.
2. Control de los intercambios de
gases y energía.
3. Proporcionar un ambiente óptimo para el crecimiento del microorganismo o para el desarrollo del
proceso fermentativo.
4. Optimización del rendimiento del producto respecto al costo
energético y de los sustratos de
fermentación.
5. Facilitar la recuperación de los
productos de la fermentación (ya
sea en forma de biomasa o en el
medio de cultivo).
6. Los fermentadores industriales están generalmente diseñados
para procesos concretos.
Consideraciones especiales en el diseño y selección de un fermentador
Las siguientes consideraciones son de suma importancia al seleccionar o
diseñar fermentadores para procesos controlados:
1. El envase o contenedor en donde se realizará la fermentación debe
ser capaz de ser operado asépticamente durante el tiempo en que
la operación se realice.
Esto es de vital importancia en procesos
continuos.
2. La aeración (o ausencia de ésta) y la agitación deben realizarse
de forma que se cumplan con los requerimientos metabólicos del
microorganismo utilizado. El mezclado debe hacerse en tal forma que
los nutrientes estén uniformemente distribuidos en el fermentador sin
que esto conlleve daño físico al microorganismo.
El aire debe estar
filtrado para evitar la entrada de microorganismos en el polvo.
3. El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.
4. Un sistema de control de temperatura debe ser provisto prácticamente
en todas las operaciones controladas.
La temperatura es un factor
sumamente importante en todos los procesos de fermentación.
5. Un sistema de control de pH debe ser provisto en la gran mayoría de
las operaciones. En muchos casos, solo se requiere de un ajuste inicial
267
Capítulo 3
de pH. Sin embargo, en medios que no tengan efectos amortiguantes,
el control de pH es muy importante, en especial si pequeñas variaciones
de pH afectan adversamente al microorganismo.
6. El fermentador debe proveer algún tipo de sistema para un muestreo
eficiente y que no promueva la contaminación del proceso.
7. Las perdidas por evaporación deben ser mínimas.
8. El diseño del envase (o tanque) debe considerar un fácil manejo para
las operaciones de limpieza y mantenimiento. Las paredes del envase
(o tanque) deben ser pulidas, es decir, no deben tener porosidad que
dificulte la limpieza y sanitización.
9. Los materiales de construcción deben ser resistentes a los compuestos
que se generen durante el proceso y a la materia prima, sales, ácidos
o bases que se añadan.
7.1.3 Diseño
alimentarias
y
elección
del
sustrato
de
fermentaciones
1. Alimentos fermentados.
- Sustrato tradicional.
- Sustrato tradicional con correcciones (adición o purificación) para:
- Favorecer o garantizar el desarrollo de los microorganismos deseables.
- Mejorar o garantizar la calidad del producto, o crear nuevos productos
alimenticios.
268
Capítulo 3
2. Aditivos y enzimas.
- Proporcionar todos los elementos y la energía necesarios para el
crecimiento del microorganismo y la formación del producto.
- Evitar la presencia de sustancias inhibidoras del crecimiento o de la
síntesis del producto (incluidos algunos nutrientes).
- Extender en el tiempo la fase productiva de crecimiento (p.ej., cultivo
continuo).
- Favorecer la recuperación del producto al final del proceso.
- Evitar la formación de espuma.
- Reducir costos mediante el uso de subproductos (bagazo, suero de
quesería,...).
* El medio debe estar adaptado a cada fase del proceso (mantenimiento
de la cepa, preinóculo, escalado, producción,...).
Desarrollo del proceso de panificación mediante enzimas
269
Capítulo 3
Actividades 12 y 13
Haz una descripción de los criterios más importantes para el diseño de
un fermentador:
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Práctica
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C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
270
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
¿De qué están provistos principalmente los fermentadores industriales?
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271
Capítulo 3
Actividad 14
¿En qué consisten los biorreactores de enzimas o células inmovilizadas?
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Práctica
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C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
272
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Práctica 5
Exaltación de las propiedades aromáticas del mosto mediante el
uso de especies de levadura no-saccharomyces y sacharomyces
La meta de esta Práctica es verificar la hipótesis siguiente: la inoculación de una cepa
de levadura “exótica” y una cepa de levadura
Saccharomyces deben engendrar directamente
una mayor complejidad e intensidad en el perfil
sensorial de los vinos. Para validar esta hipótesis, se escoge estudiar la levadura “exótica”
de la especie Torulaspora delbrueckii, conocida
por ser una levadura inicialmente presente en
ciertos mostos que no presentan ningún defecto
organoléptico conocido.
Levadura saccharomyces
Las diversas inoculaciones deben realizarse en un mosto
de la variedad
grado
CMacabeo
27,06 /con
M un
100
/ Yalcohólico
100 / Npotencial
27,84
de 12.5 % v/v. La temperatura de fermentación debe ser
de 20°C. Las co-inoculaciones se examinan combinando
C 19,61de/laMespecie
10,98Torulaspora
/ Y 19,61delbrueckii
/N0
una cepa de levadura
con una cepa de la especie Saccharomyces cerevisiae
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
A densidad de 1060 kg/m³ se le adiciona nutrientes
específicos de levadura para inhibir el efecto de compeC 69,02en/ M
53,73
Y 34,51 / NEn10,2
tencia interespecífica
el caso
de /coinoculación.
la
inoculación secuencial, la adición de nutrientes se debe
dividir en dos momentos diferentes: a densidad 1070 y a Levadura saccharomyces
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
densidad 1060.
Realiza dos ensayos basados en la coinoculación y la inoculación secuencial de las levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces. En el caso de la coinoculación, ambas levaduras se inoculan
en el mismo momento, aunque en diferentes proporciones, 60 y 70 % de Torulospora delbrueckii;
compara los resultados con la misma fermentación realizada en pureza con solo Saccharomyces.
Mientras que en la inoculación secuencia, primero se adiciona al mosto la levadura no Saccharomyces y la Saccharomyces se inocula con una pérdida de 20 puntos de densidad, comparando
de nuevo los resultados con la fermentación en pureza de Saccharomyces.
273
Capítulo 3
Resultados de la co-inoculación de Saccharomyces/no-Saccharomyces:
Los análisis estándar del vino están resumidos en la Tabla 1, donde se puede
observar una caída significativa de la acidez volátil en los vinos sometidos a
co-inoculación.
Figura 10. Cinéticas de fermentación en
coinoculación.
Tabla 1. Análisis estándar de los vinos
Una vez acabada la fermentación, se deben analizar las concentraciones de los
principales ésteres que resulten de la fermentación de las levaduras: acetato de
isoamilo, hexanoato de etilo, octanato de etilo, decanato de etilo, butanato de
etilo y acetato de hexilo en los vinos obtenidos con los dos tipos de inoculación
y en el vino producido con sólo Saccharomyces cerevisiae (Figura No. 11). Para
determinar el número de unidades de olor de cada uno de los ésteres, se utiliza
el sistema del número de unidades de olor (NUO) .
NOU para cada éster = Concentración de cada éster / el valor de su umbral de percepción.
274
Capítulo 3
Figura 11. Perfiles del aroma químico de los
vinos, obtenidos mediante el análisis de
seis ésteres.
Una vez acabada la fermentación, se deben analizar las concentraciones de los
c Los otros ésteres no son modificados de forma perceptible comparados con
los de la fermentación sólo con Saccharomyces.
Para confirmar el perfil aromático obtenido con el análisis químico, los vinos
son sometidos a análisis organoléptico por un jurado de catadores entrenados en análisis sensorial. El jurado estuvo deliberadamente compuesto por 20
catadores no profesionales, que son por consiguiente más representativos de
consumidores normales de vino.
En todos los casos, el impacto de la nota amílica (acetato de isoamilo) resulta
ser extremadamente pronunciado, cubriendo la presencia de otros ésteres,
tanto en los vinos producidos con sólo Saccharomyces cerevisiae como en los
producidos con las cepas exóticas. Por lo tanto, el jurado no puede detectar
diferencias significativas entre los vinos que resultaron de las co-inoculaciones
y los vinos producidos con la fermentación de una sola cepa pura de levadura
Saccharomyces cerevisiae.
Los primeros resultados demuestran que la inoculación de diferentes especies
fue percibida como una manera de aumentar la intensidad de ciertas notas
aromáticas que ya eran predominantes, con riesgo de acentuar el desequilibrio
y por lo tanto, de debilitar la complejidad aromática de los vinos. El riesgo en
este caso, es el aumento potencial de acetato de isoamilo, que podría desequilibrar el aroma del vino si la concentración alcanzase niveles demasiado altos.
Así, la hipótesis que consiste en considerar que la co-inoculación con una cepa
“exótica” y una cepa de Saccharomyces engendra directamente complejidad e
intensidad en los perfiles sensoriales de los vinos, se podría confirmar en esta
práctica.
275
Capítulo 3
Actualmente se está evaluando esta experimentación con un enfoque diferente,
que aporta mayores limitaciones en términos de control, pero que sin embargo
tiene la posibilidad de dar lugar a vinos más armoniosos e intensos aromáticamente. Este enfoque consiste en reproducir la ecología del ambiente de la
fermentación alcohólica fomentando lo siguiente:
• El desarrollo de levaduras exóticas durante el primer tercio de la fermentación,
momento crucial para el equilibrio y la intensidad de los aromas en el vino.
• El desarrollo de levaduras Saccharomyces para garantizar una fermentación
más segura.
Tal inoculación secuencial evita crear competiciones entre las características
sensoriales y la cinética de fermentación de cada especie de levadura.
Resultados de la inoculación
secuencial de levaduras Saccharomyces/no-Saccharomyces
Bajo condiciones de fermentación
idénticas a las aplicadas en las experimentaciones de co-inoculación
y usando igualmente un mosto de
la variedad Macabeo, con un grado alcohólico potencial de 13.6%
vol., se debe reproducir la sucesión
de poblaciones de levadura exótica
y de Saccharomyces, como se observa en numerosos estudios sobre
ecología de las levaduras en sistemas fermentativos (Figura. 12). Los Figura 12. Cinética de fermentación en inoculación secuencial.
análisis estándar de los vinos producidos están resumidos en la Tabla 2, donde se han concentrados
datos típicos semejantes a los que
deben obtenerse en el desarrollo de
esta práctica.
276
Capítulo 3
Figura 13. Perfil aromático de los vinos del ensayo en comparación a datos medios
de vinos blancos comunes de la variedad Macabeo producidos en la zona.
277
Capítulo 3
Para visualizar mejor el efecto de la inoculación secuencial sobre los ésteres
(Figura No. 13), la concentración de cada uno de los ésteres presentes en el
vino producido con inoculaciones secuenciales se divide por la respectiva concentración del éster presente en el vino testigo (Figura No. 14).
El perfil aromático que resulta del desarrollo secuencial de Torulaspora delbrueckii y después de Saccharomyces muestra claramente una intensificación
uniforme de las concentraciones de los ésteres: cuatro de los seis ésteres
analizados presentan concentraciones superiores respecto a las obtenidas en
el vino producido con una fermentación de una cepa pura de Saccharomyces;
solamente en el caso del acetato de isoamilo, cuya elevada concentración
dominaba el perfil aromático del vino testigo (Figura No. 13), disminuyó su
concentración con la inoculación secuencial.
Figura 14. Efecto de la inoculación secuencial sobre la concentración de seis ésteres.
278
Capítulo 3
Los vinos que se elaboren deben someterse al jurado de catadores mediante
un análisis sensorial con una prueba de diferenciación y un análisis descriptivo. Se observan diferencias estadísticamente significativas, con un umbral
del 5%, entre los vinos producidos con inoculación secuencial (realizada con
la levadura Torulaspora delbrueckii y después con la levadura Saccharomyces
cerevisiae) y el vino testigo (producido con una cepa pura de Saccharomyces).
Al jurado se le debe pedir entonces realizar un análisis descriptivo. Los perfiles
sensoriales obtenidos muestran una intensificación de ciertos descriptores,
como “floral”, “fruta en almíbar” y “galleta de jengibre”, ayudados por un dulzor
más intenso en el paladar. Notas más comunes, como “manzana”, “plátano” o
incluso “picante” o “animal” (Figura No. 15) fueron menos presentes.
Figura 15. Comparación de perfiles sensoriales.
279
Capítulo 3
Conclusiones
En esta práctica deben analizarse los resultados que
se obtengan para
demuestrar que la sucesión de
predominancia de la población de levadura de la
especie Torulaspora delbrueckii y después de levadura
del género Saccharomyces permite un aumento
homogéneo del nivel de ésteres, compuestos esenciales
en los aromas fermentativos de los vinos.
Un estudio parecido al propuesto en esta práctica con
la cepa Torulaspora delbrueckii se realizó con una
cepa de levadura de la especie Cándida stellata. Se
obtuvieron resultados idénticos, reforzando la decisión
de desarrollar un instrumento innovador que reproduzca
la ecología del ambiente fermentativo espontáneo.
Además, para armonizar e intensificar la complejidad
aromática de los vinos, sería preferible la opción de una
inoculación secuencial con la levadura “exótica” y después
la levadura Saccharomyces, más que una inoculación
interespecífica combinada.
Esta práctica puede ser desarrollada en alguna instalación
piloto de la industria vinícola o cervecera para los casos en
que la institución no disponga del equipamiento necesario.
280
Capítulo 3
Termina la Unidad
281
Capítulo 3
282
Capítulo 3
Unidad 8 Procesos biológicos y su control de calidad
8.1 RAP Conoce los fermentadores industriales, su
función, métodos y procesos implicados en los procesos
microbiológicos
Las materias primas tradicionales están siendo complementadas con otras
muy abundantes basadas en recursos renovables y que hasta el presente
han sido poco o nada aprovechadas como sustratos en procesos de
fermentación, como es el caso de los residuos celulósicos, que pueden
ser materias primas de muy bajo costo para la producción de alcohol,
enzimas y otros productos. También se están ampliando los usos de
hidrocarburos como sustrato de procesos en la producción de ácido
cítrico y otros compuestos. La utilización de efluentes industriales de
varias agroindustrias como materias primas de costo cero o negativo
será sin duda ampliada en el futuro, pues ello representa además una
contribución a la eliminación parcial o total de residuos contaminantes.
Algunos pigmentos como los carotenos y las ficobilinas producidas por
algunas algas del género Dunaliella, Spirulina y Nostoc tienen también
un futuro promisorio. Se han mencionado también algunos herbicidas de
origen microbiano, que tienen igualmente perspectivas de ser desarrollados.
En varios casos la elección de la vía microbiana es obligada por razones
económicas, ya que aunque sea posible producir algunas moléculas por vía
química, desde el punto de vista económico esto no resulta rentable, como
sucede en el caso de los antibióticos, algunas vitaminas y aminoácidos.
Sin embargo, los procesos microbiológicos se presentan también como
alternativas válidas para el caso de moléculas sencillas como el etanol, el
butanol o el ácido láctico, con los cuales existe lógicamente la competencia
con los procesos que derivan de la petroquímica.
Estos casos están directamente relacionados con el costo del petróleo y
sus derivados.
283
Capítulo 3
El ejemplo del butanol es muy claro es ese sentido, ya que en los últimos
años se ha producido un renovado interés en su producción por fermentación
a partir de materias primas de bajo costo o de residuos, ya que en esta forma
se pueden desarrollar procesos que son competitivos con los derivados de la
petroquímica, cuando el valor del petróleo supera un determinado valor crítico.
En algunas transformaciones microbiológicas la alta especificidad permite la
posibilidad de efectuar reacciones que son imposibles de realizar por vía química, como ocurre en los diversos procesos de producción de compuestos
esteroidales. Este campo de aplicación se ha visto enriquecido últimamente, y
lo será sin duda mucho más en el futuro, por las grandes posibilidades que
ofrece ya la biocatálisis, que está siendo aplicada, no sólo en la fase acuosa,
sino también en presencia de solventes orgánicos para lo obtención de un gran
número de compuestos. Entre los sistemas de producción no tradicionales se
incluyen fundamentalmente los procesos en estado sólido y los que emplean
microorganismos inmovilizados.
En el primer caso es necesario el desarrollo de nuevos reactores y lograr la optimización de los mismos. Estos sistemas permiten prever la
producción comercial de nuevos productos como algunas enzimas. El uso
de reactores con microorganismos inmovilizados es otro campo de futuro
desarrollo de la Microbiología Industrial, que ya está siendo aplicado a la
producción de alcohol, algunos aminoácidos y otros compuestos.
La Microbiología Industrial ofrece también como se ha visto alternativas
interesantes y únicas para resolver problemas de contaminación ambiental, ya sea para el tratamiento convencional de residuos o para el aprovechamiento específico de algunos de ellos, por lo cual es de esperar
en el futuro nuevos avances en este campo vinculados a mejoras en el
control de los procesos en conjunto con adelantos en los conocimientos
básicos y diseño de nuevos reactores. Recientes desarrollos que están
siendo investigados y que sin duda tendrán mayor trascendencia en el
futuro en esta área están relacionados con el uso de microorganismos
para la eliminación de metales pesados y purificación de efluentes gaseosos. Finalmente las metodologías tecnológicas utilizadas en el desarrollo
de procesos de la Microbiología Industrial son ya de gran valor para otro
tipo de procesos biotecnológicos, como los que se realizan con células
animales y vegetales. En este último caso se suele emplear ya el término
fitofermentación para referirse a procesos realizados con cultivos de células en suspensión en biorreactores.
284
Capítulo 3
Dos procesos microbiológicos de fermentación revisten
importancias prácticas en la alimentación de animales
de la granja, que ocurren cuando se almacena o se
efectúan reservas de forrajes para uso posterior.
1. Ensilado: Consiste en el mejoramiento del valor nutritivo de los alimentos, sea fermentado el
alimento mismo o bien otros materiales que se
pueden emplear como aditivos para suplementar el
alimento original.
2. Mejoramiento del contenido de principios nutritivos mediante fermentación. La antigua práctica de
dar papilla a los cerdos era un proceso de fermentación continua.
En la actualidad se utilizan técnicas más sofisticadas
y mejor controladas de fermentación, entre ellas las
siguientes:
PROTEÍNAS AMINOÁCIDOS: Las levaduras que son
un producto de fermentación, presentarían las características más favorables como importante fuente de
proteínas, en comparación con todos los demás microorganismos. Además de su valor proteico, la levadura
depara otros beneficios importantes desde el punto de
vista nutricional, en particular por su contenido de vitaminas del complejo B.Muchas veces es ventajoso suplementar las raciones para el ganado con determinados
aminoácidos y con proteínas intactas. Así, es de notar
que en la actualidad se realizan fermentaciones en
escala comercial para producir lisina y ácido glutámico.
VITAMINAS: Cierto suplementos vitamínicos se obtienen mediante fermentación. Se desarrollan procesos
para sintetizar caroteno y vitamina A, Riboflavina y vitamina B12. Además, una multitud de microorganismos
elaboran vitaminas del complejo B.
285
Capítulo 3
ENZIMAS: Existen procesos microbiológicos para producir diversas enzimas
y la idea de mejorar la eficiencia digestiva de los animales agregando
enzimas apropiadas a la dieta es apasionante, pero el aparato digestivo
de los animales produce suficientes enzimas para obtener la digestión
máxima de almidones, grasas y proteínas.
En lo mencionado anteriormente, se identifican algunas contribuciones que
los procesos de fermentación han hecho a la alimentación de los animales, pero más allá de esta realizaciones existe un ámbito que ha ejercido
un gran impacto: el empleo de procesos de fermentación para convertir
en alimento para el ganado los subproductos y materiales de desechos y
al mismo tiempo, reducir la contaminación del ambiente humano.
8.1.1 Vitaminas
Las vitaminas son compuestos orgánicos requeridos
en pequeña cantidad por el organismo, pero imprescindibles para un desarrollo normal del hombre y los
animales. El estudio de las vitaminas es relativamente
nuevo, aunque las enfermedades producidas por sus
deficiencias se conocen desde hace muchos años.
Los requerimientos de vitaminas para el hombre y los
animales se deben distinguir; en éstos últimos, entre las necesidades de las vitaminas en los procesos
metabólicos y las necesidades de las vitaminas en la
alimentación. Por ejemplo, los rumiantes requieren en
sus procesos metabólicos muchas de las vitaminas del
complejo B, en cambio, no necesitan recibirlas en la
alimentación ya que las sintetizan las bacterias del rumen. El ácido ascórbico o vitamina C es requerida en
los procesos metabólicos de numerosas especies, es
esencial en la alimentación de alguna de ellas (hombre,
mono), ya que la mayor parte de las especies la sintetizan en sus organismos en cantidad suficiente.
Para los bovinos, el complejo vitamínico B y la vitamina K son sintetizada por las bacterias del rumen y la
vitamina C en los tejidos. O sea, que prácticamente,
las vitaminas A, D y en algunas casos la E podrían
286
Capítulo 3
ser las únicas con posibilidad de deficiencia, aunque si
los animales dispongan de una buena alimentación las
mismas no se producirán.
Complejos compuestos orgánicos que participan en sistemas enzimáticos esenciales para transportar energía
y regular el metabolismo corporal, se requieren en
minúsculas cantidades en una o más especies de animales para el crecimiento normal, producción, reproducción y/o salud.
Son solubles en las grasas o agua; sobre esta base, se
agrupan del siguiente modo:
Vitaminas Liposolubles: se disuelven en grasas. Ejemplo:
vitamina A, D, E y K.
Vitaminas Hidrosolubles: se disuelven en agua. Ejemplo:
B, C, etc.
287
Capítulo 3
288
Capítulo 3
Unidad 9. Producción de alcohol, ácidos orgánicos y
proteínas unicelulares.
9.1 RAP Conoce los fermentadores industriales, su función,
métodos y procesos implicados en los procesos microbiológicos
9.1.1 Producción de alcohol
La fermentación es un proceso metabólico energético que comprende la descomposición de moléculas, tales como carbohidratos, de manera anaerobia, se ha
utilizado desde tiempos antiguos en la preparación de alimentos y bebidas. El desarrollo químico ha revelado la naturaleza biológica del proceso de fermentación,
que da como producto el alcohol etílico y pequeñas cantidades de propanol, butanol, ácido acético, y ácido láctico; los alcoholes de alta concentración también se
pueden formar. El alcohol etílico está familiarizado con las bebidas alcohólicas. En
su forma no natural es usado como un solvente industrial y como materia prima
para la manufactura de acetaldehido, acetato etílico, ácido acético, dibromito de
etileno, glicol y muchos otros químicos orgánicos. El alcohol puro también puede
ser utilizado para propósitos medicinales, farmacéuticos y saborizantes.
La fermentación del alcohol etílico es realizada en forma cerrada por cualquier
carbohidrato rico en substratos. La melaza, licor producido de desechos, permanece después de la cristalización de la sacarosa y es usada ampliamente como
materia prima en la fermentación alcohólica. La melaza contiene 35-40% de sacarosa y 15-20% de azúcares invertidos (glucosa y fructuosa). La melaza contiene
21-22% de sacarosa y 50-55% de azúcares invertidos. La mayoría de las melazas
no requieren otros nutrientes adicionales para realizar la fermentación del alcohol
etílico. Sin embargo, las melazas requieren cantidades considerables de sulfato de
amonio y otras sales, como fosfatos. El contenido de nutrientes no azucarados
de 50-lids de las melazas es aproximadamente 7%, comparado con el 28-35%
encontrado en las melazas.
El alcohol etílico también puede ser producido por fermentación del almidón, suero
o licor de desechos de sulfito. La fermentación de granos requiere un pretratamiento, dado que la levadura no puede metabolizar directamente el almidón. Los
granos (usualmente el maíz) son agrupados y calentados en una lechada acuosa
para gelatinizar o solubilizar el almidón. Algunas enzimas líquidas pueden ser añadidas a bajas temperaturas. El almidón líquido es enfriado alrededor de 65°C y
tratado con amilasa de malta o de hongos para convertir el almidón en oligosa-
289
Capítulo 3
cáridos. Luego, la levadura es añadida junto con amiloglucosidasa (o glucoamilasa)
los cuales convierten los oligosacáridos en glucosa. El proceso de fermentación
y refinación posteriores son los mismos que se realizan cuando se usa melaza
como materia prima.
La producción del alcohol etílico es realizada a través de procesos eficientes y
automáticos. El proceso de manufactura no es muy complejo y es fácil de realizar.
El control de la contaminación y el mantenimiento y reparación de las maquinarias y equipos también son fáciles. Aquellas naciones con climas tropicales y
sub-tropicales, con abundante producción de azúcar y maíz, podrían invertir en el
establecimiento de esta planta de producción que puede ser orientada tanto a la
exportación como a la importación.
Descripción del proceso
1. Transporte y almacenamiento de la melaza: La melaza obtenida desde una fábrica proveedora es transportada vía transferencia de tuberías o carros de almacenamiento a la planta de procesamiento de alcohol etílico. La melaza es colocada en
un tanque de almacenamiento de concreto bajo tierra por bombeo de la melaza.
Proceso de fabricación del vino
Cuando el proceso ha comenzado, la melaza almacenada será bombeada en un
contenedor o vasija de disolución para ajustarlo a una concentración adecuada.
290
Capítulo 3
2. Preparación de la melaza: La melaza es bombeada dentro del tanque medidor a
través de un bombeo desde el tanque bajo tierra, el cual recibe el material directamente desde el tanque de almacenamiento por transferencia de tuberías. Después
que la melaza es medida exactamente, fluye hacia el tanque de disolución de la
melaza. Debido a su resistente concentración de azúcar, la melaza no soporta una
fermentación directa; por lo tanto, primero debe ser diluido a la concentración
deseada. Éste es llamado masa o templa, y presenta los carbohidratos listos para
la inoculación o vacunación de los cultivos de semillas. La melaza utilizada en este
proceso no necesita ser esterilizada o “nutriotinizada” por un proceso diseñado
especialmente, el cual será útil para eliminar el consumo de vapor y los costos
de producción de corte. Después de que la melaza es diluida a la concentración
deseada, una mezcladora automática ayudará a darle una concentración homogénea para el proceso de fermentación, antes de que sea bombeado a una serie
de fermentadores de acero.
3. Estación de cultivo de granos: La estación es equipada con un fermentador piloto en conjunto con el equipo de cultivo de granos y los instrumentos de cultivo
diseñados especialmente. Este proceso es realizado bajo una exacta supervisión de
laboratorio, incluyendo la selección de la inoculación de los granos de levadura, la
adición de nutrientes, el ajuste del pH, el control de temperatura, y finalmente, la
limpieza y esterilización de la máquina de cultivo de levadura para la realización
del siguiente lote.
4. Suministro de agua procesada: El equipo suministrador de agua procesada y
el equipo incrementador de presión son proporcionados. El agua utilizada en el
proceso podría ser tratada como agua drenada de calidad o suministrado por un
pozo de 90-100 metros de profundidad.
5. Estación de fermentación: Los fermentadores se conectan por tuberías para una
operación de fermentación continua. Esta estación debe tener un control automático de temperatura, velocidad de flujo, operación de templado y operación de
alimentación. Usualmente el ciclo de fermentación dura de 2-3 días. Dado que el
alcohol etílico es formado por levadura desde monosacárido, es necesario descomponer la sacarosa en d-glucosa y l-fructuosa.
291
Capítulo 3
Las enzimas producidas por la levadura cambian los monosacáridos en alcohol y
dióxido de carbono. Después que ha sucedido la reacción, el alcohol etílico presente en los fermentadores puede ser separado por destilación. El contenido de
alcohol de la masa es de 7-12% de su volumen, es bombeada hasta la sección de
destilación del alcohol. Después de pasar a través de varios intercambiadores de
temperatura, el residuo en la base del destilador transporta proteínas, residuos de
azúcar y otras impurezas que pueden ser extraídas y usadas como componentes
para alimento animal.
6. Estación de destilación y rectificación: El caldo conteniendo alcohol etílico, agua,
aldehido, ácido acético, etc., pasa a través de un intercambiador de temperatura hacia
un condensador parcial para mantener el alcohol en la columna y para proporcionar
un reflujo para las placas superiores. Los productos más volátiles, los cuales todavía
pueden contener rastros de aldehído y alcohol, son condensados completamente y
transportados detrás de la parte superior del destilador de aldehido. Cerca de la parte
superior de la columna, el 95-96% del alcohol es absorbido a través del condensador
para su almacenamiento.
9.1.2. Producción de ácidos orgánicos
Los ácidos orgánicos encuentran amplio uso como aditivos en la industria de
alimentos y también como aditivos químicos en piensos. Todos los ácidos del
ciclo de los ácidos tricarboxílicos pueden ser producidos microbiológicamente
con un alto rendimiento. Algunos ácidos que derivan indirectamente del ciclo
de Krebs, como el ácido itacónico (se obtiene a partir del ácido isocítrico),
también pueden producirse de la misma manera. Así mismo se obtienen otros
ácidos orgánicos que derivan directamente de la glucosa (p.ej. el ácido glucónico) o que se forman como productos finales a partir del piruvato o del etanol
(p.ej. el ácido láctico o el ácido acético).
Excepto en la producción del ácido cítrico, que se produce enteramente por
procesos microbianos, existe frecuentemente una gran competición entre los
procesos químicos y los biológicos. En algunos ácidos como el láctico y acético, se utilizan indistintamente los métodos químicos o microbiológicos para
su preparación. Para otros ácidos (cetoglutárico, málico) se han desarrollado
procesos de fermentación que no se utilizan comercialmente, bien debido a la
insuficiente demanda del ácido o por razones económicas.
292
Capítulo 3
Ácido cítrico
La principal fuente de ácido cítrico, antes de que se desarrollaran los procesos
microbianos, fueron los cítricos procedentes de Italia (los limones contienen
7%-9% de ácido cítrico). Actualmente, más del 99% de la producción mundial
de ácido cítrico se produce microbiológicamente. El 70% se utiliza en la industria de alimentos y bebidas, ya que el sabor de los jugos de frutas, extractos de
jugos de frutas, caramelos, helados y mermeladas se aumenta o se preserva por
adición de ácido cítrico. El 20% se destina a productos farmacéuticos como el
citrato de hierro y ácido cítrico que se usan como conservantes de la sangre
almacenada así como en tabletas, pomadas y preparaciones cosméticas. En la
industria química (10% restante) el ácido cítrico se utiliza como agente antiespumante, como reblandecedor y para el tratamiento de textiles. En la industria
metalúrgica los metales puros se producen como citratos metálicos.
En la actualidad, para la producción comercial de ácido cítrico, sólo se utilizan
mutantes de Aspergillus niger. La esencia de la obtención del ácido cítrico
conlleva limitar las cantidades de trazas de metales, como el manganeso y el
hierro (cofactor de la aconitasa), para evitar el sobre crecimiento de Aspergillus
niger. El medio suele tratarse con resinas de intercambio iónico para asegurar
concentraciones bajas y controladas de los metales disponibles. La obtención
del ácido cítrico, que en un principio se realizaba mediante el crecimiento en
una superficie estática, ahora se lleva a cabo en fermentadores aeróbicos con
agitación. Generalmente se utilizan como materia prima las melazas en altas
concentraciones (15-18%). El ácido cítrico es un producto metabólico primario
y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la principal
fuente de carbono utilizada para la producción de ácido cítrico. En la trofofase,
parte de la glucosa añadida se utiliza para la producción de micelio y se convierte, a través de la respiración, en CO2. En la idiofase, el resto de glucosa se
convierte en ácidos orgánicos existiendo una pérdida mínima por respiración.
Durante la idiofase y cuando el nivel de sustrato es alto, se expresan todas las
enzimas del ciclo de Krebs excepto la α-cetoglutarato deshidrogenasa. La actividad citrato sintasa aumenta por un factor de 10, mientras que las actividades
de las enzimas que catalizan el ácido cítrico, aconitasa e isocitrato deshidro-
293
Capítulo 3
genasa, se reducen drásticamente en comparación con su actividad durante
la trofofase. Esto da lugar a una acumulación y excreción de ácido cítrico por
el microorganismo sobrecargado. El rendimiento teórico es de 112g de ácido
cítrico anhidro por 100g de sacarosa. Sin embargo, tales rendimientos no se
obtienen en la práctica debido a las pérdidas durante la trofofase. Generalmente se consigue un 60% sobre el rendimiento teórico.
Ácido glucónico
En la producción de ácido glucónico sólo participa una
única enzima microbiana, la glucosa oxidasa, que se encuentra en Aspergillus niger. Este hongo crece en condiciones óptimas en el líquido de maceración del maíz, pero
cuando el crecimiento se ve limitado por el nitrógeno, las
células en reposo transforman la glucosa restante en ácido glucónico. El gluconato sódico se utiliza como agente
secuestrante en muchos detergentes.
Ácido acético
La producción de ácido acético a partir de líquidos alcohólicos ha sido conocida desde hace tanto tiempo como
la producción de vino (unos 10.000 años). Los romanos y
los griegos, que utilizaban el vinagre diluido como bebida
refrescante, producían vinagre dejando el vino abierto al
aire. El vinagre se produjo sólo para consumo local hasta
la Edad Media. Los primeros vinagres fabricados industrialmente eran producidos en vasijas planas abiertas.
Eran procesos lentos en los que flotaba una película de
bacterias sobre la superficie del vino. En el siglo XIX se
modificaron los procesos en superficie hacia procesos más
rápidos. Uno de estos, el proceso del generador de goteo,
se utiliza todavía en la actualidad.
En este proceso el biorreactor de madera tiene un volumen
de 60 m³ y está lleno de virutas de haya. El material de
partida se rocía sobre la superficie y se deja gotear a través
de las virutas (que contienen bacterias) hasta el fondo del
294
Capítulo 3
recipiente donde la solución parcialmente convertida es
enfriada y bombeada de vuelta a la parte superior. A medida que el alcohol pasa a través de las virutas, las bacterias
acéticas (Acetobacter y Gluconobacter) oxidan parte del
alcohol a ácido acético. Este proceso se repite hasta que
se obtiene el vinagre con la fuerza que se quiera. Al ser
un proceso aeróbico se debe suministrar abundante aire
a través de la cámara. Además, la temperatura se debe
mantener entre 15°C y 34ºC que es el rango óptimo de crecimiento de Acetobacter. Del alcohol que se añade, el 8890% se convierte en ácido acético. El resto del alcohol se
utiliza en el metabolismo primario o escapa con los gases
de salida. El tiempo necesario para producir ácido acético
del 12% mediante este proceso es de unos tres días.
9.1.3 Producción de proteína unicelular
El término proteína unicelular (PUC) se emplea para referirse a microorganismos
tales como bacterias, levaduras, algas y hongos filamentosos, que son empleados
para alimentación humana o animal, principalmente por su alto contenido en
proteínas. El hombre ha consumido microorganismos presentes en alimentos
fermentados desde hace siglos y más recientemente empleo para consumo
animal microorganismos derivados de la producción de cerveza y de bebidas
alcohólicas.
Pero el alto costo de su producción sólo es competitivo en ciertas
circunstancias
respecto de las proteínas de origen vegetal. Los
microorganismos crecen rápidamente, lo cual es una de las razones más
importantes para su interés en su producción industrial.
Bacterias de los géneros Methilomonas, Pseudomonas, Bacillus y Aerobacter
tuvieron en los 60 gran interés debido a su alta velocidad de duplicación
y alto contenido proteico; pero el incremento del costo de los sustratos
(metano, metanol, hidrocarburos...) han limitado su aplicación.
Sin embargo ciertas especies de levaduras, como Cándida utilis,
Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromycees fragilis (k.marxianus) han sido
aceptadas para alimentación humana y producidas continuamente desde
la Segunda Guerra Mundial.
295
Capítulo 3
Los hongos filamentosos y las algas tienen la desventaja de crecer más
lentamente. En la actualidad se producen comercialmente los hongos
Gliocladium deliquescens, Paecilomyces varioti y Fusarium graminearum y
las algas Spirulina y Chlorella. En el caso de las algas, su producción es
similar a la de la agricultura convencional.
En cuanto al sustrato, aunque la atención inicial se centró en hidrocarburos
y derivados del petróleo, recientemente se ha derivado hacia recursos
renovables como residuos agrícolas y subproductos industriales. En muchos
casos los sustratos requieren de un pretratamiento fisico, químico o
enzimático previo a la fermentación. Los residuos agrícolas forestales, por
ejemplo, deben ser hidrolizados a azúcares simples o sometidos a una
deslignificación parcial para que puedan ser fácilmente accesibles a los
microorganismos.
Los principales sustratos utilizados son alcanos, alcoholes y
carbohidratos:
La Cándida utilis se obtuvo en ambas guerras mundiales como suplemento
proteico por fermentación de caldos de sulfito desecho de plantas de
celulosa y por crecimiento en melazas en Jamaica. Después también en
USA y Finlandia como levadura forrajera; pero debido a la superabundancia
de proteínas vegetales, estos procesos se convirtieron en antieconómicos.
En Finlandia (1974) se desarrolló el proceso Pekilo para la producción de
proteínas de organismos unicelulares fúngicos para alimentación animal,
haciendo crecer Paecilomyces varioti y utilizando como sustrato caldos
de sulfito.
La celulosa de fuentes naturales y restos de madera como material
de partida para la producción de PUC frecuentemente necesita de un
pretratamiento térmico o químico combinado con la hidrólisis enzimática.
El suero de leche entera o el desproteizado son una fuente de carbohidratos
que crea problemas de eliminación, de variaciones estacionales de
suministro y elevado contenido en agua. Aunque la mayoría de los
organismos no utilizan lactosa como fuente de carbono, las levaduras
Kluyveromyces fragilis crecen fácilmente en este carbohidrato, por lo que
se han construido plantas utilizándolo para la producción de PUC.
El proceso Symba diseñado en Suecia para producir PUC utiliza dos cepas
296
Capítulo 3
de levaduras: Saccharomycopsis fibuligera, que produce enzimas para la
degradación del almidón y permite el cocrecimiento de Cándida utilis, fue
diseñado para aprovechar los deshechos del procesado de patata.
La glucosa de calidad alimentaria fue el sustrato elegido por RHM ( Rank
Hovis McDougall para producir PUC utilizando Fusarium graminearum.
El proceso original de BP (British Petroleum) para producir PUC mediante
la fermentación de alcanos que aunque el costo del sustrato ( ceras
contenidas en el gas-oil) era bajo, hubo de cerrar debido a los inconvenientes
de eliminar de las levaduras producidas los carcinógenos y el mal olor
mediante un exhaustivo proceso de extracción y además existía cierta
tendencia a la contaminación microbiana. Otra planta construida en
Cerdeña en asociación de BP y ANIC que empleaba n-parafinas nunca fue
autorizada a operar comercialmente.
ICI
escogió metanol como sustrato para la producción de PUC para
consumo animal, usando Methilophilus methylotrophus; pero también hubo
de cerrar con el aumento del precio del metanol.
ICI se asoció con RHM para usar el proceso Fusarium RHM en la gran
planta de fermentación de ICI.
Pure Culture Products utilizó etanol como sustrato y Cándida para producir
proteínas de calidad alimentaria, hasta que dejó también de ser rentable.
297
Capítulo 3
Actividad es 15, 16 y 17
ACTIVIDAD 15Indica la maquinaria y equipo para la producción de alcohol.
Práctica
ACTIVIDAD 16-¿Dónde se recomienda que se ubique la planta de producción de
alcohol?
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
298
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
ACTIVIDAD 17¿Cómo se selecciona un microorganismo para la producción de
proteína unicelular?
299
Capítulo 3
300
Capítulo 3
Unidad 10 Producción industrial de enzimas, antibióticos
y productos lácteos fermentados
10.1 RAP Conoce los procesos de obtención de enzimas,
antibióticos y productos lácteos en la industria
10.1.1 Producción industrial de enzimas
La producción de enzimas para uso industrial tuvo sus orígenes en
Dinamarca y Japón, a finales del siglo XIX, cuando se produjeron las
primeras preparaciones de renina a partir del estómago de becerros
y de amilasa de origen fúngico. Las enzimas son productos de las
células y por lo tanto, pueden obtenerse a partir de tejidos animales,
tejidos vegetales o mediante procesos de fermentación empleando
microorganismos seleccionados. Las plantas han sido la fuente tradicional
de ciertas enzimas. A partir del latex producido por la papaya, algunas
proteasa aisladas desde la higuera y la piña. La cebada malteada también
ha sido fuente importante de enzimas vegetales. La industria cervecera ha
empleado tradicionalmente este material crudo por su actividad proteásica
y amilásica. En cuanto a las enzimas de origen animal, se han obtenido
pocas, por ejemplo, lipasa pancreática y tripsina, debido principalmente
a la disponibilidad limitada de material adecuado y a la posibilidad
de reemplazarlas por enzimas similares derivadas de microorganismos.
Debido a que las aplicaciones industriales de las enzimas requieren que
éstas sean producidas a gran escala y bajo costo, el empleo de algunas
enzimas de origen vegetal y animal ha ido decayendo, en favor de las
enzimas de origen microbiano.
Una de las primeras enzimas producidas industrialmente fue la amilasa
fúngica takadiastasa, empleada en USA como agente farmacéutico (para
los desórdenes intestinales) en 1894. El proceso patentado de Otto Roehm
“procesos de lavandería para todos y cualquier tipo de tejidos mediante
adición de enzima tríptica” se anunciaba en 1915. En 1969, el 80% de
todos los detergentes de lavandería contenían enzimas, fundamentalmente
proteasas. Junto a éstas se empezaron a utilizar en la industria de los
detergentes enzimas adicionales como lipasas, amilasas, pectinasas y
oxidorreductasas. En 1971 y debido a la existencia de alergias entre los
trabajadores de la industria de producción, así como entre los consumidores,
se redujo drásticamente el uso de proteasas en detergentes. Solamente
cuando se desarrollaron técnicas especiales, como la microencapsulación,
pudieron ser producidas preparaciones de proteasas carentes de riesgo
301
Capítulo 3
para los trabajadores y los consumidores. Actualmente en Europa el
95% de los detergentes de lavandería contienen proteasas (subtilisinas).
Mientras que en México sólo el 40% de los detergentes contienen el
40% proteasas.
En la actualidad se producen comercialmente las siguientes enzimas:
1. Enzimas utilizados en la industria como amilasas, proteasas, catalasas,
isomerasas y penicilina acilasas.
2. Enzimas utilizadas con propósitos analíticos como la glucosa oxidasa,
galactosa oxidasa, alcohol deshidrogenasa, hexoquinasa, muraminidasa y
colesterol oxidasa.
3. Enzimas utilizadas en medicina como la asparraginasa, proteasas, lipasas
y estreptoquinasa.
Estas tres áreas de aplicación requieren niveles variables de calidad y
cantidad. Con base en toneladas, las más importantes son las enzimas
industriales que se producen en fermentadores de 120 m³, mientras que
en las enzimas producidas para propósitos analíticos o médicos se utilizan
fermentadores de planta piloto. Todas las enzimas producidas en grandes
cantidades, salvo la glucosa isomerasa y la invertasa, son extracelulares.
Las enzimas pueden ser intracelulares o extracelulares. Pocas enzimas
intracelulares son producidas a gran escala y las ventas de estas enzimas
representan sólo un pequeño porcentaje del total de ventas. Sin embargo, la
producción de enzimas intracelulares es de gran interés por varias razones.
Con los avances en las técnicas de inmovilización, el uso de enzimas y
células inmovilizadas está en aumento. Por ejemplo, se han establecido
procesos comerciales para la producción de jarabes de fructosa usando
glucosa isomerasa. Enzimas Extracelulares los microorganismos producen
una amplia variedad de enzimas potencialmente útiles, muchas de las
cuales son excretadas al medio. La mayoría de las enzimas extracelulares
son producidas por organismos pertenecientes a dos géneros: Bacillus y
Aspergillus. y que en su mayoría son del tipo hidrolítico.
302
Capítulo 3
Estabilidad de las enzimas
La frágil naturaleza proteica de las enzimas, que conlleva a una estabilidad
limitada de su estructura y funcionalidad, constituye un aspecto importante en
un contexto tecnológico. Se considera que una enzima es apropiada para una
aplicación comercial, si su estabilidad es suficiente para dicha aplicación.
Las enzimas se obtienen por fermentación en cultivos semisólidos, sumergidos, extracción de tejidos, ya sea en plantas o animales bajo condiciones
controladas. Unas 20 compañías de Europa, Japón y Estados Unidos realizan
la producción de enzimas; pero el mercado es dominado por 3 de ellas: Novo
Nordisk (Dinamarca) con el 50% de las ventas a nivel mundial, seguida por Gist
Brocades (Neatherlands) y Rhom and Haas (Alemania).
El mercado de las enzimas ha tenido gran crecimiento desde los años 70 y
éste ha sido paralelo con el desarrollo de un gran número de aplicaciones en
la industria alimentaria.
En América latina existen empresas productoras de enzimas en México, Brasil,
Argentina y Uruguay, muchas de las cuales son subsidiarias de empresas transnacionales, como es el caso de Pfizer en México y Brasil y Novo en Brasil. En
Colombia no hay producción de enzimas a escala industrial, siendo importadas
de diversos países de Europa, también de Japón, Estados Unidos , Canadá y
México. La importación de enzimas en Colombia se hace en su mayor parte
a través de representantes o casas comerciales; pero algunas industrias de
cervecería, molinería y lácteos hacen importación directa de las enzimas que
requieren.
303
Capítulo 3
Carbohidrasas
Las amilasas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, son
las enzimas responsables de la degradación del almidón, hidrolizan los
enlaces glucosídicos α-1-4. Las amilasas se pueden dividir en tres grupos:
α-amilasas: rompen al azar los enlaces en el interior del sustrato
(endoamiladas);
β-amilasas: hidrolizan ordenadamente en unidades de maltosa a partir de
los extremos no reductores del sustrato (exoamilasas) y
glucoamilasas: liberan unidades de glucosa a partir de los extremos no
reductores del sustrato.
Las b -amilasas están presentes en la mayoría de las plantas superiores,
están ausentes en los mamíferos y su existencia en microorganismos es
dudosa. Se han cristalizado β amilasas a partir de trigo, malta de cebada,
patata dulce y soya. La enzima hidroliza únicamente enlaces glicosídicos
α-1-4, con inversión en la configuración del C 1 en el glicosido, de la
forma α a la forma β.
Este cambio de configuración es la razón por la cual la enzima se llama
beta amilasa.
Los pH’s de mayor actividad para las β amilasas están en el rango entre
4.5 - 7 y el límite de temperatura está alrededor de 55°C. Los grupos
sulfhídricos son esenciales para la actividad, por lo que la enzima se
inactiva por oxidación, por los metales pesados y sus sales.
Glucoamilasa (amiloglucosidasa)
El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el
almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de las α y β amilasas.
La enzima también produce pequeñas cantidades de oligosacáridos.
La sacarificación del almidón puede alcanzar hasta 96% de dextrosa. La
acción de la enzima causa inversión de la configuración, produciendo β
glucosa.
En el comercio se encuentran diversas preparaciones derivadas de hongos
de los grupos Aspergillus y Rhizopus. excepto por la enzima de Aspergillus
304
Capítulo 3
awamori; las glucoamilasas son inactivas sobre almidón nativo. Su actividad
es máxima entre pH 4 y 5.5, y temperatura alrededor de 55°C – 65°C. La
velocidad de reacción cae rápidamente a medida que disminuye el tamaño
de la molécula de sustrato, siendo máxima sobre almidones previamente
sometidos a licuefacción.
La producción de nuevos compuestos representa otra posibilidad interesante
de los procesos fermentativos. Un ejemplo está constituido por diversos
productos que presentan actividad farmacológica como los inhibidores
enzimáticos y los antitumorales.
Algunos inhibidores enzimáticos han sido ya aceptados en algunos
países para su empleo en medicina humana, como la bestatina, un
inmunoregulador.
Otros productos interesantes en desarrollo son los polímeros biodegradables
como el polibetahidroxibutirato, que tiene aplicaciones industriales y
medicinales.
305
Capítulo 3
Actividad 18
¿Cuáles son las enzimas pécticas?
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
306
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
10.1.2 Métodos de obtención de antibióticos
Definición
Son sustancias químicas producidas por organismos vivientes, capaces
de inhibir en pequeñas cantidades los procesos vitales de ciertos
microorganismos, destruyendo e impidiendo su desarrollo y reproducción.
Literalmente la palabra “antibiótico” significa cualquier sustancia
antagonista de la vida, pero en medicina este término tiene un concepto
más restringido.
Para su uso en terapia humana es también necesario un elevado índice
terapeútico.
La definición de antibiótico hecha por Waksman (1951) se refería a las
sustancias producidas por microorganismos, pero en la actualidad debe
ampliarse la definición para poder incluir sustancias similares preparadas
sintéticamente o existentes en algunas plantas superiores. La mayor
parte de los antibióticos utilizados en clínicas, son producidos por
microorganismos u hongos del suelo, pero se conocen ejemplos de otro
grupo que se mencionan a continuación:
Líquenes: Muchos de los antibióticos parecen deber sus propiedades
bacteriótaticas y antifúngicas al ácido úsnico o al ácido vulpínico.
Monocotiledóneas: El ajo fresco debe su acción antibiótica a la aliína,
aminoácido que contiene azufre.
Dicotiledóneas: Son ejemplo de este grupo los siguientes: lúpulo (Fam.
Cannabinaceae) que contiene las cetonas humuleno y lupuleno; en el
Anemone pulsatilla y en muchas otras ranunculaceaes está la lactona
protoanemonina; diversos compuestos sulfurados se han encontrado
en las crucíferas; en la Drosera se encuentra la plumbagina (2-metil-5hidroxil-1,4-naftoquinona). De las compuestas se han aislado principios en
diversas especies como la bardana, el cardo y el Hieracium pilosella. Esta
última planta, “oreja de ratón” o “pelosilla”, se ha utilizado clínicamente
para el tratamiento de la fiebre de Malta. Se han ensayado respecto a la
actividad antimicrobiana muchas otras plantas y en la literatura científica
están apareciendo continuamente nuevos trabajos.
307
Capítulo 3
Historia
El primer registro científico de actividad antibiótica fue realizado por Luis
Pasteur (1877), quién comunicó que no se había desarrollado el Carbunco
en animales inyectados con un inóculo que contenían bacillus Anthracis
y otros bacillus comunes. En la figura número 16 se muestra como se
puede separar un microorganismo en forma selectiva dentro de una caja
Petri, para lo cual se utiliza un medio de cultivo selectivo.
En Tyndal (1881), en sus ensayos sobre la materia flotante en el aire,
en relación con la putrefacción e infección , establecía que en algunos
tubos que contenían una infusión nutritiva y bacterias y que se habían
contaminado también con Penicillium glaucum, las bacterias perdían su
“poder de translación y caían al fondo del tubo”. Tyndal interpretó este
fenómeno como debido a la suspensión del suministro de oxígeno a las
bacterias por las películas formadas por el moho. Diez años después del
descubrimiento de Pasteur, Emmerich (1887) descubrió accidentalmente que
un cobaya al que había inyectado inicialmente Estreptococcus erysipelatis
no padeció el cólera al inyectarle cultivos virulentos de Vibrium cholerae .
Reconoció inmediatamente el significado del descubrimiento y logró evitar
el ántrax en animales de experimentación administrando Str. Erysipelatis
previamente a la inyección de bacillus anthracis.
Figura 16. Aislamiento de un
microorganismo para la producción de
antibióticos.
308
Capítulo 3
Bouchard (1889) comunicó que el Pseudomona aeruginosa evitaba el
desarrollo del ántrax en el conejo, observación que fue ampliada por
Woodhead y Wood (1889) al descubrir que cultivos esterilizados de P.
aeruginosa; concentraron estos filtrados, desprovistos de células en un
décimo de su volumen inicial y demostraron que destruían al Corinebacterium
difteriae, stafilococcos, estreptococos, neumococos, gonococos, el vibrium
cholerae y Shigella paradysenteriae in vitro. En la actualidad se ha aislado
y purificado el principio activo de este preparado, determinándose su
estructura. El reconocimiento del fenómeno de la antibiosis había sido
establecido, pero Sir Alexander Fleming observó en 1928 la inhibición
de las bacterias por una colonia de Penicillium notatum que se habían
desarrollado como contaminante sobre una caja petri. Fleming abogó en
su publicación por el posible uso clínico de la sustancia formada en el
cultivo de Penicillium.
Con la Segunda Guerra Mundial se inició un programa a gran escala
para la producción y ensayo de la sustancia, conocida en la actualidad
como Penicilina y los recursos de la industria y de las instituciones
académicas se dedicaron al estudio de esta sustancia y a la búsqueda
de otros antibióticos. Esto tuvo como consecuencia el descubrimiento de
Streptomicina , Aureomicina, Cloromicetina y muchos otros antibióticos.
En la actualidad para la fabricación de Penicilina han reemplazado al
P. notatum cepa de alto rendimiento de Penicillium chrysogenum, que
producen además poco pigmento. Se consigue la síntesis preferente de
Bencilpenicilina por adición de ácido fenilacético al medio de fermentación.
Constitución química
En general los antibióticos son sustancias químicas diversas, complejas, de
gran peso molecular, cuya síntesis suele ser muy dificultosa, y en algunos
casos antieconómica en comparación con su obtención por los medios
biotecnológicos.
La adición de varios radicales químicos a la estructura molecular de los
antibióticos da lugar a sustancias de mayor solubilidad, de menor toxicidad
y mayor actividad, y la alteración de la molécula ha producido algunas
sustancias antibióticas presumiblemente no conocidas en la naturaleza.
309
Capítulo 3
Penicilina
Es una sustancia antibiótica producida por los
hongos Penicillium notatum y P. chrysogenum
de la familia Aspergiliaceas. Es un hongo de
color verde azulado que posee delgadas hifas
sumergidas como también aéreas tabicadas de
las cuáles arrancan conideoforos ramificados. La
penicilina fue descubierta por Alexander Fleminig
en 1929.
Métodos de obtención de la penicilina
En general el procedimiento de obtención de
los antibióticos por métodos biotecnológicos, es
parecido y consiste en cultivar en gran escala el
hongo productor del antibiótico en un medio de
cultivo a temperatura adecuada y luego extraer
la sustancia activa desarrollada en el medio por
solventes especiales y evaporar el solvente y
someterlo después a purificaciones sucesivas.
Se conocen dos métodos para la producción
natural de la penicilina: el método de superficie y
el método de sumersión o de profundidad. En el
método de superficie las esporas o cenidios de
un cultivo de penicilina se desarrollan en forma
de nata en la superficie, del medio de cultivo
sílido, húmedo colocado en frascos planos o
en bandeja; este medio puede ser, por ejemplo,
salvado de trigo.
En el método de sumersión se desarrolla
en un medio líquido consistente en una
maceración de maíz con lactosa, colocado en
tanques de fermentación en donde el medio
es constantemente agitado y aireado y a una
temperatura de 23°C – 25°C; por este método se
obtiene el mayor rendimiento.
En ambos métodos las esporas germinan en
medio nutritivo formando un micelio que excreta
310
la penicilina vertiéndola en substrato; el micelio
se separa después de un tiempo por filtración a
presión y a 5°C. La penicilina cruda obtenida se
extrae ya sea por absorción con carbón activado
o por extracción del mismo medio mediante
solventes orgánicos no miscibles en agua. Cuando
se extrae por adsorción se hace pasar el medio
filtrado a través de una columna que contiene
carbón activado que adsorbe el antibiótico y
este es luego separado del carbón por medio de
un solvente apropiado (por ejemplo acetona al
80 %) por elusión, el cual por evaporación deja al
antibiótico que se purifica, se valora y se envasa.
La extracción de algunos medicamentos se
puede llevar a cabo por medio de dos líquidos
inmiscibles haciendo que el sustrato pase de una
fase a la otra; tal es el caso de la extracción del
ácido penicilínico utilizando agua y acetato de
amilo que son inmiscibles. El proceso consiste
en ajustar primero el pH a 2 para liberar el
ácido penicilínico que es soluble en el solvente
orgánico e insoluble en agua. La penicilina se
extrae del solvente orgánico con una solución
de bicarbonato de potasio o de sodio a pH de
7.5, formándose penicilina potásica o sódica.
Esta sal de penicilina se esteriliza por filtración a
través de filtros bactereológicos, para purificarse
por cristalización fraccionada. Una vez separada
la penicilina se seca al vacío a 1 a 2 °C y se
envasa asépticamente.
Capítulo 3
Tipos de penicilina
Se conocen diferentes penicilinas, todas las cuales derivan de una estructura química fundamental común : dos anillos heterocíclicos, uno de
tiazolidina y otro de beta - lactama, unido por un encadenamiento emídico
a un radical R variable; la penicilina es un ácido orgánico, el ácido penicilínico; pero por extensión se acepta el mismo nombre para sus sales.
Por el radical carboxilo la penicilina forma sales con los metales alcalinos.
Sustituyendo diferentes radicales en la posición R se tienen las siguientes penicilinas:
1. Bencil-penicilina R = C6H5CH2- , es la Penicilina G.
2. Pentenil-penicilina R = CH3CH2CH=CHCH2- , es la Penicilina F.
3. Heptil-penicilina R = CH3(CH2)6- , es la Penicilina K.
4. p-Hidroxibencil penicilina R = HO-C6H5-CH2- , es la Penicilina X.
5. Fenoximetil-penicilina R = C6H5OCH2- , es la Penicilina V.
De estas penicilinas, la más importante es la Penicilina G o bencil penicilina
que se combina con el sodio, potasio, calcio y la procaína para formar los
compuestos:
Penicilian G sódica, G potásica, G cálcica y Peniclina G Procaína, que es de acción prolongada. La penicilina V es activa por vía oral.
Actualmente existe la d-alfa-aminobencil-penicilina que es de amplio espectro,
activa contra microorganismos gram + y gram -, y activa por vía oral.
Propiedades
La penicilina que más abunda en el comercio es la penicilina G potásica o bencil
Penicilina potásica. Se presenta como un polvo cristalino blanco inodoro, muy
soluble en agua, también en alcohol y glicerina, insoluble en éter y cloroformo.
Se destruye por acción del calor, por ácidos, álcalis y agentes oxidantes y fermentos bacterianos.
Sus soluciones se deterioran a la temperatura atmosférica, pero refrigeradas
permanecen estables por algunos días.
311
Capítulo 3
Las sales de Penicilina que se fabrican actualmente permiten conservarlas en
estado sólido sin necesidad de refrigeración.
Identificación
La actividad de la penicilina es referida en unidades biológicas. Al tratar una
solución de penicilina al 2% con HCl diluido se forma un precipitado de ácido
Penicilinico que es soluble en exceso de ácido, alcohol, éter o cloroformo.
Acción farmacológica
La Penicilina tiene efecto bacteriostático (inhibiendo el desarrollo y reproducción de los gérmenes) o bacteriolítico (provocando su destrucción), según la
dosis y tiempo de contacto.
Figura 17.
312
Acción de la Penicilina inhibiendo el desarrollo y reproducción de gérmenes patógenos.
Capítulo 3
Espectro farmacológico
La penicilina es particularmente activa contra bacterias gran positivas, en especial en infecciones producidas por estafilococos, estreptococos, neumococos,
algunos clostridium y lactobacillus; ejerce también acción contra treponema
pallidum.
Es el antibiótico más usado, especialmente en infecciones estafilocócicas,
como Ántrax, en heridas y quemaduras infectadas, en el tratamiento de infecciones neumocócicas como neumonía, pleuritis y endocarditis neumocicas, en
enfermedades estreptocócicas como infección puerperal, peritonitis. En infecciones gonocócicas como gonorrea oftálmica. Se usa también en la sifilis, en la
Verruga peruana, profilacticamente en obstetricia y antes de las intervenciones
quirúrgicas.
En general la penicilina es considerada como una droga antibiótica de poca
toxicidad, sin embargo puede producir reacciones alérgicas como dermatitis,
urticaria, etc.
La penicilinasa es una enzima bacteriana que antagoniza específicamente el
efecto antimicrobiano de la penicilina produciendo su destrucción por la apertura del anillo lactámico.
313
Capítulo 3
Práctica 6
Identificación del Cloranfenicol
El Cloranfenicol es un antibiótico aislado a partir de cultivos de Streptomyces venezuelae de una muestra de tierra llevada de Caracas. Fue
descubierto por Burkholder en 1948.
Químicamente es C11H12Cl2N2O5. p-nitrofenil-di-cloroacetamido propanodiol, cuyo peso molecular es 323.13
Es un polvo blanco o blancoamarillento, inodoro, intensamente amargo; es
poco soluble en agua, muy soluble en alcohol, propilenglicol, acetona y acetato
de etilo. Es prácticamente estable en soluciones neutras o ligeramente ácidas,
pero se destruye rápidamente en solución alcalina.
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35
314
Capítulo 3
Desarrollo de la práctica:
Disuélvase 10 mg de cloranfenicol en una mezcla de
1 mg de alcohol diluido y 3 ml de solución reactivo
de CaCl2 al 10 %. Adicionar 50 mg de Zn en polvo y
calentar en baño María por 10 minutos. Descartar el
líquido transparente en un tubo de ensayo y agregar
100 mg de acetato de sodio anhidro y 11 gotas de
cloruro de benzoilo. Agítese la mezcla por 1 minuto,
agréguese 0.5 ml de solución reactivo de FeCl3 y HCl
diluido hasta producir una solución transparente, se
obtendrá un color rojo violado púrpura.
315
Capítulo 3
Los productos lácteos son aquellos del grupo de alimentos que incluyen
la leche, así como sus derivados procesados (generalmente fermentados).
Las plantas industriales que producen estos alimentos pertenecen a la
industria láctea y se caracterizan por la manipulación de un producto
altamente perecedero, como es la leche, que debe vigilarse y analizarse
correctamente durante todos los pasos de la cadena de frío hasta su
llegada al consumidor.
Los productos lácteos que se elaboran utilizan leche en la industria, utilizan leche de vaca, principalmente de la raza Holstein, aunque también se utiliza leche
de cabra o de oveja; en algunos países se llega a utilizar la leche de búfala, la
de camella y hasta la de la yegua.
Los productos lácteos se conocen desde hace varios milenios; es muy posible
que estén unidos al consumo humano desde los tiempos de las antiguas tribus
nómadas del neolítico; el ser humano logró la domesticación de cabras y ovejas probablemente hace casi unos 9.000 años en las zonas del Mediterráneo
Oriental, aunque no existen registros de consumos lácteos desde hace unos
mil años, luego de tal domesticación: hace 8.500 años puede suponerse la
insipiencia de producción láctea para consumo humano, aunque recién hace
7.000 años es que se datan importantes producciones de leche de vaca, cabra
y oveja en zonas como el noreste de Anatolia, debido a la gran disponibilidad
de leche procedente de los ganados que se desplazaban con la población. La
elaboración de ciertos lácteos como el queso se asocia en la cultura popular
con las costumbres culinarias de los pastores de ganado. Algunos autores
mencionan que el mismo puede haberse originado en la fermentación de la
leche que se almacenaba en las vasijas elaboradas con los estómagos de animales. Los productos lácteos y la leche se han desarrollado históricamente
en aquellas poblaciones, o razas humanas, que han evolucionado físicamente
para mantener en la edad adulta una mejor capacidad de digestión del principal azúcar de la leche: la lactosa. En los demás grupos humanos, la secreción
de la lactasa (una enzima esencial para esa digestión) se pierde tras la fase
de lactancia infantil, y por esta razón muchas culturas tienen una «aversión
culinaria» a la leche y sus derivados. Sólo en algunas partes de Asia o África
se consumen habitualmente productos lácteos; y su consumo más extendido
316
Capítulo 3
se centra en el norte de Europa y en las zonas del mundo
con presencia migratoria significativa de ese origen, como
Norteamérica, Argentina y Australia. Se ha estimado que
casi un 96% de los europeos del norte son capaces de
digerir la lactosa; entre un 50% y un 75% de los africanos,
indios, habitantes de Oriente Medio y europeos del este;
mientras que casi todos los nativos americanos y asiáticos
son incapaces de digerirla.
El desarrollo de los productos lácteos se considera como
uno de los principales logros de la humanidad. El problema
de la digestión de la lactosa, en algunas personas se resuelve al transformarse en un derivado lácteo mejor digerible.
Las razones evolutivas aducidas están ligadas al equilibrio
con otro nutriente esencial que, como la lactosa, ayuda a la
absorción del calcio: la vitamina D, que se puede sintetizar
por el organismo en presencia de luz solar. Los pueblos
ganaderos del norte de Europa, con un débil sol que nunca
se alza mucho sobre el horizonte, vivían la mayor parte del
año bajo cielos cubiertos y protegidos por ropa que les
tapaba casi por completo la piel, además de no acceder
fácilmente a otras fuentes de calcio (verduras, por ejemplo). Verían comprometido su desarrollo si no accedieran
al calcio aportado por la leche líquida junto con la lactosa
(la cual desempeña el papel que en otras latitudes cumple una abundante vitamina D sintetizada gracias a la luz
solar). Por el contrario, pueblos secularmente dedicados
a la ganadería, como judíos, árabes, griegos, sudaneses y
culturas del Asia Meridional, que presentan altos índices de
intolerancia a la lactosa, desarrollaron tradicionalmente la
elaboración y consumo de productos lácteos fermentados,
en vez de la leche líquida sin fermentar.
317
Capítulo 3
El siglo XX es el período donde la leche
y los lácteos sufren una fuerte expansión
en su consumo a lo largo de todo el
planeta, las mejoras en los métodos
artificiales de ordeña, alimentación y
las mejoras en selección artificial de las
especies; los avances tecnológicos en los
procesos de transporte y refrigeración,
hicieron que se produjera la paradoja de la
«sobreproducción» (paradójico, ya que se
empezaba a extraer más leche con menos
vacas). Al mismo tiempo se empezaron a
abrir serios debates acerca de lo adecuado
de sus valores nutricionales aplicados a una
dieta sana.
CARACTERÍSTICAS
Las características físicas y químicas de los lácteos se testean en muchos casos
de forma similar que en la leche, es decir, se emplean por ejemplo lactómetros
para medir la densidad específica. No obstante la elaboración de los lácteos
es diferente según el proceso que se haya realizado; por ejemplo algunos de
ellos se han sometido a fermentación láctica (un ejemplo son los yogures);
otros por el contrario, sufren un proceso mecánico de concentración de su
contenido graso (mantequillas). A veces es posible un proceso combinado de
fermentación y maduración (quesos). Estos procesos cambian la composición
y la concentración inicial de ciertos macronutrientes y micronutrientes, dependiendo del lácteo en cuestión.
Contenido proteínico
Gran parte de los lácteos provienen del procesado de la leche de la vaca que está compuesta principalmente de agua
con un contenido aproximado de 4,8% de lactosa, 3,2%
de proteínas, 3,7% de grasas y un 0,19% de contenido no
proteínico, así como un 0,7% de cenizas. Las principales
familias de proteínas en la leche son las caseínas, las proteínas de los sueros de leche y las inmunoglobulinas.
Figura 18. Estructura química de la
lactosa.
Contenido graso
La leche de vaca, cabra, oveja y de otros animales, tiene un
contenido graso de lípidos formados por glóbulos microscópicos de 1 – 4 mµ, en forma de emulsión agua – aceite.
La mayoría de los lípidos lácteos son triglicéridos (97 – 98
%), el resto son:
Fosfolípidos 0.2 – 1 %
Esteroles libres 0.2 – 0.4 % y
Trazas de ácidos grasos.
318
Capítulo 3
Aproximadamente el 62% de de la grasa de la leche tiene
un 30 % de ácidos grasos mono-insaturados (ácido oleico),
4 % de ácidos graso poli-insaturados.
Los productos lácteos contienen colesterol y está relacionado con la concentración de ácidos grasos que contengan. Por ejemplo una mantequilla con 80 % de ácidos
grasos contiene 200 mg de colesterol por cada 100 g de
producto.
Carbohidratos y otros
La lactosa es el principal carbohidrato de la leche, con un
contenido del 5 %, es un disacárido formado de galactosa
y glucosa y proporciona un 30 % del contenido energético
de la leche. La lactosa no es soluble en agua y cuando la
leche se agria se convierte en ácido láctico.
La leche también contiene minerales, como el calcio, fósforo, magnesio, potasio y otros; y vitaminas, como la D,
esenciales para la alimentación humana.
Figura 19.
Mujer elaborando mantequilla
319
Capítulo 3
LÁCTEOS CON FERMENTACIÓN
Una de las propiedades de la leche es que invita a la propia preservación:
la propia leche tiene unos cultivos lácticos que permiten convertir sus azúcares en ácidos, permitiendo de esta forma que la leche pueda preservarse
durante períodos mayores. Este proceso hace que las propiedades de la leche cambien sustancialmente dando lugar a una nueva gama de productos:
productos fermentados de la leche gracias a la acción de las bacterias de
la familia Lactobacillales (bacterias del ácido láctico). Algunas poblaciones
como los escandinavos poseen una gran tradición en el uso de productos
lácteos fermentados. Por regla general se producen en la leche tres tipos
de fermentaciones: la primera es una fermentación láctica, donde mediante
las bacterias lácticas se consumen los azúcares de la leche; la segunda
ataca los albuminoides de la leche y la tercera se denomina fermentación
butírica y ataca a las grasas.
El yogur es leche con un grado medio de fermentación al igual que las cremas
de mantequilla como la crema agria, como la créme fraiche y el Smetana, muy
popular en los países eslavos. En algunos casos las bacterias empleadas
en la fermentación de la leche corresponden a los mesófilos denominados:
Lactococcus lactis subsp. lactis/cremoris/diacetilactis y la Leuconoctoc
cremoris, que trabajan a temperaturas dentro del rango de los 20°C–30 °C
durante periodos de tiempo entre las 16 y 20 horas. Todos los productos
lácteos contienen bacterias lácticas vivas, a menos que se haya procedido a su
pasteurización tras la fermentación.
320
Capítulo 3
YOGUR
Yoğurt es el término turco para la «leche» que ha sido fermentada hasta lograr
una forma final de masa semilíquida. El yogur permaneció desconocido en
gran parte de Europa hasta que el premio Nobel concedido al inmunólogo Ilya
Metchnikov (profesor del Instituto Pasteur de París que obtuvo el Premio Nobel
de Fisiología y Medicina en 1908) conectó la longevidad de algunas etnias en
países tales como Bulgaria, Rusia o Francia con el consumo de este lácteo. El
empleo del yogur está muy extendido en algunas gastronomías del Mediterráneo Oriental, donde se emplea como ingrediente principal de algunos platos
y bebidas muy populares (ayran). En la India se consume el Lassi, que es una
especie de yogur que se toma bebido. Una leyenda europea menciona que
el yogur (y el kéfir) nace en las laderas septentrionales del monte Elbrus en el
Cáucaso.
Uno de los productos lácteos fermentados que más se ha desarrollado es
el yogur, que desde mediados del siglo pasado se han producido diversas
combinaciones de yogur con fruta, en
este caso la fermentación se produce por bacterias acidófilas como el
Streptococcus thermophilus y el Lactobacillus delbrueckii bulgaris.
Figura 20. Yogur
Para fabricar el yogur se fermenta la
leche una temperatura de 30 a 43 °C
durante 2.5 a 20 horas. La selección
del cultivo define el tiempo de fermentación y el sabor del producto final.
Cuando se le agrega fruta al yogur,
esto se hace justo antes de empacar
el producto en una proporción es del
15 % en peso.
321
Capítulo 3
QUESO
El queso es el producto lácteo de mayor antigüedad en la historia de la humanidad, es producido de la fermentación cuajada de leche de vaca, cabra,
oveja, u otros mamíferos. El proceso consiste en cuajar la leche con cuajo o
con quimosina obtenida por biosíntesis, con una ligera acidificación y agregado
de cloruro de sodio.
La composición promedio del queso es:
35 – 55 % de agua.
10 – 40 % de proteína (caseína)
4 – 5 % de sales
La acidificación de la leche en el proceso de producción de queso se hace a
través de bacterias existentes en el líquido lácteo.
Figura 21. Queso
322
Capítulo 3
Algunas variantes de quesos frescos empleados como alimento lácteo
para untar son:
Queso cottage - Se denomina así al queso no madurado, bien sea
escaldado o no, de alta humedad en su interior, que posee textura blanda
o suave, algo granular o cremosa, preparado con leche descremada
coagulada con enzimas y/o por cultivos lácticos. Un ejemplo es la ricota
de origen italiano.
Queso crema - es un queso joven y blando que se prepara al unir el
cuajo seco del requesón con una mezcla cremosa de leche. A diferencia
del queso cottage es ligeramente dulce. El cuajo seco de requesón tiene
un contenido de materia grasa inferior al 0,5 %. Sin embargo, el requesón
deberá tener un contenido graso no menor del 4%. Un ejemplo de este
tipo de queso es el quark empleado en la cocina alemana.
OTROS PRODUCTOS LÁCTEOS FERMENTADOS
Dependiendo del cultivo de bacterias empleado en la fermentación láctica
se pueden obtener diferentes productos lácteos; algunos de los más
populares en las gastronomías de los Balcanes son el kumis y el kéfir
que emplean diversos cultivos de bacterias: Lactococcus, Leuconostoc,
Lactobacillus, el acetobacter y las levaduras que les proporcionan sabores
y aromas característicos. El kéfir es técnicamente una bebida espumosa
efervescente que por regla general se elabora a partir de leche entera
tratada térmicamente a temperatura de 95ºC. Posee en su cuerpo gránulos
gelatinosos de 2-15 mm de diámetro que están compuestos por una
mezcla de microorganismos agrupados. En Suecia, uno de los productos
lácteos más populares es el filmjölk, elaborado con cultivos mesófilos de
la Lactococcus lactis y Leuconostoc mesenteroides. Algunos productos
lácteos emplean leche de animales como el caballo, por ejemplo, la cocina
mongola, en la que fermentan la leche de caballo en una bebida que
recibe el nombre de airag.
Los lácteos probióticos son productos de leche fermentada con Lactobacillus
y Bifidobacterium, ambos presentes en la leche, pero algunas veces no se
desarrollan espontáneamente y debe estimular su producción, tal es caso del
Yakult, producto de origen japonés que se consume en todo el mundo.
323
Capítulo 3
Los alimentos prebióticos (favorecen el
crecimiento o actividad de la flora intestinal
en el colon) y los simbióticos, (mezcla de los
probióticos y de los prebióticos) se consideran
alimentos lácteos. Los prebióticos introducen
cultivos exógenos en el organismo y rara vez
son digeridos en el tracto superior del intestino,
debido en parte a la ausencia de enzimas
capaces de romper los enlaces de hidrógeno
de los monosacáridos y por esta forma actúan
como fibras digestivas que se digieren en el
colon.
INNOVACIÓN DE LOS PRODUCTOS LÁCTEOS FERMENTADOS
La reconocida aceptación de los productos lácteos los posiciona como instrumentos efectivos al apoyo de la salud y bienestar del consumidor. En particular,
las leches fermentadas han ayudado a mejor la salud intestinal, y su aceptación
y popularidad continúan en ascenso. Estas constituyen una herramienta excelente para explotar su potencial y posibilidades de innovación.
Las innovaciones actuales incluyen fórmulas nutritivas en combinación de
yogur con jugo de frutas (Smoothies), fórmulas reducidas en grasa o en carbohidratos, bebidas lácteas fermentadas fortificadas con calcio, probióticos,
extractos vegetales, adición de sabores exóticos, mezclas de sabores, empaques novedosos-convenientes y estrategias de segmentación de mercado. En
el futuro inmediato es importante considerar la fortificación con proteínas y
péptidos lácteos, los cuales poseen propiedades bioactivas como los reguladores del sistema inmunológico, reguladores del metabolismo, control de peso
y apetito, control de hipertensión y la promoción de la salud dental.
El reto para la industria de alimentos será el desarrollar productos lácteos
fermentados, más allá de su calidad nutricional, sabor, conveniencia, o inocuidad. Los nuevos productos deben promover la salud y el bienestar del
consumidor.
324
Capítulo 3
Actividad 19
Hacer unta tabla que contenga los cinco siguientes
productos: lácteos fermentados: leche fermentada, leche
búlgara, leche de acidófilos, yogur y kéfir, con sus
correspondientes microorganismos que lo producen y la
descripción del producto.
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
325
Capítulo 3
Actividad 20
Tomando como base las necesidades del mercado y la
presión de la industria, indica los principales criterios de
innovación en la producción de productos fermentados
lácteos.
Práctica
C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84
C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0
C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86
326
C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Actividad 1: a)
Figura 3. Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad
específica de crecimiento de dos organismos A y B.
Gráfica del Efecto de la concentración del sustrato de un método de preservación.
sobre la velocidad específica de crecimiento de
dos organismos Ay B
En cultivo continuo el valor de µm está
determinado por la concentración de sustrato y
es igual en estado estacionario a la velocidad de
dilución (D). A valores de u = D < µz se tiene que
µA > µB y por lo tanto el organismo A podrá ser
seleccionado a pesar de que µmA < µmB (µz =
valor de µ a partir del cual µB > µA).
c).
El método de preservación utilizado en
los cultivos depende de sus características de
crecimiento en diferentes medios. Los cultivos,
en general, no son estudiados sistemáticamente
debido a la imposibilidad de determinar si se ha
tenido una alteración genética. En la mayoría
de los casos sólo se observan la pigmentación,
la morfología, las reacciones fermentativas, las
propiedades microscópicas, etc.
b).
a) Preservar la pureza genética del cultivo
sin pérdida de ninguna de sus propiedades
bioquímicas; b) preservar los niveles de su
productividad inicial; y c) lograr que el cultivo
pueda ser transportado y manejado con facilidad.
Esto puede ser un factor esencial en la selección
327
Capítulo 3
a) En este caso se puede establecer la siguiente
ecuación basada en la estequiometría:
0.585 C12 H22 012 + 3.205 02 + 0.61 NH3
C3,72 H6.11O1.95N0
(Sacarosa)
.61
+
3.30
C02
+
(Biomasa) +4.29 H 20 + 387 Kcal.
En la ecuación anterior se representa la
formación de 100 g de biomasa a partir de 200
g de sacarosa. En este caso no se han indicado
los elementos menores como el P. el S, y el
Mg, por eso es que la suma da 90.46 en lugar de
100. Esta es la demostración de que toda fuente
de carbono se puede emplear para obtener
biomasa y CO2.
b) La esterilización de gases y líquidos
fundamentalmente es llevada a cabo por
filtración mediante filtros absolutos o filtros
fibrosos.
Los filtros absolutos son de materiales
cerámicos, de vidrio o de metal sinterizado con
poros tan pequeños que la penetración de los
microorganismos no es posible.
Los filtros fibrosos no son absolutos y el material
filtrante puede ser lana de vidrio, amianto y
esteres de celulosa, siendo las fibras de un
diámetro variable de 0.5 a 15 micrones.
328
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Regulación de la síntesis de lisina en Corynebacterium
glutamicum
329
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Distintas penicilinas que pueden obtenerse en función
del precursor de la cadena lateral y a partir del
Penicillican chrysogenum.
330
Capítulo 3
Actividad 5
La producción de penicilina como otros procesos biotecnológicos está dominada
por su aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores, que
realizan permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada área del proceso: cepa,
fermentación y separación. El proceso a grandes rasgos implica el cultivo de
Penicillican chrysogenum en reactores de volumen creciente hasta una escala de
500.000 l, separación del micelio por filtración y extracción del antibiótico del
caldo, seguida por la cristalización o precipitación ácida del mismo.
Las distintas penicilinas son producidas a partir de P. chrysogeizuin por adición de
una apropiada cadena carboxílica en cantidad adecuada en el medio de cultivo;
pero solamente tienen valor terapéutico la penicilina G y la V. Ambas tienen un
espectro y actividad similar, pero la penicilina V es más estable a pH ácido, lo
que permite su administración por vía oral.
Actividad 6
Los procedimientos en medios líquidos son en general largos y requieren gran
cantidad de material. La ventaja es que el proceso es controlado en condiciones
relativamente comparables a las de producción en relación a agitación y aeración.
El test en placas es más rápido, permite controlar un mayor número de colonias
con menor material, pero en condiciones que no reproducen la fermentación en
medio líquido. Se trata aquí de evaluar la cantidad de antibiótico excretado por una
colonia. Una variante consiste en cubrir la placa con un celofán estéril y agregar
sobre el mismo una capa de agar conteniendo el organismo indicador, incubando
luego la placa toda la noche. De esta forma, las colonias de los mutantes son
mantenidas libres de contaminación por el organismo sensible. En este caso el
tamaño de la zona de inhibición es controlado por el espesor de la capa.
331
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Actividad 7
Se requiere de un vector de expresión, el cual debe ser capaz de entrar y
replicarse dentro de ella. Un vector ideal debería ser pequeño, de fácil preparación
y replicación en la célula huésped, no generar productos tóxicos para la misma,
poseer uno o más marcadores (resistencia a drogas, etc.) para facilitar una rápida
y positiva selección y contener al menos un sitio donde se pueda integrar el ADN
extraño sin destruir una función esencial (replicación).
Actividad 8
Pueden ser ligadas, ya sea por el ADN ligasa del bacteriófago T4 si los extremos
son romos, o por la acción de la ligasa de E. coli, o de T4 si son cohesivos.
Actividad 9
1.Mantenimiento n Cultivo puro. (PUREZA)
2.Que esté viva (VIABILIDAD)
3.La cepa debe guardarse genéticamente estable. (ESTABILIDAD)
Actividad 10
Método de elección o de conservación a largo plazo
– Conservación por congelación
– Conservación por liofilización
Métodos Alternativos
– Conservación por transferencia periódica
– Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar
estéril
Actividad 11
Recuento en cámara de Neubauer Es una cámara que se utiliza para contar
glóbulos y está diseñada de manera de contener una cantidad fija de líquido.
Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada
uno de ellos está, a su vez, dividido en 16 cuadrados.
Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros
laterales, de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una
distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cámara. Esto determina que el
líquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3.
332
Capítulo 3
Actividad 12
1. El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos
días, así como para las operaciones de más larga duración.
2. Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir
las necesidades metabólicas de los microorganismos.
3. El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.
4. Debe tener un sistema para el control del pH.
5. El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.
6. Debe existir un sistema para el control de la temperatura.
7. Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas.
8. El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el
funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas.
9. El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de
procesos.
10. Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea
posible, soldaduras.
11. La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños
o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos
en diferentes escalas.
12. Deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados
satisfactorios.
13. Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.
Actividad 13
Los fermentadores más ampliamente utilizados en el nivel industrial están provistos
de mecanismos de agitación, dispersión y aireación, así como de sistemas para el
control de la temperatura, pH y formación de espuma.
Actividad 14
Consiste en pasar el medio fresco a través de un biorreactor en el que por
diversas técnicas hemos inmovilizado células (o enzimas). En el biorreactor se
producen las transformaciones bioquímicas que deseamos y recuperamos el
producto transformado tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan
los problemas de desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo clásico y además
el producto resultante está libre de células. Presenta el inconveniente de que no
todos los microorganismos pueden inmovilizarse.
333
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Actividad 15
MAQUINARIA Y EQUIPO.
A.
Equipo de fermentación:
Fermentadores continuos.
Equipo de disolución de la melaza
Tanque de almacenamiento del caldo.
Tanque medidor del caldo.
B.
Equipo de destilación:
Columna de la masa.
Columna del aldehido.
Refrigerador del producto.
Tanque de almacenamiento de polvo.
Refrigerador.
Máquina de entrega de residuos.
Tanque medidor de alcohol.
Columna del producto.
Columna de tratamiento.
Examinador de residuos.
Columna de aceite combustible.
Separador.
Columna para el producto refrigerado.
Precalentador de la masa.
Columna para el producto refrigerado.
Columna para el refrigerador de la base.
Columna para el refrigerador.
Columna para el refrigerador.
Sistema de entrega de los desechos de gas.
Columna para el refrigerador.
C. Equipos de servicio:
Caldera de vapor.
Bombas de alcohol.
Tanque de la masa.
Bomba de agua.
Panel eléctrico.
Filtros de alcohol.
D. Equipo automático:
334
Capítulo 3
Sistema de entrega automática.
Control automático de vapor.
Registrador de temperatura.
Controlador de flujo.
Regulador automático de la masa o mezcla.
E. Equipo de laboratorio:
Medidor de pH.
Microscopio.
Medidor de viscosidad.
Medidor de sacarosa.
Fotómetro eléctrico.
Medidor de atincado.
Refractómetro.
Actividad 16
La planta de alcohol etílico podría ser ubicada cerca de un suministro de caña de
azúcar y del mercado de alcohol etílico con buenas facilidades de transportación.
La mayor parte de la planta será ubicada en área abierta, pero el cliente podría
requerir una estructura de concreto reforzada para soportar aquellos servicios
ubicados en posiciones elevadas.
Actividad 17
Se deben tener en cuenta criterios como el sustrato necesario y los posibles
suplementos del mismo, la velocidad de crecimiento, productividad y rendimiento
del sustrato, el pH y la temperatura, la aireación, morfología del crecimiento en el
fermentador, seguridad y no patogenicidad, ausencia de productos tóxicos, facilidad
de recuperación de las proteínas de organismos unicelulares, la composición
proteica, el contenido de RNA (indeseable para la utilización humana)
Los hongos tienen la capacidad de degradar un amplio rango de productos
vegetales y son fáciles de recuperar por filtración, pero son difíciles de airear en
su morfología filamentosa que optimiza la velocidad de crecimiento de los mismos.
Por su parte las bacterias crecen muy rápidamente, pero exigen de refrigeración
en el fermentador. Las bacterias y levaduras son más fáciles de airear pero más
difíciles de recuperar que los hongos, exigiendo técnicas de sedimentación y
centrifugación. Además, aunque las bacterias tienen mayor contenido proteico que
los hongos, estos tienen un nivel mayor de RNA indeseable nutricionalmente.
335
Capítulo 3
Respuestas a las actividades
Actividad 18
El término se refiere a un complejo formado por varias
enzimas, presentes en diversas proporciones, capaces de
actuar sobre pectinas y sus derivados. El grupo incluye:
1. Pectin esterasa, que actúa para desesterificar pectinas,
removiendo los grupos metoxilo y produciendo ácido
péctico.
2. Enzimas despolimerizantes que actúan principalmente
sobre pectina, ácidos pépticos y protopectina.
Actividad 19
Productos con base en fermentación de la leche.
Productos fermentados de leche
PRODUCTO
Leche
fermentada
Leche búlgara
336
MICROORGANISMOS
Streptococcus sp.
Leuconostoc sp.
Lactobacillus
bulgaricus
Leche de
acidófilos
Lactobacillus
acidophilus
Yogurt
Streptococcus
thermophilus,
Lactobacillus
bulgaricus
Kefir
Streptococcus
lactis, Lactobacillus
bulgaricus, Levaduras
DESCRIPCIÓN
Fabricada con leche total o parcialmente
descremada y pasteurizada.
Leche fermentada con alta acidez y poco
aroma.
Leche fermentada por L. acidophilus. Esta
leche se usa por su valor benéfico al
tracto digestivo y mejora el estado de
salud.
Producto de leche con sólidos
concentrados por evaporación o por la
adición de sólidos de leche descremada.
Producto con consistencia de budín.
Leche fermentada conteniendo ácido
láctico y alcohol. Las bacterias lácticas
producen ácido láctico, las levaduras
producen alcohol.
Capítulo 3
Actividad 20
- La preferencia del mercado por alimentos
dulces ha sido determinante en la aceptación
de productos lácteos como bebidas edulcoradas
refrescantes y postres, y no sólo de alimentos con
valor nutrimental.
- La demanda por alimentos bajos en calorías
se aprovecha para diseñar productos reducidos
en grasa o en carbohidratos, dirigidos al apoyo
de programas de reducción de peso en personas
preocupadas por su figura.
- Las campañas de promoción y comercialización,
encaminadas a mejorar la imagen de estos
productos en el mercado y aumentar así sus
ventas.
La orientación de la publicidad y su mensaje
hacia las generaciones más jóvenes, quienes han
respondido en forma entusiasta.
La investigación y desarrollo tecnológico realizados
para lograr innovaciones en estos productos, puede
conducir a un importante aumento en su aceptación.
337
Capítulo 3
Autoevaluación
Fermentación de productos industriales
1. El ámbito de la Biotecnología microbiana
o Microbiología industrial se centra
principalmente en:
(a) La comercialización de cepas microbiana
(b) Las actividades útiles de los
microorganismos
(c) La alimentación de los microorganismos
(d) Los efectos perjudiciales de los
microorganismos
Actividad
2. ¿Cuál es la fuente más frecuente
de aislamiento de una cepa de interés
industrial?
(a) Aislamiento directo de fuentes naturales,
como agua, suelo, plantas y desechos.
(b) De cultivos desarrollados en el laboratorio.
(c) De microorganismos modificados
genéticamente.
(d) De enriquecimiento de cultivos mixtos,
buscando favorecer el crecimiento del
microorganismo deseado.
Práctica
3. ¿Cuál es la principal característica que
debe reunir la preparación de medios para
el desarrollo de procesos de fermentación.
(a) Bajos requerimientos de nutrientes.
(b) Que no requiera de micronutrientes o en
una cantidad muy pequeña.
(c) Que los nutrientes solo sean de origen
animal o vegetal.
(d) Que tenga factores de crecimiento
adecuados para asegurar una alta
productividad.
338
4. ¿Con qué finalidad se diseña un medio de
fermentación?
(a) Conocer los requerimientos nutricionales
de las cepas por utilizar en el proceso
fermentativo
(b) Determinar la disponibilidad real de los
componentes del medio de fermentación
(c) Determinar los componentes necesarios
para lograr el crecimiento de las cepas y la
formación de los productos por fabricar.
(d) Conocer los mecanismos bioquímicos que
regulan la formación de los productos de
fermentación.
5. ANÁLISIS DE UN CASO: se desea
desarrollar una levadura para la industria
vinícola y obtener 30 gramos de biomasa/
lt en un fermentador. Determina las
condiciones del medio de cultivo, su
formulación y optimización del proceso.
6. ¿Qué significa esterilización?
(a) Es la remoción o destrucción por cualquier
vía de organismos vivos que pueden causar
daño particular o infección.
(b) Es la exclusión continuada de
microorganismos contaminantes.
(c) Es la eliminación de toda forma de vida de
un medio o material, lo que se lleva a cabo
generalmente por medios físicos
(d) Es el proceso que se utiliza para la
destrucción de algunos de los microorganismos
posiblemente presentes en materiales sensibles
al calor como la leche y cerveza.
Capítulo 3
7. ¿Cuál es el primer aspecto para
considerar en el desarrollo de de un
proceso fermentativo?
(a) Determinación de la temperatura óptima
(b) Determinación del pH
(c) Determinación de la presión osmótica
(d) Selección de una cepa microbiana
apropiada
8. ¿En qué consiste la mutación inducida
de los microorganismos?
(a) La que ocurre cuando se produce una
división celular
(b) Es la mutación producida mediante el
empleo de un mutágeno
(c) Cuando el elemento mutagénico es
desconocido
(d) Es la mutación que ocurre
espontáneamente
9. ¿Qué son los metabolitos?
(a) Son elementos esenciales para la vida de
un microorganismo
(b) Son los nutrientes de los microorganismos
(c) Son los oligoelementos que requieren los
microorganismos en su alimentación
(d) Es el producto eliminado por la célula
debido a la permeabilidad de la membrana
celular
10. ¿Cuál de las siguientes opciones es un
metabolito secundario?
(a) Los aminoácidos
(b) Los antibióticos
(c) Las melazas
(d) Las vinazas
11. ¿Para qué se lleva a cabo la
conservación de cepas?
(a) Para su regulación gubernamental
(b) Para mantener la supervivencia de las
cepas sin alteración genética
(c) Para la manipulación de las cepas
(d) Para el desarrollo de las cepas
12. ¿Cuál de los siguientes factores no
afecta la velocidad de fermentación?
(a) La textura de las células
(b) La temperatura
(c) La concentración de las cepas
(d) La presencia de catalizadores
13. ¿Cuál es la función más específica de
las enzimas en los procesos fermentativos?
(a) Actúan como inhibidores de los procesos
fermentativos
(b) No tienen ninguna función específica en la
fermentación
(c) Cambia las reacciones de fermentación
(d) Aumenta la velocidad de fermentación
339
Capítulo 3
14. ¿En qué modo de operación de las
fermentaciones se introduce parte de la
materia prima por procesarse al principio del
proceso, luego se inocula la misma con el
microorganismo seleccionado comenzando el
proceso de la fermentación. Posteriormente se
adiciona el resto de la materia prima durante el
tiempo de la fermentación, utilizando un criterio
preestablecido para la razón de alimentación?
(a) Operación por lotes
(b) Operación continúa
(c) Operación semicontinua
(d) Operación Fed-Batch
15. ¿Cuál grupo de tres parámetros son
principalmente controlados en la operación de
los fermentadores?
(a) Temperatura, concentración del microorganismo
y tamaño del fermentador
(b) Temperatura, pH y concentración de oxígeno
disuelto
(c) Temperatura, densidad del caldo de fermentación
y pH
(d) Temperatura, diámetro del fermentador y
producción de CO2
16. En la fabricación de un producto para elegir si
se lleva a cabo por vía química o biotecnológica,
se toman en cuenta varios factores, entre ellos
¿cuál es el más importante?
(a) El tamaño del equipo
(b) El transporte de la materia prima
(c) El costo del proceso
(d) La temperatura de operación del proceso
340
Capítulo 3
17. En la producción de etanol ¿cuál es la
principal materia prima que se utiliza
mayoritariamente?
(a) El petróleo
(b) Las melazas (subproducto en la fabricación de
sacarosa)
(c) Los cereales
(d) Síntesis química
18. ¿Cuál de los ácidos orgánicos es el que se
produce en mayor cantidad por fermentación?
(a) El ácido cítrico
(b) El ácido glucónico
(c) El ácido acético
(d) El ácido málico
19. ¿Cuáles fueron las dos enzimas que se
produjeron primero?
(a) Renina y amilasa
(b) Proteasa y lipasas
(c) Isomerasa e invertasa
(d) Pectinasa y esterasa
20. ¿Qué son los antibióticos?
(a) Son microorganismos que curan enfermedades
microbianas
(b) Son cepas modificadas genéticamente para
combatir enfermedades virales y bactereanas
(c) Son extractos de plantas que curan diversas
enfermedades actuando como bacteriostáticas
y antifúngicas
(d) Son substancias químicas producidas por
organismos vivientes, en la mayoría de los casos,
capaces de inhibir los procesos bacterianos y
fúngicos
341
Capítulo 3
Respuestas a la autoevaluación
1. (b)
2. (a)
3. (d)
4. (c)
5. Para tener una biomasa de levadura de 30 gal/ se deberá formular un medio
de por lo menos con 60 g/lt de fuentes de carbono asimilable. Con respecto a la
fuente de nitrógeno, ésta debe estar en concentración tal como para satisfacer las
condiciones necesarias, como es 0.61 moles de NH3 o sea 10.37 g de amoníaco, lo
que representa 8.54 g de N2. Ya tenemos por lo tanto la cantidad de la otra fuente
fundamental a ser agregada. Del conocimiento de la composición centesimal de
otros componentes menores se pueden establecer así las cantidades por agregar.
Por otro lado, sabes que la levadura necesita para crecer algunas vitaminas
del grupo B como la biotina, tiamina, ácido pantoténico, etc. Esas vitaminas
deben estar por lo tanto presentes en el medio. Como el proceso de
producción de levadura es un proceso industrial que interesa desarrollar
con costos de producción mínimos, es conveniente estudiar las fuentes de
carbono, nitrógeno y de vitaminas y minerales más económicos y disponibles
que puedas encontrar. Surge así la elección lógica de las melazas de caña
de azúcar o de remolacha que reúnen la mayor parte de las condiciones.
Para evitar la formación de alcohol y maximizar la producción de biomasa
se debe implementar una alimentación programada utilizando melaza como
sustrato limitante, de lo cual resulta la elección de un sistema de lotes
alimentado para la producción.
Para llevar a cabo una optimización del medio de cultivo para el desarrollo
de la levadura deberán considerarse las situaciones siguientes:
1) No existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de
macro y microelementos para el cultivo de la levadura.
2) Existencia de limitaciones nutricionales
microelementos y factores de crecimiento.
342
ocultas,
especialmente
de
Capítulo 3
3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en
exceso respecto de los requerimientos nutricionales de
la levadura en cuestión, que pueden causar inhibición
del crecimiento.
4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e
inhibidoras del crecimiento y formación del producto.
5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
6.(c)
7.(d)
8.(b)
9.(a)
10.(b)
11.(b)
12,-(a)
13.(d)
14.(d)
15.(b)
16.(c)
17(b)
18.(c)
19.(a)
20.(d)
343