Guía para las simulaciones de experimentos en BAÑOS DE

Grado en Farmacia / Medicina
Universidad de Alcalá
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Curso Académico 2016‒2017
Apellidos:
Nombre:
Curso / Facultad:
Dr. Álvaro Cortés Cabrera
Dr. Pedro Alejandro Sánchez Murcia
Prof. Federico Gago Badenas
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ORGAN BATH SIMULATIONS
SIMULACIÓN DE EXPERIMENTOS EN BAÑOS DE ÓRGANOS
1. Starting an Experiment
To start a new experiment:
a) Select the type of tissue to be placed within the organ bath from the Tissue Type list.
b) Click the New Experiment button.
c) Click the Record button to start the chart recorder running.
d) Nerve stimulation / Select and apply drugs from the list of available Agonists and
Antagonists.
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Note. Four types of tissue are available:
The guinea pig ileum is a section cut from the ileum region of a guinea pig’s
gastrointestinal tract. The smooth muscle within the ileum contracts in response to the
application of a variety of agonists. It also has nerves within it which can be electrically
stimulated to produce contraction.
The chick biventer cervicis is a skeletal muscle from the neck of a young chicken. It is
dissected out with the nerve which innervates it intact. It can be made to contract by the
application of agonists or by electrical stimulation of its nerve.
The rabbit arterial ring is a section cut from a rabbit artery and attached to a force
transducer. It can be made to contract by the application of either KCl or the agonist
noradrenaline. The artery can be made to relax again by applying a number of
antagonists.
The rabbit jejunum (Finkleman's preparation) is a section cut from the jejunum region
of a rabbit’s gastrointestinal tract. It contracts spontaneously and these contractions can
be inhibited by the application of adrenergic agonists or by stimulation of the
sympathetic nerve supply.
2. Adding Agonists
To add an agonist drug to the organ bath:
a) Select the type of agonist to be applied from the list of available agonists.
b) Select the concentration of the drug solution to be applied from the Stock Soln. list.
c) Enter the volume (between 0 and 1 mL) of the stock solution to be applied into the
Volume box.
d) Click the Add to Organ Bath button to inject the selected volume of the select stock
solution agonist into the organ.
e) When the tissue response on the chart recording reaches a steady state (or after 30
seconds if no response has occurred) click the Flush Reservoir to Bath button to wash
out the agonist from the organ bath.
Note. Agonists are drugs which, when applied to tissue, cause a response (contraction in
the case of the tissues typically studied in organ baths) by binding to specific receptors
on the surface of the cells within the tissue.
3. Adding Antagonists
To add an antagonist drug to the organ bath or Krebs’ solution reservoir:
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a) Select the type of antagonist to be applied from the list of available antagonists.
b) Select the concentration of the drug solution to be applied from the Stock Soln. list.
c) Enter the volume (between 0 and 1 mL) of the stock solution to be applied into the
Volume box.
d) Select Organ Bath from the Add To list if the antagonist is to be applied directly to
the organ bath. Select Reservoir if the drug is to be added to the Krebs solution
reservoir.
e) Click the Add to button to inject the volume of the selected stock solution agonist
into the organ bath or reservoir.
Note. Antagonists are drugs which block the actions of agonists on tissue, reducing or
preventing the tissue response to the agonist. Application of an antagonist will thus have
no apparent effect on the tissue in the organ bath unless an agonist is present (or the
tissue is being stimulated).
Antagonists are typically studied by observing the effects an antagonist has on different
concentrations of a chosen agonist. To avoid the necessity of repeatedly applying the
antagonist to the organ bath before each agonist, it is usually added to the Kreb’s
solution reservoir of Krebs’ solution used to flush the organ bath between agonist
applications.
4. Calculating Final Bath Concentration (Organ Bath)
The final bath concentration (FBC), in M (Moles/litre), is related to the stock solution
concentration [stock] (in M) the volume of stock added to the bath (in mL) and the
tissue bath volume (mL) by the formula:
FBC 
[ stock ]  volume added
bath volume
The organ volume is 10 mL. Thus, adding 0.1 mL of a 10-4 M stock solution gives a
final bath concentration of 10-6 M.
The bath dilution formula can be rearranged to work out the volume you need to add to
achieve a required FBC:
Volume added 
[ FBC]  bath volume
stock
You should aim to add volumes between of 0.1 – 0.5 mL to the tissue bath (less than
0.1 mL is difficult to measure accurately and more than 0.5 mL starts to increase the
solution volume in the bath significantly).
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5. Calculating Final Bath Concentration (Reservoir)
When applying drugs to the Krebs’ solution reservoir, the resulting concentration within
the reservoir [RC], in M (Moles/litre)., is related to the stock solution concentration
[stock] (in M) the volume of stock added to the reservoir (in mL) and the reservoir
volume (mL) by the formula:
RC 
[ stock ]  volume added
reservoir volume
The reservoir volume is 1000 mL. Thus, adding 0.1 mL of a 10-3 M stock solution gives
a final bath concentration of 10-7 M.
The dilution formula can be rearranged to work out the volume you need to add to
achieve a required reservoir concentration:
Volume added 
[ RC]  reservoir volume
[ stock ]
You should aim to add volumes greater than 0.1 mL to the reservoir (less than 0.1 mL
is difficult to measure accurately).
6. Measuring Tissue Responses
To measure the peak amplitude of tissue contractions:
a) Click the Stop button to stop recording.
b) Using the scroll bar at the bottom of the chart recorder display, select a section of the
recording containing the tissue contraction to be measured.
c) Drag the measurement cursor on the chart display to the point on the recording trace
to be measured (the peak of nerve stimulated responses, or the plateau of agonist
responses). The contractile force at the cursor point (in units of grams) is displayed
below the cursor.
7. Menu Options
Printing a chart recording
To print a copy of the displayed chart recording on a printer, select Print from the File
menu.
Copying the chart recording to other programs
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To copy the data points of the displayed chart recording to the Windows clipboard for
pasting into a spreadsheet or graph plotting program, select Copy Data from the Edit
menu.
To copy the a picture of the displayed chart recording to the Windows clipboard for
pasting into a Word document or a PowerPoint presentation, select Copy Image from
the Edit menu.
Saving a chart recording to file
To save the current chart recording for the current experiment to a data file, select Save
Experiment from the File menu and enter the name of a new data file.
Loading an existing chart recording from file
To load a previously saved chart recording from a data file, select Load Experiment
from the File menu and enter the name of the data file.
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2.1. Simulación de íleon de cobaya aislado
El término simulación se refiere la imitación de una cosa o un proceso real. Las técnicas
de simulación se emplean en multitud de campos de la tecnología, ingeniería,
formación, aprendizaje y educación. En nuestro caso, en esta sesión de prácticas vamos
a emplear el programa de simulación de baño de órganos Virtual Organ Bath de la
Universidad de Strathclyde, que está disponible de forma gratuita en la dirección
http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_sims.htm .
PASOS
1. Vaya al menú de inicio y abra el programa OBSim > OBSim.
2. Una vez abierto el programa de simulación, examine los siguientes
apartados:
a. Tipo de tejido (Tissue type). Presione ON > New experiment.
b. Verá que en los menús que aparecen dos menús de agonistas y
antagonistas, en los cuales aparecen diferentes fármacos a
distintas concentraciones (nota: no puede añadir más de 1 mL de
disolución de fármaco, el volumen para el baño de órganos viene
determinado en 10 mL y el volumen de reserva son 1000 mL).
c. En el eje de las abscisas (X) se representa el tiempo en minutos.
d. En el eje de las ordenadas (Y) se representa la fuerza de
contracción en gramos.
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3. Seleccione íleon de cobaya como tipo de tejido e histamina como
agonista.
Después
presione
Experimental
Setup
para
ver
la
representación del montaje experimental.
4. Vuelva a Chart y presione ahora Record para comenzar el experimento.
Compruebe que la línea base está estabilizada.
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5. Seleccione el volumen y la concentración stock de histamina que desea
añadir al baño de órganos con el fin de obtener una concentración final
en el baño de órganos de 10-9 M (e.g. 1 mL  10-8 M / 10 mL). Presione
entonces Add to Organ Bath; compruebe que la concentración deseada
coincide con la que aparece en la parte inferior del registro. Deje la
histamina durante unos 5 s (i.e. ~ 1 división vertical), y presione a
continuación Flush Reservoir to Bath, con el fin de lavar el órgano y
eliminar la histamina. Espere hasta que se recupere la línea base.
6. Añada dosis crecientes de histamina (2x, 5x, 10x) usando el
procedimiento anterior (e.g. 0,2 mL  10-7 M; 0,5 mL  10-7 M; 0,1 mL  106 M; etc), dejando 5 s entre cada una de las administraciones (“dosis”) y
lavando entre ellas. Continúe hasta que se alcance la respuesta máxima
(Emáx = 100% efecto).
7. Para cada concentración de histamina en el baño (que aparece
mostrada en la parte inferior del gráfico), mida la fuerza de contracción
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("gms") desplazando la línea verde vertical con el botón izquierdo del
ratón hasta los puntos deseados. Anote el valor en cada caso.
8. Rellene la siguiente tabla y construya finalmente la “curva dosisrespuesta” representando la fuerza de la contracción, expresada como
% del efecto máximo, frente al log[histamina] en el baño.
concentración
(M)
1 10-9
5 10-9
1 10-8
2 10-8
5 10-8
1 10-7
2 10-7
5 10-7
1 10-6
Respuesta
(g)
% Emáx
(H sola)
10
Respuesta
(g)
% Emáx
(H + antag.)
9. En un nuevo experimento, utilice ahora la CE 50 de histamina obtenida de
la gráfica anterior y, sin lavar, añada al baño mepiramina (Mepyramine)
para obtener una concentración de 1 nM de este antagonista. Observe el
efecto y razone el resultado.
10. Pruebe a añadir concentraciones mayores y menores de agonista y
antagonista en este mismo orden. Razone los resultados cualitativos
obtenidos.
11. En un nuevo experimento, examine el efecto de invertir el orden de
adición de agonista y antagonista. Observe los efectos y razone los
resultados cualitativos obtenidos.
12. En una nueva serie de experimentos, añada al reservorio una cantidad
de mepiramina tal que dé lugar a una concentración de 10-9 M.
Compruebe que la concentración deseada coincide con la que aparece en
la parte inferior del registro. Presione Flush Reservoir to Bath y repita los
puntos 6‒8.
13. Anote los datos en la misma Tabla del punto 8 y represente en la misma
gráfica la nueva curva dosis-efecto para la histamina, teniendo en cuenta
que necesitará una concentración superior a 110-6 M de histamina para
obtener el efecto máximo. Compare los resultados y determine la CE50 en
presencia del antagonista. Calcule la "razón de dosis".
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Apellidos / Nombre:
Grado:
Curso:
Grupo Prácticas:
PROBLEMA 1: receptores opioides intestinales
A. (i) Seleccione “Guinea pig ileum” como material biológico sometido a estudio. Haga clic en Record
para comenzar el registro y presione ON en Stimulation – Nerve. La estimulación eléctrica manda trenes
de ondas cuadradas al plexo mientérico y se produce la contracción de la musculatura lisa intestinal por la
acetilcolina liberada por la neurona posganglionar de forma altamente reproducible. Seleccione ahora
Morphine de la lista de Agonists, fije la concentración de la solución madre (Stock soln.) en 10-6 M y, al
cabo de unas 5 contracciones, añada al baño de órganos 0,1 mL de la solución de Morfina. Lave el
órgano (Flush Reservoir to Bath) y, una vez recuperada la contracción máxima, añada 0,2 mL de la
misma solución. Lave y repita con 0,5 mL de la misma solución. Anote, en cada caso, el cambio en la
fuerza de la contracción correspondiente a cada concentración de morfina en el baño (es decir, la
diferencia entre los valores en ausencia y en presencia de morfina). Vuelva a lavar y repita las
administraciones, incrementando progresivamente la concentración en el baño hasta que obtenga el
efecto máximo posible (Emáx). Calcule y represente gráficamente los (% Emáx) obtenidos frente a las
concentraciones de Morfina haciendo uso del papel semilogarítmico (o utilizando Excel). Compare sus
resultados con los registros mostrados en la figura de la página 14.
(ii) Lave el órgano (Flush Reservoir to Bath) y observe la recuperación de los valores basales.
(iii) Repita el experimento con la concentración de Morfina que da lugar al 50% del efecto máximo (CE50)
y observe el efecto de añadir al baño de órganos 0,15 mL de una concentración de Naloxona (en la lista
de Antagonists), por ej. 10-3 M, sin lavar previamente. Pruebe también con otras concentraciones para
comprobar la dependencia de los efectos observados con la “dosis”. Invierta el orden de adición de estos
dos fármacos y razone el resultado obtenido.
B. (i) En un nuevo experimento, añada al reservorio 1 mL de una solución que contenga 10-2 M de
Naloxona. Presione Flush Reservoir to Bath para que la preparación esté en todo momento en presencia
de este anatagonista y repita el experimento anterior, empezando por una concentración de Morfina en el
baño de 110-8 M y aumentando progresivamente las concentraciones hasta que consiga el Emáx.
(ii) Compare las gráficas obtenidas para Morfina, en presencia y ausencia de Naloxona, representando
en ordenadas el efecto (como % Emáx) y en abscisas el logaritmo de la concentración molar de Morfina en
el baño (comenzando por 10-8 M). Utilice el siguiente papel semilogarítmico y/o una hoja de Excel en su
ordenador. Calcule la "razón de dosis".
(iii) ¿Qué ocurriría si repite la secuencia de adiciones de Morfina realizada en el experimento anterior
pero en presencia de una concentración de Naloxona en el baño de 510-5 M? Para ello debe calcular
primero la dosis que necesita añadir al reservorio mediante un volumen medido con la jeringa.
(iv) ¿Cómo procedería para calcular el pA2 (grado de antagonismo) de Naloxona?
(v) Caracterice en esta misma preparación la acción farmacológica de Loperamida.
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Recordatorio de las clases teóricas:
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Trabajo personal: estudie los efectos de Acetylcholine, Carbachol o Pilocarpine
como agonistas y Atropine como antagonista. Razone los resultados.
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15
Papel semilogarítmico
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