MODELAMIENTO DEL EFECTO DEL CLORURO DE SODIO SOBRE EL CRECIMIENTO Y LA PRODUCCIÓN DE NISINA DE Lactococcus lactis. RESUMEN Lactococcus lactis es una bacteria ácida láctica que generalmente se encuentra en la leche y productos lácteos. Se caracteriza por producir nisina el cual tiene efecto antimicrobiano. Su aislamiento permitirá utilizarlo en la conservación de alimentos que tienen compromiso con bacterias patógenas responsables de las ETAs. El bjetivo del presente estudio fue estimar la bondad de ajuste de la curva de crecimiento de L. lactis mediante el uso de modelo de Gompertz modificado y obtener parámetros cin icos para ser utilizados en modelos secundarios que estimaron el efecto del cloruro de sodio en concentraciones de 2, 4 y 6% sobre su biocinética de l crecimiento celular y la producción de bacteriocinas. Se investigaron, en condiciones in vitro, fermentaciones usando el caldo MRS con glucosa 20 g/L. Se midieron el consumo de glucosa, producción de ácido láctico, p cción de biomasa y nisina, bajo el efecto de las concentraciones creciente de sal. Los resultados demostraron que el modelo de Gompertz modificado explica el crecimient de L. lactis obteniendo una velocidad de crecimiento específico de .30 Log UFC/mL/h. Así mismo, el crecimiento celular y la actividad de bacteriocinas se vieron afectados por los cambios en la concentración de sal. La concentración de NaCl al 2% no afecta sustancialmen e el crecimiento y la actividad de la nisina. El efecto neg vo de concentraciones mayores a 2% se traduce en una disminución de la producción específica de nisina (k B) y en consecuencia en la actividad de la bacteriocina.El efecto inhibitorio del NaCl se debió principalmente a su papel como agente reductor de a w. 1 I. INTRODUCCION Actualmente existe una gran variedad de productos quím cos que son utilizados por la industria en la conservación de los alimentos, pero los esfuerzos por proteger además, sus propiedades alimenticias y gustativas aumentaron consi erablemente en los últimos años. Si bien la conservación por adición de sustancias quím cas presenta muchas ventajas, parte de la población rechaza fuertemente su uso por temor a sus posibles efectos tóxicos. Esto llevó a las industrias elaboradoras de alimentos a la squeda de alternativas que permitan suprimir la adición de tales sustancias o reducir las is para satisfacer las exigencias de los consumidores, con el riesgo de que se puedan afect la estabilidad microbiológica del producto En algunos alimentos la adición de ácido acético entre 0,5% y 1,2% es una alternativa para controlar células vegetativas de microorganismos patógenos. Aunque estas condiciones son generalmente de carácter bactericida, un limitado grup de microorganismos acidófilos es capaz de crecer bajo estas condiciones lo que se evidencia por la generación de dióxido de carbono y aroma indeseable. Por otro lado, se ha demostrado que los sorbatos retar an el crecimiento de numerosos microorganismos, este es el antimicrobiano más utilizado en jugos, salsas y aderezos; siendo su acción inhibitoria generalmente más pronunciada contra hongos y levaduras que contra bacterias; Así mismo, el antimicrobiano nisina resulta efectivo contra un gran grupo 2 de bacterias Gram (+), por lo que el uso nisina-sorbato podría ser una alternativa para la reducción de la concentración del preservador químico. La nisina es ampliamente usada desde 1953, recientemen e recibió la calificación de GRAS (“Generally Recognized As Safe”, sustancia recono ida generalmente como segura) por parte de la US FDA (Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos) para su utilización en alimentos con acidez alta y baj . Debido a las características de que muchos alimentos procesados por la industria alimentaria, el uso de nisina en los mismos se vería favorecido. De todas las sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias lácticas, las bacteriocinas, dentro de las cuales se encuentra la ni ina, aparecen como las más adecuadas desde un punto de vista tecnológico para ser utilizadas como conservantes de rado alimentario. En principio, su naturaleza peptídica permite la degradación por los enzimas digestivos, resultando así presuntivamente inocuas para el consumidor y su microbiota intestinal de ocupación y, en algunos casos, su espectro de acción incluye a los potenciales patógenos y alterantes asociados a los alimentos (B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes, Clostridium spp., etc.). Por último, sus propiedades físico-químicas las hacen resistentes a los tratamientos térmicos y cambios de pH que sufren l alimentos durante su fabricación y almacenamiento y, además, su pequeño tamaño permite difusión en sistemas semisólidos, propios de la mayoría de los productos al mentarios. Adicionalmente, las bacterias lácticas ofrecen la posibilidad de producir as bacteriocinas in situ durante el proceso de fabricación. De hecho, se ha demostrado que muchos de los cultivos iniciadores utilizados en sistemas alimentarios producen bacteriocina. Por lo tanto, 3 se podría evitar la adición directa de una preparación pura de la bacteriocina, que implicaría un mayor gasto económico. La inclusión de c pas bacteriocinogénicas en los cultivos iniciadores puede realizarse siguiendo dos estrategias diferentes. La primera es utilizar la cepa productora como cultivo iniciador puro y segundo, como cultivo iniciador mixto, combinando la cepa productora con una segunda e pecie microbiana resistente a la bacteriocina y responsable, al menos en parte, de la fermentación. Actualmente es un problema el no tener una claridad en la medición y estimación de los valores que expresan los efectos de distintos factores físico-químicos sobre la actividad de una bacteriocina por lo que no permite inferir su posible aplicación industrial, ya que las altas temperaturas y las amplias variaciones de pH son, entre otras, algunas de las condiciones que debe resistir una bacteriocina para se útil como potencial agente inhibidor de microorganismos no deseados en procesos alimenticio (fermentaciones de leche, maduración de quesos, curado de encurtidos, etc.). La producción de bacteriocinas está influenciada por ersos factores, entre los que se incluyen las fuentes de carbono y nitrógeno, las condi iones de fermentación (pH, temperatura, agitación, concentración de Cloruro de sodio o actividad de ag etc) y en general, cualquier variable que afecte el crecimiento bacteriano. La nisina es una sustancia polipeptídica producida por Lactococcus lactis a partir de una fermentación en medio lácteo modificado. La molécula exhibe su mayor estabilidad bajo condiciones ácidas en la que también es más soluble. Sin embargo, la velocidad en que puede metabolizar mono o disacáridos permitirá la formación de ácidos y de esta manera generar la producción de nisina, permitiéndole manifestar la propiedad bactericida. Esta 4 correlación metabólica debe ser explorada debido a que son muy variadas las respuestas de Lactococcus cuando utiliza sustratos diversos en los diferentes alimentos a que puede llegar, sobre todo cuando se trabaja con cepas nativas aisladas de nuestr s alimentos. Existen diversos modelos matemáticos que intentan describir el crecimiento de las bacterias lácticas. Un ejemplo son las ecuaciones logísticas y las de Gompertz que pueden ser útiles a la hora de predecir el efecto de un único factor ambient l sobre la producción de bacteriocina y otros parámetros biológicos relevant (biomasa, evolución del pH del medio de cultivo, etc). La principal desventaja del uso de estas ecuaciones es que han sido diseñadas para una cepa en concreto, de manera que su xtrapolación a otras cepas, con un crecimiento muy diferente, da resultados muy imprecisos, por esta razón es necesario hallar sus parámetros de crecimiento y poder utilizar estos valores cuando se trata de medir su potencial tecnológico para producir nisina en forma masiva. Por último, cabe señalar que, aunque la producción de cteriocina sea un proceso concomitante con el crecimiento, las condiciones óptimas para este último no implican necesariamente un máximo en la producción de bacteriocina. Por se ha encontrado una relación bastante lineal entre la veloc dad de bacteriocina y la velocidad de crecimiento celular para algunas bacteriocinas, pero esta relación no se ha encontrado para la nisina, cuya biosíntesis es muy compleja y podría depender de factores de cultivo intrínsecos o metabolitos que se forman en el cultivo pueden alterar dicha correspondencia entre los parámetros de crecimiento y producción de bacteriocina. Muchos de los modelos matemáticos han sido estructurad para describir la cinética del crecimiento celular y la producción de ácido láctico en fermentaciones acidolácticas, sin 5 embargo existen pocos modelos los cuales describen la roducción de bacteriocinas y especialmente la nisina. Se hace necesario establecer los parámetros de crecimiento para Lactococcus lactis cuando es cultivado a temperatura óptima y en sustratos fermentables como la lactosa, la cual establecería condiciones ideales para que la nisina formada se mantenga estable y con propiedades antimicrobianas. Este comportamiento del crecimiento (Log UFC/mL) debe ser ajustado mediante un modelo matemático apropiado como el de Gompertz, para que así se puedan calcular los parámetros cinéticos del crecimiento en el medio de cultivo de caldo MRS con glucosa y determinar el comportamiento de los fermentativos en presencia de cantidades variables de arámetros en procesos uro de sodio. El objetivo del presente estudio es el modelamiento de datos experimentales del crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa usando el modelo primario de Gompertz modificado para cuatro variables y medir el e ecto del cloruro de sodio sobre dichos parámetros de crecimiento y la producción de nisina, utilizando modelos secundarios. 1.1. ALCANCES DE LA INVESTIGACION Las cepas de Lactococcus lactis generalmente son aisladas de productos lácteos o de la leche, sin embargo no todas las cepas son apropiadas p ra su uso tecnológico, e tal forma que primero tiene que demostrar su crecimiento en sustratos natural s o medios de cultivo sintéticos. Su adaptación y crecimiento requiere de mu compuestos químicos que deben existir en los sustratos o se deben incorporar. 6 Por otro lado las condiciones de cultivo intrínsecas también son inconvenientes que se deben subsanar para que de esta manera su manejo o uso tecnológico en la industria láctea pueda ser efectiva. Por lo tanto encontrar constantes de su crecimiento bajo los efectos de dos variables como es la concentración de su fuente limitante de su crecimiento y del factor osmolaridad (Cloruro de sodio) permitirá que esta bacteria pueda ser accesible por cualquier productor artesanal y aprovechar sus propied s como conservador natural pro la producción de la nisina. El modelo permitirá obtener una curva de crecimiento que servirá de base para que la industria láctica artesanal, quienes no tienen acceso a controles microbiológicos por sus costo elevados, puedan servirse de una herramienta que controlando la el pH o acidez y midiendo la concentración de cloruro de sodio puedan inferir los niveles de UFC/mL que pueden contener sus productos y de ésta forma predecir la vida útil, garantizando la inocuidad del alimento. 1.2 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION Tecnológicamente, el presente estudio, favorecería a la industria láctea y frutos fermentables debido a que las bacterias lácticas ofrecen la posibilidad de producir las bacteriocinas in situ durante el proceso de fabricación. De hecho, se ha demostrado que muchos de los cultivos iniciadores utilizados en sistemas alimentarios producen bacteriocinas. Por lo tanto, se podría evitar la adición directa de una preparación pura de la bacteriocina, que implicaría un mayor gasto económico. 7 Así mismo, la inclusión de cepas bacteriocinogénicas en los alimentos podría realizarse siguiendo la estrategias de utilizar la cepa productor como cultivo iniciador puro o bien como cultivo iniciador mixto, combinando la cepa produ ora con una segunda especie microbiana resistente a la bacteriocina y responsable, a menos en parte, de la fermentación. Los modelos matemáticos estiman las acciones de los microorganismos como una respuesta a las condiciones ambientales, incluyendo aquellas presentes durante las operaciones de producción y procesamiento de alimentos. Desarrollar un modelo matemáticos para estimar el comportamiento de las bacterias benéficas en los alimentos permitirá conocer las actividades de Lactococcus lactis en fases de su crecimiento mediante el método logístico. Los resultados permitirán tener una base para el monitoreo de la conservación de los productos lácteos, quienes no recurrirán a la incorporación de antibióticos o inhibidores químicos por poseer en su composición sustancias antibióticas naturales producidas por Lactococcus lactis. El estudio se justifica porque tecnológicamente el uso de esta bacteria se haría m s simple manejando variables como pH, temperatura o medición de la concentración de cloruro de sodio y se podría predecir como es el comportamiento del crecimiento y de esta mane a estar seguro que Lactococcus lactis estaría produciendo nisina otorgándole al alimento propiedades de inocuidad. Esta situación es benéfica t o para el productor como para el consumidor. 8 Así mismo los resultados de éste estudio permitirán evitar o bajar la dosis de aditivos químicos usados como conservadores de alimentos, y de sta manera no producir daños a la salud por los efectos secundarios por su consumo diario. Económicamente será mucho más rentable adicionar una b cteria productora de nisina que los aditivos químicos, más aun cuando los efectos cola erales de los aditivos químico son a largo plazo y de manera irreversible, consecuentemente las atenciones de salud serán más costosas. Actualmente no se aplica la Microbiología Predictiva a nivel industrial, debido a ue se entiende que el uso de los modelos matemáticos es complicado y de manejo difícil para el personal común; sin embargo, la experiencia indica que cuando los resultados en el proceso de producción se incrementan y aseguran el man jo de los Programas de Buenas Prácticas de Manufactura y Análisis de peligros y Punt críticos de control, las empresas comienzan a implementar sus áreas de producción con personal profesional matemático que esté involucrado con el tema de microbiología o la biomatemática. El cuidado de reportar predictivamente la cantidad de bacterias productoras de antibióticos disminuirá los riesgos de consumir un alimento que está alterándose por bacterias no exigidas en su control por las normas, evitará que los cuadros de enfermedades gastrointestinales aumenten, sobre todo en tiempos en que la temperatura del ambiente se eleve. Finalmente, el presente proyecto tiene la finalidad de aportar información científica para cepas naturales que mantienen un genoma adaptado a una ecología microbiana muy típica 9 de nuestros alimentos, para las cuales falta aporte de datos científicos para su mejor aprovechamiento. II. MARCO TEÓRICO Las bacterias lácticas se encuentran en ambientes muy variados, pero generalmente están asociadas con sustratos ricos en nutrientes. Esto ha d erminado que en su evolución hayan perdido muchas capacidades biosintéticas, así como la acidad de esporulación, innecesarias en sustratos como los alimentos o el tracto gastrointestinal (Makarova y Koonin, 2007; Pfeiler y Klaenhammer, 2007). En relación con los alimentos, forman parte de la microbiota natural de las superficies de vegetales, aparecen con frecuencia en leche y derivados, en productos cárnicos y en otros alimentos. En estos sustratos la acidificación y otros cambios que acompañan el crecimiento de las bact s lácticas, como por ejemplo la producción de compuestos antimicrobianos, exopolisacár dos y diversas enzimas, contribuyen al aroma, textura, conservación y valor nu ritivo de una gran variedad de productos fermentados (Kleerebezem y Hugenholtz, 2003; Wood, 1997). En general, las bacterias lácticas toleran bien concentraciones relativamente altas de ácidos y valores de pH más bajos que el resto de las bacterias por lo que elen llegar a predominar en los hábitats que colonizan. Gracias a las bacterias láctic la vida útil y la calidad microbiológica y organoléptica de los productos finale aumentan notablemente con respecto a la materia prima original. Sin embargo, el nterés industrial de estas bacterias no se limita a la obtención de alimentos fermentados, sin que también abarca la producción de diversos compuestos químicos y biológicos como etanol, ácido láctico, bacteriocinas, biopolímeros o enzimas (Leroy y De Vuyst, 2004). 10 El hecho de que las bacterias lácticas y los productos de su metabolismo hayan sido consumidos por el hombre durante tantos siglos sin ocasionar problemas, salvo en muy contadas excepciones, ha determinado se consideren como bacterias reconocidas generalmente como seguras (GRAS, acrónimo de Generally Recognized As Safe). Para hacernos una idea de su inocuidad baste considerar que n europeo ingiere unos 22 kg de leche fermentada al año, lo que equivaldría a un consumo global, tan sólo en Europa, de 8,5 × 1020 bacterias lácticas (o 3.400 toneladas) cada año, sin que se les haya asociada con ningún problema sanitario grave (Chamba y Jamet, 2007). Los productos fermentados suponen alrededor de un tercio de los alimentos que consumimos habitualmente. La importancia económica de las fermentaciones a gran escala en la industria alimentaria ha desterrado la práctica radicional de confiar en las fermentaciones espontáneas o de utilizar como inóculo una pequeña porción de una fermentación previa (back -slopping). Estos métodos han quedado relegados en la actualidad a la obtención de productos fermentados en aíses en vías de desarrollo o para la elaboración de productos fermentados artesanos, así como en ciertos casos en los que no se conoce con precisión la sucesión de los microorganismos implicados, en países desarrollados (Harris, 1998). En los países occidentales la práctica habitual para la producción a gran escala de alimentos fermentados es el empleo de cultivos in iciadores. En este caso lo que se añade es un microorganismo, o una ezcla, seleccionado previamente por sus características fisiológicas y metabólicas. Así, se logra un estrecho control del proceso de la fermentación y de las características del producto fin evitándose las grandes pérdidas económicas derivadas de fermentaciones fallidas o anómalas. Un grave inconveniente asociado a esta práctica es que con frecuencia los productos fermentados industriales carecen de las propiedades organolépticas que caracterizan a los productos 11 artesanos elaborados sin empleo de cultivos iniciadores y que son tan apreciadas por los consumidores (Caplice y Fitzgerald, 1999). Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos activos frente a otras bacterias generalmente próximas filogenéticamente a la cepa productora. Debido a su naturaleza peptídica las bacteriocinas pueden ser degradadas por nzimas digestivas, resultando inocuas para el hombre y su microbiota intestinal. Además, sus propiedades fisicoquímicas confieren a estos compuestos resistencia a los tratamientos térmicos y gracias a su pequeño tamaño pueden difundir con relativa facilidad en los a imentos. Las bacteriocinas de las bacterias lácticas presentan un gran interés para su uso en quesería como bioconservantes. La nisina, producida por algunas cepas de lactococos, la más estudiada y se emplea actualmente como conservante en más de 40 países (Rodríguez, 1996). Existen numerosas bacteriocinas producidas por bacterias lácticas y cada una de ellas exhibe un espectro de inhibición particular. Algunas inhiben únicamente el crecimiento de cepas relacionadas taxonómicamente con la cepa product como las lactococinas A, B y M, activas solamente frente a Lactococcus (Ross et al., 1999). Otras bacteriocinas, en cambio, inhiben a un amplio rango de bacterias, si bien es cierto que la acción inhibitoria de las bacteriocinas producidas por bacterias Gramposi vas suele restringirse a otras bacterias Gram-positivas. Con respecto a las bacterias Gram-negativas, los mohos y las levaduras, las bacteriocinas de las bacterias lácticas tienen difícil el acceso a su lugar de acción, la membrana plasmática. Existen algunas excepciones a este comportamiento general. Así, la nisina A es activa frente a diversas bacterias Gram-negativas de importancia médica, como Campylobacter , Haemophilus, Helicobacter o Neisseria (MotaMeira et al., 2000). Además, la congelación, el calent miento suave, la exposición al ácido 12 láctico y/o EDTA o la presión hidrostática facilita la actuación de las bacteriocinas sobre otras bacterias Gram-negativas (Kalchayanand et al., 1992; Stevens et al., 92; Kalchayanand et al.,1998; Arqués et al., 2005). La producción de bacteriocinas es una característica m y extendida y conservada entre las bacterias. Esto indica que es un rasgo ventajoso para bacteria productora, ya que le permite adquirir una posición dominante en un determinado nicho ecológico al e liminar a otras bacterias competidoras (Deegan et al., 2006). A ferencia de las bacteriocinas de la clase I, que tienen un espectro de acción bastante amplio, en la clase II suele ser más limitado. Una de las posibles razones quizá sea la necesidad de un receptor en la bacteria sensible. Es preciso aclarar que la sensibilidad depen de la especie e incluso de la cepa. Merece la pena destacar que las mismas concentraciones de esta bacteriocina no tienen ningún efecto en diversas especies que frecuentemente forman parte de cultivos iniciadores, como las del género Lactococcus (Eijsink et al., 1998; Guyonnet et al.,2000). Con respecto a las bacterias Gram-negativas, sus cubiertas celulares impiden el acceso de las bacteriocinas a la membrana plasmática. Sin embargo, es suficiente alterar la permeabilidad de sus membranas externas para permitir bacteriocinas. Uno de los ejemplos más clásicos es el acción antibacteriana de las l quelante EDTA, que une iones magnesio del lipopolisacárido y altera la membrana externa de las bacterias Gramnegativas, permitiendo el paso de las bacteriocinas (Stevens et al., 1991). Este modo de acción también explica que las bacterias Gram-negativas sean sensibles a las bacteriocinas después de haber sido sometidas a algunos nuevos métodos de conservación que debilitan o forman poros en sus cubiertas celulare como las altas presiones hidrostáticas (Kalchayanand et al.,1998). 13 Es muy difícil comparar la actividad de unas bacteriocinas con otras porque, aunque se han realizado muchos ensayos, las condiciones empleadas son difícilmente comparables. Por otra parte, a pesar de la homología entre las secuencias de las bacteriocinas de la familia de la pediocina, existe variabilidad tanto en la especificidad de las bacterias sensibles como en la intensidad de su actividad (Eijsink et al., 1998; F mland et al., 1996; Richard et al., 2006). Este hecho se ha relacionado con las diferencia que existen en las secuencias de estas bacteriocinas (Johnsen et al., 2005). Combinar el empleo de bacteriocinas con otros métodos de conservaci (control de pH, temperatura, sal, altas presiones hidrostáticas, pulsos eléctricos o condiciones de almacenamiento) si se considera como una opción muy prometedora (Deegan et al., 2006; Muriana, 1996; Stiles, 1996). Esta estrategia, conocida como “siste a de barreras múltiples” o “teoría de los obstáculos”, podría compatibilizar la obtención de alimentos más seguros con una reducción considerable de las cantidades de aditivos químicos y/o de la intensidad de los tratamientos tecnológicos (Leistner, 1992). De este modo, podríamos disponer de alimentos que conservan mejor sus propiedades nutritivas y organolépticas, al tiempo que tienen una excelente calidad higiénica que les permite tener una larga vida útil. Cabe destacar que se ha comprobado, mediante experimentos realizados in vitro, que cuando L. monocytogenes se somete a estrés osmótico (6,5% NaCl, w/v) se hace i sensible a la acción de la bacteriocina. Igualmente la bacterio bacterias sometidas previamente a estrés térmico con t a era mucho menos activa sobre eraturas de refrigeración (5ºC) (Jydegaard et al., 2000). Se desconoce si estos efectos son debidos a cambios en la 14 conformación de la bacteriocina, a la dificultad de la interacción electrostática entre la bacteriocina y la membrana bacteriana o a cambios en l cubierta celular de las bacterias. Sería interesante comprobar si esos resultados son ext polables en la práctica a los alimentos, dado que es muy común en la industria alimentaria aplicar refrigeración y adicionar sal en muchos productos. Es posible que la limitada acción antibacteriana que generalmente se observa durante la aplicación de bacte iocina en productos alimenticios concretos se deba, al menos en parte, a que casi siempre se hace en combinación con el empleo de refrigeración. Ya en la primera aplicación de la bacteriocina a sustratos alimentarios se indicó que el ácido láctico, que se encontraba de forma natural en los productos lácteos que se estaban ensayando, tenía un efecto sinérgico con la bacteriocina (Pucci et al., 1988). Los ácidos orgánicos y sus sales, sobre todo cuando el pH del ali to es ácido, son muy efectivos potenciando la actividad de las bacteriocinas. En un m cido aumenta la solubilidad de las bacteriocinas, y por tanto su capacidad para difundir, y se podría facilitar su translocación a través de la pared celular al aumentar la carga neta de la molécula (Gálvez et al., 2007). La acción sinérgica de las bacteriocinas y diversos ácidos orgánicos se ha puesto de manifiesto en varios alimentos, como por ejemplo productos cárnicos, queso y hortalizas (Barakat y Harris 1999; Bari et al.2005; Uhart et al.2004). En este contexto de barreras múltiples, también se han empleado conjuntamente varias bacteriocinas, con la idea de reducir la cantidad de cada una de las bacteriocinas y, al mismo tiempo, impedir la aparición de bacterias resist tes (aunque esto último sea dudoso). De las distintas combinaciones ensayadas cabe destacar que la pediocina PA-1 15 sue le tener un efecto sinérgico con bacteriocinas de otras clases (nisina, lactacina 481, lactacina F y lactacina B), por lo que sería factible plear como bioconservante una mezcla de distintas bacteriocinas (Mulet-Powell et al.,1998). El mismo efecto se ha comprobado no sólo in vitro, sino también en un sustrato alimenticio, carne, con na mezcla de una bacteriocina de la clase IIa (enterocina CRL35) y otras pertenecientes a otras clases: nisina y lactocina 707. El empleo conjunto de estas tres bacteriocinas impidió la aparición de células resistentes en L. monocytogenes y L. innocua (Vignolo et al., 2000). Los alimentos conservados mediante la aplicación de tr tamientos térmicos también se podrían beneficiar de la actividad de las bacteriocinas desde el punto de vista de los sistemas de barreras múltiples. Las bacterias que han sometidas a un tratamiento térmico son más sensibles a la acción de las bacteriocinas, como se ha demostrado para la nisina (Kalchayanand et al., 1992). Y, al contrario, la acción de algunas bacteriocinas reduce la resistencia térmica de las bacterias (Boziaris et al.1998). Es decir, el empleo conjunto de bacteriocina y un tratamiento térmico perm iría reducir la intensidad de este último, lo que se traduciría en una mínima modificación de las propiedades sensoriales del alimento al tiempo que se logra una calidad microbiológica adecuada. Las bacteriocinas también podrían ofrecer una protección adicional frent a la proliferación de las endosporas que sobreviven al tratamiento térmico (Galvez et al., 2007). El empleo de las bacteriocinas como una barrera adicional con métodos de conservación no térmicos (aplicación de altas presiones hidrostátic s y los pulsos eléctricos de alta intensidad) permitiría disminuir la intensidad de dichos tratamientos y/o contrarrestar el efecto protector del alimento. Además, como uno de sus puntos clave de actuación es la membrana celular, cuya integridad dañan, se potencia l eficacia bactericida de las 16 bacteriocinas, que llegan a destruir incluso bacterias Gram-negativas como, por ejemplo, E. coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhymuri m y Serratia liquefaciens (Kalchayanand et al., 1994). Por otra parte, estos inv tigadores han comprobado que el efecto sinérgico de la combinación de pediocina PA-1 y nisina se potencia en gran medida cuando se emplean con altas presiones, siendo efectivo in vitro incluso frente las esporas de Clostridium que han germinado por las altas presiones (Kalchayanan et al., 1998; 2004). A pesar de los resultados satisfactorios que se obtienen al añadir la bacteri cina más o menos purificada a los alimentos, tanto desde el punto de vista legal como desde el económico, una opción más interesante es la adición de un cultivo productor de la bacteriocina, bien como cultivo iniciador o como adyuvante. Así tendríamos un ucto dotado de su propio sistema de conservación, como si f era una fábrica “viva”, y sin necesidad de aprobación legal. De hecho, ésta es la aplicación que ha aglutinado una gran parte de la investigación realizada en los últimos años (Drider et al., 006). Por supuesto, se ha de escoger el cultivo adecuado para cada aplicac ón, teniendo en cuenta las peculiaridades de cada producto y, además, controlar q su metabolismo no modifique indeseablemente las características del producto final. En los productos cárnicos fermentados una opción relativamente sencilla sería emplear un cultivo iniciador que posea la capacidad de producir b eriocina. La fermentación y el descenso del pH (pH < 4,9), y el secado en el caso de los productos curados, controla en cierta forma el crecimiento de L. monocytogenes . La bacteriocina producida in situ por el cultivo iniciador a lo largo de la fermentación contribuiría adicionalmente a obtener un producto seguro, especialmente en aquellos casos en los que no se llegasen a alcanzar esas 17 condiciones (Baccus-Taylor et al., 1993; Berry et al., 1990; Foegeding et ., 1992). Sin embargo, muchas de las bacterias que producen bacteriocinas de la clase IIa no son adecuadas para llevar a cabo las fermentaciones tradicionales porque n tienen la capacidad de producir ácido láctico con rapidez (Drider et al., 2006). Se debe resaltar que el empleo de las bacteriocinas casi siempre se ha enfocado desde el punto de vista de la seguridad microbiológica, pero no se debe olvidar el posible p el que pueden jugar para controlar el crecimiento de bacterias alterantes o incluso mejorar sus propiedades sensoriales. Como ejemplo de esto último, comercializa un cultivo liofilizado de P. acidilactici (Choozit™ Lyo. Flav 43), recomendado como cultivo adju o en la elaboración de queso Cheddar y otros tipos semid os, para acelerar y potenciar los rasgos aromáticos gracias a la producción de bacteriocinas (Deegan y col, 2006). Aunque las bacteriocinas producidas por las bacterias ácticas son muy interesantes para la bioconservación de los alimentos, su eficacia y/o la de las cepas productoras puede verse seriamente comprometida por diversos factores. Entre ellos se incluye el que su espectro de acción en algunas ocasiones puede ser bastante reducido, la incapacidad de obtener buenos protocolos de purificación que permitan unos rendimien os aceptables, la aceptabilidad de la cepa productora como microorganismo QPS, la adaptab lidad de la cepa bacteriocinogénica a diferentes sustratos alimentarios o la posibilidad de aparición de bacterias resistentes (Rodríguez et al., 2002b). Algunas bacterias lácticas, como L. lactis, son muy versátiles y su potencial ha aumentado notablemente en los últimos años como resultado de los recientes a ances en la estabilización de genes heterólogos y en el control de su expresión, así como con la 18 secuenciación completa de su genoma (Le Loir et al., 2005). De hecho, ya se ha descrito la producción heteróloga a escala industrial de una proteína (la lisos afina, con actividad antibacteriana) en L. lactis, comprobándose que el escalado, la producción y el posterior procesado del producto eran simples y permitían obtener una proteína muy purificada y con actividad biológica (Mierau et al., 2005). La producción de nisina y el crecimiento de L. lactis está determinado por las condiciones de cultivo en periodos de tiempo de 24 horas, temperat 22 °C, pH entre 5.8 – 8.2 y concentraciones de NaCl 0-6% p/v. Se demostró que la actividad antimicrobial de 50 I.U./ml de Nisina disminuyó con la presencia de NaCl, con un mínimo efecto inhibitorio entre 2 y 4% de NaCl. La actividad antimicrobiana sobre Listeria monocytoge es se caracteriza por la modificación de los parámetros de crecimiento como la crecimiento de y el tiempo lag, que fueron estimados m Gompertz tasa de iante el modelo matemático de (Lebois, et. al, 2004). En relación a bacterias esporuladas como Bacillus licheniformis se observó que su crecimiento en leche a 37 °C es favorable, sin embargo concentraciones subletales de nisina (30 IU/ml) actúa totalmente la germinación de las esporas y células vegetativas a pH 6.0, sin posibilidad de remontar el crecimiento después de 7 días a 37 °C. (Mansour, 1999). Cuando se refiere a patógenos como Staphylococcus aureus presente en quesos experimentales con pH 5 y acidez 0.53%. la nisina inhibió el crecimiento de la bacteria, mientras que en el queso control el crecimiento fue de cinco ciclos logarítmicos (100.000UFC/g) a los siete días de almacenamiento (Maldonado, 2007). En otro estudio se vuelve a reiterar el efecto inhibidor de la nisina sobre el mismo patógeno cuando interactúa la la bacteriocina con un quelante EDTA y la concentración de ácido láctico 2 mg%. (Marquez, 2007). 19 Así mismo los componentes de los sustratos que se encu ntran incorporado en los medios de cultivo también pueden afectar la producción de nisina. Comparativamente los compuestos proteicos solubles presentes en el medio de MRS permitieron obtener menor cantidad de nisina comparado con el medio de TYT (Triptona, extracto de levadura y tween 80), (Parente, 1992). Existiendo una variedad de factores que intervienen en el crecimiento de Lactococus lactis y que estos factores repercuten en la producción de la nisina. Muchos ores proponen diversos modelos matemáticos para explicar y obtener p rámetros constantes del crecimiento de dicha bacteria, sin embargo las respuestas que se obtiene no siempre tiene sentido biológico sino matemático. El mayor atributo de un modelo es p ecir el evento biológico con una elevada correlación con la realidad. En este aspecto existen modelamientos del incremento de la biomasa de acuerdo una ecuación logística, el consumo de sustrato asociado al mantenimiento del metabolismo (no crecimiento) y cinética del metabolito primario para la producción de bacteriocina. Lejeune (1998) estableció un modelo empírico simple que examina el cr ento y la producción de bacteriocina en diferentes condiciones. Los parámetros estimados fueron obtenidos a artir de una fermentación con 20 g.l-1 (p/v) que podría ser usado para predecir la evolución de la masa celular seca, concentración de glucosa y concentraciones de ácido láctico de fermentaciones estructuradas con 5, 30, 40 y 60 g l-1 de glucosa inicial, operando a temperaturas de a 30, 37 and 45 °C. El modelo ajustó datos experimentales y se pudo establecer que la tasa específica de la producción de ina es a 30 °C y las mejores predicciones se realizan entre el rango de 30 a 37 °C. Wenhua (2002) varió el uso de sustrato con la sacarosa y propuso un modelo matemático que pueda describir el proceso de fermentación utilizando 6, 7, 8 y 10 g l– 1 h–1 , de sacarosa por Lactococcus lactis subsp. 20 Lactis y su producción de nisina, determinando que existe un incremento del 58% de la producción de nisina cuando se alimenta el bach con 7 g l–1 h–1 La biosíntesis de nisina se vio afectada por la sacarosa residual. Finalmente, el modelo matemático fue desarrollado para simular el crecimiento celular, el consumo de sac a, la producción de ácido láctico y la producción nisina. El modelo fue capaz de describir el proceso de fermentación en todos los casos. El modelo primario de Gompertz viene siendo utilizado como preferente par simular el crecimiento bacteriano y producción de metabolitos pri ios y secundarios. El modelo de Gompertz fue utilizado para evaluar el crecimiento de bacterias lácticas y producción de bacteriocinas bajo la influencia del pH, temperatura y medio de cultivo. Los resultados indican que el medio de cultivo y la temperatura tuvie on un dramático efecto sobre la producción de bacteriocinas y las condiciones óptimas de ésta producción fueron diferent s a las condiciones óptimas del crecimiento. Se demostró que el descenso del pH del medio de cultivo fue paralelo al crecimiento. Las condiciones óptimas de la producción de nisina en caldo MRS es pH inicial 6 y temperatura de 37 °C y en el medio de LAPTg después de 6 horas de cultivo a 37 °C, pH inicial de 6.8. (Juarez. 2002). Poschet (2005) propuso un nuevo modelo para estimar el crecimiento bacteriano, en contraste con los modelos logísticos comúnmente utilizados porque incorpora a su modelo los efectos que inducen al establecimiento de la fase stacionaria que le atribuye a la inhibición del crecimiento por la formación de product tóxicos y el modelo lo describe como una función de la evolución del pH y además por un agotamiento del sustrato. El modelo es llamado P-Model es aplicado de manera eficiente al crecimiento de Listeria 21 inocua en cocultivo con Lactococcus lactis mediatizados por la producción de ácido láctico. III. MATERIALES Y METODOS El universo y la muestra se caracterizan por ser de la misma dimensión y ambas están determinado por todas las células de Lactococcus lactis contenidas en un cepario. 3.1.1. MATERIALES 3.1.1.1 EQUIPOS Refrigeradora congeladora, 15 pies 3 Baño de agua, 15 l capacidad Estufa Incubadora, Temperatura máxima 65 ºC sensibilidad 1 ºC Estufa Esterilizadora, Temperatura máxima 250 ºC, sens bilidad 1 ºC Potenciómetro, rango de pH 1 – 14 Contador de colonia, Amplitud 15X Centrifugadora 5,00 g 3.1.1.2 MATERIAL DE VIDRIO Frascos de cultivo microbiológico de 2 L capacidad Placas petri 15 cm diámetro Tubos de ensayo 20x200 c/tapa rosca 22 Tubos de ensayo 15 x 100 Tubos de centrífuga cónico graduados 1/10 con tapa Pipetas de 10 mL div. 1:10 Pipeta 1 mL, div 1: 10 3.1.1.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Caldo MRS (Oxoid) Agar MRS (Oxoid) Agar BHI (Oxoid) Agar Agar (Merck) 3.1.1.4 MATERIAL BIOLOGICO Cepa experimental: Lactococcus lactis Cepa sensible a bacteriocina: Lactobacilus innocua 3.1.2. METODOS Microorganismo y medios de cultivo Se ha considerado como cepa experimental a La ct o coc cu s la ct is subsp. la ct is la cual posee la capacidad de sintetizar nisina. Para efectos de medir la actividad biológica de la nisina se utilizó como organismo Indicador sensible a nisina a Lactobacilo innocua cuya respuesta de su crecimiento sirvió para cuantificar los niveles de actividad de la bacteriocina . A partir de las cepas que se encontraban conservadas en congelación a -20 °C en Agar MRS y Agar BHI (Meck) y ambas conteniendo 25% (vol/vol) de glicerol como un 23 crioprotector, sirvieron para obtener cultivos frescos. Para el uso experimental las cepas fueron reactivadas por dos veces 30 °C por 12 horas en caldo MRS, antes de su uso en los experimentos. Para la cuantificación de las células se utilizó caldo MRS (MerK) que se modificó a agar MRS añadiéndole 1.5% (p/v) de agar (Oxoid). Para la valoración de títulos de bacteriocina se utilizaron sobrecapas de agar que se prepararon usando 0.7 % de agar. (p/v). Para establecer las condiciones de esterilidad de los edios de cultivo y otras soluciones requeridas todos ellos fueron esterilizados a 121°C por 20 minutos. Las fermentaciones se realizaron en Frasco de 2000 mL estériles con un volumen de trabajo de 1000 mL de caldo MRS estéril. Se realizaron una serie de fermentaciones in vitro usando caldo MRS con 20 g de glucosa por litro, complementado con concentraciones diferente de NaCl (0, 2, 4, y el 6 % [p/v]) para investigar sus efectos tanto sobre el crecimiento como sobre la producción de bacteriocina de L. lactis. Todas las fermentaciones se realizaron por triplicado para mostrar la reproductibilidad de los experimentos. Preparación del inóculo El inóculo fue preparado utilizando un cultivo fresco de L. lactis en caldo MRS obtenido en fase logarítmica que corresponde a un tiempo de 8 horas de cultivo a 30 ºC. Bajo estas 24 condiciones, 10 ml de caldo MRS fueron inoculados con 0.5 ml de L. lactis, obtenido de un cultivo reciente y luego fue incubado a 30°C por 12 h para alcanzar su máximo crecimiento. Luego, 5 mL de este precultivo es añadidos a 100 ml de caldo MRS. Después de 12 horas de crecimiento a 30°C, este cultivo fue usado como inóculo primario. El inóculo definitivo consistió en tomar volúmenes suficientes hasta alcanzar una equivalencia del nivel 0.5 de la escala McFarland. (1,5x109 u.f.c/mL). De esta solución se tomaron volúmenes necesarios diluidos con suero fisiológico estéril para obtener finalmente el inóculo experimental correspondiente a 103 ufc/mL aproximadamente, el cual fue inoculado en los frascos de fermentación. De las fermentaciones Se utilizaron 12 frascos de 2000 mL de capacidad en condiciones de esterilidad a los cuales se les adicionó 1000 mL de caldo MRS estéril con 20 g de glucosa. Los frascos se dividen en 4 grupos o Tratamientos, con 3 unidades de etición, caracterizados de la siguiente manera: Grupo 01: Caldo MRS glucosado sin adición de NaCl. Grupo 02: Caldo MRS glucosado + 2 % NaCl [p/v] Grupo 03: Caldo MRS glucosado + 4 % NaCl [p/v] Grupo 04: Caldo MRS glucosado + 6 % NaCl [p/v] A cada uno de los frascos de cultivo el grupo 01 se les inoculará 1 mL del inóculo experimental en la cual se estima un aproximado de Log UFC/mL iniciales de 103. Inmediatamente después de la inoculación los frascos se agitarán de manera suave asta 25 lograr una homogenización completa de las células en el medio de cultivo. Los frascos se dejarán incubando a 30 ºC por un periodo de 24 horas. Antes de llevar los frascos a incubación a 30 ºC se obtendrá de cada uno de ellos y en forma aséptica una muestra de 10 mL, considerándose a ésta como tiempo cero (t=0). Luego los frascos son trasladados a incubación y a int alos de 2 horas, de cada frasco de fermentación se retiraron 10 mL. De esta muestra se utilizó 0.1 mL para determinar las Unidades Formadoras de Colonias (UFC/mL) estimado por iembra por inmersión en placa. La biomasa o masa seca celular (CDM) se determinó por gravimetría después de filtrar 5 ml del cultivo por membranas de acetato ? 22µ. Los niveles de actividad de la bacteriocina soluble en una suspensión libre de células (CFS) se determinaron por el método de dilución crítica usando como cepa indicadora a Lactobacillus innocua. Se utilizaron 2 mL del medio de cultivo fermentado que se homogenizaron con 1 volumen de HCl 0.04 N y luego fue calentado a 98ºC durante 5 min. Las muestras se centrifugaron a temperatura ambiente para luego recoger los sobrenadantes. Una vez neutralizados, se analizarán mediante el test d difusión en agar. Las concentraciones de ácido láctico se medirá, neutralizando 9 ml del cultivo con NaOH 0.1 N en presencia de una solución alcohólica de fenolftaleína al 1% como indicador; los resultados se expresarán como porcentaje de ácido láctico producido. Las concentraciones residuales de glucosa serán cuanti icadas por métodos de determinación enzimática para glucosa (Kit MercK). Del mismo modo que se opera con el Grupo 01, se procederá con el resto de grupos. 26 Para determinar el efecto de factor de inducción añadido (IF), dos fermentaciones adicionales se ejecutarán una de ellas será usando caldo 1000 mL de caldo MRS con 6 % (p/v) de NaCl estéril a una temperatura controlada de °C y pH constante de 5.5 y otra fermentación se realizará en las mismas condiciones de sustratos a una temperatura controlada de 22°C y un pH constante de 5.4. Después de 24 horas de crecimiento, las células serán retiradas por centrifugación (2,500 g y C durante 30 minutos). 50 mL del supernadante libre de células (CFS), que se asumirán una actividad de 1,600 Unidades arbitrarias [AU] ml-1 de bacteriocina, serán usadas como una fuente de FI para la primera fermentación que contiene 1000 mL de caldo MRS. Esta fermentación que usará el CFS también será ejecutada por triplicado, y sus desviacio es estándar serán calculadas. Como una fuente alternativa del IF, un precipitado de acteriocina y asumiendo que éste es un factor de inducción, se preparará de la manera siguiente. El pH del CFS fue ajustado a 6.5, luego se añadirá 300 g de sulfato de amonio por litro (saturación del 48 %). La suspensión se agitará mecánicamente a 4 ºC por 12 horas. Luego se centrifugará a 20,500 g y 4°C durante 30 minutos, el sedimento será cosechado y disuelto en buffer fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 (5 ml por litro de CFS). La segunda fermentación se realizará añadiendo 1.5 ml de la solución de proteína (represent do por el precipitado de sulfato de amonio; biocina con una actividad de 153,600 AU ml-1) al fermentador (1.0 litro de caldo MRS). Del Modelado primario y secundario El modelado primario del crecimiento celular, consumo e glucosa, producción de ácido láctico, y la producción de bacteriocina se realizarán ajustando los datos según la ecuación 27 propuesta para el crecimiento celular y de esta manera determinar los valores de los parámetros biocineticos del crecimiento y producción d bacteriocina. El modelo primerio corresponde a la ecuación de Gompertz modificado: Y=a+c*exp(-exp(-b*(x-d))). Donde: Log N es logaritmo decimal del número de microorganismo tiempo t, A es el valor asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente (aproximadamente equivalente al logaritmo decimal del número inicial de microorganismos), C representa el incremento en el logaritmo del número e microorganismos cuando el tiempo se incrementa indefinidamente (número de ciclos de crecimiento), B es la velocidad de crecimiento máxima relativa al ti mpo M M es el tiempo requerido para alcanzar la máxima velocidad de crecimiento. Las abreviaturas para parámetros biocinéticos represen ativos del crecimiento y la producción de la nisina y las ecuaciones utilizadas qu se detallan en párrafo siguiente, según los reporta Messens et al (2002), excepto que la ecuación pa a la producción de bacteriocina fue elaborada dependiendo de XB , definido como la mínima concentración de biomasa requerida para el inicio de la producción de b eriocina debido a la inducción. Las fermentaciones se realizarán por triplicado, se calcularán las desviaciones estándar para todos los parámetros biocinéticos estimados vía el modelo primario. Las ecuaciones serán integradas usando el Programa Curve expert v. 1.4. Mediante el empleo de modelado secundario, todos los p rámetros biocineticos (µ max, Xmax, n, YX /S , ms, YL/S , el kB , y k inact), extraídos del modelo primario, serán expresados 28 como funciones de la concentración de sal. Por esta razón, se emplearan los modelos empíricos. Las Desviaciones estándar serán calculadas donde se requiera necesario hacerlo. Ecuaciones usadas para el desarrollo de los modelos primarios: Modelo Ecuación Crecimiento celular dX/dt = {µ max [1 - (X/X max)]n - a } X Cuando t >? Modelo secundario para el Consumo dS/dt= - [(1/YX/S )(dX/dt)] - mSX de Glucosa Modelo secundario para la dL/dt= - (YL/S)(dS/dt) Producción de ácido láctico Modelo secundario para la dB/dt = [( k B)( dX/dt)] - [(k inact)( XB )] Producción de Bacteriocinas Cuando X > XB Abreviaturas: X Concentración de biomasa (en gramos [CDM] por litro) t Tiempo (en horas) ? Duración de la fase lag (en horas) µ max Tasa máxima específica del crecimiento (en h-1) X max Concentración de biomasa máxima alcanzable (en gramos CDM] por litro) n Inhibición exponencial a Índice de mortalidad específica (en h-1) S Concentración residual de glucosa (en gramos de glucosa por litro); 29 YX/S Coeficiente de producción celular (en gramos [CDM] por gramo de glucosa); ms Coeficiente de mantenimiento (en gramos de glucosa por gramo de CDM por hora) L Producción de ácido láctico (en gramos de acido láctico por litro); YL/S Coeficiente de producción para la conversión de glucosa en ácido láctico (en gramos de ácido láctico por gramo de glucosa) B Actividad de bacteriocina soluble (en AU por litro) kB Producción específica de bacteriocina (en AU por gramo de CDM); k inact Tasa aparente de inactivación de bacteriocina (en litros por gramo de CDM por hora) X B’ Concentración mínima de biomasa para el inicio de pro ucción de bacteriocina (en gramos [CDM] por litro). 3.1.3 ANÁLISIS EXPERIMENTAL La bondad de ajuste de los modelos se evaluar on mediante los valores del coeficiente de determinación (R2 ) de cada ajuste. Cuánto más cercano a 1 es el valor de R2 y más bajo el valor de RMSE, mejor ajusta el modelo. El efecto de las concentraciones de cloruro de sodio y producción de nisina se utilizaó el diseño de Análisis de varianza con tres repeticiones y un nivel de confianza de 95%. 30 IV. RESULTADOS 1. Se obtuvo la curva de crecimiento de Lactococcus lactis sub sp. lactis en cultivo en caldo MRS glucosa 20% en un periodo de tiempo de 24 ho as, a una temperatura de 30 ºC por un periodo de 24 horas, utilizando 13 iteraciones de tiempo. Los valores de Log UFC/mL de la curva de crecimiento se ajustaron aplicando el modelo de Gompertz modificado cuya expresión es: a+c*exp(-exp(-b*(x-d))), Y= obteniéndose los parámetros de crecimiento que se mues an en la tabla Nº 1. La bondad de ajuste permite decidir que el ajuste de la curva al modelo de Gompertz modificado es suficiente el cual está representado por un coeficiente de determinación de 99.8%. 2. La figura Nº 2 representa el crecimiento celular expresado por la Biomasa /X=g/L) obtenida en caldo MRS glucosa durante el periodo de 24 horas. Se destaca que la ecimiento específico (µ max) Xmax alcanza un valor de 2.88 g/L cuando alcanza una tasa de 0.30 Log UFC/mL/h, según el modelo primario. El modelo de Gompertz adapta con elevada bondad de ajuste los datos experimentales obtenidos con el 99% de validez estadística. Tabla Nº 2. 3. El consumo de Glucosa durante los ensayos experimentales de fermentación se observa en la Figura Nº 3, reportando un consumo prome de 18. 99 ± 0.46 g/L, que relacionado a la concentración de biomasa se deter ina el Coeficiente del rendimiento celular (Y(X/s) = g/L) que alcanza un valor de 0.15 g X/g S/L. Así mismo el coeficiente de mantenimiento (ms) y el coeficiente del rendimiento celular (YX/S) alcanzan valores de 0.27 g Glu/gXmax /h y 0.11 g Xmax/gGlu; respectivamente. Tabla Nº 3 31 4. La producción de ácido láctico a partir de la glucosa orporada al medio de cultivo se encuentra graficada en la figura Nº 4, en la cual se observa que la concentración final de produccíon de ácido láctico es e 16,05 g/L, con un coeficiente de conversión de 0.84.Tabla Nº 4. 5. La Figura Nº 5 grafica el modelamiento de la producción de la nisina destacando que la máxima concentración es de 2.12 UA/L en un periodo de 14 horas, con una producción específica de 0.74 AU/gXmax, requiriéndose de una concentración mínima de biomasa de 0.0015 gXmax/L para iniciar la producción de nisina. Tabla Nº 5. 6. La adición de cloruro de sodio al 2% (p/v) no afectó el valor de µmax. Comparando éste parámetro de crecimiento con el del control no existe diferencia estadísticamente significativa Fc (n:3;a :0.0 5):3.22>Ft:3.47. Figura Nº 6. Concentraciones de sal por encima del 2% afecta la tasa de crecimiento específica (b ó µ max) disminuyéndola en forma lineal, (Fc (n:3 ;a :0.05) :6.44>Ft: 3.47). Del mismo modo, el tiempo que se tarda en alcanzar la máxima tasa de crecimiento (M) para valores de cloruro de sodio menores del 2% es de 5.14 oras y el control 4.91 horas y a concentraciones mayores del 2% el incremento es mayor. 7. El modelamiento de la actividad de la bacteriocina pre ente en el sobrenadante libre de células frente a varias concentraciones de cloruro e sodio está representado en la figura Nº 7. La actividad de la Nisina con adición del 2% de sal no se modifica sustancialmente sus parámetros cuando se compara con el cultivo que no contiene sal. (Fc (n:3 ;a :0.05):4.36>Ft:3.47). Concentraciones mayores al 2% afectan 32 drásticamente la actividad de la biocina, demostrándose que la adición de 6% de sal determina que el Bmax alcance un valor de 0.38 AU/L y consecuentemente disminuye el valor de producción específica de nisina (KB ) a 0.14 AU/gX max. Tabla N 7, Cuando se adiciona 2% de sal, la cantidad mínima de bi a que se requiere para iniciar la producción de nisina es de 0.42 g/L. El uso de mayores concentraciones de sal como 6% obliga a utilizar concentraciones de biomasa equivalente a 1.12 g/L 8. Los datos derivados de los experimentos de fermentación fueron analizados a fin de caracterizar cinéticamente el proceso y proponer estra egias para mejorar su desempeño empleando modelos primarios como el de Gompertz modificado que se ocupa de la descripción de los cambios del número microbiano en función del tiempo. Por otro lado se propusieron modelos secundarios con la finalidad de permitir evaluar cómo dos o más factores interactúan so el crecimiento microbiano. Dichos parámetros biocinéticos derivados de los modelos primarios están en la tabla Nº 8. Los datos representan las relaciones entre los parámetros biocinéticos y el efecto del cloruro de sodio. Los resultados expuestos son elementos que permiten aceptar la hipótesis de que el modelo primario de Gompertz modificado tiene una elevada bondad de ajuste para atos experimentales del crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa. Así mismo, los modelos secundarios permiten estimar el efecto negativo de las concentraciones de cloruro de sodio mayores del 2% sobre el crecimiento de Lactococus lactis y la producción de nisina. 33 V. DISCUSIÓN Las investigaciones en alimentación plantean nuevos retos en seguridad alimentaria. Estos desafíos deben ir más allá de la vigilancia y el control de la calidad, en respuesta básicamente a los nuevos métodos de producción agrícola y de novedades alimenticias, como los denominados alimentos funcionales. Buena part de la labor se centra ahora en identificar los principales riesgos alimentarios que emergen de los cambios en el sector de la alimentación. El tema de la presencia de bacterias patógenas en lo alimentos cobra importancia cuando se trata de su calidad en condiciones naturales o procesados, por tal motivo se requiere buscar alternativas para el control, inhibición o eliminación de dichos microorganismos. La Nisina es efectiva en una gran variedad de productos alimenticios, a través de un amplio rango de niveles de pH (3.5 - 6.0), como es el caso de la variedad de quesos,; productos de crema tales como: saborizada, batida, espesa, ácida, etc.; lechería y postres elaborados con grasa, yogurt y leches saborizadas; preparaciones de frutas y vegetales que incluyen la pulpa, jugos de fruta pasteurizados, postres y bebidas elaborados con proteína vegetal y leche de coco; bocadillos (snacks); productos de huevo líquido pasteurizado; salsas de bajo pH, incluyendo mayonesa y salsas y aderezos salados; sopas y salsas pasteurizadas; alimentos enlatados; carnes procesadas; procesos de fe entación y productos de fermentación tales como la cerveza y alimentos de alto contenido de humedad / reducidos en grasas. 34 La nisina es un grupo de polipéptidos compuestos por 3 aminoácidos, estrechamente relacionados, y es producida por ciertas cepas de la bacteria Lactococcus (Streptococcus) lacticas ssp. La nisina tiene un doble modo de acción antimicrobiana: se une a los fosfolípidos II con la subsiguiente inhibición de la síntesis de pared celular y también forma poro en la membrana citoplasmática. La nisina sólo se utiliza como conservante alimentario y actualmente no tiene ningún uso terapéutico. Sin embargo, la producción de nisina en condiciones de laboratorio no necesariamente significa que es efectiva, suficiente y biodisponible en el ecosistema de los alimentos debido a que en éstos se incluyen factores limitantes, por ejemplo, la disponibilidad de nutrientes restringida para las células productoras de bacteriocina, la adsorción de las bacteriocinas sobre las partículas de carne, grasas y roteínas, y / o la presencia de proteasas endógenas degradantes de la bacteriocina. Además, la tecnología de procesamiento de alimentos puede interferir con la capacidad de producción de bacteriocinas de cultivos iniciadores o cocultivos utilizados como es el caso de embutidos o salsas. El crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa fue ajustado mediante el uso del modelo de Gompertz modificado el cual incorpora cuatro variables obtenidas del crecimiento en un periodo de 24 horas, siendo ésta la variable independiente. La velocidad de crecimiento específicao (µ max ) de 0.27 UFC/mL/h indica que el medio de cultivo aporta nutrientes suficientes para ,mantener el crecimiento en condiciones logarítmicas por espacio de 6 a 8 horas. El declive de la tasa de crecimiento es debido a la falta de nutrientes o factores de crecimiento como el extracto de levadura o riqueza de bioelementos; sin embargo la velocidad de crecimiento hallada esta en concordancia con lo reportado por 35 Valbuena 2005 cuya µ max = 0.31LogUFC/mL/h en cultivos con leche fresca. Del mismo modo Castro, 2008 ; reporta un valor de 0.29 LogUFC/mL/h en leche. Estos resultados confirman que los datos experimentales de este estudio fueron bien obtenidos facilitando su ajuste por el modelo primario de Gompertz. Se realizaron fermentaciones en caldo MRS glucosa con la adición de cloruro de sodio en los niveles de 2, 4, y 6%, observándose que la sal afecta el crecimiento de Lactococcus lactis y del mismo modo la producción de bacteriocinas. En el caso de L. lactis , una baja concentración de NaCl (2%, peso / volumen) no mostró ningún efecto sobre el crecimiento bacteriano, mientras que la inhibición del crecimiento aumenta linealmente cuando se utiliza mayores niveles de concentraciones de sal. El efecto negativo de concentraciones elevadas de sal en el crecimiento de bacterias ácido lácticas (LAB) ha sido reportado por Dew Vuyst (1996); Rozés (1996), Uguen(1999); así mismo se reporta que bajas concentraciones de sal (1a2%, en peso/vol) muchas veces puede favorecer el crecimiento bacteriano, como es el caso de las fermentaciones de vegetales o salsas reportados por Ganzle (1998), Korkeala (1992), Vignolo ( 1995). Si bien la sal tiene como propiedad ionizarse en el sistema agua proteínas del medio de cultivo y que ésta condición que puede afectar el crecimiento, se observa que un nivel del 2% de sal no modifica sustancialmente la tasa máxima de crecimiento específico (µmax) y concentración máxima de biomasa (X max) de L. lactis. Concentraciones más elevadas si modifican dichos parámetros debido a que la concentración de solutos en el medio de cultivo se incrementa generando condiciones de a w menores a las requeridas para la fisiología del lactobacilo. La disminución de la actividad de agua demanda al lactobacilo un mayor gasto energético para su mantenimiento; sin embargo la actividad enzimática no 36 se desarrolla en dichos niveles de actividad de agua que establecen las concentraciones de 4 y 6% de sal. Esta situación es poco diferente con el caso de ciertas BAL que resisten altas concentraciones de sal en procesos fermentativos de carne y hortalizas. Herman (2009), informa que concentraciones del 2% de sal no modifican la tasa máxima de crecimiento, siendo ésta de 0.27 UFC/mL/h, compatibles para éste estudio. Sin embargo, Lactococcus lactis es sensible a la concentración de sal y muestra una tendencia decreciente de la X max con el aumento de las concentraciones de NaCl debido a que esta sal interfiere con la eficiencia de la conversión de sustrato en biomasa. Semejante situación encontró Leroy (1999) en donde el cloruro de sodio afecta el crecimiento y la producción de nisina de las BAL cuando la fermentación de las salsas se eleva al 6%. La presencia de ácido láctico y su consecuente modific ción de su pH del medio de cultivo no afecto los parámetros del crecimiento de Lactococcus lactis porque su producción está en íntima correlación con el consumo de glucosa y el d senso de la población bacteriana o muerte celular es pequeña. Serna (2009) encuentra seme antes respuesta con este estudio fermentando 20 g/L de glucosa y obtiene 13.7 g/L de ácido láctico, explicando que la cepa Lactococcus lactis ssp. lactis se adapta a ambientes con altas concentraciones de sacarosa y además es capaz de sobrevivir y replicarse en más altos niveles de estrés, en comparación con otras cepas productoras de ácido láctico. Además el microorganismo tiene un sistema enzimático que hidroliza el disacárido y metaboliza la glucosa mediante la vía glucolítica en ambientes con baja disponibilidad de agua. Por otro lado, se observó que si bien una concentración de 2% de sal no afecto el crecimiento de bacterias, si afectó la máxima activida d de la bacteriocina (Bmax ) y se 37 redujo en 10% en relación al cultivo que no tenía sal. Esto se explica por la disminución de la producción de bacteriocina espec ífica (KB ), aún cuando los valores de X max son comparables. A mayores concentraciones de NaCl, k B disminuyó aún más. Leal-Sanchez (2002) reporta que la plantaricina S por L. plantarum, la mayor producción se observa a una concentración de cloruro de sodio de 2,5% (p/vol). Por otra parte, la producción de sakacin K por L. sakei CTC 494 se ve afectada negativamente por el agregado de NaCl, Leroy (1999). Aunque los enterococos son más resistentes a la sal, la producción de las enterocinas A y B de Enterococcus faecium CTC 492 también se inhibe en presencia de NaCl (Aymerich, 2000, 2002). Sin embargo, la producción de enterocina se puede aumentar en la matriz de la carne mediante la adición de una pequeña cantidad de la bacteriocina, que actúa como un inductor . Tratando de explicar los efectos de la sal sobre la producción de bacteriocinas es que L. lactis posee la capacidad de expulsar un péptido denominado Factor de Inducción (IF) y cuando ésta alcanza una concentración crítica, facilita su unión a su receptor y pronto se inicia la producción de bacteriocinas. El Cloruro de sodio interfiere al IF para su unión con su receptor (Nilsen, 1998). Nilson (2002) atribuye el rol del acetato como factor de inducción para la síntesis de carnobacteriocina por C. piscicola A9b, la cual se ve afectada negativamente por la adición de NaCl. Incluso en NaCl concentraciones que no afectan el crecimiento, la inducción de la bacteriocina disminuye la producción, lo que indica que el aumento de las concentraciones del inductor son necesarias para mantener la producción de bacteriocinas Nilsen ( 1998). Glaster 1998, considera que es probable que la adición de sal a l medio de cultivo interfiera 38 con el crecimiento desestabilizando la unión del Factor de Inducción a su receptor generando el síndrome de fatiga bacteriana y de forma irreversible. Muchos alimentos se encuentran contaminados con bacterias patógenas que no siempre se multiplican por la falta de algún factor nutricional determinante. Sin embrago, la naturaleza del alimento puede servir de vehículo. En otros casos el alimento ofrece todas las condiciones para su multiplicación. Debido a estas circunstancias se requiere utilizar un sistema de barrera para evitar el crecimiento bacteriano y es así que se apunta al uso de bacterias productoras de nisina, como es el caso de Lactococcus lactis , pero para la cual los parámetros biocinéticos en sustratos complejos no está claramente establecidos, más aún cuando los factores del entorno no son considerados de manera eficiente. Es allí donde los modelos matemáticos primarios debidamente elegidos logran un nivel de ajuste de la curva de crecimiento, como es el caso del modelo de Gompertz modificado, que aportarán diferentes parámetros biocinéticos para utilizar los modelos matemáticos secundarios utilizados en este estudio, que estiman valores de crecimiento o productividad de nisina interaccionando dos o más variables al mismo tiempo sobre el microorganismo. Los datos obtenidos en este estudio tienden a establecer criterios biocinéticos de Lactococcus lactis para obtener a escala piloto concentraciones elevadas de nisina y de esta manera lograr su aplicación masiva en muchos alimentos que se deterioran fácilmente. Se ha conocido que las condiciones de fermentación y producción de nisina se afectan por la presencia de cloruro de sodio en concentraciones mayores al 2%. Esta característica servirá de modelo para predecir los eventos fermentativos en productos elaborados a base de vegetales y carne. 39 Es esencial comprender los efectos de diferentes factores ambientales relacionados con los alimentos en la inducción de nisina con el fin de comprender mejor el potencial de aplicación de esta cepa en la producción de embutidos fermentados. El potencial de esta cepa puede ser ampliado considerablemente si se logra manipular el Factor de Inducción (IF) para alcanzar un nivel más alto de la producción de bacteriocina en condiciones desfavorables. Se recomienda investigar el uso de licor de diversos procesos fermentativos en donde se puede encontrar el factor de Inducción y de esta menra obtener mejores resultados 40 VI. REFERENCIALES 1. Abee T., Krockel L. y Hill C. (1995) Bacteriocins: modes of action and potentials in food preservation and control of food poisoning. Int. J. Food Microbiol., 28: 169-185. 2. Arqués, L., Rodríguez, E., Gaya, P., Medina, M., Nuñez, M. 2005. Effect of combinations of high pressure treatments and bacteriocin-producing lactic acid bacteria on the survival of Listeria monocytogenes in raw milk cheese. Int.Dairy J. 15: 893-900. 3. Aymerich, M. T., M. G. Artigas, M. Garriga, J. M. Monfort, and M. Hugas. 2000. Effect of sausage ingredients and additives on the production f enterocins A and B by Enterococcus faecium CTC 492. Optimization of in vitro production and antilisterial effect in dry fermented sausages. J. Appl. Microbiol.88:686–694. 4. 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APÉNDICE 52 Tabla Nº 1 Parámetros de crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRs glucosa, según modelo primario de Gompertz a b c d Desv. Estand R2 3.03 0.27 5.17 4.98 0.188 0.998 a= población inicial UFC/mL b= Tasa máxima de crecimiento UFC/mL/h c= Máxima población obtenida UFC M= Tiempo tasa máxima crecimiento Edgar Zárate S. 53 Tabla Nº 2 Parámetros de crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRs glucosa, en función de la biomasa, según modelo primario de Gompertz a b c d Desv. Estand R2 0.02 0.30 2.93 7.72 0.064 0.99 a= población inicial UFC/mL b= Tasa máxima de crecimiento UFC/mL/h c= Máxima población obtenida UFC M= Tiempo tasa máxima crecimiento Edgar Zárate S. 54 Tabla Nº 3 Parámetros del consumo de Glucosa por la biomasa de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa Concentración Glucosa inicial (g/L) Consumo de Glucosa (g/L) Concentración Glucosa residual (gL) Máxima concentración Biomasa (Xmax=g/L) Coeficiente del rendimiento celular (Y X/s= g/L) Coeficiente mantenimiento (ms= g Glu/gXmax/h) Coeficiente rendimiento celular (Y X/S=g X max/gGlu) 20.00 18.99 1.01 2.88 0.15 0.27 0.11 Edgar Zárate S. 55 Tabla Nº 4 Parámetros de la producción de Ácido láctico por Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa Ácido láctico producido (L= g/L) Conversión Glu/Ac. Lact (Y L/S = g Ac. Lac./g Gluc) 16.05 0.84 Edgar Zárate S. 56 Tabla Nº 5 Parámetros de la producción de Nisina por Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa Actividad de la Nisina (B= AU/L) 2.12 Producción especifica de nisina(KB= AU/gXmax) 0.74 Tasa aparente de inactivación nisina (Kinact = gX max/L/h) 0.052 Conc. Minima Biomasa para el inicio prod. Nisina (KB'=gX max/L) 0.0015 Edgar Zárate S. 57 Tabla Nº 6 Efecto del cloruro de sodio sobre los parámetros de crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS según modelo de Gomper z Parámetros crecimiento a b c M Desv. Estand R2 0% NaCl 2% NaCl 4% NaCl 6% NaCl 3.11 0.27 5.19 4.91 0.188 0.998 3.19 0.24 4.69 5.14 0.118 0.999 3.09 0.21 2.48 6.03 0.11 0.997 2.89 0.17 2.01 7.59 0.02 0.989 a= población inicial UFC/mL b= Tasa máxima de crecimiento UFC/mL/h c= Máxima población obtenida M= Tiempo tasa máxima crecimiento 58 Edgar Zárate S. Tabla Nº 7 Parámetros de la producción de nisina por Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa Cloruro de sodio Parámetros 0% 2% 4% 6% 2.12 1.39 1.22 0.38 0.82 0.53 0.47 0.14 0.052 0.072 0.129 0.268 0.25 0.42 0.76 1.12 Actividad de la Nisina (B= AU/L) Producción especifica de nisina(KB= AU/gXmax) Tasa aparente de inactivación nisina (K inac = gX max/L/h) Conc. Minima Biomasa para el inicio prod. Nisina (XB'=gXmax/L) Edgar Zárate S. 59 Tabla Nº 8 Valores de los parámetros biocinéticos de Lactococcus lactis y su relación con las concentraciones de NaCl y producción de nisina según modelos primarios y secundarios Parámetros biocinéticos Modelo primario Ecuaciones modelo empírico Modelo secundario µ max 0.27 ± 0.18 0.30 ± 0.22 Xmax 0.30 ± 0.06 2.92 ± 0.18 ? 0.51 ± 0.01 0.49 ± 0.04 YX/S 0.15 ± 0.03 0.14 ± 0.02 mS 0.27 ± 0.02 0.29 ± 0.03 kB 0.74 ± 0.01 0.76 ± 0.02 0.052 ± 0.002 0.0054 ± 0.005 Kinact. Edgar Zárate S. 60