RESOLUCIÓN OIV-OENO 426-2011 DETERMINACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DEL DEUTERIO EN EL ETANOL DERIVADO DE LA FERMENTACIÓN DE MOSTOS DE UVA, MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS, AZÚCAR DE UVA (MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS RECTIFICADOS) Y VINOS POR RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (SNIFNMR/RMNFINS) La ASAMBLEA GENERAL CONSIDERANDO el Artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo de 3 de abril de 2001 que establece la creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino, EN VISTA DE las acciones del Plan Estratégico de la OIV 2009-2012 CONSIDERANDO los trabajos de la Subcomisión de Métodos de Análisis DECIDE sustituir el método actual de Determinación de la distribución del deuterio en el etanol derivado de la fermentación de mostos de uva, mostos de uva concentrados, mostos de uva concentrados rectificados y vinos por resonancia magnética nuclear publicado en el Compendio Métodos Internacionales de Análisis del vino. Dicho método se sustituye por el siguiente método de Tipo II. Determinación de la distribución del deuterio en el etanol derivado de la fermentación de mostos de uva, mostos de uva concentrados, azúcar de uva (mostos de uva concentrados rectificados) y vinos por resonancia magnética nuclear (SNIF-NMR/ RMNFINS 1) 1. Introducción El deuterio contenido en los azúcares y en el agua del mosto de uva se redistribuye tras la fermentación en moléculas I, II, III y IV del vino: CH2D CH2 OH I CH3 CHD OH II CH3 CH2 OD III HOD IV Fractionnement Isotopique Naturel Spécifique étudié par Résonance Magnétique Nucléaire (Site Specific Natural Isotope Fractionation studied by Nuclear Magnetic Resonance). Brevet: France, 8122710; Europe, 824022099; Etats Unis, 854550082; Japon 57123249. 1 Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 1 2. Ámbito de aplicación El método permite medir las relaciones isotópicas del deuterio (D/H) en el etanol del vino y el etanol obtenido por fermentación de productos del vino (mostos, mostos concentrados, mostos concentrados rectificados). 3. Definiciones (D/H)I: relación isotópica asociada a la molécula I (D/H)II: relación isotópica asociada a la molécula II (D/H)QW: relación isotópica del agua en el vino (o en productos fermentados) R = 2(D/H)II/(D/H)I R expresa la distribución relativa del deuterio en moléculas I y II; R se mide directamente a partir de las intensidades h (alturas pico) de las señales y, así, R = 3hII/hI. 4. Principio Los parámetros arriba definidos R, (D/H)I y (D/H)II se determinan por resonancia magnética nuclear del deuterio en el etanol extraído del vino o de los productos de fermentación del mosto, el mosto concentrado o el azúcar de uva (mosto concentrado rectificado) obtenido en ciertas condiciones. 5. Reactivos y materiales 5.1 Reactivos: 5.1.1 Reactivos para la determinación de agua mediante el método de Karl Fischer (cuando dicho método se utiliza para la medición del grado alcohólico del destilado). 5.1.2 Hexafluorobenzeno (C6F6) utilizado como sustancia de bloqueo 5.1.3 Ácido trifluoroacético (TFA CAS: 76-05-1) o anhídrido trifluoroacético (TFAA, CAS: 407-25-0) 5.2 Materiales de referencia (disponibles en el Institute for Reference Materials and Measurements IRMM de Geel (B)): 5.2.1 Tubos NMR sellados CRM-123, utilizados para comprobar la calibración de la instrumentación NMR 5.2.2 N,N-tetrametilurea estándar (TMU); TMU estándar con una relación isotópica D/H calibrada. Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 2 5.2.3 Otros CRM disponibles utilizados para comprobar las etapas de destilación y preparación: CRM CRM-656 Parámetro Etanol del vino, 96% vol. tD (etanol) en w/w δ13C (etanol) en VPDB (D/H)I (etanol) ppm (D/H)II (etanol) ppm R (etanol) CRM-660 Valor certificado Incertidumbre solución hidroalcohólica, vol. % 94,61 0,05 ‰ -26,91 0,07 en 102,84 0,20 en 132,07 0,30 2.570 0,005 % 11,96 0,06 ‰ -26,72 0,09 en 102,90 0,16 en 131,95 0,23 en 2.567 148,68 0,005 0,14 12% tQ (etanol) en vol. δ3C (etanol) en VPDB (D/H)I (etanol) ppm (D/H)II (etanol) ppm R (D/H)w (agua) ppm 5.3 Aparatos 5.3.1 Espectrómetro NMR que incorpora una sonda de "deuterio" específica ajustada a la frecuencia característica νo del campo Bo (por ejemplo, para Bo = 7,05 T, νo = 46,05 MHz y para Bo = 9,4 T, νo = 61,4 MHz) con un canal de desacoplamiento de protones (B2) y un canal de estabilización de campo-frecuencia (bloqueo) en la frecuencia del flúor. El instrumento NMR puede estar equipado con un intercambiador de muestras automático y un software de procesamiento de datos adicional para la evaluación de los espectros y la computación de los resultados. El rendimiento del espectrómetro NMR puede comprobarse utilizando los Materiales de Referencia Certificados (Certified Reference Materials) (tubos sellados CRM 123). 5.3.2 Tubos NMR de muestra de 10 mm 5.3.3 Aparatos de destilación Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 3 Nota: puede utilizarse cualquier método para la extracción del etanol siempre que el alcohol total contenido en el vino se recupere sin fraccionamiento isotópico. La columna Cadiot que aparece en la figura 1 es un ejemplo de sistema de destilación manual que permite la extracción del 96 al 98,5% de etanol de un vino sin fraccionamiento isotópico y obtener un destilado con un grado de alcohol de 92 a 93 en %w/w (95% vol.) Dicho sistema está compuesto por: • Manta eléctrica con regulador de voltaje, • Un frasco de base redonda de un litro de capacidad con junta de cuello de vidrio esmerilado, • Columna Cadiot con cinta helicoidal (pieza móvil de teflón), • Frascos cónicos con juntas de cuello de vidrio esmerilado, para la recogida del destilado. También existen sistemas de destilación automática. El rendimiento del sistema de destilación puede comprobarse periódicamente tanto por lo que respecta a la tasa de extracción como a la precisión de la determinación isotópica. Dicho control puede realizarse mediante destilación y medición de CRM -660. 5.3.4 Se necesita el equipo y los consumibles de laboratorio habituales siguientes: -micropipeta con puntas adecuadas, -equilibrio con una precisión de 0,1 mg o mayor, -equilibrio con una precisión de 0,1 g o mayor, -jeringa de un solo uso para la transferencia de líquidos, -frascos graduados con precisión (50 ml, 100 ml, 250 ml…) -frascos equipados con sistemas de cierre hermético y tabiques inertes (para el almacenamiento de partes alícuotas de vinos, destilados y residuos hasta la medición) -equipo y consumibles especificados en otros métodos a los que se hace referencia en el presente documento. El equipo de laboratorio y los consumibles que se indican en las listas anteriores son ejemplos y pueden ser sustituidos por otros equipos de prestaciones similares. 6. Muestreo (Preparación de la muestra) 6.1 Si todavía no se cuenta con este dato, determinar el grado alcohólico del vino o del producto fermentado (tv), midiendo hasta el 0,05% vol. más cercano (por ejemplo, utilizando el método MA-F-AS312-01-TALVOL de la OIV). 6.2 Extracción del etanol Utilizando el matraz graduado apropiado, introduzca una muestra homogénea de un volumen adecuado V ml del vino o del producto fermentado en el matraz de base redonda del aparato de destilación. Coloque un matraz cónico esmerilado para que se deposite en él el destilado. Caliente el producto que desea destilar para obtener un ratio de reflujo constante al nivel del condensador. Comience a recoger el destilado cuando se alcance una temperatura estable de Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 4 78 °C de los vapores en el condensador típico del azeótropo de etanol y agua y deje de recogerlo cuando la temperatura aumente. Debería continuar con la recogida del destilado hasta que se el azeótropo de etanol y agua se recupere completamente. Cuando se utilice manualmente una columna Cadiot (Figura 1), podrá aplicarse el procedimiento siguiente: -Recoja el líquido hirviendo que corresponde al azeótropo de alcohol y agua, cuando la temperatura aumente, interrumpa la recogida durante cinco minutos. Cuando la temperatura alcance de nuevo los 78 °C, reanude la recogida del destilado hasta que la temperatura de los vapores vuelva a aumentar. Repita dicha operación hasta que la temperatura, tras interrumpir la recogida y trabajando en un circuito cerrado, no vuelva a alcanzar los 78 ºC. Como alternativa, también pueden utilizarse sistemas de destilación disponibles en comercios. El peso mD de destilado recogido se pesa con un rango inferior a ±0,1 g. Para evitar el fraccionamiento isotópico, el destilado debería conservarse en un frasco hermético que impida cualquier evaporación hasta nuevo uso para determinación del grado alcohólico (6.3) y preparación del tubo NMR (7.1). Se conserva una parte alícuota de unos pocos ml de los residuos. En caso necesario, puede calcularse su relación isotópica (D/H)QW. 6.3 Determinación del grado alcohólico del destilado El grado alcohólico (%w/w) del destilado debe determinarse con un rango de error inferior a ±0,1% . El contenido de agua del destilado (ρ' g) puede determinarse mediante el método de Karl Fischer utilizando una muestra de aproximadamente 0,5 ml de alcohol de una masa ρ g conocida con exactitud. El grado alcohólico por masa del destilado está determinado por: tmD % w/w= 100 (1-ρ')/ ρ De manera alternativa, el grado alcohólico puede determinarse mediante densimetría, por ejemplo, utilizando un densímetro electrónico. 6.4 Rendimiento de destilación El rendimiento de destilación se calcula utilizando la fórmula siguiente: Rendimiento de dest. % = 100 tmD mD /(V.tv) Dada la incertidumbre en relación con cada variable y, especialmente, en relación con tv, el rendimiento de destilación se estima a ±0,5% (en el caso de un vino 10%v/v). Cuando se utiliza una columna Cadiot, no se espera ningún efecto de fraccionamiento del isótopo significante en el caso de un rendimiento de extracción superior al 96%. En cualquier caso, el operario puede utilizar un volumen Vml suficiente de vino o de producto fermentado para la destilación con el fin de garantizar que el rendimiento de la extracción sea suficiente. Las partes alícuotas típicas de 750, 500, 400 y 300 ml de muestra de vino deberían ser suficientes para obtener un rendimiento del 96% al realizar el procedimiento de destilación arriba indicado con la columna Cadiot en vinos o productos fermentados de tv = 4, 6, 8 y 10% vol, respectivamente. 6.5 Fermentación de mostos, mostos concentrados y mostos concentrados rectificados Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 5 Antes de su uso, la levadura puede reactivarse en un pequeño volumen de mosto. El recipiente de fermentación tiene un dispositivo de cierre hermético y que evita la pérdida de etanol. 6.5.1 Mostos Ponga aproximadamente un litro de mosto, cuya concentración de azúcares fermentables se haya determinado previamente, en el recipiente de fermentación. Añada antes aproximadamente 1 g de levadura seca eventualmente reactivada. Inserte el dispositivo de cierre hermético. Deje que la fermentación se produzca a unos 20 °C hasta que el azúcar se acabe. El producto fermentado puede destilarse siguiendo el procedimiento ya descrito para el vino en los puntos 6.1 al 6.4. Nota: los mostos preservados mediante incorporación de dióxido de azufre deben desulfitarse introduciendo nitrógeno en burbujas en el mosto al baño maría a una temperatura de entre 70 y 80 °C en condiciones de reflujo con el fin de impedir el fraccionamiento del isótopo mientras se produce la evaporación del agua. De manera alternativa, el dióxido de azufre puede eliminarse añadiendo una pequeña cantidad de una solución de peróxido de hidrógeno (H2O2). 6.5.2 Mostos concentrados Ponga V ml de mosto concentrado que contenga una cantidad conocida de azúcar (aproximadamente 170 g) en un recipiente de fermentación. Rellene hasta un litro con (1.000 - V) ml de agua. Añada levaduras secas (1 g) y 3 g de base de nitrógeno de levadura Bacto sin aminoácidos. Homogenice y repita el procedimiento tal y como se describe en el 6.5.1.. 6.5.3 Azúcar de uva (Mostos concentrados rectificados) Haga lo mismo que en 6.5.2, rellenando hasta un litro con (1.000 - V) ml de agua que también contenga 3 g de ácido tartárico disuelto. Nota: Los mostos concentrados y los mostos concentrados rectificados se diluyen en agua con una relación isotópica (D/H) distinta a la del mosto original. Normalmente, los parámetros (D/H)I y (D/H)II medidos en etanol deben normalizarse como si el mosto hubiese fermentado en agua, conservando la misma concentración del deuterio que la de V-SMOW (155,76 ppm). Esta normalización de datos puede llevarse a cabo utilizando las siguientes ecuaciones (Martin et al., 1996, J. AOAC, 79, 62-72): Norm.V − SMOW D S D = − 0.19 × − 155.76 H I H W Norm.V − SMOW D S D = − 0.78 × − 155.76 H II H W D H I D H II D S en donde es la relación isotópica del deuterio del mosto diluido. Este valor puede H W calcularse utilizando la ecuación del Global Meteoric Water Line (Craig, 1961) : Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 6 (8 ×δ 18O +10) D S +1 = 155.76 × H W 1000 en donde δ 18O se mide en el mosto diluido mediante el método de 18O/16O para la determinación de la relación isotópica de agua en vinos y mosto [OIV-MA-AS2-12].. Conserve 50 ml de muestra de mosto, mosto tratado con dióxido de azufre, mosto concentrado o mosto concentrado rectificado con el fin de llevar a cabo la posible extracción de agua y la determinación de su relación isotópica.(D/H)WQ. 7. Procedimiento 7.1 Preparación de la muestra de alcohol para la medición de NMR - sonda NMR de 10 mm de diámetro: en una botella previamente pesada, recoja 3,2 ml de destilado tal como se describe en el apartado 6.2 y pésela haciendo la lectura en el ±0,1 mg (mA) más cercano; tome una muestra de 1,3 ml del TMU patrón interno (5.2.2) y pésela haciendo la lectura en el ±0,1 mg (mST) más cercano. Dependiendo del tipo de espectrómetro y la sonda utilizados, añada una cantidad suficiente de hexafluorobenzeno (5.1.2) como sustancia de estabilización de campo-frecuencia (bloqueo): Espectrómetro 7,05 T 9,4 T sonda de 10 mm 150 µl 35 µl Estas cifras son indicativas y el volumen real que vaya a utilizarse debería ajustarse a la sensibilidad del instrumento NMR. Al preparar el tubo y hasta la medición de NMR, el operario debería tener cuidado para evitar cualquier evaporación de etanol y TMU ya que ello provocaría el fraccionamiento isotópico, errores en los pesos (mA y mST) de los componentes y resultados de NMR erróneos. La exactitud del procedimiento de medición que incluye este paso de preparación puede comprobarse utilizando el CRM 656. Nota: el hexafluorobenzeno puede añadirse con un 10% (v/v) de ácido trifluoroacético (5.1.3) para catalizar el intercambio rápido de hidrógeno en el enlace de hidroxilo resultante en un único pico NMR tanto para la señales de hidroxilo como para las de agua residual. 7.2 Registro del espectro ²H NMR del alcohol La homogeneidad del campo magnético B0 en la muestra se optimiza mediante el procedimiento de “compensación” maximizando la señal de bloqueo 19F NMR observada en el hexafluorobenzeno. Los espectrómetros NMR modernos pueden realizar de manera automática y eficiente ese procedimiento de “compensación” siempre que los ajustes iniciales sean lo bastante próximos a la homogeneidad del campo magnético óptimo para una muestra determinada, como suele ser el caso de un lote de muestras de etanol preparadas tal como se describe en 7.1. La eficacia de dicho procedimiento puede comprobarse mediante la resolución medida en el espectro obtenido sin multiplicación exponencial (a saber, LB = 0) (Figura 2b) y expresarse mediante la mitad de la anchura de las señales de metilo y metileno Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 7 de etanol y la señal de metilo de TMU, que debe ser inferior a 0,5 Hz en condiciones óptimas. La sensibilidad, medida con un factor multiplicador exponencial LB igual a 2 (Figura 2a) debe ser superior o igual a 150 para la señal de metilo de etanol de grado alcohólico 95% vol (93,5% máx.). 7.2.2 Comprobación de los ajustes instrumentales Realice la estandarización habitual en busca de la homogeneidad y la sensibilidad de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Utilice los tubos sellados CRM123 (H: Alto, M: Medio, L: Bajo). Siguiendo el procedimiento descrito más adelante en 9.3, determine los valores del isótopo de esos alcoholes, denominándolos Hmeas, Mmeas, Lmeas. Compárelos con los valores estándar correspondientes facilitados, indicados por un superíndice Hst, Mst, Lst. Normalmente, a título indicativo, la desviación típica obtenida para 10 repeticiones de cada espectro debería ser del orden de 0,01 para la relación R y 0,5 ppm para (D/H)I y 1 ppm para (D/H)II. Los valores medios obtenidos para los diversos parámetros isotópicos (R, (D/H)I, (D/H)II) deben situarse dentro de la desviación típica de repetibilidad correspondiente dada para esos parámetros para el CRM123. Si no se sitúan dentro de dicho rango, realice de nuevo las comprobaciones. Una vez que los ajustes se hayan optimizado también pueden utilizarse otros materiales CRM para controlar la calidad de las medidas en los análisis rutinarios. 7.3 Condiciones para obtener el espectro NMR Ponga una muestra de alcohol preparada tal como se indica en 7.1 en un tubo de 10 mm e introdúzcalo en la sonda. Las condiciones aconsejadas para la obtención del espectro NMR son las siguientes: - una temperatura de sonda constante, ajustada para que la variación sea inferior a ±0,5°K en el rango 302K a 306K dependiendo del poder calorífico generado por el desacoplamiento; - tiempo de adquisición de al menos 6,8 s para una anchura del espectro de 1200 Hz (memoria de 16K) (a saber, unas 20 ppm a 61,4 MHz o 27 ppm a 46,1 MHz); - pulso de 90°; - detección parabólica: establezca el offset 01 entre las señales de referencia OD y CHD en el caso del etanol, y entre las señales de referencia HOD y TMU en el caso del agua; - determine el valor del offset de desacoplamiento 02 desde el espectro de protones medido por la bobina de desacoplamiento en el mismo tubo. Se obtiene un buen desacoplamiento cuando 02 se sitúa en el centro del intervalo de frecuencia existente entre los grupos CH3- y CH2-. Utilice el modo de desacoplamiento de banda ancha o las secuencias de pulso compuesto (por ejemplo, WALTZ16) para garantizar un desacoplamiento homogéneo en el espectro completo. Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 8 Para cada espectro, realice un número de acumulaciones NS suficiente para obtener la relación señal/ruido indicada como sensibilidad en 7.2 y repita NE veces este ajuste de acumulaciones NS. Los valores de NS dependen de los tipos de espectrómetro y sonda utilizados. Algunos ejemplos de posibles selecciones son: Espectrómetro 7,05 T 9,4 T sonda de 10 mm NS = 304 NS = 200 El número de repeticiones NE debería ser estadísticamente significativo y suficiente para lograr el rendimiento y la precisión del método como se indica más abajo en §9. En el caso de que dos tubos de muestra NMR hayan sido preparados siguiendo el procedimiento descrito en 7.1, pueden registrarse cinco repeticiones de espectros NMR (NE=5) en cada tubo. El resultado final de cada parámetro isotópico corresponde al valor medio de las mediciones obtenidas en dos tubos de muestra NMR. En ese caso, los criterios de aprobación para la valoración de los resultados obtenidos con estos dos tubos son: |Mes1(D/H)I-Mes2(D/H)I|<0.5ppm , |Mes1(D/H)II-Mes2(D/H)II|<0.8ppm ) 8. Expresión de resultados Para cada uno de los espectros NE (véase espectro NMR para etanol, Figura 2a), determine: hII R = 3 h1 = 3 ⋅ altura de señal II (CH3 CHD OH) altura de señal I (CH2D CH2OH) donde • TI = • TII = ____altura de señal I (CH2D CH2OH)____ altura de señal de patrón interno (TMU) ____altura de señal II (CH3CHD OH)____ altura de señal de patrón interno (TMU) - mST y mA, véase 7.1 - tmD, véase 6.3 - (D/H)ST = relación isotópica de patrón interno (TMU) indicada en el certificado expedido por IRMM. Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 9 La utilización de alturas pico en lugar de área pico, que es menos precisa, supone que la anchura pico a media altura es idéntica y es una aproximación razonable, en caso aplicable (Figura 2b). Para cada uno de los parámetros del isótopo, calcule la media y el intervalo de confianza para el número de espectros repetidos adquiridos en una muestra dada. Diversos programas informáticos opcionales permiten realizar dichos cálculos online. 9. Precisión La repetibilidad y reproducibilidad del método SNIF-NMR han sido estudiadas a través de estudios colaborativos en zumos de fruta como se indica en la bibliografía citada más abajo. Sin embargo, estos estudios consideraron solamente el parámetro (D/H)I. En el caso del vino, se pueden considerar datos de estudios internos llevados a cabo por varios laboratorios para determinar la desviación típica de la repetibilidad y el límite de repetibilidad como se presenta en el Anexo 1. Los resultados de los ensayos de aptitud presentados en el Anexo II brindan datos que pueden utilizarse para calcular la desviación típica de la reproducibilidad y el límite de reproducibilidad para los vinos. Estas cifras se pueden resumir del siguiente modo: (D/H)I (D/H)II R Sr 0,26 0,30 0,005 r 0,72 0,84 0,015 SR 0,35 0,62 0,006 R 0,99 1,75 0,017 Donde: - Sr: desviación típica de repetibilidad - r: límite de repetibilidad - SR: desviación típica de reproducibilidad - R: límite de reproducibilidad REFERENCIAS MARTIN G.J., MARTIN M.L., MABON F., Anal. Chem., 1982, 54, 23802382. MARTIN G.J., MARTIN M.L., J. Chim. Phys., 1983, 80, 294297. MARTIN G.J., GUILLOU C., NAULET N., BRUN S., Tep Y., Cabanis J.C., CABANIS M.T., SUDRAUD P., Sci. Alim., 1986, 6, 385405. Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 10 MARTIN G.J., ZHANG B.L., NAULET N. and MARTIN M.L., J. Amer. Chem. Soc., 1986, 108, 51165122. MARTIN G.J., GUILLOU C., MARTIN M.L., CABANIS M.T., TEP Y. et AERNY J., J. Agric. Food Chem., 1988, 36, 316. MARTIN G. G., WOOD R., MARTIN, G. J., J. AOAC Int., 1996 , 79 (4), 917-928. 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Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 11 motor junta hermética ATMÓSFERA termómetro columna termómetro tapón sonda recipiente Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 12 Figura 1 – Aparato para extraer etanol Figura 2a Espectro 2H NMR de un etanol procedente de vino con un patrón interno (TMU: N, N-tetrametilurea) Figura 2b Espectro 2H de etanol tomado en las mismas condiciones que las de la Figura 2a, pero sin multiplicación exponencial (LB = 0) Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 13 Anexo I: Estimación de la repetibilidad a partir de estudios de repetibilidad internos Los estudios internos de repetibilidad llevados a cabo en cuatro laboratorios ofrecen datos que permiten la estimación de la repetibilidad del método SNIF-NMR. Estos estudios internos de repetibilidad han sido realizados mediante destilaciones duplicadas y mediciones de 10; 9 ó 15 diferentes muestras de vino por los laboratorios 1; 2 y 3. De manera alternativa, el laboratorio 4 realizó 16 destilaciones y mediciones en el mismo vino en condición de repetibilidad durante un corto período de tiempo. Cuadro I-1: Laboratorio 1: 10 vinos analizados por duplicado (D/H)I Muestra (D/H)I (D/H)II 1 103,97 130,11 2,503 104,52 130,79 2,503 103,53 130,89 2,529 103,94 130,57 2,513 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (D/H)II abs(∆(D/H)I) Cuadra dos 0,55 R abs(∆(D/H)II) Cuadra dos abs(∆(R)) Cuadra dos 0,302 0,68 0,462 0,000 0,00000 0,41 0,168 0,32 0,102 0,016 0,00026 0,32 0,102 0,20 0,040 0,004 0,00002 0,14 0,020 0,20 0,040 0,000 0,00000 0,48 0,230 0,20 0,040 0,016 0,00026 0,30 0,090 0,36 0,130 0,001 0,00000 0,15 0,023 0,75 0,563 0,011 0,00012 0,24 0,058 0,42 0,176 0,003 0,00001 0,04 0,002 0,44 0,194 0,007 0,00005 0,50 0,250 0,18 0,032 0,010 0,00010 R 102,72 130,00 2,531 103,04 130,20 2,527 105,38 132,39 2,513 105,52 132,59 2,513 101,59 127,94 2,519 101,11 128,14 2,535 103,23 132,14 2,560 102,93 131,78 2,561 103,68 130,95 2,526 103,53 130,20 2,515 101,76 128,86 2,533 101,52 128,44 2,530 103,05 129,59 2,515 103,01 129,15 2,508 101,47 132,63 2,614 100,97 132,45 2,624 Suma de los cuadrados: 1,245 1,779 0,00081 Sr 0,25 0,30 0,006 r 0,71 0,84 0,018 Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 14 Cuadro I-2: Laboratorio 2: 9 vinos analizados por duplicado (D/H)I Muestra (D/H)I (D/H)II R 1 105,02 133,78 2,548 104,76 133,88 2,556 102,38 130,00 2,540 101,65 129,60 2,550 3 100,26 126,08 2,515 99,42 125,44 2,523 4 101,17 128,83 2,547 100,66 128,38 2,551 101,47 128,78 2,538 101,47 128,52 2,533 106,14 134,37 2,532 106,26 134,41 2,530 103,62 130,55 2,520 103,57 130,66 2,523 103,66 129,88 2,506 103,38 129,33 2,502 103,50 129,66 2,506 103,93 129,44 2,491 2 5 6 7 8 9 (D/H)II abs(∆(D/H)I) Cuadrados 0,26 R abs(∆(D/H)II) Cuadrados abs(∆(R)) Cuadrados 0,068 0,10 0,010 0,008 0,00007 0,73 0,533 0,40 0,160 0,010 0,00011 0,84 0,706 0,64 0,410 0,008 0,00007 0,51 0,260 0,45 0,203 0,004 0,00002 0,00 0,000 0,26 0,068 0,005 0,00003 0,12 0,014 0,04 0,002 0,002 0,00000 0,05 0,003 0,11 0,012 0,003 0,00001 0,28 0,078 0,55 0,302 0,004 0,00001 0,43 0,185 0,22 0,048 0,015 0,00021 Suma de los cuadrados: 1,846 1,214 0,00053 Sr 0,32 0,26 0,005 r 0,91 0,74 0,015 Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 15 Cuadro I-3: Laboratorio 3: 15 vinos analizados por duplicado (D/H)I Muestra (D/H)I (D/H)II R 1 101,63 125,87 2,477 101,57 125,41 2,470 99,24 124,41 2,507 99,19 124,37 2,508 101,23 125,07 2,471 101,17 125,23 2,476 100,71 125,29 2,488 100,78 124,13 2,464 5 99,89 124,02 2,483 99,71 123,46 2,476 6 100,60 124,14 2,468 100,41 124,80 2,486 101,47 125,60 2,476 101,70 125,74 2,473 102,02 124,00 2,431 102,15 123,93 2,426 99,69 124,60 2,500 100,09 125,13 2,500 99,17 123,71 2,495 99,47 123,90 2,491 100,60 123,89 2,463 101,00 124,43 2,464 99,38 124,88 2,513 99,05 124,33 2,511 13 99,51 125,24 2,517 99,95 125,25 2,506 15 101,34 124,68 2,460 101,77 125,09 2,458 2 3 4 7 8 9 10 11 12 (D/H)II abs(∆(D/H)I) Cuadrados 0,06 R abs(∆(D/H)II) Cuadrados abs(∆(R)) Cuadrados 0,004 0,46 0,212 0,007 0,00005 0,05 0,002 0,04 0,002 0,001 0,00000 0,06 0,004 0,16 0,026 0,005 0,00002 0,07 0,005 1,16 1,346 0,024 0,00058 0,18 0,032 0,56 0,314 0,007 0,00005 0,19 0,036 0,66 0,436 0,018 0,00032 0,23 0,053 0,14 0,020 0,003 0,00001 0,13 0,017 0,07 0,005 0,005 0,00002 0,40 0,160 0,53 0,281 0,000 0,00000 0,30 0,090 0,19 0,036 0,004 0,00002 0,40 0,160 0,54 0,292 0,001 0,00000 0,33 0,109 0,55 0,302 0,002 0,00000 0,44 0,194 0,01 0,000 0,011 0,00012 0,43 0,185 0,41 0,168 0,002 0,00000 Suma de los cuadrados: 1,050 3,437 0,00120 Sr 0,19 0,34 0,006 r 0,53 0,96 0,018 Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 16 Cuadro I-4: Laboratorio 4: un vino analizado 16 veces Repetición (D/H)I (D/H)II R 1 101,38 126,87 2,503 2 101,30 126,22 2,492 3 100,98 125,86 2,493 4 100,94 126,00 2,497 5 100,71 125,79 2,498 6 100,95 126,05 2,497 7 101,17 126,30 2,497 8 101,22 126,22 2,494 9 100,99 125,91 2,494 10 101,29 126,24 2,493 11 100,78 126,07 2,502 12 100,65 125,65 2,497 13 101,01 126,17 2,498 14 100,89 126,05 2,499 15 101,66 126,52 2,489 16 100,98 126,11 2,498 (D/H)I (D/H)II R Varianza: 0,0703 0,0840 0,000013 Sr 0,27 0,29 0,004 r 0,75 0,82 0,010 Los datos combinados para la desviación típica de repetibilidad y para el límite de repetibilidad pueden, por tanto, estimarse del siguiente modo: (D/H)I (D/H)II R Sr 0,26 0,30 0,005 límite de repetibilidad r 0,72 0,84 0,015 Los datos de los estudios de repetibilidad internos fueron proporcionados por (en orden alfabético): - Bundesinstitut für Risikobewertung, Thielallee 88-92 PF 330013 D-14195 BERLÍN – ALEMANIA - Fondazione E. Mach-Istituto Agrario di San Michele all'Adige , Via E. Mach, 1 - 38010 San Michele all'Adige (TN), ITALIA - Joint Research Centre - Institute for Health and Consumer Protection, I-21020 ISPRA (VA) – ITALIA Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 17 - Laboratorio Arbitral Agroalimentario, Carretera de la Coruña, km 10,7 E-28023 MADRID – ESPAÑA Anexo II: Evaluación de la reproducibilidad a partir de los ensayos de aptitud Desde diciembre de 1994, se han organizado con regularidad ejercicios de ensayos de aptitud sobre la determinación de parámetros isotópicos en el vino y varias otras matrices de alimentos. Estos ejercicios de ensayos de aptitud permiten a los laboratorios participantes evaluar su rendimiento y la calidad de sus análisis. La utilización estadística de estos resultados obtenidos sobre una gran cantidad de muestras a lo largo de un período de tiempo prolongado permite la apreciación de la variabilidad de las mediciones bajo condiciones de reproducibilidad. Esto permite una buena estimación de los parámetros de varianza y del límite de reproducibilidad del método. Los resultados de 40 rondas de ensayos de aptitud desde 1994 hasta 2010 para distintos tipos de vino (tinto, blanco, rosado, seco, dulce y espumoso) se resumen en el cuadro II-1 presentado abajo. Para (D/H)I y (D/H)II la SR combinada puede, por tanto, ser calculada usando la siguiente ecuación: donde Ni ,y SR,i son el número de valores y la desviación típica de la reproducibilidad de la ronda iº, y K el número de rondas. Considerando la definición de la relación intramolecular R, y aplicando las reglas estándar de propagación de errores, asumiendo que (D/H)I y (D/H)II no están correlacionadas (los términos de covarianza corresponden a cero), se puede también calcular la desviación típica de reproducibilidad para este parámetro. Se pueden calcular, por tanto, las siguientes cifras: (D/H)I (D/H)II R SR: 0,35 0,62 0,006 Límite de reproducibilidad R 0,99 1,75 0,017 Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 18 Cuadro II-1: : Ensayo de aptitud FIT – Resumen de los valores estadísticos observados en las muestras de vino: (D/H)I (D/H)II Muestra Año Ronda N Media SR N Media SR Vino tinto 1994 R1 10 102,50 0,362 10 130,72 0,33 Vino rosado 1995 R1 10 102,27 0,333 10 128,61 0,35 Vino tinto 1995 R2 11 101,45 0,389 11 127,00 0,55 Vino tinto 1996 R1 11 101,57 0,289 11 132,23 0,34 Vino rosado 1996 R2 12 102,81 0,322 12 128,20 0,60 Vino blanco 1996 R3 15 103,42 0,362 15 127,97 0,51 Vino tinto 1996 R4 15 102,02 0,377 13 131,28 0,30 Vino rosado 1997 R1 16 103,36 0,247 16 126,33 0,44 Vino blanco 1997 R2 16 103,42 0,444 15 127,96 0,53 Vino blanco dulce 1997 R2 14 99,16 0,419 15 130,02 0,88 Vino 1997 R3 13 101,87 0,258 15 132,03 0,61 Vino dulce 1997 R3 12 102,66 0,214 12 128,48 0,48 Vino rosado 1997 R4 16 102,29 0,324 16 129,29 0,63 Vino dulce 1997 R4 15 102,04 0,269 13 131,27 0,30 Vino blanco 1998 R1 16 105,15 0,302 16 127,59 0,59 Vino dulce 1998 R3 16 102,17 0,326 16 129,60 0,56 Vino tinto 1998 R4 17 102,44 0,306 17 131,60 0,47 Vino blanco 1999 R1 14 102,93 0,404 13 129,64 0,46 Vino dulce 2000 R2 15 103,19 0,315 14 129,43 0,60 Vino 2001 R1 12 105,28 0,264 16 131,32 0,68 Vino dulce 2001 R2 14 101,96 0,249 15 128,99 1,05 Vino 2002 R1 17 101,01 0,365 16 129,02 0,74 Vino 2002 R2 17 101,30 0,531 17 129,28 0,93 Vino 2003 R1 18 100,08 0,335 18 128,98 0,77 Vino dulce 2003 R2 17 100,51 0,399 18 128,31 0,80 Vino 2004 R1 18 102,88 0,485 19 128,06 0,81 Vino dulce 2004 R3 16 101,47 0,423 16 130,10 0,71 Vino 2005 R1 19 101,33 0,447 19 129,88 0,76 Vino dulce 2005 R2 15 102,53 0,395 15 131,36 0,38 Vino seco 2006 R1 18 101,55 0,348 18 131,30 0,51 Vino dulce 2006 R2 18 100,31 0,299 18 127,79 0,55 Vino 2007 R1 18 103,36 0,403 18 130,90 0,90 Vino dulce 2007 R2 19 102,78 0,437 19 130,72 0,55 Vino 2008 R1 24 103,20 0,261 23 131,29 0,59 Vino dulce 2008 R2 20 101,79 0,265 19 129,73 0,34 Vino seco 2009 R1 24 102,96 0,280 23 130,25 0,49 Vino dulce 2009 R2 21 101,31 0,310 21 127,07 0,50 Vino seco 2010 R1 21 101,80 0,350 20 129,65 0,40 Vino espumoso 2010 R1 11 101,51 0,310 11 129,09 0,68 Vino seco 2010 R2 20 104,05 0,290 19 133,31 0,58 Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 19 Certificado conforme Porto, 24 de junio de 2011 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2011 20