TP 4 teoría y práctica

MICROBIOLOGÍA GENERAL
2016
TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
INTRODUCCIÓN A LA
GENÉTICA BACTERIANA
1
INDICE GENERAL
1
TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES EN BACTERIAS ........................................... 3
1.1
Conjugación bacteriana ........................................................................................... 3
1.1.1
El plásmido F ..................................................................................................... 3
1.1.2
Formas de presentación del plásmido F y su utilidad en genética bacteriana 4
1.2
2
Algunos conceptos básicos de transducción y transformación............................... 8
PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................... 13
2.1
Conjugación bacteriana ......................................................................................... 13
2.1.1
Objetivo .......................................................................................................... 13
2.1.2
Metodología ................................................................................................... 13
2.2
Fagos ...................................................................................................................... 14
2.2.1
Objetivo .......................................................................................................... 14
2.2.2
Metodología ................................................................................................... 14
3
CUESTIONARIO GUÍA ................................................................................................. 15
4
PROBLEMAS ............................................................................................................... 16
2
1 TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES EN BACTERIAS
Las bacterias intercambian y adquieren nuevos material genético básicamente a través de
tres procesos: conjugación, transducción o transformación.
1.1 Conjugación bacteriana
La conjugación es el proceso de transferencia de material genético entre una célula
bacteriana dadora y una receptora. Fue descubierto por Joshua Lederberg y Edward
Tatum en 1946. Este proceso que requiere del contacto directo entre ambas bacterias
es promovido por determinados tipos de plásmidos presentes en la célula dadora.
Estos plásmidos transportan genes que codifican para estructuras de superficie
especializadas que posibilitan el establecimiento del contacto célula-célula y funciones
específicas que median la transferencia de la información genética. La mayoría de los
plásmidos conjugativos codifican además para sistemas que aseguran que la célula
receptora no tenga ya un elemento similar.
Algunos de estos plásmidos se pueden integrar al cromosoma bacteriano. En este caso,
si se produce la conjugación, se puede transferir parte del propio plásmido más un
segmento adyacente del cromosoma, que a su vez podrá recombinarse con secuencias
homólogas del cromosoma del receptor, dando lugar a un cromosoma híbrido.
La información genética transferida a menudo beneficia al receptor. Las ventajas
pueden incluir resistencia a antibióticos, tolerancia a tóxicos o xenobióticos o la
capacidad de utilizar o sintetizar nuevos metabolitos.
1.1.1 El plásmido F
El factor de fertilidad de E. coli K12, el plásmido conjugativo F, fue el primero en ser
caracterizado. En este plásmido se distinguen regiones: región tra, donde se
encuentran genes que codifican para funciones relacionadas con la transferencia
conjugativa (biosíntesis y ensamblaje del pelo sexual, estabilización, regulación,
replicación asimétrica y transferencia del ADN); la zona RepFIA u oriV, región implicada
en la replicación vegetativa del plásmido F, la incompatibilidad de F respecto de otros
3
plásmidos, y con el reparto de las copias replicadas de F a las células hijas; secuencias
de inserción (IS3, IS2 y Tn1000) que permiten la integración de F en varios lugares del
cromosoma; y oriT que es el origen para la transferencia conjugativa.
Figura 1. Esquema de la organización genética y funcional del plásmido F
1.1.2 Formas de presentación del plásmido F y su utilidad en genética bacteriana
El plásmido F tiene la capacidad de permanecer como tal o de integrarse al cromosoma
bacteriano, por lo que puede encontrarse en uno de tres posibles estados en la célula
aceptora:
Plásmido F autónomo – las células se denominan F+
• F integrado - las células se denominan Hfr (o de alta frecuencia de recombinación),
• Plásmido F que contiene genes provenientes del cromosoma - las células se
denominan F’ (F-prima).
•
Cuando una célula F+ o F’ transfiere el plásmido por conjugación, una de las dos
cadenas parentales del plásmido pasa a la célula receptora, replicándose en ella,
mientras que la otra permanece en el dador, sirviendo a su vez como molde para la
síntesis de una nueva cadena complementaria. Al final del proceso, ambas células en el
par conjugativo poseen una copia del plásmido (Figura 2).
4
Figura 2. Conjugación bacteriana entre una célula F+ (o F´) y una célula F-
En el caso de las células Hfr, como el plásmido no se transfiere completo, la célula
receptora sólo adquirirá genes nuevos si éstos pueden estabilizarse mediante
recombinación homóloga (Figura 3).
5
Figura 3. Generación de una célula Hfr y su posterior conjugación con una célula F-
Dependiendo de la secuencia de inserción implicada en la integración, su localización
dentro del cromosoma de E. coli, y de la orientación en que se produzca la inserción se
pueden obtener distintas células Hfr. La transferencia de ADN por cada cepa Hfr es
unidireccional y linear, o sea, los genes del dador ingresan al receptor en un orden
determinado y de manera secuencial. Por ello la frecuencia relativa obtenida para un
determinado marcador (es decir, el nº final de recombinantes obtenido) guarda una
relación inversa con el tiempo en que éste comienza a aparecer (a menor tiempo de
aparición, mayor frecuencia final de ese marcador) y con el sitio de inserción y
orientación del plásmido F en el genoma. De hecho, en la población de bacterias
6
algunas células reciben el marcador antes y otras después, dentro de un cierto rango
de tiempo.
Si se grafica la frecuencia de obtención de recombinantes en función del tiempo para
cada marcador se obtiene una curva característica para cada uno. Cada curva presenta
una pendiente característica y culmina en una meseta (momento a partir de un punto
ya no entra más ese marcador). A partir de estas curvas se puede determinar el tiempo
de entrada inicial del marcador, extrapolando la pendiente de la curva al eje de las
abscisas. El tiempo en que comienza a detectarse un determinado marcador, así como
la frecuencia final de dicho marcador en los transconjugantes provee una estimación
de su distancia respecto del origen de transferencia y permite determinar la posición
relativa de un marcador desconocido respecto a otros conocidos. Por ello esta
herramienta se puede utilizar para la elaboración de mapas genéticos del cromosoma
bacteriano. (Experimentos de conjugación interrumpida, Figura 4).
Figura 4. Experimento de conjugación interrumpida y determinación de los tiempos de
entrada de distintos marcadores
Una cepa Hfr puede revertir a F+ si la escisión se da a través de las mismas secuencias
de inserción implicadas en su formación; o a F’, si la escisión involucra a secuencias
repetidas diferentes a las IS que las que le dieron origen (Figura 5). En este último caso,
el plásmido conjugativo que se origina posee uno o más genes de la bacteria que se
ubicaban en las cercanías del sitio de integración original. Por ello, estos plásmidos se
denominan F'.
7
Figura 5. Generación de un plásmido F´ a partir de una célula Hfr
1.2 Algunos conceptos básicos de transducción y transformación
La transducción es un proceso mediante el cual se transfieren genes desde una
bacteria a otra mediante la acción de un virus bacteriano o bacteriófago. Esta
herramienta también es utilizada por los biólogos moleculares para introducir en forma
controlada un gen extraño en el genoma de una célula receptora.
El proceso de la infección comienza cuando la partícula del fago se adsorbe sobre
receptores en la superficie de la bacteria e inyecta el ADN contenido en su cápside. Este
ADN tenderá a expresar su programa genético, pero el resultado final dependerá de
que el fago sea de tipo virulento o de tipo atemperado. En el primer caso, se produce el
ciclo lítico, como del resultado del cual se producen muchas copias del ADN fágico y
cápsides proteicas donde este se empaqueta. Las nuevas partículas (viriones), una vez
completadas y ensambladas, lisan a la bacteria, quedando libres en el medio y
preparadas para infectar nuevas células de la especie bacteriana hospedadora. Este
proceso se puede visualizar sobre un césped bacteriano como placas de lisis, también
llamadas calvas.
Si el fago es de tipo atemperado, al ingresar en la bacteria se pueden reprimir las
funciones líticas del fago e incorporarse el ADN del fago por recombinación específica
de sitio conservativa en el genoma bacteriano generando un profago. Ante condiciones
adversas, se puede inducir el ciclo lítico previa escisión del profago del genoma.
8
Como consecuencia de la activación del ciclo lítico del fago se pueden generar
partículas fágicas transductoras, partículas que pueden tener o no restos del ADN viral,
pero que transportan una porción de material genético de la célula hospedadora. Estas
partículas son las que median el proceso de transducción, ya que al igual que los fagos
silvestres inyectan de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, pero en
este caso los genes provenientes de la bacteria dadora pueden recombinarse con el
ADN de la célula receptora y expresar su información generando así cepas bacterianas
nuevas.
Se distinguen dos tipos de transducción: generalizada y especializada, según el fago
que les dio origen sea de tipo virulento o atemperado, respectivamente. En la
transducción generalizada (Figura 6), la partícula transductora (pseudovirión) se forma
por empaquetamiento anómalo de ADN bacteriano y sólo de éste, durante el ciclo
virulento de un fago lítico, por lo que puede contener cualquier fragmento del genoma
bacteriano. Junto con la utilización de cepas Hfr, la transducción generalizada ha sido
de suma utilidad para la elaboración de mapas genéticos del cromosoma bacteriano,
ya que ambas metodologías se complementan.
9
Figura 6. Transducción generalizada en bacterias
Por el contrario, la transducción especializada (Figura 7) es consecuencia de la
inducción del ciclo lítico de un fago atemperado, por lo que el número de marcadores
que pueden ser transferido se restringe a los loci genéticos adyacentes al sitio de
integración del profago (Figura 8). Estas partículas por lo tanto contienen ADN del fago.
Figura 7. Transducción especializada en bacterias
10
Figura 8. La escisión defectuosa del fago toma genes del hospedador.
La transformación (Figura 9) es la introducción de ADN libre en una bacteria. Hay
células capaces de captar ADN desde el medio y por lo tanto son naturalmente
transformables, pero tambien la competencia, o sea la capacidad de adquirir ADN se
puede inducir, mediante perturbaciones químicas (cationes divalentes) o físicas (shock
electrico) de la envoltura bacteriana.
11
Figura 9. Transformación bacteriana con fragmentos de ADN (panel izquierdo) y ADN
plasmídico (panel derecho).
12
2
PARTE EXPERIMENTAL
2.1 Conjugación bacteriana
2.1.1 Objetivo
Reconocer experimentalmente una forma en que las bacterias adquieren resistencia a
los antibióticos, por transferencia horizontal de genes.
2.1.2 Metodología
Cada grupo realizará una conjugación entre las siguientes cepas:
Escherichia coli MC4100 SmR
Escherichia coli XL1Blue (F´) TcR
La cepa receptora MC4100 lleva en su cromosoma un gen que confiere resistencia a
estreptomicina. La cepa dadora, XL1Blue, contiene un plásmido que incluye un gen que
confiere resistencia a tetraciclina.
1.- En el centro de una caja de Petri conteniendo medio LB-agar, colocar varias colonias
de cada una de las cepas y mezclarlas con el ansa.
2.- Incubar a 37ºC durante dos horas.
3.- Sembrar la mezcla por agotamiento de ansa en una caja de Petri conteniendo LBagar suplementado con 20 µgr/ml de Sm y 10 µgr/ml de Tc.
4.- Sembrar por depósito y posterior quemado una colonia de cada una de las cepas
utilizadas para la conjugación en una placa con el mismo medio de cultivo.
5.- Incubar a 37ºC durante 24 hs.
6.- Observar y sacar conclusiones.
13
2.2 Fagos
2.2.1 Objetivo
Observación y reconocimiento de placas de lisis del fago P1 que desarrollaron sobre un
césped bacteriano.
2.2.2 Metodología
Se realizaron diluciones seriadas en medio LB de un lisado del fago P1. En un tubo de
hemólisis estéril se mezclaron 100 μl de la dilución 10-4 del fago con 100 μl de un
cultivo saturado de la cepa de E. coli JM109. Luego se agregó al tubo 3 ml de medio LB
soft (LB conteniendo 0,5% agar) precalentado a una temperatura de aproximadamente
42°C, se agitó en un vortex, y la mezcla se esparció uniformemente sobre una placa de
LBA. Se dejó reposar hasta solidificación y posteriormente se incubó en estufa a 37ºC
durante toda la noche.
14
3
CUESTIONARIO GUÍA
1. Defina conjugación.
2. ¿A que se denomina factor F? ¿Cómo definiría una cepa F+ y una F-?
3. ¿A que se denomina célula dadora y célula receptora?
4. ¿A que se denomina Hfr? ¿Una cepa Hfr puede actuar como dadora o como
aceptora? ¿Qué utilidad tienen este tipo de cepas?
5. ¿A que se denomina F’? ¿Cómo se origina? ¿Qué ventajas tiene su uso respecto a
una cepa F+ o una Hfr?
6. ¿Cuáles son los tres tipos de cruzas posibles entre cepas que transportan un
plásmido F libre o integrado y una cepa que carece del mismo? ¿Cuál es el resultado de
la conjugación en cada caso?
8. ¿Cuándo interviene la proteína RecA durante el proceso de conjugación?
9. ¿Una cepa F+ recA+ puede conjugar con una cepa F- recA-?
10. Explique por qué los recombinantes de una conjugación de Hfr x F- son
generalmente F-, mientras que los transconjugantes de F+ x F- son usualmente F+.
12. ¿A qué se denomina marcadores seleccionables y no seleccionables?
13. ¿Cómo se pueden visualizar los bacteriofagos?
14. ¿Cómo se determina el título de un fago? ¿En qué unidades se expresa?
15. ¿Qué tipos de transducción conoce? Mencione las diferencias entre ellas.
16. ¿Qué tipo de partículas se pueden distinguir en un lisado de un bacteriofago que
hace transducción generalizada (P22)? ¿y en un lisado que hace transducción
especializada (λ)?
15
4
PROBLEMAS
1. Dadas las siguientes cepas:
a. XL2 Hfr leu+ met+ trp- recA+
b. Rc84 F- leu- met- trp+ recA+
Determine cuál es la cepa dadora y la aceptora. Describa el medio de cultivo que
utilizaría
para
seleccionar
los
transconjugantes.
Escriba
el
genotipo
del
transconjugante. ¿Qué ocurriría si la cepa XL2 fuera recA-? ¿Y si la cepa RC84 fuera
recA-?
2. Usted realiza una conjugación entre dos cepas de E. coli:
a. Cepa A12 F- trp- met- leu- recA+ Strr
b. Cepa B15 Hfr trp+ met+ leu- recA+ Tetr
Determine cuál es la cepa dadora y la aceptora. Describa el medio de cultivo que
utilizaría
para
seleccionar
los
transconjugantes.
Escriba
el
genotipo
del
transconjugante. Indique: ¿Qué ocurriría si la cepa A12 fuera recA-? ¿Y si la cepa B15
fuera recA-?
3. Dadas las siguientes cepas:
a. BB45 Hfr gal+ Strr recA+
b. CS487 F-Tetr leu- met- trp- gal- recA+
Determine cuál es la cepa dadora y la aceptora. Describa el medio de cultivo que
utilizaría
para
seleccionar
los
transconjugantes.
Escriba
el
genotipo
del
transconjugante. Indique: ¿Qué ocurriría si la cepa BB45 fuera recA-? ¿Y si la cepa
Cs487 fuera recA-?
4. Dada las siguientes cepas:
a. CV456 Hfr Ampr leu- met+ recA+
b. XC456 F- Cmr trp- recA+
16
c. GH456 F- Cmr trp- recAd. CV345 [F´ Ampr] trp- recA+
Describa las posibles conjugaciones, y en cada caso determine cuál es la cepa dadora y
la aceptora. Describa el medio de cultivo que utilizaría para seleccionar los
transconjugantes.
5. Dadas las cepas de E. coli K12 detalladas más abajo, usted desea realizar la
transferencia de material genético por conjugación.
a. Y1023 Hfr Tcr recAb. Dh104 F- met- leu- Ampr recAc. X3030 [F’ Kmr]
d. JM120 F- trp- Smr recA+
Detalle todos los pares posibles de cepas dadoras y aceptoras. Diseñe el medio de
cultivo para seleccionar los posibles transconjugantes.
Una cepa donante Hfr de genotipo a+ b+ c+ d+ strs es conjugada con una F-
6.
- - - - r
que tiene el genotipo a b c d str . Los genes a, b, c, d están espaciados igualmente.
En un experimento de tiempo de entrada se obtienen los datos de la tabla.
tiempo de conjugación
(min)
a+ strr
Nº de recombinantes por 100 Hfr
b+ strr
c+ strr
0.006
0.008
d+ strr
0.0001
0
0.01
10
5
0.1
0.01
0.0004
15
50
3
0.1
0.001
20
100
35
2
0.001
25
105
80
20
0.1
30
110
82
43
0.2
40
105
80
40
0.3
17
50
105
80
40
0.4
60
105
81
42
0.4
70
103
80
41
0.4
a) ¿Cuál es el tiempo de entrada de cada gen?
+
b) Explique la baja frecuencia de recombinación en el plateau para recombinantes d
r
str ?
7.
Se lleva a cabo un experimento de conjugación interrumpida utilizando 3
cepas Hfr distintas, aunque derivadas de la misma cepa original y una cepa F-. En la
tabla se indican las cepas Hfr utilizadas como cepa dadora en los tres experimentos de
conjugación. Para cada experimento, se detallan los tiempos de aparición (en min) en la
cepa receptora de cada uno de los marcadores de selección indicados (los genes que no
se mencionan no fueron seleccionados).
Hfr-1
Hfr-2
Hfr-3
gen
b+
a+
c+
f+
g+
tiempo
3
5
16
27
59
gen
e+
f+
c+
d+
b+
tiempo
6
24
35
46
48
gen
d+
c+
f+
e+
g+
tiempo
4
15
26
44
58
En base a la información provista, esquematice el orden de los genes en el cromosoma
bacteriano y utilice una flecha para indicar la posición relativa y orientación de F en
cada cepa Hfr. Tenga en cuenta las distancias relativas entre los genes y que los genes
pueden no estar ubicados en orden alfabético.
18
8.
Se mezclan una serie de cepas Hfr derivadas de la misma cepa original que
poseen el genotipo m+ n+ o+ p+ q+ r+ con una cepa F- que posee el genotipo m- n- o- p- qr-. La conjugación se interrumpe a intervalos regulares y se determina el orden de
aparición de los genes de cada una de las cepas Hfr en la cepa receptora. El orden de
transferencia de los genes (en orden decreciente de frecuencia de aparición) que
observa para cada par es el siguiente.
Hfr dadora
orden
Hfr1
m + q + p + n + r+ o +
Hfr6
n + r+ o + m + q + p +
Hfr9
o + m + q + p + n + r+
Hfr15
q + m + o + r+ n + p +
¿Cuál es el orden de los genes en el cromosoma bacteriano? (tenga en cuenta que es
circular). Esquematice la ubicación del factor F en el cromosoma de cada cepa Hfr
indicando con una punta de flecha su polaridad.
9.
El orden de los genes en una cepa Hfr es a, b, c, d. En una conjugación entre
una cepa Hfr donante que tiene el genotipo a+ , b+, c+ d+ x- strs y una F- que tiene un
genotipo a- b- c- d- x+ strr, 90% de las recombinantes d+ strr son x -, y 100% de las c+
d+ strr son x-. El tiempo de entrada de a, b, c y d son de 5, 10, 15 y 20 minutos, el del
gen strr es de 55 minutos. ¿Dónde se encuentra localizado el gen x?
10.
¿Cuál es el título de un stock de fagos a partir del cual se cuentan 53 placas
de lisis en la dilución 10-6 ?. Volumen de lisado utilizado 0,05 ml.
11.
Se dispone de 5 ml de un stock de fago T4 para titular, el cual es diluido 1:5.
A partir de esta dilución se realizan diluciones seriadas al décimo (10-1 a 10-8) y se
19
mezclan por duplicado 0,2 ml de la dilución que con 0,1 ml de un cultivo de células
susceptibles y agar blando y se deposita la mezcla sobre una placa de medio sólido.
Luego de la incubación, los resultados obtenidos fueron:
Dilución Número de placas de lisis
10-5
520-480
10-6
60-54
10-7
3-6
10-8
0-1
Calcule el título del stock de fago. ¿Qué esperaría observar en las placas
correspondientes a diluciones menores que 10-5 ?
20