guía para la secuenciación automática de adn - Segai

Servicio de Secuenciación de ADN
UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA
Edf. Servicios Generales - IUBO
Avda. Francisco Sánchez s/n Tfno.: 922 318 644
GUÍA PARA LA SECUENCIACIÓN
AUTOMÁTICA DE ADN
SERVICIO DE SECUENCIACIÓN - SEGAI
UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA
Guía para la secuenciación automática de ADN. SERVICIO DE SECUENCIACIÓN-S.E.G.A.I.
CONTENIDOS:
1.- Secuenciación automática de ADN
2.- Tipos de molde
3.- Preparación del molde
4.- Diseño de cebadores para secuenciación
5.- Repetición de secuencias.
6.- Información adicional
7.- Interpretación de resultados. Problemas más
frecuentes
1.- SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DE ADN
Recientemente se han desarrollado métodos no
radioactivos para secuenciar ácidos nucleicos, que
generan resultados comparables e incluso superiores a
los producidos con isótopos. Incluyen los sistemas
manuales y los sistemas automáticos.
Guía para la secuenciación automática de ADN. SERVICIO DE SECUENCIACIÓN-S.E.G.A.I.
Entre los sistemas automáticos no radiactivos
existen básicamente dos opciones: la electroforesis en
gel de poliacrilamida y la electroforesis capilar.
Ambos
métodos
son
modificaciones
del
método
desarrollado por Sanger y colaboradores a finales de
los años 70. En estos métodos, el ADN que va ser
secuenciado funciona como un molde para la síntesis
enzimática de un nuevo ADN que comienza en un sitio
definido por la unión de un cebador. En la reacción se
utiliza
una
mezcla
de
desoxinucleótidos
y
didesoxinucleótidos a unas concentraciones que crean
una probabilidad finita de que un didesoxinucleótido
se
incorpore
en
lugar
del
correspondiente
desoxinucleótido en cada posición de la cadena que
está siendo sintetizada. La incorporación de un
didesoxinucleótido bloquea la elongación de la cadena
y esto da como resultado una población de fragmentos
de ADN truncados de diferente longitud. La identidad
del nucleótido que termina la cadena en cada posición
se puede determinar bien realizando 4 reacciones de
elongación separadas, cada una de las cuales con un
didesoxinucleótido (ddATP, ddCTP, ddTTP ddGTP), en la
que es el cebador el que está marcando con un
fluorocromo o con una única reacción de elongación,
combinando los 4 didesoxinucleótidos en un solo tubo
pero marcando cada uno de estos específicamente. La
utilización
del
marcaje
fluorescente
permite
la
detección del ADN durante la electroforesis. La
población de moléculas resultante se separa por
tamaños
mediante
electroforesis
en
geles
de
poliacrilamida
o
por
capilaridad y la secuencia se obtiene correlacionando
el orden de los fragmentos en la electroforesis con el
didesoxinucleótido que termina cada uno de ellos.
1.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
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La
ventaja
principal
de
los
sistemas
de
secuenciación basados en la electroforesis de geles de
poliacrilamida
(PAGE;
“ P olyAcrylamide
Gel
Electrophoresis” ) es que permiten leer un mayor
número de bases. El límite actual para geles de unos
90 cm es de unas 1400 bases con un 99% de precisión.
Su principal inconveniente es que son tediosos (hay
que preparar el gel, limpiar los cristales y cargar
manualmente las muestras), lentos y entrañan un cierto
riesgo (manipulación de acrilamida monomérica, que es
neurotóxico y neurocarcinógeno).
1.2 Basados en electroforesis capilar (CE)
Los
sistemas
de
secuenciación
basados
en
electroforesis
capilar
(CE;
“ c apillary
electrophoresis” ) son muy recientes y está claro que
representan la próxima generación de secuenciación
automática. Su ventaja principal es justamente ésa: el
proceso se automatiza todavía más, siendo por ello muy
cómodos. Basta colocar las reacciones de secuenciación
en las placas microtiter y la máquina se encarga del
resto. Además son mucho más rápidos y el operario no
tiene que manipular directamente la acrilamida (no hay
que preparar gel). Su inconveniente es que las
lecturas obtenidas (unas 500 bases con 99% de
precisión) son menores que las que se consiguen
mediante PAGE. Además, el costo por reacción es
aproximadamente el doble que el de los sistemas
basados en gel.
2.- TIPOS DE MOLDE PARA SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
2.1 Vectores de clonación:
2.1.1.basados en
Vectores de simple cadena: casi todos
el bacteriófago M13. Son muy útiles y
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generan
muy
buenas
secuencias,
pero
tienen
el
inconveniente que sólo permiten la secuenciación en
una única dirección.
2.1.2.- Vectores plasmídicos de doble cadena: son
los más utilizados.
2.1.3.- Vectores fagémidos: vectores híbridos,
plásmidos de doble cadena que contienen un origen de
replicación de un bacteriófago de simple cadena. Si es
necesario, vectores del tipo pBluescript y pGem 18/19
pueden funcionar como fagémidos. Dependiendo de la
forma del fagémido se utilizarán como vectores de
doble cadena o de cadena sencilla.
2.1.4.- Cósmidos, YACs, PACs y BACs: son vectores
capaces de replicar grandes fragmentos de ADN. Son
ideales para estrategias de “ primer walking ” .
2.2 Fragmentos de PCR:
2.2.1.- Productos de PCR de cadena sencilla:
producidos a partir de reacciones de PCR que contienen
exceso de un primer.
2.2.2.Productos
de
PCR
de
doble
cadena:
obtenidos a partir de reacciones de PCR que contienen
cantidades iguales de cada primer.
Se pueden obtener fragmentos de ADN por PCR a
partir de tejidos o amplificar insertos directamente
de colonias. Cuando los fragmentos de PCR se clonan
pueden
producirse
problemas
de
errores
en
la
secuencia, que pueden ser evitados si se realiza la
secuenciación directamente del producto de PCR.
3. PREPARACIÓN DEL ADN MOLDE
3.1.- Obtención del ADN molde
La calidad de los datos obtenidos depende en gran
medida de la pureza y correcta cuantificación del ADN
molde proporcionado. Cualquier resto de proteínas,
RNA, sales, carbohidratos, fenol, cloroformo, etanol,
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detergentes, PEG, EDTA, etc., va a contribuir a la
obtención de una mala secuencia.
A
continuación
enumeramos
una
serie
de
recomendaciones para obtener un molde de calidad:
3.1.1 ADN plasmídico:
Para la purificación del ADN plasmídico pueden
utilizarse diferentes protocolos pero funcionan mejor
los
que
conllevan
métodos
de
purificación
con
minicolumnas.
3.1.1.1 Purificación mediante columnas
Por lo general todos los kits comercializados que
comprenden una etapa de purificación en columna dan
plásmidos de buena calidad para la secuenciación
((QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen; High Pure Plasmid
Isolation Kit, Roche; GFX Micro Plasmid prep.,
Amersham
Biosciences),
a
excepción
de
algunas
sílicas/resinas comerciales que dejan impurezas. Es
necesario centrifugar la columna dos veces después del
paso de lavado, para asegurar la eliminación del
etanol presente en la solución de lavado de la
muestra. A continuación eluir el ADN con agua
precalentada a 50 ºC
Es muy importante que el usuario prepare LAS
MUESTRAS SIEMPRE DILUIDAS EN AGUA mili-Q. Evitar el
tampón TE y los buffers de elución del ADN de los kits
comerciales porque la presencia de EDTA en la muestra
inhibe la reacción de secuenciación.
3.1.1.2 Purificación mediante protocolos manuales
→ Los métodos tipo "boiling" pueden dar buenos
resultados si se realiza tratamiento posterior
fenol/cloroformo,
cloroformo,
precipitación
isopropanol y lavados con etanol.
→
Los
recomendables
métodos
a
no
de
ser
"lisis
que
alcalina"
vaya
seguido
con
con
no
son
de
una
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purificación posterior
mediante precipitación.
con
un
kit
específico
o
→ Si en la purificación del ADN se ha utilizado
algún solvente orgánico como fenol o cloroformo, el
ADN debe purificarse al menos dos veces mediante
precipitación con etanol, para eliminar cualquier
traza del solvente orgánico.
→
Si
se
utiliza
etanol
o
isopropanol
para
precipitar
el
ADN,
realizar
la
precipitación
utilizando acetato de amonio en lugar de acetato de
sodio.
Lavar
el
precipitado
después
de
la
centrifugación al menos una vez con etanol al 70%.
Secar el precipitado el máximo posible y resuspender
en agua. La presencia de trazas de etanol en el molde
es una de las principales causas de fallo de la
secuenciación.
3.1.2 Productos de PCR:
La
mezcla
de
PCR
debe
ser
purificada
(precipitación, kits comerciales...) con objeto de
eliminar subproductos, cebadores y dNTPs contaminantes
que impidan la secuenciación.
La secuenciación de fragmentos de pequeño tamaño
es algo problemática por lo que se recomienda que los
productos sean al menos de 150 pb. Los fragmentos más
pequeños se pueden comportar como cebadores y son
difíciles de purificar con buen rendimiento.
Los productos de PCR deben verse como una única
banda en un gel de agarosa.
3.1.2.1 Purificación mediante Columna
Emplear cualquiera de los kits de purificación por
filtración o mini columnas existentes en el mercado
(QIAquick PCR Purification Kit, Quiagen; kit ExoSAPIT, Amersham Biosciences; High Pure PCR Cleanup Micro
Kit, Roche). Este método sólo puede utilizarse si la
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banda de interés es producto único de amplificación y
no una PCR múltiple, en tal caso la secuenciación será
fallida.
3.1.2.2 Precipitación
Existen varios protocolos: i) con acetato de
amonio sólo si la concentración total de cebadores en
la PCR no es superior a 5 pmol; ii) También se puede
usar Etanol y acetato sódico, etc. Al igual que en el
caso anterior, sólo se puede aplicar si el producto de
amplificación es único.
3.1.2.3 Purificación del producto de PCR de un gel
de agarosa
Cuando existan artefactos o más de un producto de
amplificación, es necesario el aislamiento de la banda
de interés mediante electroforesis en gel de agarosa
Además, permite la eliminación de primers y dNTPs. Se
trata de correr el producto de PCR en un gel de
agarosa de bajo punto de fusión al 1% (no emplear
geles más reticulados ya que puede afectar a la
purificación),
cortar
la
banda
correspondiente
(procurar no contaminar la banda con oligos y cortar
la menor cantidad de agarosa posible) y fundir la
agarosa. A continuación se explica el protocolo
recomendado por el Servicio, empleando los productos
presentes en el kit de miniprep de Qiagen para
purificación de ADN plasmídico.
3.1.2.3.1 Protocolo recomendado
1.- Llevar a cabo la electroforesis del producto de PCR en
gel de agarosa.
2.- Cortar la banda deseada.
3.- Pesar el fragmento de agarosa.
4.- Añadirle 3 volúmenes de la solución QXI del kit de
miniprep de Qiagen.
5.- Disolver el fragmento calentándolo en un baño a 50ºC
durante 10 minutos, agitar cada 2 minutos.
6.- Una vez disuelta la agarosa añadirle 0,1 volúmenes de
isopropanol absoluto y mezclarlo por inversión.
7.- Añadir la mezcla a las columnas de purificación que
proporciona el kit.
8.- Centrifugar 4000 r.p.m. durante 1 minuto a temperatura
ambiente.
9.- Lavar con 750 μl de la solución PE del kit y centrifugar
a 4000 r.p.m durante 1 minuto a temperatura ambiente.
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10.- Eliminar los restos centrifugando dos veces a 13000
r.p.m durante 1 minuto a temperatura ambiente, eliminando en cada
caso el eluido.
11.- Pasar la columna a un tubo limpio y eluir el fragmento
de ADN añadiendo 25 μl de agua-miliQ precalentada a 50ºC justo en
el centro de la columna, incubar durante 1 minuto y recoger el
ADN centrifugando a 13000 r.p.m durante 1 minuto.
12.- Cuantificar la muestra en gel de agarosa y guardarla a
4ºC durante 2-4 días o a -20ºC si son más días.
3.1.2.4
Purificación
enzimática
del
producto
de
PCR
Consiste en el tratamiento del producto de PCR con
Exonucleasa I y SAP. Recomendado para productos
pequeños de PCR. El tratamiento con exonucleasa I
degrada los primers de PCR residuales mientras que la
SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) defosforila los
dNTPs restantes. Tras la inactivación por calor de
ambas enzimas puede utilizarse el producto de PCR para
secuenciación
automática.
Este
método
no
puede
utilizarse en el caso de productos de PCR contaminados
con subproductos secundarios.
3.1.3 Lambda, Cósmidos, BACs:
Recomendamos para la extracción de ADN maxipreps
obtenidas por gradiente en ClCs. Para cualquier
consulta en relación a este tema ponerse en contacto
con el Servicio.
3.2.- Cuantificación del ADN molde
Otro factor determinante en el éxito de las
reacciones
de
secuenciación
es
la
correcta
cuantificación del ADN. Si la cantidad de ADN presente
en la muestra es inferior a la necesaria, casi con
toda probabilidad la reacción de secuenciación fallará
produciendo datos con baja señal, ruido de fondo,
errores y ambigüedades. Demasiado ADN molde también
puede producir efectos similares.
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La cuantificación se puede realizar mediante
espectrofotometría
a
260
nm.
Puesto
que
la
contaminación del ADN molde con RNA o proteínas pueden
afectar
negativamente
a
los
resultados
de
la
secuenciación, hay que medir también la absorbancia de
la muestra a 280 y 230 nm y comprobar las ratio
A260/A280 y A260/A230. El ADN molde debe tener una
ratio entre A260 y A280 nm de 1.8-2.0.
Aun así, debido al amplio margen de error de los
espectrofotómetros,
nosotros
solicitamos
además,
realizar la cuantificación mediante electroforesis en
gel de agarosa con un control de concentración
conocida y enviar la foto. De esta forma se comprueba
tanto la cantidad como
secuenciar.
Cantidades requeridas
la
calidad
del
Las muestras se traerán en tubos
debidamente etiquetados con el nombre,
concentración.
ADN
a
eppendorf
fecha y
ADN
Concentración mínima
Producto de PCR
10ng/100
PCR
Plásmido (3-10Kb)
50-100 ng/μl
500-750 ng
Plásmido (10-20 Kb)
150-200 ng/μl
1000-1200 ng
Plásmido
sencilla
100 ng/μl
200-400 ng
300 ng/μl
1500-4000 ng
cadena
Fago, Cósmido y BAC
pb
de
producto
Cantidad máxima
de
100-200ng
4.- DISEÑO DE CEBADORES PARA SECUENCIACIÓN
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La secuencia de los cebadores tiene una influencia
importante en la especificidad y la sensibilidad de la
reacción de secuenciación. Por ello es importante
seguir una serie de recomendaciones a la hora de
diseñar los cebadores.
1. Asegurarse de que la secuencia utilizada para
el diseño es correcta.
2. La longitud debe ser al menos de 18 bases y la
longitud óptima entre 20-25 bases.
3. El contenido en G-C debe ser entre 40-60%
siendo óptimo el 50%. Los cebadores con un menor
contenido en GC deben diseñarse algo más largos para
conseguir una Tm por encima de la recomendada.
4. La Tm debe estar entre 55 y 65 ºC. El Servicio
solicita que la Tm se calcule empleando la siguiente
fórmula.
[(G+C) x 4]+ [(A+T) x 2]
5. La presencia de una G o C en el extremo 3’
contribuye a la estabilidad del final del primer.
6. Evitar repeticiones de la misma base (3 o más
seguidas). Su presencia puede producir hibridaciones
secundarias sobre otras secuencias que puedan contener
un motivo complementario.
7. Evitar cebadores que puedan formar dímeros o
estructuras secundarias.
8.
Diseñar
el
cebador
al
menos
50
bases
“ u pstream ” de la secuencia de interés. La secuencia
inmediatamente posterior al cebador o no se obtiene o
puede ser bastante imprecisa.
9. Los cebadores al igual que el ADN molde deben
resuspenderse en agua estéril y no en TE y enviarse en
tubos eppendorf debidamente etiquetados indicando
nombre, fecha y concentración.
La secuenciación se puede realizar con cebadores
del usuario o con los universales disponibles en el
Servicio.
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Cebador
Concentración
máxima
Cualquier
cebador
2 picomoles/μl
El Servicio suministra gratuitamente
cebadores universales siguientes:
los
pUC/M13 Forward: 5’ CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3’
SP6 Prom: 5’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA 3’
T7 Prom: 5’ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’
pQE Prom: 5’ CCC GAA AAG TGC CAC CTG 3’
pQE Type III: 5’ CGG ATA ACA ATT TCA CAC AG 3’
pQE Reverse: 5’ GTT CTG AGG TCA TTA CTG G 3’
5.- REPETICIÓN DE SECUENCIAS
5.1 Secuencias fallidas
Los procedimientos empleados en el Servicio se han
diseñado
para
minimizar
la
variabilidad
y
la
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frecuencia de secuencias fallidas. No obstante se
pueden producir fallos debido a tres tipos de causas:
a. Características de las muestras, bien del molde
bien de los cebadores.
b. Información insuficiente por parte del usuario.
c. Error operativo del funcionamiento interno del
servicio.
Las secuencias fallidas se facturan cuando se
estima que las causas de error son del tipo a o b. Las
producidas por errores del tipo c se repiten. Para
cualquier duda o consulta ponerse en contacto con la
Unidad. Cuando las muestras enviadas sean repeticiones
indicarlo
en
el
“ formulario
de
solicitud ”
que
se
adjunta con las muestras para hacer los cambios
oportunos con el fin de conseguir un resultado
satisfactorio.
5.2 Causas de error
Las principales causas de error que se asocian con
el ADN de partida y que afectan, a la calidad del
mismo, son las siguientes:
5.2.1 Para muestras en vectores de clonación:
5.2.1.1 Las condiciones de crecimiento del cultivo.
Los cultivos bacterianos para la purificación de
plásmidos deben obtenerse de colonias frescas crecidas
en medios selectivos o de pequeños precultivos
obtenidos de stocks de glicerol o de agar.
5.2.1.2 La cepa bacteriana donde se propaga el molde
puede afectar a su calidad. Se obtienen resultados
fiables con DH1, DH5α, DH10B, XL1-blue y C600. Las
cepas MV1190, HB101 y JM101 no son recomendables
puesto
que
contienen
una
gran
cantidad
de
carbohidratos y poseen el locus endA con lo que
producen relativamente grandes cantidades de nucleasa.
5.2.1.3
Características
del
ADN.
Formación
de
estructuras en la clonación que impiden una correcta
secuenciación,
clones
o
PCRs
múltiples,
poliT,
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presencia
de
microsatélites,
etc.
En
general,
características del fragmento u organismo a secuenciar
de las cuales no se tiene conocimiento, hasta una
primera de secuenciación. Una vez conocidas tales
características, se requieren uno o varios pasos de
optimización para conseguir resultados óptimos.
5.2.1.4
Cantidad
insuficiente
de
ADN
molde.
Se
recomienda cuantificar el ADN mediante electroforesis,
empleando diluciones y comparando con marcadores de
masa conocida y comprobar la concentración.
5.2.1.5 Calidad del molde. Aunque para su preparación
se hayan utilizado kits comerciales pueden permanecer
impurezas que interfieran con la secuenciación:
5.2.2 Para productos de PCR las impurezas más
habituales son los fragmentos que copurifican con el
molde como por ejemplo primer-dimers, que contienen
sitios de unión para los cebadores de secuenciación.
5.3 Contaminación por nucleasas: por ejemplo la
DNasa causa un cambio de la forma del plásmido
superenrollada a lineal lo que reduce gradualmente la
intensidad de la señal y la longitud de la secuencia
obtenida. Por lo tanto hay que evitar las cepas
hospedadoras que produzcan nucleasas.
5.4 Contaminación por RNA: esto ocurre más
frecuentemente
cuando
los
cultivos
han
crecido
demasiado tiempo y el tampón de lisis es insuficiente
para
lisar
todas
las
células.
Las
muestras
contaminadas con RNA muestran un ruido de fondo alto.
El tratamiento del ADN molde con RNasa (libre de
DNasa) degradará el RNA con lo que se puede mejorar
los resultados de la secuenciación. Además, se falsea
la cuantificación del ADN.
5.5 Contaminación por sales: la presencia de sales
inhibe la reacción de secuenciación (disminuye la
procesividad de la polimerasa). Sin embargo, el tipo
de sal influye en la severidad del efecto: por ejemplo
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el cloruro de sodio o de potasio tiene un efecto mayor
que la misma concentración de acetato de sodio. Una
concentración de acetato de sodio mayor de 20mM inhibe
severamente la reacción de secuenciación. Las causas
más comunes de contaminación por sales son: la
coprecipitación
de
éstas
con
el
etanol
en
la
precipitación del ADN, sobre todo si esta se realiza a
baja temperatura; una eliminación insuficiente del
sobrenadante; o un lavado con etanol 70% insuficiente.
Por lo tanto la precipitación del ADN molde y los
lavados deben realizarse muy cuidadosamente y a
temperatura ambiente.
5.6 Contaminación por etanol: se produce por la
resuspensión del ADN molde tras la precipitación sin
que se haya secado suficientemente. La presencia de
pequeñas cantidades de etanol (5%) puede causar la
terminación prematura de las cadenas y por lo tanto la
obtención de secuencias cortas. Una contaminación con
etanol superior al 10% tiene como consecuencia
normalmente
el
fallo
total
de
la
reacción
de
secuenciación.
5.7 Contaminación con fenol: algunos métodos de
preparación de ADN plasmídico utilizan un paso de
extracción con fenol. La contaminación con este
reactivo tiene como resultado la degradación severa de
la secuencia resultante, especialmente en lecturas
largas. Más de un 1,4% de fenol en el ADN molde
produce secuencias totalmente inutilizables.
5.8 Problemas con los cebadores específicos del
molde. La muestra puede contener distintos sitios de
unión, o el cebador no unirse al molde o cantidad
insuficiente del cebador, error en el cálculo de la
Tm, ADN subclonado que arrastre polinker
y existan
varios sitios diana para cebadores universales, etc.
6.- INFORMACIÓN ADICIONAL
Guía para la secuenciación automática de ADN. SERVICIO DE SECUENCIACIÓN-S.E.G.A.I.
El Servicio pone a disposición de los usuarios la
asesoría
científica-técnica
necesaria
para
ser
usuarios de este Servicio. También prestamos la
asesoría informática necesaria, para realizar los
análisis relacionados con el ensamblaje, edición,
alineamiento,
búsqueda
de
secuencias
homólogas,
relaciones
filogenéticas,
detección
de
motivos,
análisis de uso de codones, comparación de la
secuencia problema con las publicadas en las bases de
datos, análisis de microsatélites, etc.
En caso de duda, aclaratorias sobre cualquier
punto, etc, puede ponerse en contacto con el Servicio
a través de nuestro teléfono o e-mail.
Tel:
922
31
86
44
o
email:
ana_gonzalezgarcia@yahoo.es
7.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
FRECUENTES Y POSIBLES SOLUCIONES
A) No se produce
después de comenzar.
reacción
o
PROBLEMAS
ésta
decae
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MÁS
poco
Posible causa
No hay ADN o hay menos del necesario
No hay cebador o la concentración es inferior a la necesaria. El
primer puede estar degradado
El cebador no encuentra el sitio de hibridación
El ADN presenta contaminación
El cebador está mal diseñado o la temperatura de melting no es la
adecuada
El sitio de unión del cebador en el vector se ha perdido o dañado.
Durante la clonación pueden crearse artefactos con una deleción
cerca del sitio de inserción del ADN a clonar o deleciones que
eliminan la secuencia del primer del vector.
En los productos de PCR puede que los amplificados no sean el
producto de la amplificación con los dos cebadores. Si el
amplificado se genera a partir de uno de los dos primers sólo se
obtendrá secuencia con éste. Este efecto se puede producir cuando se
utilizan para secuenciar los mismos primer que se han utilizado en la
amplificación del ADN molde y alguno de ellos no funciona
correctamente.
B) Señal
cebador.
de
baja
intensidad.
Posible solución
Aumentar la cantidad de ADN
Aumentar la concentración o
cantidad de cebador, Cambiar la
alícuota.
Cambiar el cebador. Asegurarse
del diseño
Volver a preparar el ADN
Rediseñar el cebador
Volver a clonar en el vector
Cambiar de cebador
Unión
Posible causa
Mala calidad del ADN
ADN presenta estructura secundaria en el sitio de hibridación del cebador
La concentración del ADN inferior a la necesaria
El cebador utilizado en la secuenciación no es el adecuado:
- Estructura secundaria (afecta más en extremo 3´)
- Tm del cebador demasiado baja (muy corto, poco contenido GC, etc…)
débil
del
Posible solución
Volver a purificar el ADN
Cambiar de cebador
Aumentar la concentración
Cambiar el cebador
C) El cromatograma es correcto pero presenta mucho
ruido de fondo.
Posible causa
Existe un sitio secundario de unión del cebador
que da lugar a picos extra
La cantidad de ADN es insuficiente y la señal es
demasiado baja
El ADN presenta contaminación1
La PCR no fue especifica y existen amplicones
Posible solución
Intentar eliminar añadiendo DMSO en la secuenciación o
cambiar de cebador
Aumentar la cantidad de ADN
Purificar el ADN
Cambiar de cebador
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contaminantes en la muestra
Cebador mal purificado o degradado
Fragmento de PCR mal purificado
Cambiar de cebador o purificar
Eliminar los cebadores de la amplificación
En la secuenciación en capilares este
(contaminación del ADN) es aún mayor al
sensible.
D)
El
cromatograma
superpuestas.
presenta
Posible causa
El cebador tiene varias dianas
Primer drimer: Esto puede ocurrir cuando los primers empleados en la
amplificación forman dímeros y están presentes en la reacción de
secuenciación debido a una mala purificación del producto. Cuando
termina la secuencia de los dímeros la lectura es correcta.
Cebador degenerado
ADN subclonado existiendo dos sitios diana para el cebador universal
utilizado.
Posible causa
PCR inespecífica: diana del cebador en ambos extremos, es decir, amplicón
inespecífico generado por un solo cebador
Hay más de un ADN molde en la muestra3
dos
problema
ser más
secuencias
Posible solución
Cambiar de cebador
Volver a purificar el producto de PCR
Cambiar de cebador
Secuenciar con otro cebador
Posible solución
Cambiar de cebador
Repreparar el ADN
Comprobar, si se ha arrastrado polinker durante la
subclonación
porque
esto
implicaría
que
el/los
cebadores universales tienen sitio de hibridación
duplicado y no se pueden utilizar en la secuenciación
de esa muestra. Asegurarse de que se parte de una
única
colonia
o
que
no
es
PCR
múltiple
con
amplificaciones secundarias inespecíficas.
-Primer Drimer
Si el producto de PCR no está purificado o en la
purificación no se ha eliminado totalmente los restos
de primer que no se utilizaron en la amplificación, se
pueden formar dimeros de primer que actúan como molde
en la reacción de secuenciación. Esto genera lecturas
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superpuestas. El rango o longitud de la superposición
dependerá del tamaño del molde contaminante.
- En el caso de productos de PCR: la mezcla de
lecturas comienza desde el principio. Si a partir de
las 20-60 pb la mezcla desaparece es indicativo de
primer drimer.
- En el caso de un clon múltiple: la mezcla de
lecturas comienza a partir de las 30-90 pb, es decir,
la lectura de ambas colonias coincide solo en el
vector. Una vez comienza el inserto, si son distintos,
se mezclan las lecturas.
Ejemplo: la reacción comienza de forma normal pero
existe doble lectura a partir de un determinado punto
(30-90 pb aprox.)
-Inserción/Deleción
La reacción comienza de forma normal pero existe
doble lectura a partir de un determinado punto (más de
150 pb aprox.)
Posible causa
Región heterocigótica
fragmento
Mutaciones frame shift
Posible solución
para
ese
Digestión para eliminarlo
E) La secuencia pierde bruscamente la señal y cae
Posible causa
Efecto de una estructura secundaria (presencia de
secuencias repetidas, palindromicas, etc…)
La cantidad entre el ADN y el cebador no es la
equilibrada
Formación de estructuras en la clonación que impiden
una correcta secuenciación
Presencia de compuestos contaminantes en la muestra
(EDTA, sales, etanol, fenol, etc.)
ADN cortado, digerido a ese nivel o finalización de
producto de PCR
Posible solución
Añadir DMSO, secuenciar la cadena complementaria, digerir
el molde, subclonarlo y secuenciar los subclones o utilizar un
kit alternativo para las reacciones de secuenciación cómo el
kit dGTP Big Dye de ABI.
Respetar las concentraciones y cantidades indicadas en las
tablas de entrega de muestras
Realizar PCR sobre el clon (cebadores universales o propios)
y mandar a secuenciar el amplicón resultante y no el clon
No resuspender nunca el ADN en solución que contenga
EDTA
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F) Presencia de picos saturados y fuera de escala
en el cromatograma
Posible causa
Demasiada cantidad de ADN
Posible solución
Reducir la cantidad de ADN
G) La secuencia es normal pero aparece un pico de
forma repentina
Posible causa
Terminadores no incorporados (entre 0-180 pb)
Posible solución
Repetir la reacción de secuenciación
H) Aparición de un pico anómalo con los colores
correspondientes a todas las bases
Posible causa
Posible solución
Burbuja producida por el capilar
Volver a analizar la muestra o repetir la reacción de secuenciación
I) Aparición de picos muy
consecuente pérdida de resolución
Posible causa
Exceso de ADN (capilar)
Presencia de sales o contaminantes en la muestra
Problema del capilar
J) Secuenciación de
abiertos
con
la
Posible solución
Respetar la cantidad y concentración de ADN
Volver a purificar la muestra
Repetir la secuencia
regiones ricas en GCs, GAs ……
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Posible causa
Formación de dúplex que alteran estabilidad del cebador
Composición nucleotídica (Repeticiones dinucleótidos
GT, GC, GA….)
Estructura secundaria, efecto de la alta Tm del
tratamiento del ADN
Posible solución
Usar temperaturas de secuenciación más bajas que la
estándar
Secuenciar cadena complementaria
Repetir la secuenciación con un kit alternativo (dGTP Big
Dyes).
Añadir DMSO en la secuenciación
Cambiar condiciones de PCR: aumentar la tª de
desnaturalización a 98º, el nº de ciclos de PCR o la cantidad
de Taq; incluir un paso de pre-desnaturalización de 5 min
Linearizar el vector y secuenciar productos tras subclonarlos
Cuando se secuencien organismos con un alto
contenido GC indicarlo en las tablas que se adjuntan
con la muestras a secuenciar
Las repeticiones de AG pueden ser problemáticas
pues la Taq produce una señal débil de G después de A
cuando se utilizan terminadores marcados. En este caso
conviene secuenciar la cadena complementaria.
K) Presencia de microsatélites
Posible causa
Presencia Microsatélites: SSRs, VNTRs, en el caso de productos de
PCR son más problemáticos que en productos clonados, sobre todo si
son de elevada longitud. Se puede producir el deslizamiento de la
polimerasa y no se puede obtener secuencia de esa región.
Repeticiones dinucleótidos GC
Posible solución
Secuenciar a partir del plásmido no del producto
de PCR y añadir DMSO en la reacción de
secuenciación
Crear delecciones seriadas en esas zonas y
secuenciar
Cambios ya recomendados
L) Presencia de largos homopolímeros
Posible causa
Presencia de poliA/poliT1
Posible solución
Secuenciar cadena complementaria
Empleando cebador degenerado del tipo T25(A, G ó C)2 si no se conoce la
base siguiente a la región poliA/poliT o los cebadores individuales específicos
T25A, T25G ó T25C. La base 3´ del cebador permite anclar este a la
secuencia al final del homopolímero, mejorando los resultados obtenidos
La polimersa “ p atina ” dando lugar a una lectura
ilegible después de la región homopolimérica, aunque
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los datos de antes de esa región sean de buena
calidad. Este problema se puede producir en la
reacción de secuenciación o en la de amplificación,
aunque en este último caso no son aparentes cuando el
fragmento se visualiza en un gel de agarosa.
Se denominan primer anclado: Son primers que se
unen al homopolímero, tipo T25-(N) y que terminan en
una base degenerada para obligar al oligo a pegarse en
la posición 3´.
Posible causa
Posible solución
Secuenciar cadena complementaria
Homopolímero de Gs o Cs (causa deslizamiento de la
polimerasa generándose una secuencia ilegible)
Usar un cebador más interno que hibride 20-30
bases antes del homopolímero para forzar a la polimerasa a
pasar sobre él
Realizar deleciones seriadas y secuenciarlas
En los productos de PCRs pueden existir saltos,
problemas que no existen en el material clonado
Secuenciar el material clonado, además del amplificado. Si es
posible, es mejor verificar la especificidad de la secuencia a
partir de otros clones
M) Primer N-1
Posible causa
Posible solución
Secuencia sombra N-1
El cebador está compuesto por cadenas completas (N), pero una proporción de
ellas contiene una base menos (N-1), esto da lugar a un cromatograma ilegible,
en algunos casos, al tener picos superpuestos y desfasados. Puede verse una
“secuencia sombra” (N-1) de menor altura, donde cada pico sombra es igual que
el pico siguiente de mas altura y/o intensidad de fluorescencia.
Prepara una nueva alícuota
del primer
N) Solo terminadores
Posible causa
Aparecen solo los terminadores debido a que la
cantidad de ADN es insuficiente
Posible solución
Poner mas cantidad de ADN o de mejor
calidad
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O) No inserto
Posible causa
Inserto no clonado correctamente
Falso positivo
Posible solución
Clonar de nuevo
Seleccionar otra colonia
P) Heterocigosis (No fallo)
G C +
T C
A
A
Heterozigoto: GT
ana
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