Abstract - Universidad Icesi

Evaluación de la glicosilación de proteínas como un
posible mecanismo neuroprotector en el infarto
Alejandro Vera, Carlos Fernando Cardozo, María Juliana Cruz,
Laura I. Mosquera, Cesar Augusto Arango y Juliana Rengifo G.
Grupos de Investigación: Natura y Grupo de Investigación Biomédica
Más información: jrengifo@icesi.edu.co
Introducción
El infarto o isquemia cerebral es la primera causa de incapacidad física en
el mundo y la tercera causa de muerte. Es un área que continúa siendo
de gran relevancia para la investigación básica ya que las estrategias
farmacológicas que se han postulado como neuroprotectoras no han
mostrado resultados significativos en ensayos clínicos. Al mismo tiempo,
la glicosilación tipo O-GlcNAc (O-GlcNAcilación) se ha convertido en una
nueva frontera de estudio en el entendimiento de la supervivencia
celular en momentos de estrés. La transferencia de un grupo Nacetilglucosamina con enlace tipo O (O-GlcNAc) a proteínas
citoplasmáticas y nucleares es un tipo de modificación post-traduccional
que se asemeja mucho a la fosforilación ya que además de ser dinámica e
inducible, regula la función de muchas proteínas.
El grado de O-GlcNAcilación de proteínas se ha relacionado con la
fisiopatología de la isquemia cardíaca y de la enfermedad de Alzheimer.
Numerosos estudios en modelos de estrés miocárdico agudo asocian el
tratamiento con glucosamina (que aumenta los niveles de OGlcNAcilación) con cardioprotección (Zachara et al 2004; Chatam et al
2008; Jones et al 2008; Champattanachai et al 2007).
El presente trabajo evalúa el efecto que tiene la aplicación de
glucosamina intraperitoneal en la magnitud de la lesión, en el grado de
O-GlcNAcilación en proteínas celulares y en la recuperación funcional en
un modelo experimental de isquemia cerebral focal en ratas Wistar.
Objetivos y Métodos
1. Estandarizar el modelo de isquemia cerebral focal en ratas Wistar.
2. Determinar si la aplicación de glucosamina intraperitoneal disminuye
el tamaño del infarto.
3. Comparar los niveles de expresión y de O-GlcNAcilación de proteínas
del citoesquelto y de proteínas que regulan el proceso de apoptosis en
ratas a las que se les genera un infarto cerebral en tratamiento y sin
tratamiento con glucosamina.
4. Contrastar los niveles de O-GlcNAcilación de proteínas con la
integridad de la arquitectura del citoesqueleto en ratas a las que se les
genera un infarto cerebral en tratamiento y sin tratamiento con
glucosamina.
5. Contrastar los niveles de O-GlcNAcilación de proteínas con la
recuperación funcional de ratas expuestas a isquemia cerebral en
tratamiento y sin tratamiento con glucosamina.
El modelo de isquemia cerebral focal en ratas Wistar consiste en la
introducción de un monofilamento a través de la carótida interna
generando una obstrucción de la arteria cerebral media (ACM) y un
infarto focal principalmente en la corteza frontoparietal (Durukan et al
2009). La delimitación de la extensión del infarto se obtiene con la
tinción del cerebro con TTC (triphenyltetrazolium chloride). La
comparación de los niveles de expresión y de O-GlcNAcilación de
proteínas se realiza por medio de las técnicas de Western Blot e
Inmunoprecipitación. Se están estudiando proteínas del citoesqueleto
(MAP-2 y Tau) y proteínas previamente identificadas como reguladoras
de los procesos de muerte y de supervivencia en neuronas (Akt y Bcl-2).
La reorganización del citoesqueleto neuronal en el área de lesión
isquémica se evalúa con histoquímica e inmunohistoquímica de
fluorescencia para marcadores de proteínas del citoesqueleto.
El desempeño funcional de los animales se determina por medio de la
prueba neurológica Test de García y de las pruebas comportamentales
Test de Campo Abierto, Test del Cilindro y Test de la Remoción de
Adhesivo. Estos datos son procesados con el software de video de
seguimiento ANY-maze versión 4.70 (Stoelting, USA).
Facultad de Ciencias Naturales – Universidad Icesi
Resultados y Conclusiones
Estandarización del modelo MCAO (Oclusión de la arteria cerebral media)
en ratas Wistar.
Estamos realizando el modelo de infarto cerebral focal MCAO usando el
monitoreo de parámetros fisiológicos como presión arterial, frecuencia
respiratoria, frecuencia cardíaca y temperatura rectal, disminuyendo así
significativamente la probabilidad de muerte de los animales durante el
procedimiento quirúrgico. Así mismo, la reproducibilidad y eficacia del
procedimiento se ha comprobado con registros de la actividad eléctrica
cerebral durante la cirugía y con pruebas neurológicas y comportamentales
que muestran una correlación con el tamaño del infarto cerebral medido
con TTC.
La aplicación de glucosamina intraperitoneal disminuye el tamaño del
infarto.
En este modelo animal de isquemia cerebral la
aplicación intraperitoneal de glucosamina a una dosis
de 200 mg/Kg media hora después de generada la
isquemia reduce el volumen de cerebro infartado
(medido con tinción de TTC) a aproximadamente la
mitad comparado con sujetos a los cuales se les
produce un infarto pero no se les aplica glucosamina
(grupo control).
Detección de expresión y de O-GlcNAcilación de proteínas en
homogenizados de tejido cerebral.
Por medio de electroforesis separamos las proteínas en
los homogenizados de tejido cerebral, esta separación
se evidencia por medio de la tinción
de Coomassie. Luego de transferir las
proteínas
desde
el
gel
de
poliacrilamida a una membrana de PVDF, estas son
detectadas específicamente por medio de la técnica del
Western Blot. En la imagen superior vemos varias
proteínas modificadas por O-GlcNAcilación y en la
inferior vemos detección de la proteína Akt.
Histoquímica de tejido cerebral infartado.
Usando los métodos de coloración histoquímica
H&E, Nissl y Golgi (usado en estas imágenes)
también hemos identificado el área de tejido
infartado generado con el procedimiento quirúrgico.
La imagen superior muestra el hemisferio isquémico,
mientras la imagen inferior muestra el hemisferio no
isquémico donde es evidente la presencia de axones
y dendritas de neuronas sanas.
Déficit funcional medido con el Test neurológico de García es indicativo
del tamaño del infarto.
Esta prueba es efectiva para evidenciar lesión cerebral pues los sujetos
sometidos a isquemia (Control) obtienen
consistentemente valores más bajos que
sujetos sometidos a todos los pasos de la
cirugía exceptuando la obstrucción de la
arteria cerebral media (grupos denominados
Sham). La implementación de pruebas
neurológicas permite verificar objetivamente
la generación de un infarto como resultado
de la cirugía experimental.
Seguimos trabajando en la ejecución de esta investigación con el objetivo
de contribuir al entendimiento de un posible tratamiento neuroprotector
en eventos de isquemia.