Rev. Cubana de Ciencia Avícola, 2002, 26: 129-135 Enfermedad Infecciosa de la Bolsa: efecto inmunosupresor en pollos de engorde E. BABAAHMADY Y R. JOA. Facultad de Veterinaria Universidad Agraria de La Habana, Cuba E- mail: jnoda@censa.edu.cu JULIA NODA EDISLEIDYS RODRÍGUEZ, P. ALFONSO Y CARMEN LAURA PERERA Grupo de Virologìa Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) Apdo. 10, San José de las Lajas, CP. 32 7800 La Habana, Cuba E-mail: jnoda@censa.edu.cu RESUMEN. La enfermedad infecciosa de la bolsa (EIB) puede afectar al pollo de engorde provocando mortalidad o inmunosupresión. Por lo que para determinar el efecto sobre los órganos linfoides y la respuesta de anticuerpos al virus EIB y a la vacunación con virus de la enfermedad de Newcastle (EN), se infectaron pollos de engorde de 5 días de edad con el aislado BF8 y una cepa vacunal del virus EIB. Las aves se evaluaron por la determinación del peso relativo de la bolsa de Fabricio (PRBF) y del bazo (PRB) a los 4, 7, 12 y 21 días postinoculación (PI), la detección de anticuerpos neutralizantes al virus de EIB y por Inhibición de la Hemoaglutinación al virus EN. Los pollos no presentaron mortalidad ni evidencia de signos clínicos pero se detectaron cambios en los parámetros morfométricos de los órganos linfoides, con diferencias entre los pollos inoculados con el aislado BF8 respecto a la cepa vacunal y un PRBF menor respecto a los controles no inoculados. Ambas cepas indujeron respuesta de anticuerpos neutralizantes a los 21 y 35 días postinoculación, pero fue superior en las aves inoculadas con el aislado comparado con la cepa vacunal. Los títulos de anticuerpos IHA al virus EN fueron inferiores en los pollos inoculados con el aislado BF8 lo cual revela su potencial para provocar mayor inmunosupresión en pollos de engorde. Palabras claves: Enfermedad de Gumboro, pollo de engorde, vacunación, enfermedad de Newcastle, anticuerpos. La enfemedad infecciosa de la bolsa (EIB), es considerada una de las patologías de mayor importancia para la avicultura mundial, debido a las pérdidas económicas que ocasiona, no sólo en la forma clínica con mortalidad sino por su efecto inmunosupresor (Lukert y Saif, 1997; Van den Berg, 2000). La vacunación y un riguroso programa de bioseguridad son considerados los pilares fundamentales en el control de esta enfermedad. La infección con el virus EIB en pollos de engorde de 3-6 semanas de edad produce morbilidad de 50 por ciento y mortalidad de 3 por ciento, pero se reportan que cepas muy virulentas pueden provocar mortalidad hasta 25 por ciento (van den Berg et al., 1991). Sin embargo en áreas donde la enfermedad es endémica, los pollos de engorde con anticuerpos maternos moderados, pueden infectarse sin síntomas clínicos y sólo se revela por la inmunosupresión que se produce (Lasher y Shane, 1994; Nielsen et al.,1998). También cepas virulentas tienen mayor capacidad que las cepas vacunales para infectar en presencia de elevados niveles de anticuerpos maternos, lo que sugiere un mayor riesgo de infección 130 E. Babaahmady, Julia Noda, Edisleidys Rodríguez y otros temprana antes que se apliquen las vacunas atenuadas (Laher y Shane, 1994). El diagnóstico de la EIB aguda y severa con mortalidad se realiza frecuentemente por los signos clínicos y las lesiones severas, lo cual se corrobora por el examen histopatológico y la detección de virus o antígenos como diagnóstico confirmativo. Sin embargo la infección en los primeros 10 días de edad provoca inmunosupresión que puede ser permanente (Velverde y Davidson, 1997; Saif, 1998), la cual sólo se revela de forma indirecta por las alteraciones patológicas de los órganos linfoides y la pobre respuesta inmune a las vacunas aplicadas como la enfermedad de Newcastle (Sharma et al. 1989). La enfermedad continua afectando la avicultura mundial, aún cuando diversos programas de control y estrategias de vacunación como la vacunación asistida por serología fundamentalmente en pollos de postura y en menor magnitud en pollos de engorde (Perera, 2000; Van den Berg et al, 2000). Por lo que en este trabajo se realizó la evaluación del efecto inmunosupresor de un aislado cubano del virus EIB, caracterizado como una cepa virulenta clásica, en la infección temprana y se compara con la cepa vacunal de tipo intermedia utilizada en el control de la enfermedad. MATERIALES Y MÈTODOS Pollos. Se utilizaron pollos de engorde de una raza pesada comercial, de 5 días de edad, mantenidos en jaulas en una nave de experimentación con aire filtrado y alimentación según los requerimentos de la edad y la categoría zootécnica. Embriones de pollos de la raza White Leghorn, libres de patógenos específicos (LPE), procedentes de la unidad de aislamiento del Centro para la Producción de Animales de Laboratorio, se emplearon para la titulación viral y para la obtenció de cultivo de células de fibroblastos de embrión de pollo (FEP) para la sueroneutralización. Virus. Se utilizó la cepa virulenta BF8, aislada en 1997 y caracterizada por Perera (2000) y la cepa vacunal tipo intermedia, la vacuna comercial Gumboro (Labiofam, S.A., Cuba). Se empleó además la vacuna contra la enfermedad de Newcastle cepa La Sota, comercial de igual procedencia y la cepa de referencia GT-1 (CVL, Weybridge). La sus- 2002 pensión viral de la cepa BF8 se obtuvo de homogenado de bolsas de Fabricio (BF) de pollos LPE infectados y colectadas a los 4 días postinoculación, la cual fue titulada en embriones de pollo (LPE) de 12 días de desarrollo y por vía de la membrana corioalantoidea (MCA). El cálculo se realizó según el método de Spearman-Kärberg (Finney, 1964). Las vacunas fueron reconstituídas como recomienda el productor para aplicar una dosis. La cepa GT-1 adaptada a células de FEP se utilizó en la prueba de sueroneutra-lización. Patología. Indicadores morfométricos de los órganos linfoides se evaluaron por los pesos relativos de la Bolsa de Fabricio (BF), el bazo (B) y el Coeficiente Bolsa-Bazo (CBB); la masa del órgano analizada (BF o B), según la fórmula PRBF/P. corporal x 1000 y PRB/P. corporal x 1000 ( Lucio y Hitchner, 1979). Las muestras de bolsa de Fabricio y el bazo fueron fijadas con formalina al 10 %, inclusión en parafina y coloración de hematoxilina y eosina. Las alteraciones histopatológicas se evaluaron por la presencia de necrosis linfoide, atrofia de los folículos, infiltración de heterófilos, edema, hemorragias, fibrosis y formación de vacuolas. (Yamaguchi et al., 1996). Sueroneutralización (SN). Se realizó por el método virus constante-suero variable en microplacas, diluciones de los sueros en Log2, a partir de 1:20 (previamente inactivados a 560C por 30 min.) y se enfren-taron a 100 DICT/ 50 de la cepa de referencia GT-1 y se incubaron durante 2 horas a 370 C y con 5% de atmósfera de CO2. A este tiempo se añadió la suspensión de células de FEP en concentración de 106 células/ml y se incubaron con iguales condiciones. La lectura fue realizada a las 48 horas y se calcularon las medias geométricas (MG) de los títulos de anticuerpos (Villegas, 1998). Inhibición de la hemoaglutinación (IH). Se determinó el título de anticuerpos por el método virus constante-suero variable y microplacas, las diluciones en Log2, se enfrentaron a 4 unidades hemoaglutinantes (HA) del antígeno comercial (Laboratorios LABIOFAM S.A.). Se calcularon las medias geométricas (MG) de los títulos de anticuerpos (Villegas, 1998). Vol. 26 Enfermedad Infecciosa de la Bolsa Diseño experimental. Los pollos a los 5 días de edad se dividieron en tres grupos de 75 pollos, a los que se inoculó la cepa virulenta BF8 con 100 µl de la suspensión viral que contenía 103 DIEP/50 en 100 µl y la vacuna Gumboro con una dosis ambas por la vía óculo-nasal y al grupo control se le inoculó un placebo. Se realizó una observación diaria para revelar signos clínicos y mortalidad, a los 4, 7, 12 y 21 días postinoculación, fueron sacrificados 5 inoculados y 5 controles, se les realizó el examen anatomopatológico y se determinó el PRBF, PRB y las muestras de BF y B se obtuvieron para análisis histopatológico. A los 13 días de edad los pollos inoculados y los controles se dividieron en dos grupos y se inocularon con la vacuna comercial de EN con una dosis de campo, por la vía intranasal. Se les extrajo la sangre al día de edad y a los 7, 21 y 35 días postinoculación con la cepa virulenta de EIB, para determinar el título de anticuerpos neutralizantes a este virus y para revelar anticuerpos al virus EN por Inhibición de la Hemoaglutinación (IHA), se obtuvieron muestras antes de vacunar y a los 14 y 28 días posterior a la vacunación . Análisis estadístico Los datos relacionados con los índices de los pesos relativos de la Bolsa de Fabricio y el bazo respecto al peso corporal y el índice bolsa/bazo (PBF/PC, PB/PC y CBB) fueron analizados por el método estadístico T de Student para comparar los inoculados respecto al control no inoculado y los cálculos se realizaron por el programa computarizado SAS (Sistema de análisis estadístico,1987). Para el análisis de la respuesta de anticuerpos neutralizantes a EIB y de anticuerpos por IHA a ENC, se aplicó el Test de Rangos Múltiples de Dunkan (1955) (SLD), con un nivel de significación de p< 0.005. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La infección temprana con el virus EIB, tanto en los pollos de raza ligera como de engorde se manifiesta de forma subclínica y sólo se evidencia su efecto inmunosupresor (Nielsen et al, 1998). En este trabajo los pollos de en- 131 gorde inoculados a los 5 días de edad con la cepa autóctona BF8, caracterizada por Perera (2000) como clásica virulenta al producir mortalidad en pollos LPE de tres semanas de edad, no presentaron signos clínicos ni mortalidad en el tiempo de observación. Resultados similares fueron obtenidos también por Velverde y Davidson (1997), cuando inocularon pollos de engorde a dife-rentes edades y determinaron que la aparición de la forma clínica se relacionaba con la edad de las aves. El grupo de aves que se les aplicó la cepa vacunal (tipo intermedia), no presentó manifestaciones. Sin embargo, el examen anatomopatológico reveló a los 4 y 7 días PI en los pollos inoculados con la cepa BF8 hemorragias, congestión y atrofia de la BF, lo que se corresponde con las lesiones prominentes producidas por el virus EIB donde se producen cambios inflamatorios seguidos de atrofia (Müller et al., 1979). Similares alteraciones son referidas en la infección por cepas virulentas de este virus produciendo una atrofia más temprana (Tanimura y Sharma, 1998) pero diferente de las cepas variantes que sólo producen atrofia. En el timo se observaron también hemorragias discretas y en masas musculares con signos de nefrosis, lo cual evidencia la virulencia de esta cepa. Figura 1. Lesiones observadas en pollos inoculados con la cepa BF8 a los 5 días de edad, muestreo a los 7 días Postinoculación. Bolsas de Fabricio y bazos de pollos controles (izquierda), en los inoculados (derecha) la BF presenta una atrofia y el bazo aumento de volumen. Los indicadores morfométricos muestran una disminución del PRBF a los 4 y 7 días PI respecto al control (Tabla 1), este resultado a este tiempo de inoculación fue observado por (Nakamura et al., 1992) cuando evaluaron el efecto inmunosupresor de las cepas muy vi- 132 E. Babaahmady, Julia Noda, Edisleidys Rodríguez y otros 2002 TABLA 1. Resultados de la valoración de los pesos relativos de la bolsa y el bazo en pollos de engorde inoculados a los 5 días de edad. T I EMPOS POST I NOCULA CI ÓN PRBF PRB CONT ROL BF8 VA CUNA DOS CONT ROL BF8 4 d PI 2.00a 1.95a 1.98 7 d PI 2.46a 2.17ab 12 d PI 2.59a 21 d PI 2.48a VA CUNA DOS a 0.88a 1.01a 0.796 a 2.60 a 0.97a 1.22ab 0.709 a 2.24a 2.45 a 0.98a 1.09a 0.943 a 2.04b 2.54 a 0.81b 1.06a 1.053 a Peso relativo de la bolsa de Fabricio (g), PRBF/ peso corporal (g) x 1000 Peso relativo del bazo (g), PRB/ peso corporal (g) x 1000 3 CBB, cociente del PRBF y PRB (Morales y Boclair, 1993) Las letras desiguales dentro de la misma fila difieren en p< 0.005 1 2 rulentas aisladas en Japón lo que sugiere que el PRB se incrementa indicando esplenomegalia lo cual se relaciona con el efecto producido por cepas virulentas del virus EIB (van den Berg, 2000). La cepa vacunal produjo menores cambios como refieren Masariegos et al. (1990) para las cepas tipo intermedias de este virus. Al examen histopatológico aunque se observó edema y hemorragias en la BF a los 7 días PI y la presencia de vacuolas, la depleción de linfocitos y necrosis a los 12 y 21 días PI (Fig. 1), fue mayor como evidencia de atrofia con la cepa BF8, lo cual indica el daño que puede provocar esta cepa, también descrito por Noda et al. (2002) pero en pollos ligeros. Sin embargo, sólo produjo lesiones menores en bazo y timo como se señalan para las cepas virulentas clásica del serotipo 1 y diferente de las cepas altamente virulentas que provocan lesiones severas en estos órganos linfoides (Nunoya et al, 1992, Tanimura et al., 1995). Estas lesiones no se observaron en las aves a las que se le aplicó la vacuna tipo intermedia, aspecto señalado por Coletti et al. (2001) en la evaluación del efecto de las cepas atenuadas del virus EIB en pollos. Figura 2. Lesiones en la bolsa de Fabricio. A) hemorragias y edema 4 días PI B) Necrosis folicular, vacuolas, infiltración de heterófilos 21 días PI El efecto de la infección producida por el virus EIB sobre la respuesta a la vacunaciòn con EN es uno de los elementos para valorar el efecto inmunosupresor (Faranger et al. 1974) por lo que en este trabajo la respuesta de anticuerpos hemoaglutinantes fue muy inferior en los grupos inoculados tanto con la cepa BF8 como con la vacuna con MG de 1.5 y 3.5 respectivamente, comparado con los controles (17,4), lo cual refleja la inmunosupresión provocada por la infección con ambas cepas, aunque mayor con la cepa BF8 y que el grado de este efecto está en dependencia de la patogenicidad de la cepa (Mazariegos et al 1990; Van den Berg, 2000), además de la edad de aplicación. Vol. 26 Enfermedad Infecciosa de la Bolsa 133 TABLA 2. Respuesta de anticuerpos IHA a EN en pollos inoculados a los 5 días de edad con la cepa BF8 del virus de la EIB VA C + EN BF8 + EN CONT ROL+EN DÍ A S PV 1 LOG. 2 A NT I LOG. 2* I Día de edad 4.9 29.9 A nt es de Vac. 2.3 4.9 14 días PV 28 días PV LOG. 2 A NT I LOG. 2* 4.9 29.9 a 2.3 4.9 0.6 1.5a 0.3 1.8 3.5 b 0.6 a LOG. 2 A NT I LOG. 2* 4.9 29.9 a 2.0 4.0 1.0 b 0.3 1.0b 1.5 b 4.1 17.1 a a a a * Medias geométricas de los títulos de anticuerpos. 1 Días postvacunación con EN. La evaluación de la respuesta de anticuerpos neutralizantes al virus EIB reveló altos títulos de los anticuerpos maternos al día de edad (1:2251) y su descenso característico en los controles (Gráfico 1), mientras que los inoculados a los 21 y 35 días PI, presentaron un incremento con MG de 113 y 394 respec-tivamente y los vacunados de 70 y 106, lo cual demuestra que se produjo la infección por el virus EIB y que este incremento es debido al estímulo producido por el virus en el sistema inmune en las aves infectadas, con diferencias significativas respecto al grupo control. Resultados similares fueron referidos por Kelemen et al. (2000) al evaluar la respuesta inmune a cepas altamente virulen-tas en pollos con títulos altos de anticuerpos maternos neutralizantes al virus de la EIB. De te r m inación de anticue r pos ne utr aliz ante s 1600 (M G) 1400 1200 Controles 1000 800 V ac una 600 BF8 400 200 0 1d edad 7 d (PI)21 d (PI)35 d (PI) Días pos t - inoculación Estos resultados sugieren que el aislado BF8 puede causar infección sin signos clínicos pero con efecto inmunosupresor en pollos de engorde comerciales y confirma su carácter patogénico determinado en pollos SPF de raza Leghorn (Perera, 2000). Además, evidencia que puede ser capaz de producir por tanto la forma subclínica de la enfermedad en esta categoría de pollos, lo que en condiciones de producción representa un compro- miso de la efectividad del programa de control que se aplica, problema actual en la presentación de la EIB a nivel mundial (van den Berg, 2000). Todo lo cual revela la necesidad de continuar las investigaciones relacionadas con la detección de la forma subclínica de la enfermedad, que aún cuando no produce mortalidad y síntomas clínicos manifiestos puede causar grandes pérdidas económicas además del compromiso ambiental. 134 E. Babaahmady, Julia Noda, Edisleidys Rodríguez y otros Infectious Bursal Disease: inmunosuppressive effect in broilers ABSTRACT. Bag infectious disease affects broilers causing mortality and inmunosuppression. Thereby, in order to determinate the effect on linfoid organs and the response of antibodies to the BID virus and vaccination with Newcastle disease, 5day broilers were infected with the isolate BFS and a vaccine strain of EIB virus. Poultry were evaluated by determination of the relative bag weight (BRW) and the relative spleen weight (SRW) at 4, 7, 12 and 21 days after inoculation, detection of neutralizing antibodies to the EIB virus and inhibition of the hemoaglutination to the NE virus. No mortality or clinical signals were observed in chicken, although changes in morfometric parameters of lymphoid organs, with differences between chicken inoculated with de isolate BF8 in respect to the vaccine strain and a minor PRBF in respect to non-inoculated controls were observed. Both strains induced neutralizing antibodies response at 21 and 35 days after inoculation, although that response was higher in poultry inoculated with the isolate, compared with the vaccine strain. Titles of IHA antibodies to the ND virus were lower in chicken inoculated with the isolate BF8, which reveals their potential to provoke a higher inmunosuppression in broilers. Key words: broiler, Infectious bursal disease, inmunosuppression, vaccination. REFERENCIAS COLETTI M, DEL ROSSI E, MP. FRANCIOSINI, F. PASSAMONTI, G. TACCONI, C. MARINI . 2001. Efficacy and safety of an infectious bursal disease virus intermediate vaccine in ovo. Avian Dis 2001 Oct-Dec;45(4):1036-43 FINNEY, J.D. 1964. 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