Presentación de PowerPoint - Facultad de Ingeniería Química

Comparación de dos metodologías para la determinación de
glifosato, glufosinato y AMPA mediante UHPLC-MS/MS.
Demonte L., Repetti M.R., Michlig N., García S.R., De Jesús J.J., Beldomenico H.R.
P R I N A R C
Programa de Investigación y Análisis de Residuos y Contaminantes Químicos (PRINARC –FIQ-UNL)
Laboratorio Central, Facultad de Ingeniería Química, Universidad Nacional del Litoral (FIQ-UNL)
Santiago del Estero 2654, Piso 6, (3000) Santa Fe, Argentina. e-mail: lcsa@fiq.unl.edu.ar
INTRODUCCIÓN
“Glifosato” es un herbicida de amplio espectro, no selectivo, post emergente empleado a nivel mundial para el control de hojas y vegetación. Si bien es potencialmente menos
tóxico y perjudicial para el medioambiente comparado con otros herbicidas, es necesaria su evaluación debido a su extensiva aplicación. Esto es especialmente relevante en
nuestro país ya que es el agroquímico más extensamente utilizado (210 milliones kg-L en 2011), con un incremento constante en la última década. Sus posibles efectos,
comportamiento y destino final en el medioambiente resultan controversiales, haciéndose necesario realizar estudios específicos y controles periódicos. Uno de los principales
problemas debido a su carácter anfotérico, alta polaridad y bajo peso molecular, es el análisis a niveles de traza, ineludible para su determinación en muestras medioambientales
(suelos y aguas). En este trabajo se describe el desarrollo de un método de cromatografía-espectrometría de masas (UHPLC-MS/MS) para la determinación de glifosato, AMPA y
glufosinato en agua y sedimentos, con estudios de alternativas de derivatización con FMOC y etapa de preconcentración, y su aplicación a muestras regionales seleccionadas.
ENFOQUES ANALÍTICOS
LC – ESI – MS/MS
MÉTODO DE ANÁLISIS
Se evaluaron y validaron alternativas del método analítico basado en
la derivatización con 9-fluorenilmetilcloroformato (FMOC-Cl). Durante
la etapa de preparación de la muestra fueron optimizados: la cantidad
de muestra y la relación muestra/solvente de extracción (para
sedimentos); en la etapa de derivatización: reactivos empleados,
tiempo de reacción, pH, mientras que en la etapa de limpieza se
evaluaron las alternativas de SPE y partición líquido-líquido.
COMPUESTO
EXTRACCIÓN
H2O (0.1 % ácido fórmico)
Diclorometano
Glifosato-FMOC
ION MOLECULAR
(m/z)
392.0
CONO
(V)
20
AMPA-FMOC
334.0
20
Glufosinato-FMOC
404.0
30
GLI 2-C13 N15-FMOC
395.0
20
AMPA C13 N15-FMOC
336.0
20
ION HIJO
(m/z)
88.1*
214.1
112.1
179.1*
136.1*
208.2
91.1*
217.1
114.1*
181.1
FILTRACIÓN
40 mL
Isótopos marcadores -13C, 15N glifosato y AMPA
Acidificación
+ HCl 6M (pH~1)
+ Agitar y esperar
*ION DE CUANTIFICACIÓN
Neutralización
+ KOH 6M (pH~7)
Tabla 2. Parámetros de validación para 10 mL de muestra de agua, 3 g de muestra de suelo y limpieza SPE.
RESULTADOS
SUELO
COMPUESTO RECUPERADO (%)
GLIFOSATO
80-109
AMPA
76-97
GLUFOSINATO 112-127
Buffer borato 5% (pH~9)
FMOC-Cl 12 mg/mL
DERIVATIZACIÓN
Durante la noche a temperatura ambiente
Filtración
0.45 μm filtro de jeringa
AGUA
LOD (ng/g) RECUPERADO (%)
0.4
87-105
0.4
84-92
0.4
123-160
RSD (%)
11
15
22
GLIFOSATO
Ácido fórmico
(pH~3)
y = 54,069x - 55,936
R² = 0,9995
y = 48,433x - 38,944
R² = 0,9992
MATRIZ - PARTICIÓN
Área de analito
SPE
Oasis HLB 3cc
5000
ESTANDAR - SOLVENTE
4000
MATRIZ - SPE
MATRIZ- PARTICIÓN
6000
ESTANDAR - SOLVENTE
5000
y = 44,714x + 143,88
R² = 0,9973
3000
2000
4000
18000
3000
LOD (ng/mL)
0.02
0.02
0.02
16000
ESTANDAR - SOLVENTE
14000
MATRIZ - SPE
y = 125,72x + 150,72
R² = 0,9993
y = 150,38x - 25,824
R² = 1
y = 166,85x + 9,4325
R² = 0,9988
12000
10000
8000
6000
4000
1000
2000
0
0
0
0
20
40
60
80
100
0
120
20
40
Concentración de analito (ng/mL)
-1000
LC – MS/MS
MATRIZ - PARTICIÓN
2000
1000
Filtración 0.22 μm
Filtro de jeringa
20000
y = 50,288x + 121,02
R² = 0,9973
y = 49,294x - 17,992
R² = 0,9999
y = 60,773x + 30,351
R² = 0,9995
MATRIZ - SPE
RSD (%)
9
7
25
GLUFOSINATO
AMPA
7000
6000
LIMPIEZA
PARTICIÓN
Diclorometano
C. E.
(V)
30
10
15
20
25
10
30
10
15
20
Área de analito
10 mL
Área de analito
4 mL
Función: MRM ESI+
Dwell time (seg): 0.01
Capilar (Kv): 2
Flujo gas de cono (L/h): 10
Temperatura de fuente (ºC): 145
Flujo gas de desolvatación (L/h): 400
Temperatura de desolvatación (ºC): 250 Software: MassLynx 4.1
Volumen de inyección: 10mL
Columna: ACQUITY UPLC® HSS C18 1.8mm, 2.1x100 mm
Temperatura de columna: 40ºC
3 g muestra
CENTRIFUGACIÓN
(capa superior)
SISTEMA TQD
Tabla 1. Parámetros MS/MS
AGUA
SUELOS Y SEDIMENTOS
SISTEMA UHPLC
Fase móvil A: Agua/Acetonitrilo 98:2 + 0.1% AF
Fase móvil B: Acetonitrilo + 0.1% AF
Flujo: 0.35 mL/min
60
80
100
120
0
20
40
60
80
100
120
Concentración de analito (ng/mL)
Concentración de analito (ng/mL)
Figura 2. Curvas de calibrado para 10 mL de muestra de agua, limpieza SPE y PARTICIÓN.
Figura 1. Método de análisis.
RESULTADOS
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
3.57
584
%
100
0
1.00
06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1)
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
3.07
256
%
100
0
1.00
06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1)
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
3.07
598
%
100
0
1.00
06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1)
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
3.25
251
%
100
0
1.00
06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1)
2.00
3.00
3.25
83
%
100
4.00
3.43
3
3.58
2
5.00
6.00
7.00
8.00
4.57 4.84
3
2
0
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
100
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
404 > 136.1 (GLUFOSINATE-FMOC)
1.54e4
Area
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
392 > 214.1 (GLYPHOSATE-FMOC)
5.93e3
Area
1.00
06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1)
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
392 > 88.1 (GLYPHOSATE-FMOC)
1.41e4
Area
1.00
06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1)
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
334 > 112.1 (AMPA-FMOC)
2.04e3
Area
Time
9.00
10.00
3.00
4.00
3.55
183
2.42
4
0
1.00
06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1)
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
334 > 179.1 (AMPA-FMOC)
6.41e3
Area
2.00
2.00
3.00
3.84
5
5.00
7.00
8.00
1.3 ng/mL
4.20
6
4.00
6.00
5.00
6.00
7.00
8.00
3.55
524
100
0
2.00
3.00
3.05
223
100
0
100
0
2.00
4.00
6.00
7.00
8.00
0.7 ng/mL
3.50
6
3.00
2.00
100
3.00
2.67
6
0
1.00
06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1)
5.00
5.00
6.00
7.00
8.00
3.05
442
1.08
10
1.00
06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1)
4.00
2.00
3.24
218
3.00
4.00
3.32
8
3.75
4
6.00
7.00
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
404 > 136.1 (GLUFOSINATE-FMOC)
1.38e4
Area
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
392 > 214.1 (GLYPHOSATE-FMOC)
6.22e3
Area
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
392 > 88.1 (GLYPHOSATE-FMOC)
1.18e4
Area
8.00
0.3 ng/mL
4.56
9
4.00
3.24
151
100
5.00
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
404 > 208.2 (GLUFOSINATE-FMOC)
5.35e3
Area
5.00
6.00
7.00
8.00
4.57
19
0
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
334 > 179.1 (AMPA-FMOC)
5.63e3
Area
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
334 > 112.1 (AMPA-FMOC)
4.33e3
Area
Time
9.00
10.00
SEDIMENTO
%
0
1.00
06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1)
MRM of 6 Channels ES+
TIC
1.24e6
Area
3.56
3.05 43668
6736
100
2.00
3.00
4.00
5.00
4.00
5.00
6.00
6.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
404 > 208.2 (GLUFOSINATE-FMOC)
2.85e5
Area
7.00
8.00
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
404 > 136.1 (GLUFOSINATE-FMOC)
9.58e5
Area
7.00
8.00
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
392 > 214.1 (GLYPHOSATE-FMOC)
5.23e4
Area
17.9 ng/g
3.56
9838
100
%
%
0
1.00
06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1)
4.56
34
3.74
20
06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1)
0
1.00
06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1)
2.00
3.00
3.56
34209
100
%
2.00
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
404 > 208.2 (GLUFOSINATE-FMOC)
3.19e3
Area
MRM of 6 Channels ES+
TIC
2.13e4
Area
0
1.00
06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1)
2.00
3.00
2.7 ng/g
3.05
2118
100
%
8.00
3.55
704
0
1.00
06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1)
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
392 > 88.1 (GLYPHOSATE-FMOC)
1.18e5
Area
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
334 > 179.1 (AMPA-FMOC)
7.95e4
Area
9.00
10.00
MRM of 6 Channels ES+
334 > 112.1 (AMPA-FMOC)
4.05e4
Area
Time
9.00
10.00
3.05
4576
100
%
7.00
%
6.00
%
5.00
3.56
118
0.95
4
1.00
06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1)
4.00
%
3.00
3.05
665
100
%
%
0
2.00
06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1)
%
%
0
1.00
06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1)
MRM of 6 Channels ES+
TIC
2.14e4
Area
3.57
705
%
3.07
849
100
100
111A_V0.5
127A_V0.5
06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1)
0
1.00
06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1)
2.00
3.00
3.24
3212
100
%
STD_CONJ_FM
1.00
06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1)
2.00
3.00
4.00
3.24
1643
100
2.00
3.00
5.00
6.00
7.00
8.00
5.00
6.00
7.00
8.00
4.57
46
0
1.00
1.5 ng/g
4.58
67
0
%
Muestras
ESTANDAR MIX
AGUA SUPERFICIAL
Para demostrar la utilidad de este ensayo en diferentes matrices de agua y suelo,
se analizaron muestras de varios sitios.
1) Aguas superficiales: de los ríos locales que corren a través de las zonas
agrícolas.
2) Aguas superficiales: de los canales locales con alto contenido de metales
pesados.
3) Aguas superficiales: efluentes de lavado de silo-bolsa.
4) Suelo de la superficie agrícola de 1.5 y 4.5 m de profundidad.
Figura 3. Ejemplos de TIC y MRM para solución estandar y 2 muestras.
5) Sedimentos de los ríos locales.
4.00
CONCLUSIONES
La metodología evaluada permite determinar los residuos de glifosato, glufosinato y AMPA en muestras de agua y suelo con características diferentes.
Las ventajas del uso de bajos volúmenes fueron significativos especialmente cuando fue introducido el paso de SPE, en términos de simplicidad, de limpieza de los extractos finales y de la
posibilidad de una mayor concentración. A pesar de las diferencias entre los dos enfoques respecto a la capacidad de detección, los LOD conseguidos en los dos casos cumplen con la
legislación vigente.
REFERENCIAS Y AGRADECIMIENTOS
[1] Arregui C., Beldomenico H.R., Cassano A., Collins P. et alter 17 authors (2011). “UNL Report on toxicity of glyphosate”. ISBN Nº 9876575066, http://www.unl.edu.ar/noticias/noticia.php?nid=7487 accessed April 2012.
[2] PAITI Programa de Promoción y Apoyo a la Investigación en Temas de Interés (PAITI), Proyecto i+D.-2011. “Methodologies by UHPLC MSMS for the determination of glyphosate residues and applications to priority matrices of Santa Fe Province”.
Resolución C.S. N° 563/11.
[3] Hanke I., Singer H., Hollender J. (2008). Anal Bioanal Chem , 391, 2265–2276.
[4] Ibañez M., Pozo O., Sancho J., López F., Hernández F. (2006). J. of Chrom. A, 1134, 51-55.
UNL
CAI+D-PAITI