Tipaje del virus del papiloma humano (VPH) en relación con la

VIII Congreso Virtual Hispanoamericano
de Anatomía Patológica — Octubre de 2006
David Guerrero
Amaya Ojer Gambart
Rosa Guarch Troyas (*)
Ana Mancha Oraá
Cristina Bértolo
Elena Almudévar Becero (*)
Eufrasia Díaz de Rada (*)
Hortensia Yagüe Moreno (**)
Belén Lloveras Rubio (***)
Ana Puras Gil (*)
Centro de Investigación Biomédica
Servicio Navarro de Salud
Pamplona, Navarra, España
(*) Anatomía Patológica
Hospital Virgen del Camino
Pamplona, Navarra, España
(**) Ginecología
Hospital Reina Sofía
Tudela, Navarra, España
(***) Instituto Catalán de
Oncología
Barcelona, Cataluña, España
http://conganat.cs.urjc.es
Patología Molecular
Tipaje del virus del papiloma humano (VPH) en
relación con la metilación en cáncer de vulva
El cáncer de vulva está asociado a la presencia de virus del papiloma humano (VPH). La metilación de genes favorece la progresión tumoral. Se analiza
en una muestra de 22 casos la hipermetilación del promotor del gen p16 en
relación con la presencia de VPH y de características anatomopatológicas.
Esta alteración es más frecuente en casos sin VPH y no se relaciona con el
grado histológico.
Palabras clave: cáncer de vulva; virus del papiloma humano; metilación; p16
Vulvar cancer is correlated to HPV presence. The methylation of genes
contributes to the tumor progression. We analyse the associations between
hypermethylation of p16 gene, HPV and pathological variables in 22 patients with vulvar cancer. This alteration is more frequent among patients
without HPV and is not associated with histologic grade.
Keywords: vulvar cancer; human papillomavirus; methylation; p16
Correspondencia:
David Guerrero
Centro de Investigación Biomédica
C/Irunlarrea 3. 31008 Pamplona.
Navarra, España
Telf: +34 848 422 186
Fax: +34 848 422 200
E-mail: dguerres@cfnavarra.es
INTRODUCCIÓN
el tipo de virus, el grado histológico y la hipermetilación
del promotor del gen p16 en cáncer de vulva.
El cáncer de vulva (Vulvar intraepithelial neoplasia,VIN) constituye una lesión intraepitelial del epitelio
escamoso de la vulva y es un tipo de tumor ginecológico
poco frecuente en nuestro entorno, aunque su incidencia está aumentando considerablemente (1). Este tipo de
cáncer se asocia con la presencia del virus del papiloma
humano (VPH), fundamentalmente con el tipo VPH-16
(2).
La hipermetilación de promotores de genes diana es frecuente en cáncer y provoca la inhibición de su expresión
que puede favorecer la progresión tumoral (3). Entre estos genes destaca el gen p16 (INK4A), que codifica para un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina 4
(CDK-4) de la fase G1/S del ciclo celular (4). En el presente trabajo se analiza la asociación entre la presencia y
PACIENTES Y MÉTODOS
Se considera un grupo de estudio de 22 casos con cáncer
de vulva, diagnosticados en Navarra. El 31.8 %, 63.6 %
y 4.5 % de los casos son tumores bien, medianamente y
pobremente diferenciados, respectivamente (Fig. 1). El
tipaje del virus y el análisis de la coexistencia de diferentes tipos se realiza mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los cebadores GP5+/6+
biotinilados y Reverse Line Blot (RLB), descrita previamente por van der Brule y cols. (5). Las sondas empleadas para la hibridación son de alto riesgo-AR (16, 18,
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68) y bajo riesgo-BR (6, 11, 26, 34, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 55,
57, 61, 70, 71/ CP8061, 72, 73, 81/CP83104, 82/MM4,
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82/IS39, 83/MM7, 84/MM8) y el método de revelado es
la quimioluminiscencia (Fig.2).
La técnica para el estudio de metilación del gen p16 es
la PCR específica de metilación (Methylation-specific
PCR, MS-PCR), que consiste en una PCR para síntesis de fragmento de secuencia desmetilada y otra
para secuencia metilada a partir de ADN modificado
mediante bisulfito sódico, que transforma las citosinas desmetiladas a uracilo (6). Las secuencias de los
cebadores empleados fueron, para la reacción desmetilada: 5’TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT3’ (cebador sentido) y 5’CAACCCCAAACCCACAACCATAA3’ (cebador antisentido); para la reacción metilada: 5’TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC3’ (cebador sentido) y 5’GACCCCCGAACCGCGACCCTAA3’
(cebador antisentido). La comprobación de la presencia
o ausencia de banda para la mezcla metilada en gel de
agarosa permite comprobar la hipermetilación del gen
p16 (Fig. 3). Las comparaciones en las distribuciones de
las variables se realizaron mediante el test γ 2 o el test
exacto de Fisher, mediante el programa estadístico SPSS
(versión 16.0, Inc., Chicago, USA), considerando un nivel de confianza del 95 %.
(9). Esta alteración puede deberse a la deleción del gen,
presencia de mutaciones y metilación del promotor del
gen (10).
Se ha descrito la hipermetilación del promotor del gen
p16 en múltiples tumores, como el cáncer de colon (11)
y el cáncer escamoso cervical (12). Su patrón de expresión y su implicación difiere en los distintos tipos de tumores ginecológicos, tal y como se ha descrito recientemente (13).
Se ha descrito que la expresión de la proteína p16 es elevada y de patrón difuso en casos de cáncer de vulva con
virus de VPH (14). En nuestro grupo de estudio el silenciamiento de la expresión originado por la hipermetilación del gen es más frecuente en los casos sin VPH, pero
no obtenemos valor significativo de probabilidad asociada. Estos hallazgos son similares a los descritos recientemente en la neoplasia cervical intraepitelial (CIN) (15).
REFERENCIAS
RESULTADOS
Únicamente se detecta el virus en el 13.5 % de los casos
(4.5 % VPH-16, 4.5 % VPH-18 4.5 % la combinación de
VPH AR-BR 6/59). Un porcentaje del 63.6 % de las pacientes presentan metilación del gen p16. Esta alteración
es más frecuente en casos que no presentan la secuencia
del virus, aunque sin valor significativo de probabilidad
asociada (p= 0.133). Los casos con VPH-16 y VPH-18
presentan el promotor de p16 desmetilado, mientras que
el caso VPH-6/VPH-59 lo presenta metilado. La metilación no se asocia al grado histológico (p= 0.502).
DISCUSIÓN
Se ha descrito la presencia de VPH en un elevado porcentaje de casos de VIN, normalmente de VPH-AR (7).
La presencia del virus parece estar igualmente distribuido en todo tipo de lesión displásica y carcinoma in situ
(8), aunque otros grupos describen su asociación con lesiones más avanzadas (VIN3) (2).
El silenciamiento de la expresión del gen p16 en cáncer
debido a la metilación parece ser un evento precoz en
cáncer que evita la hiperfosforilación de la proteína Rb
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1. Joura EA, Losch A, Haider-Angeler MG, Breitenecker G,
Leodolter S. Trends in vulvar neoplasia. Increasing incidence of vulvar intraepithelial neoplasia and squamous cell
carcinoma of the vulva in young women. J Reprod Med
2000;45(8):613-5.
2. Ngan HY, Cheung AN, Liu SS, Yip PS, Tsao SW. Abnormal
expression or mutation of TP53 and HPV in vulvar cancer.
Eur J Cancer 1999;35(3):481-4.
3. Esteller M. Epigenetics provides a new generation of oncogenes and tumour-suppressor genes. Br J Cancer 2006;
94(2):179-83.
4. Rocco JW, Sidransky D. p16(MTS-1/CDKN2/INK4a) in
cancer progression. Exp Cell Res 2001;264(1):42-55.
5. van den Brule AJ, Pol R, Fransen-Daalmeijer N, Schouls
LM, Meijer CJ, Snijders PJ. GP5+/6+ PCR followed by reverse line blot analysis enables rapid and high-throughput
identification of human papillomavirus genotypes. J Clin
Microbiol;40(3):779-87.
6. Fraga MF, Esteller M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques 2002;33(3):632, 634,
636-49.
7. Ueda Y, Enomoto T, Miyatake T, Shroyer KR, Yoshizaki T,
Kanao H, et al. Analysis of clonality and HPV infection in
benign, hyperplastic, premalignant, and malignant lesions
of the vulvar mucosa. Am J Clin Pathol. 2004;122(2):26674.
8. Junge J, Poulsen H, Horn T, Hording U, Lundvall F. Prognosis of vulvar dysplasia and carcinoma in situ with special
reference to histology and types of human papillomavirus
(HPV). APMIS 1997;105(12):963-71.
9. Nuovo GJ, Plaia TW, Belinsky SA, Baylin SB, Herman JG.
In situ detection of the hypermethylation-induced inactivation of the p16 gene as an early event in oncogenesis.Proc
Natl Acad Sci U S A. 1999; 96(22):12754-9.
VIII Congreso Virtual Hispanoamericano
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http://conganat.cs.urjc.es
Patología Molecular
10. Liggett WH Jr, Sidransky D. Role of the p16 tumor suppressor gene in cancer. J Clin Oncol. 1998;16(3):1197-206.
11. Ishiguro A, Takahata T, Saito M, Yoshiya G, Tamura Y, Sasaki M, et al. Influence of methylated p15 and p16 genes
on clinicopathological features in colorectal cancer. J Gastroenterol Hepatol. 200;21(8):1334-9.
12. Jeong DH, Youm MY, Kim YN, Lee KB, Sung MS,
Yoon HK, et al. Promoter methylation of p16, DAPK,
CDH1, and TIMP-3 genes in cervical cancer: correlation
with clinicopathologic characteristics. Int J Gynecol Cancer.
2006;16(3):1234-40.
13. Riethdorf S, Neffen EF, Cviko A, Loning T, Crum CP, Riethdorf L. p16INK4A expression as biomarker for HPV 16related vulvar neoplasias. Hum Pathol 2004; 35(12):147783.
14. Kang S, Kim J, Kim HB, Shim JW, Nam E, Kim SH, et
al. Methylation of p16INK4a is a non-rare event in cervical
intraepithelial neoplasia. Diagn Mol Pathol 2006;15(2):7482.
15. O’Neill CJ, McCluggage WG. p16 expression in the female genital tract and its value in diagnosis.Adv Anat Pathol.
2006;13(1):8-15.
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ICONOGRAFÍA
Figura 1.- Ejemplos de carcinomas escamosos de vulva bien (Fig. 1.1), y poco diferenciado (Fig. 1.2.) (H&E, Figs.
1.1 y 1.3.:100x; Fig. 1.2.: 200x).
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Figura 2.- Técnica Reverse-line-blot para hibridación de ácidos nucleicos:Miniblotter empleado para la técnica de
Reverse-Line-Blot (izquierda) y resultado de hibridación con sondas de Alto riesgo-AR y Bajo riesgo-BR (derecha)
para las muestras de cáncer de vulva.
Figura 3.- Imagen de gel de agarosa 2,5 % con resultados de técnica de MS-PCR para el gen p16.
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