“NANOSISTEMES PER DIAGNÒSTIC, UNA PORTA CAP AL FUTUR” APLICACIONS EN LA DETECCIÓ DE MARCADORS MOLECULARS Jornada sobre aplicaciones industriales de la nanotecnología Nodus Barberà, Barcelona, 27 de noviembre de 2007 Overview sobre AROMICS Nanodiagnóstico o Diagnóstico in vitro o Diagnóstico por imagen o “Theranostica” Limitaciones Oportunidades para las empresas ¿Quiénes somos? • Empresa biotecnológica biotecnología definida como la aplicación de los conocimientos biológicos en procesos tecnológicos e industriales Biotecnología roja: biotecnología aplicada al sector sanitario. Dedicada a… Pharmacology Molecular Biology Biochemistry Proteomics Genomics Biomarcadores Cell biology Pharmacogenetics In vivo studies Drug Screening Engineering •La aplicación de distintas disciplinas en el proceso de investigación y desarrollo de fármacos •permite, la identificación, biomarcadores selección y validación de Aplicabilidad de los BIOMARCADORES Diagnóstico: integrar estos biomarcadores en el diseño y desarrollo de métodos de diagnóstico que ayuden a: Entender las bases moleculares de la enfermedad Detección precoz y prevención de la enfermedad Predecir respuesta a terapia Monitorear incio y progresión de la enfermedad Promover la medicina personalizada (incluyendo variabilidad interindividual) y prescribir medicación “Objetivo”: diagnóstico más concreto y fiable” la Terapéutica: ofrecer una nueva aproximación a: •Identificación de nuevas dianas terapéuticas •Desarrollar fármacos más eficaces (cómo funcionan y cuándo dejan de funcionar) y seguros (toxicidad, efectos adversos) •Incrementar el éxito clínico (identificación de marcadores de respuesta) “Objetivo”: terapias más efectivas y con menos efectos secundarios ENFERMEDADES: Cáncer, neurodegenerativas, infecciosas y enfermedades asociadas a dolor crónico enfermedades Objetivo Desarrollar una cartera de productos propios, con un clara “orientación a pacientes” desde prevención a diagnóstico con énfasis particular en el tratamiento individualizado y efectivo, promoviendo la medicina traslacional (aplicación de los conocimientos en biología al manejo de la enfermedad y el tratamiento “from bench to bed”) I+D PRODUCTOS Área diagnóstico Área terapéutica BIOTECNOLOGIA / NANOTECNOLOGÍA Aplicaciones de la nanotecnología en diagnóstico Nanodiagnóstico Diagnóstico In Vitro (ex-vivo) Diagnóstico In Vivo Diagnóstico por imagen Teranóstica Aplicaciones de la nanotecnología en diagnóstico 1. Nanotechnology-based Diagnostics a) Diagnóstico in-vitro: o I: Nanopartículas acopladas a biosensores capaces de detectar ciertas moléculas o II: Nanocristales de material semiconductor “Quantum Dots”: Dispositivos capaces de realizar múltiples análisis a escala subcelular o III: Nanodispositivos: dispositivos nanométricos para detectar biomarcadores Un biosensor es un dispositivo analítico que utiliza las interacciones específica entre el analito de interés y el elmento de reconocimiento para proporcionar resultados cualitativos ó cuantitativos. Consecuencia de esta unión se produce la variación de una o varias propiedades físico-químicas (como pueden ser el pH, transferencia de calor, cambio de potencial, de masa, variación de las propiedades ópticas, etc.) que detecta el transductor. I: Nanopartículas acopladas a biosensores Tipo de nanopartículas •Liposomas •Emulsiones •Polimeros •Nanopartículas cerámicas •Partículas metalicas •Gold shell nanoparticles •Nanoparticulas basadas en carbono •Fulerenos •Nanotubos (SWNCT and MWNCT) •Dendrimers •Quantum Dots La forma y el tamaño de estas nanopartículas les confieren características físicas específicas (magnéticas, ópticas, térmicas, …) Estas propiedades son pues moldeables en función del tamaño y la forma La funcionalización de superficies permite reconocer analitos específicos Nanopartículas acopladas a biosensores Magnetic Nanoparticles Nanopartículas magnéticas funcionalizadas con elementos de reconocimiento específicos (anticuerpos, secuencias de ADN,…) para biosensorización magnética En esta aproximación, el “label” clásico (p.ej fluorescente) se reemplaza con una partícula superparamagnetica, que puede ser detectada mediante sensores magneto-resistivos. Ventajas: mayor sensibilidad, habilidad de manipular estas partículas controlando las fuerzas magnéticas (transportarlas hacia una localización específica en un chip), capacidad de utilizarse en immunoseparaciones de biomoléculas Mercado Global para Magnetic nanoparticles: 750 millones $ para 2012 (250 millones en 2008) Inorganic Nanoparticles: Gold Gold nanoparticles presentan características ideales para aplicaciones diagnósticas: o Aumento sensibilidad en varios ordenes de magnitud: luz dispersada de una nanopartícula equivale a luz emitida por 5x105 (500,000) fluorophores. o Tests que usan partículas de oro funcionalizadas con anticuerpos, son 2-3 veces más sensibles que métodos ELISA o Mayor especificidad para detección de acidos nucleicos y proteina. o Poco ruido de fondo, aumento de señal: unión inespecífica a la partícula de oro es mínima o Partículas estables en el tiempo Ejemplo: Verigen®, Nanosphere Inc. : “Detection of DNA or RNA targets using gold nanoparticles” Verigen: Uses of gold nanoparticles in array formats SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes •Genomic DNA is fragmented and hybridized to a microarray containing allele-specific capture probes •After a wash step, a second hybridization step designed to attach oligonucleotide-modified gold nanoparticle probes to the capture targets •It forms a “sandwich” beteween immobilized capture probes and gold nanoparticle probes •A silver development step is used to precipitate silver around the gold nanoparticle (improve scatter light) •Detection Light from LED (630 nm). The evanescent wave (SPR effect) excite the silver-amplified gold nanoparticle. A Photosensor captures the image Nanosphere Inc., Nucleic Acid Res 2005 Lateral Flow : Uses of gold in POC testing Durante los ultimos cinco años, se han utilizado partículas de oro en sensore tipo lateral flow, Aplicación: POC tests para: •Biomedical application •Food manufacturing •Quality control Tests •Veterinary practice •Environment monitoring Tradicionalmente se utilizaba Dyed Latex. Actualmente es substituido por nanopartículas Oro Ventajas: •Tamaño (5-200 nm), permite pasar a través de membrana nitrocelulosa de 8-10 µm •Mayor cantidad de partículas (packing) que ayuda a visualización •Buena calidad: monodispersas, esféricas, estables •Fácil funcionalización con biomoléculas específicas Ejemplos: Phadia AB (Sweden) y Merck KgGA (GE), POC testing para patógenos en sector alimentación y medioambiente Láser SERS signal SERS-tag metal nanoparticle Functionalized with reporter And antibodies Biomarker (Troponin, CKMB,…) Immobilized capture antibody SERS benefits : high specificity, attomole to high zeptomole mass sensitivity ultra low concentrations sensitivity and interfacial generality Future trends: alternatives to spheres: triangles, rods…) Oxonica Inc. Sistemas híbridos La proteína de interés se captura por hibridación simultanea a: •MP funcionalizadas con anticuerpos primarios contra la proteína de interes •Gold nanoparticles, funcionalizadas con anticuerpos secundarios contra la misma proteína El resultado es un complejo, donde la proteína de interés está entre la partícula magnetica y la partícula de oro. Ejemplo: Ultrasensitive protein detection (Nanosphere Inc) Ej:Ultrasensitive protein detection Antibody-coated Gold Ps (10-30nm) Antibodycoated MPs Supernatant Washing Protein Incubation Separation Resuspend Release Sequence-specific DNA detection array VERIGENE® system Tª Bar-code DNA dehybridization Detection (Nanosphere Inc) Nanopartículas: “Nanoshells” •Nanoshells son pequeñas partículas (dielectric core, silicon) recubiertas de metal (generalmente oro). •Las propiedades ópticas de estas partículas dependen del tamaño del core y del grosor de las distintas capas metálicas.(http://www.nanospectra.com/physics/physic s.asp). •Nanoshells funcionalizadas con proteínas específicas permitirían seleccionar distintos tipos de células. •Penetran en los tejidos hasta algunos centímetros de profundidad • Las más utilizadas, nanoshells que absorben en la luz IR cercana (NIR). La absorción de la luz por estas nanoshells calienta las células, hasta matarlas. (L. R. Hirsch, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003,100, 13549-554) Nanocristales de material semiconductor II: Quantum Dots •QDs son nanonocristales semiconductores que fluorecen cuando se les expone a la luz •Las propiedades ópticas, electrónicas, magnéticas o incluso químicas dependen de su tamaño (típicamente <10nm), forma y propiedades intrínsecas. •Unidos a un anticuerpo o una biomolécula de interés, actúan como fuente de luz y permiten detectar un analito concreto •Presentan ventajas claras respecto otros fluoróforos: tunable, photostability, high signal to noise ratio, brightness, narrow emission, sensitive and precise, easilly excitable. •Los quantum dots pueden combinarse según su tamaño para poder detectar varias moléculas simultáneamente II: Quantum Dots Aplicaciones •Life-sciences: Western Blot, Citometría de flujo, Uptake celular, FRET, Microarrays de ADN/ARN, Immunoensayos, etc. •Medical Imaging and Disease detection •QD LEDS: unexpensive, industrial white light (intermixing red, green and blue dots). Improvement over traditional phosphorLED •Solar cells and photovoltaics (aumenta eficiencia en la producción electricidad (60% versus 33%) con menor superficie) •Trazabilidad: caracteristicas de absorcion/emision El mercado global para QDs en 2005 fue de 13 millones $. Se espera alcanzar hasta 37.2 millones $ para 2009. Examples of companies commercialising nanomaterials for biomedical applications COMPANY MAJOR AREA OF ACTIVITY TECHNOLOGY Membrane Filtration Nanoporous ceramic materials for endotoxin filtration, DNA and protein separation MRI Nanomagnetic/carbon composites materials to shield medical devices from RF fields Luminiscent biomarkers Semiconductor QDs with amine or carboxyl groups on the surface Immunicon Separation of cell types Magnetic particles sourrounded by a polymeric layer coated with antibodies for capturing cells Nanoplex technologies Inc Nanobarcodes for bioanalysis Nanoprobes Inc Gold nanoparticles for biological markers Gold nanoparticles bioconjugates for TEM and fluorescent microscopy Nanosphere Inc Gold biomarkers DNA barcode attached to each nanoprobe for identification purposes QuantumDot Corporation Luminiscent Biomarkers Bioconjugated semiconductor quantum dots Argonide Biophan Technologies, INC Evident Technologies Nanodispositivos Los dispositivos de escala nanométrica se basan en muchas de las técnicas estándar empleadas para los circuitos electrónicos integrados Nanoestructuras (litografia) Los sistemas más sofisticados son los llamados lab-on-a-chip que integran: Microfluidica + superficie sensora + transductor de señal Revestimiento con biomoléculas III. Nanodispositivos : “nanocantilevers” Son pequeñas estructuras de distintas formas (cuadradas, rectangulares, triangulares, …) formadas generalmente por silicio. •Cuando el analito a detectar se une a la superficie del nanocantilever, se producen cambios en la tensión superficial y el nanocantilever se dobla (estructuras resonantes). •Monitoreando estos cambios, podemos cuantificar el número de moléculas/analito presentes en la muestra •Como tienen una medida tan pequeña, tienen una gran resolución en un rango muy pequeño: permiten detectar cantidades muy pequeñas del analito III. Nanodispositivos: “Nanoporos” •Los nanoporos poseen un diamétro entre 10 y 20 nm y unos cientos nanometros de longitud. •Fabricados a base de Silicio, estos nanoporos permiten el paso de una sola hebra de ADN. •Al pasar el ADN a través del poro, se puede monitorear la forma y las propiedades electricas de cada base nucleotídica de la hebra, pudiéndose detectar con rapidez y eficacia las secuencias de ADN 1. Nanotechnology-based Diagnostics a) Diagnóstico in-vitro. Aumentar la eficiencia y precisión del diagnóstico a partir de muestras de fluidos corporales o de tejidos mediante: -Nanodispositivos capaces de detectar ciertas moléculas -Múltiples análisis a escala subcelular b) Diagnóstico in-vivo. Dispositivos que penetren en el cuerpo humano para identificar una enfermedad. Impulsar el diagnóstico molecular -Identificar y cuantificar moléculas, células cancerígenas, etc. -Técnicas in-vivo no invasivas de elevada sensibilidad y fiabilidad. Mejora diagnóstico por imagen. - Validación para uso clínico. La nanotecnología ha impulsado un nuevo avance para las técnicas de diagnóstico por imagen: -desarrollando nuevas técnicas -mejorando las esistentes aumentando la resolución y sensibilidad. De hecho las nanopartículas estan siendo utilizadas como trazadores y agentes de contraste Algunas partículas utilizadas: •Quantum dots •Nanopartículas magnéticas •Estructuras derivadas de carbono: Nanotubos, Dendrímeros Actualmente la mayoría están en estudio. Entre las enfermedades target se encuentra el cáncer y enfermedades cardiovasculares Principales técnicas de imagen • Técnicas ópticas, espectroscopía y fluorescencia: Algunos ejemplos de estas técnicas son: •la microscopía confocal •microscopias de fluorescencia QDs applications •FRET (fluorescence resonance energy transfer) •TIRF (total internal reflection) •NIRF (near infrared fluorescence). Aplicaciones: Investigación biomédica (expresión de genes relevantes en ciertas patologías) In vivo Imaging : QDs Target: tumores de próstata (marcador: PSMA) In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots Gao X, et al. Nature Biotechnology 2004, 22 (8):969-976 C D Imagen del QD-PMSA conjugados animales que presentan el tumor Alta especificidad (C=control, D= disease) Mayor sensibilidad comparado con fluoróforos comunes en Ensayos multiplex In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots Gao X, et al. Nature Biotechnology 2004, 22 (8):969-976 • Técnicas de imagen nuclear: Las técnicas de imagen nuclear son métodos no invasivos Detectan y analizan la distribución de un radioisótopo en el cuerpo humano. La Tomografía por Emisión Positrones PET, es capaz de medir actividad metabólica en distintos tejidos del cuerpo humano. Aplicación en oncología, cardiología y neurología. Ejemplo: SWNT-RGD In vivo imaging: SWNT-targeted molecules •Single walled carbon nanotubes exhiben una propiedades físicas estructurales, mecánicas, eléctricas y ópticas •Los SWNT pueden solubilizarse añadiendo grupos PEG SWNT-PEG (AFM picture) SWNT-PEG (Estable en suero, PBS) SWNT atraviesan la membrana celular via endocitosis Aplicación: •Diagnóstico imagen •Delivery de proteinas, plasmidos, RNAi SWNT solubles funcionalizados con PEG, marcados con Cu, y funcionalizados con péptido RGD Dimensiones: Diámetro 1-5 nm Longitud: 100nm Targeting: RGD se une a αvβ3 integrin (receptores de membrana) 0,5 h 6h 24 h MicroPet Images. Las flechas marcan el tumor (glioblastoma). La radiación persiste por encima de las 24h. Future trends: “Theranostics” Utilizar la propiedad de SWNT de absorber en NIR Irradiando tumor con luz láser, se produce un “calentamiento local” capaz de matar célula tumoral Dr. Cheng , et al. Nature 2006 In vivo imaging: paramagnetic particles • Resonancia magnética (MRI): •Las imágenes por MRI se obtiene mediante la exposición del organismo a un campo magnético generado por un electroimán •Cada tejido produce una señal diferente •Permite obtener información en tres dimensiones de la estructura del organismo Ej: Endothelial αvβ3 integrin-targeted fumagillin nanoparticles inhibit angiogenesis in atheroesclerosis Winter PM et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2006: 2013-2019 Contrast agents: Dendrimers Agentes de contraste actuales (MRI, tomografías (CT), X-ray imaging) Problemas : •Tiempo circulación torrente sanguíneo corto (t1/2 excreción = 60 min) •Difunde rápidamente (tras 5 min 80% agentes de contraste difundido) •Rápida detección •Necesitas altas concentraciones para determinadas imágenes •A veces generan reacciones adversas PAMAMs como agentes de contraste (muy prometedores) Ventajas •Se pueden funcionalizar fácilmente •Se pueden utilizar par complejar diferentes iones metálicos (gold, platinum, magnetic) •“Stealh-like” propiedades •Biocompatibles, biodegradables •Preparación escalable, bajo coste Aplicaciones de la nanotecnología en diagnóstico 1. Nanotechnology-based Diagnostics a) Diagnóstico in-vitro. Aumentar la eficiencia y precisión del diagnóstico a partir de muestras de fluidos corporales o de tejidos mediante: -Nanodispositivos capaces de detectar ciertas moléculas -Múltiples análisis a escala subcelular b) Diagnóstico in-vivo. Dispositivos que penetren en el cuerpo humano para identificar una enfermedad -Identificar y cuantificar moléculas, células cancerígenas, etc. -Técnicas in-vivo no invasivas de elevada sensibilidad y fiabilidad. Mejora diagnóstico por imagen - Validación para uso clínico. 2. Theranostics: “Therapy + Diagnostics” Theranostics = “Terapia + diagnóstico” El objetivo es crear un nanodispositivo que sea capaz de detectar una célula/tejido específico, mejorar la imagen (y por tanto el diagnóstico in vivo) de las células específicas, y finalmente penetrar sólo en estas células y liberar un fármaco (mejorando la eficacia del tratamiento) Dendrimeros sirven como “plataformas nanoescala” para crear dispositivos multifuncionales capaces de detectar células cancerosas y liberar fármacos •Folate receptor that bounds cancer cell •Fluorescein label (indica la unión del dendrímero a la celula) •MTX or PTX drugs (deliver eficaz, menor dosis •Algunos de estos constructos basados en dendrimeros están actualmente en fases clínicas para tratar una variedad de cánceres Multi-functional particles Silica-coated micelles containing LHRH as a targeting agent Deliver iron oxide particles to LH-RH receptor positive cancer cells •They can be imaged using MRI (enhanced sensitivity) •Applying rapidly oscillating magnetic field causes the entrapped Fe2O3 molecules to become hot, killing the cells En resumen… o Mercado emergente o Comercialización de productos están en estadio inicial o Gran numero de iniciativas y movilización de fondos para nuevos desarrollos o Elevadas Inversiones públicas: •Europa (31,5%) •USA (37,2%) •Japón (37,2%) Oportunidad: Representan una mejora en el diagnóstico y en la terapia Problemas a resolver: •Altos costes de produccion •Dificultad escalado •Toxicidad (AROMICS está desarrollando métodos toxicológicos) •Inexistencia regulación específica •Largo proceso de aprobación por agencias reguladores Thank you www.aromics.es info@aromics.es carme.plasencia@aromics.es