Cordobamateriales [Modo de compatibilidad]

Making quality control easy
Materiales de referencia microbiológicos
26 de octubre 2011
Preguntas más frecuentes
1. ¿Qué es un material de referencia?
2. ¿Qué es un material de referencia certificado?
3. ¿Qué características principales tienen los materiales de referencia microbiológicos
desarrollados por Labaqua?
4. ¿Qué son los productos BACuali, BACuanti, BAControl, BACuanti PCR y BACuanti
DNA desarrollados por Labaqua?
5. ¿Qué diferencia existe entre los diferentes materiales presentados por Labaqua?
6. ¿Qué proporciona el uso de los materiales de referencia y materiales de referencia
certificados?
7. ¿Qué vantajas presentan estos materiales frente a las cepas habituales procedentes
de Colecciones de Cultivo?
Preguntas más frecuentes
8. ¿ Son los productos BACuali, BACuanti, BACuanti PCR, BAControl y BACuanti
trazables con cepas de Colecciones de Cultivo?
9. ¿En que actividades del laboratorio puedo emplear estos materiales?
10. ¿Es obligatoria la realización de todas estas actividades?
11. ¿Qué es validar un método de ensayo?
12. ¿Cuales son los controles de calidad que debe efectuar un laboratorio?
13. ¿Cuales son los controles de calidad internos que debe realizar un laboratorio?
14. ¿Qué son los controles externos de calidad?
15. ¿Con que periodicidad debe un laboratorio realizar las actividades internas de
control de calidad?
Materiales de Referencia
Material de Referencia (ISO 17025)
Material o substancia una o más de cuyas propiedades tienen valores
suficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder ser
utilizados en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de
medida, o la asignación de valores materiales.
Material de Referencia Certificado (ISO 17025)
Material de referencia, acompañado de un certificado, en el cual uno o más
valores de sus propiedades han sido certificados mediante un procedimiento
que establece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la que
se expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se
acompaña de una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente.
Materiales de Referencia
Cepa de Referencia (ISO 11133)
Microorganismo definido por lo menos al nivel de género y especie,
catalogado y descrito según sus características y preferiblemente de origen
conocido.
Cepa de Reserva (ISO 11133)
Cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de
referencia, o lo que es lo mismo, una serie de alícuotas de cultivos idénticos
elaboradas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia.
Cepa de Trabajo (ISO 11133)
Subcultivos primarios obtenidos de una cepa de reserva, a fín de ser
empleados en los ensayos pertinentes.
G-ENAC-04:
Utilización de cepas de referencia
Un material de referencia debe ser:
• Representativo
• Valor de la propiedad (Identidad)
• Homogéneo
• Estable
Material liofilizado clásico
1. Ampolla conteniendo material liofilizado
2. Rotura de la ampolla con diamante
3. Rehidratación en medio líquido apropiado
4. Extensión en medio sólido
apropiado
5. Crecimiento y preparación de
cepas de reserva
TIEMPO: 24-48 h
Material liofilizado clásico
1. Preparación suspensión bacteriana
2. Preparación de diluciones seriadas
3. Incubación y recuento del título
TIEMPO: 24-48 h
Inconvenientes de los materiales de referencia
microbiológicos
NECESIDAD DE NUEVOS MATERIALES DE REFERENCIA
- Estabilidad (microorganismos)
- Homogeneidad (bajas concentraciones)
Nuevos Materiales de Referencia
BACuanti
BAControl
BACuali
Objetivo
Desarrollo de un material de referencia
microbiológico
GUÍA-ISO 34 “General requirements for the competence of
reference materials producers ”
-Fácil de preparar
-Homogéneo
-Estable
-Fácil de usar
Guia ISO 35 e ISO 13528
-Aplicable a diferentes microorganismos
Material de Referencia:
Preparación I
Hidratación de la cepa de una Colección de Cultivos Tipo
Comprobación de la identidad de la cepa mediante secuenciación
del gen rDNA 16S
Realización de la titulación del microorganismo
Material de Referencia:
Preparación II
Realización de los cálculos a partir del título obtenido
Pastillas de rango bajo (<2 log)
Pastillas de rango alto (>2 log)
Preparación y dispensación de una mezcla homogénea :
“Caldo de mantenimiento” + suspensión bacteriana
Material de Referencia:
Preparación III
Proceso de estabilización (liofilización)
Resultado: PASTILLA
Desemblistado y conservación a -18ºC
Material de Referencia:
Controles de calidad I
1. Reconstitución del Material de Referencia
De cada cepa empleada
2. Controles de esterilidad
De cada mezcla preparada
De cada lote fabricado
Material de Referencia: Controles de
calidad II
3. Homogeneidad
10 pastillas, 2 réplicas de cada pastilla
ISO 13528: Statistical methods for use in proficiency testing
by interlaboratory comparisons
T: Test estadístico de Cochran
T2/(I-1) ≤ 2
(Heisterkamp et. al.,1993)
ANOVA
p-valor>0.05
ss ≤ 0.3 σ
(σ: desviación estándar diana)
Material de Referencia: Controles de
calidad II
ESTUDIO DE MATERIAL DE REFERENCIA
Homogeneidad
Ejemplo 1:
Test T
Lote PCP11088
C. perfringens
HOMOGENEIDAD PASTILLAS (11/02/08) Lote PCP11028
Microorganismo: Clostridium perfringens (UFC/1 mL)
Dilución: 1/10
Cápsula
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Réplica 1 Réplica 2
42
36
30
48
40
46
39
44
37
34
44
37
41
43
37
37
41
39
38
36
Media
Nº cápsulas
39,5
10
T-1:
T-1/I(J-1):
6,22
0,57
T-2:
T-2/(I-1):
2,67
0,30
Media geométrica
St. dev. (log)
39,2
0,027
RESULTADO:
T-1
T-2
Limites
T-1 (97.5%)
3,25
T-2 (5%)
16,92
HOMOGENEO
HOMOGENEO
T-1(2.5%)
20,48
Material de Referencia: Controles de
calidad II
Ejemplo 1: ANOVA, Homogeneidad Lote PCP11028 C. perfringens
Análisis de varianza de un factor
RESUMEN
Grupos
Fila 1
Fila 2
Fila 3
Fila 4
Fila 5
Fila 6
Fila 7
Fila 8
Fila 9
Fila 10
Cuenta
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las
Suma de
variaciones
cuadrados
Entre grupos
0,013184202
Dentro de los grupos
0,030518894
Total
Suma
3,179551791
3,158362492
3,264817823
3,234517284
3,099680641
3,211654401
3,246252312
3,136403448
3,203848464
3,136086097
Grados de
libertad
Varianza
0,00224094
0,02083248
0,00184211
0,00137225
0,00067428
0,00283135
0,00021393
0
0,00023586
0,00027568
Promedio de los
Valor crítico
F
Probabilidad
cuadrados
para F
9
0,001464911 0,48000145 0,857775864 3,020382947
10
0,003051889
0,043703096
19
Ss=
0,028168937
Ss/sigma=
Promedio
1,589775896
1,579181246
1,632408912
1,617258642
1,549840321
1,6058272
1,623126156
1,568201724
1,601924232
1,568043049
0,06 < 0.3
Material de Referencia: Controles de
calidad II
ESTUDIO DE MATERIAL DE REFERENCIA
Homogeneidad
Ejemplo 2:
Test T
Lote PEC08027
E. coli
ESTUDIO HOMOGENEIDAD PASTILLAS (08/02/07) Lote PEC08027
Microorganismo: Escherichia coli (UFC/1 mL)
Dilución:
Cápsula
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Réplica 1 Réplica 2
10
13
9
13
15
13
17
15
12
14
17
13
6
10
9
15
8
8
17
7
Media
Nº cápsulas
12,1
10
T-1:
T-1/I(J-1):
8,74
0,79
T-2:
T-2/(I-1):
10,49
1,17
Media geométrica
St. dev. (log)
11,5
0,104
RESULTADO:
T-1
T-2
Limites
T-1 (97.5%)
3,25
T-2 (5%)
16,92
HOMOGENEO
HOMOGENEO
T-1(2.5%)
20,48
Material de Referencia: Controles de
calidad II
Ejemplo 2: ANOVA, Homogeneidad Lote PEC08027 E. coli
Análisis de varianza de un factor
RESUMEN
Grupos
Fila 1
Fila 2
Fila 3
Fila 4
Fila 5
Fila 6
Fila 7
Fila 8
Fila 9
Fila 10
Cuenta
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Suma
2,11394335
2,06818586
2,29003461
2,40654018
2,22530928
2,34439227
1,77815125
2,13033377
1,80617997
2,07554696
Promedio
1,05697168
1,03409293
1,14501731
1,20327009
1,11265464
1,17219614
0,88907563
1,06516688
0,90308999
1,03777348
Varianza
0,00649154
0,01275218
0,00193118
0,00147738
0,00224094
0,00678677
0,02460843
0,02460843
0
0,07424765
ANÁLISIS DE VARIANZA
Entre grupos
Dentro de los grupos
0,19622884
0,15514451
Promedio de
Valor crítico
los
F
Probabilidad
para F
cuadrados
9
0,0218032 1,40534808
0,300849328 3,02038295
10 0,01551445
Total
0,35137335
19
Ss=
0,05607474
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Ss/sigma=
Grados de
libertad
0,21 < 0.3
Material de Referencia: Controles de
calidad II
Homogeneidad
Estudios de Homogeneidad (04/08/02) Lote PLPQ28036
Microorganismo: Legionella pneumophila (ct/7.1 uL)
Ejemplo 3:
Test T
Lote PLPQ28036
L. pneumophila Q-PCR
Pastilla
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Replica 1 Replica 2
39,07
37,84
36,1
37,23
36,67
36,58
35,74
37,71
39,92
36,51
36,06
38
36,48
38,02
37,42
37,76
36,73
38,84
36,28
35,94
Media
Nº Pastillas
T-1:
T-1/I(J-1):
37,2
10
0,39
0,04
T-2:
T-2/(I-1):
0,28
0,03
Media geométrica
St. dev. (log)
37,2
0,009
Resultados:
T-1
T-2
Limites
T-1 (97.5%)
3,25
T-2 (5%)
16,92
HOMOGENEO
HOMOGENEO
T-1(2.5%)
20,48
Material de Referencia: Controles de
calidad III
4. Estabilidad
Dos pastillas por triplicado durante X días
Estudios previos:
Temperatura de conservación: ambiente, 4ºC y –18ºC.
Estabilidad medio plazo: Período de tiempo de 15-20 días
Estabilidad largo plazo: 9 meses
Estudiado tanto por cultivo como por Q-PCR (L. pneumophila)
Estudios estadísticos (ISO 13528):
/X-Y/ < 0.4 σ (X:media homogeneidad; Y:media cada día
estudiado; σ:desviación estándar diana)
L.pneumophila: Análisis de varianza (p-valor>0.05)
Gráficas de evolución temporal
Material de Referencia: Controles de
calidad III
4. Estabilidad
Temperatura de conservación
Escherichia coli
ESTABILIDAD LOTE PEC160
4.5
4
3.5
Conservar a –18ºC
3
2.5
E.coli Tª
amb.
E.coli Nevera
2
E. coli
Congelador
1.5
1
0.5
0
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
84
91
98
DIAS
105 112 119 126 133 140 147 154 161 168 175
Material de Referencia: Controles de
calidad III
4. Estabilidad
Estabilidad a corto plazo
ESTABILIDAD LOTE PCF25115
6,0
5,5
5,0
Citrobact
er f.
4,5
4,0
3,5
Citrobacter freundii
Lineal
(Citrobac
ter f.)
3,0
2,5
2,0
0
5
10
DIAS
15
y = 0,0045x + 5,1686
ESTABILIDAD DIANA PCF25115
0,1600
0,1400
0,1200
0,1000
/X-Y/
0,4xSs
0,0800
0,0600
0,0400
0,0200
0,0000
0
4
7
11
15
Material de Referencia: Controles de
calidad III
4. Estabilidad
Estabilidad a largo plazo
Enterococcus faecium
ESTABILIDAD LOTE 160 PEF28084
4,0
3,5
3,0
2,5
E.faecium
Caducidad 6 meses
2,0
Lineal
(E.faecium)
1,5
1,0
0,5
0,0
0
7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133 140 147 154 161 168 175
DIAS
y = -0,0002x + 2,9436
Material de Referencia: Controles de
calidad III
4. Estabilidad
Estabilidad a largo plazo
Legionella pneumophila Lote
PLP18065
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
1,7
1,6
1,5
1,4
0
7
14 21 28 38 42 49 57 63 70 77 84
DIAS
p-valor=0,5898
DIAS
RESULTADOS
1,8
Box-and-Whisker Plot
0
7
14
21
28
38
42
49
57
63
70
77
84
1,3
1,4
1,5
1,6
RESULTADOS
1,7
1,8
Estudios de certificación I
Condiciones:
- 7 laboratorios acreditados por ENAC
- 2 pastillas por triplicado
- mismas condiciones de ensayo
Microorganismo
Medio cultivo
Tiempo/ Temperatura incubación
Escherichia coli
Citrobacter freundii
Enterococcus faecium
Clostridium perfringens
Legionella pneumophila
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Tergitol-7 agar
Tergitol-7 agar
Slanetz-Bartley agar
TSC agar
BCYE-α
Chapman manitol
Agar Cetrimida
24 h a 37ºC
24 h a 37ºC
48 h a 37ºC
24 h a 44ºC (Anaerobiosis)
4 días a 37ºC
48 h a 37ºC
48 h a 37ºC
Estudios de certificación II
BOLETÍN DE RESULTADOS (*)
Resultados:
LABORATORIO:
- fecha envío resultados
LOTE:
MICROORGANISMO:
RESULTADOS MEDIO ESPECÍFICO
- boletín de resultados
RÉPLICA
PASTILLA
- tratamiento estadístico (Guía ISO 35:
Certification of reference materials. General and
statistical principles)
¿Diferencias entre pastillas?
¿Diferencias entre réplicas?
UNIDADES
R1
R2
R3
1
2
RESULTADOS MEDIO GENERAL (en su caso)
RÉPLICA
PASTILLA
UNIDADES
R1
R2
R3
1
2
NOTA: En caso de que los resultados correspondan a una dilución, indicar a cual
corresponde.
OBSERVACIONES:
¿Diferencias entre laboratorios?
(*)Realizar tantas copias de este boletín como lotes se hayan analizado
Estudios de certificación III
Enterococcus faecium
¡¡¡Calcular la estadística robusta para obtener H15 mean y H15 Std Dev!!!
PEF01028 (19/02/2008)
Lab 1
Lab 2
Lab 3
Lab 4
Lab 5
Lab 6
Lab 7
R1
1400
1980
1220
2200
2000
1600
1620
Slanetz Bartley (ufc/pastilla)
Pastilla 1
Pastilla 2
R2
R3
R1
R2
R3
1600
2800
2000 3000 2600
1800
1740
1760 1940 1800
1740
1580
2140 1560 1800
2000
1600
2600 1400 1400
1800
1600
2000 1600 2000
1200
2000
2800 2600 2000
1880
1760
2080 2200 1960
TOTAL
X
S
3,3318 0,1364
3,2635 0,0231
3,2174 0,0811
3,2591 0,1109
3,2611 0,0476
3,2912 0,1359
3,2803 0,0483
AMC Robust Statistics V1.0
ROBUST STATISTICS SUMMARY
Estimate
Estimate value
Parameters
Median
3,263512308
A15 mean
3,268905864 c=1.5: Convcrit=0.001
H15 mean
3,271059179 c=1.5: Convcrit=0.001
MAD
0,016808962
MADe
0,024920982
sMAD
0,024920982
H15 Std Dev
0,029790253 c=1.5: Convcrit=0.001
¡¡¡Asignar valor de n (Nº de laboratorios)!!!
media robusta
desviación estandard
3,271
0,030
¡¡¡Asignar valor de t en la tabla, para (n-1)!!!
Incertidumbre=s/raiz n
%
0,011
0,344
VALORES CERTIFICADO
Valor medio/pastilla 1,87E+03
0,34
Incertidumbre (%)
1,75E+03
Intervalo confianza
1,99E+03
Intervalo confianza(I)=t*s/raiz n 0,02755238
3,244
Intervalo (media-I; media+I)
3,299
Certificados de análisis: Cuantitativos
BACuanti
Guía Caducidad
ISO 31: Contenido
6 mesesde
Descripción
Certificados de Materiales de
Código: L060046
Referencia
Microorganismo: Citrobacter freundii V318
precedente de NCTC 6272, con menos de dos
Valor
medio
porliofilizada
pastilla,
en las
pases desde
la cepa
empleada
condiciones
Lote: PCF05028de análisis indicadas
Fecha de preparación: 05/02/08
Fecha de caducidad: 05/08/08
Resultados
Conservar
–18ºC 10%
Porcentaje
del loteaanalizado:
Valor medio por pastilla: 2.06x103 ufc
Incertidumbre: + 1.82%
Intervalo de confianza 95%:
1.46x103 – 2.89x103 ufc
Certificados de análisis: Cuantitativos
BAControl
Guía Caducidad
ISO 31: Contenido
6 mesesde
Certificados de Materiales de
Descripción
Referencia
Código: L060046
Microorganismo: Citrobacter freundii V318
Valor
por pastilla, en las condiciones
precedente de NCTC 6272, con menos de dos
de
ensayo
pases
desde ladel
cepafabricante
liofilizada empleada
Lote: PCF07028
Fecha de preparación: 07/02/08
Fecha de caducidad: 07/11/08
Resultados
Conservar a –18ºC
Valor por pastilla
obtenido por el fabricante: 8.87x103 ufc
Certificados de análisis: Cualitativos
BACuali
Descripción
9 meses
Código: Caducidad
L060031
Microorganismo: Citrobacter freundii V318
precedente de NCTC 6272, con menos de dos
pases desde la cepa liofilizada empleada
Lote: PCF25117 de la identidad de
Certificación
preparación: 25/11/07
laFecha
cepadesuministrada
Fecha de caducidad: 25/08/08
Control
de calidad
Conservar
a –18ºC
Contaminación: Correcto
Homogeneidad: Homogéneo
Estabilidad: Estable
Certificados de análisis:
Cuantitativos para PCR
BACuanti- PCR
Descripción
Caducidad 12 meses
Código: L060047
Microorganismo: Legionella pneumophila
L2949 precedente de ATCC 33152, con menos
de dos pases desde la cepa liofilizada empleada
Lote: PLPQ21018
Valor
medio por pastilla, en las
Fecha de preparación: 21/01/08
condiciones
de análisis indicadas
Fecha de caducidad: 21/01/09
Resultados
Porcentaje del lote analizado: 10%
8 células
Conservar
a temperatura
ambiente
Valor medio
por pastilla: 3.15x10
Incertidumbre: + 0.98%
Intervalo de confianza 95%:
1.84x108 – 5.37x108 células
Certificados de análisis:
Cuantitativos para PCR
BACuanti- DNA
Descripción
Código: L060024
Caducidad
6 meses
Microorganismo:
Legionella
pneumophila
L2949 precedente de ATCC 33152, con menos
de dos pases desde la cepa liofilizada empleada
Lote: LN31018
Fecha de preparación: 17/01/08
Valor
medio por vial, en las
Fecha de caducidad: 17/07/08
condiciones de análisis indicadas
Resultados
Porcentaje del lote analizado: 10%
Conservar
temperatura
Valor medio a
por
pastilla: 12 µg ambiente
(2.8x109 unidades
genómicas)
Incertidumbre: + 2.6%
Intervalo de confianza 95%: 11.32 - 12.70 µg/vial
Material de Referencia:
Guía rápida de utilización (BACuanti/BACuali)
Recepción del material
Extraer el dispositivo
Conservar a -18ºC
Romper precinto seguridad
Rasgar la bolsa de aluminio
Girar siguiendo flecha
Incubar 10 min. Suspensión bacteriana Tratar como una muestra
Extraer el dispositivo
Liberar la pastilla en 20 mL
Comparar con el valor certificado
Material de Referencia:
Guía rápida de utilización (BAControl)
Recepción del material
Conservar a -18ºC
Romper precinto seguridad
Incubar 10 min.
Tratar como una muestra
Extraer el vial
Adicionar 20 mL
Materiales de referencia disponibles
BACuanti
• Escherichia coli
BAControl
• Citrobacter freundii
• Entrococcus faecium
• Clostridium perfringens
• Pseudomonas aeruginosa
• Staphylococcus aureus
• Legionella pneumophila
Material cuantitativo
Material cuantitativo
Cada pastilla contiene un número
determinado de células viables y cultivables
Cada pastilla contiene un número determinado de
células viables y cultivables
Útil para la validación de métodos y
controles de calidad cuantitativos
Útil para el control de calidad rutinario (controles
de proceso, gráficos de control, control de calidad de
medios de cultivo, etc.)
Disponibilidad de rango bajo (<2log) y
rango alto (>2log)
Disponibilidad de rango bajo (<2log) y rango alto
(>2log)
Materiales de referencia disponibles
BACuali
• Escherichia coli
• Citrobacter freundii
• Entrococcus faecium
• Clostridium perfringens
• Pseudomonas aeruginosa
• Staphylococcus aureus
• Legionella pneumophila
• Salmonella enterica subsp. enterica
Material cualitativo
Se certifica la identidad de la cepa suministrada
Útil para la validación de métodos y controles de
calidad cualitativos
Materiales de referencia disponibles
BACuanti- PCR
Legionella pneumophila
Material cuantitativo
Cada pastilla contiene un número
determinado de células inactivadas
Útil para la validación de métodos
moleculares y control de calidad del proceso
analítico completo
BACuanti- DNA
DNA liofilizado de Legionella pneumophila
Material cuantitativo
Cada vial contiene un número
determinado de unidades genómicas
Útil para la validación de métodos
moleculares y control de calidad de la fase
de amplificación por PCR
Materiales de Referencia: Ventajas
SENCILLEZ: la preparación del material es extremadamente simple, gracias al
formato en pastilla que se suministra en un vial o en un dispositivo plástico
estéril de muy fácil uso, que evita manipulaciones engorrosas
RAPIDEZ: el tiempo de reconstitución se reduce a 10 minutos
SEGURIDAD: al reducirse las manipulaciones al mínimo, se reduce el riesgo de
contaminación
TRAZABILIDAD: las cepas empleadas son trazables a diferentes Colecciones de
Cultivos tipo
CALIDAD: el material va acompañado de una Guía Rápida de Uso y el
correspondiente Certificado de Análisis
FLEXIBILIDAD: el material está disponible en dos rangos de concentraciones,
baja (<2 log.) y alta (>2 log.)
SERVICIO: además de las especies disponibles en stock, se ofrece la posibilidad
de preparar material de referencia a una concentración predefinida por el cliente
Material liofilizado clásico
1. Ampolla conteniendo material liofilizado
2. Rotura de la ampolla con diamante
3. Rehidratación en medio líquido apropiado
4. Extensión en medio sólido apropiado
5. Crecimiento y preparación de cepas de reserva
TIEMPO: 24-48 h
1. Preparación suspensión bacteriana
2. Preparación de diluciones seriadas
3. Incubación y recuento del título
TIEMPO: 24-48 h
Material de referencia:
BACuanti – BACuali - BAControl
1. Sacar del congelador
2. Abrir el sobre de aluminio/Extraer el vial de la caja
3. Abrir el dispositivo de dispensación/Desprecintar el vial
4. Servir una pastilla/Adicionar el agua
5. Incubar a Tª ambiente 10 min.
6. Material preparado
TIEMPO: 15 min
TIEMPO: 48-96 h
TIEMPO: 15 min
Uso de los materiales de
referencia junto con los kits de
qPCR
www.ielab.es
Kits de diagnóstico molecular
KITS PARA CADA UNA DE LAS FASES DEL PROCESO
CONCENTRACIÓN DE
MUESTRAS DE AGUA
-Kit aguas limpias
EXTRACCIÓN &
PURIFICACION DE DNA -Kit aguas sucias
ANALISIS POR PCR
- Confirmación bacteriológica por PCR
- Detección cualitativa de Legionella
- Detección cuantitativa de Legionella
Kits de diagnóstico molecular
KITS PARA CADA FASE DEL PROCESO
1. KIT DE
CONCENTRACIÓN DE
MUESTRAS DE AGUA
- Membranas de filtración
- Tubos de recogida
- Tubos de concentración
2. KIT EXTRACCIÓN &
PURIFICACIÓN DE DNA
AGUA LIMPIA
AGUA SUCIA
Kits de diagnóstico molecular
KITS PARA CADA FASE DEL PROCESO
3. ANALISIS POR PCR
3.3. Kit de detección cuantitativa de
Legionella spp. y
L. pneumophila
3.1. Confirmación
bacteriológica por PCR
(confirmación simultánea de
hasta 10 especies)
3.2. Kit de detección cualitativa de
Legionella spp. y
L. pneumophila
CONTROLES POSITIVO & NEGATIVO
CONTROL INTERNO POSITIVO
Kits de diagnóstico molecular
KITS DE DETECCIÓN CUALITATIVA DE
Legionella spp. y L. pneumophila
Description
Analysis
conditions
Code:
I060002
Method: amplification by PCR and electroforesis
Specificity:
Legionella pneumophila
in agarose
gel analysis
Batch: CLN11068
Thermocycler:
GeneAmp PCR System9700,
Manufacturing
Applied Biosystemsdate: 11/June/2008
Expiry
date:program:
11/Dec/2008
Quality
controls
Amplification
Denaturation at 95ºC 4
Number
of
tests:
70
Positive
control
right
min, 35 cycles
of amplification:
95ºC 30 s., 58ºC
30 s., 72ºC 1
Negative
control
amplification:
min. and final
extesion
at 72ºC 10right
min.
Internal positive control amplification: right
Kits de diagnóstico molecular
KITS DE DETECCIÓN CUANTITATIVA DE
Legionella spp. y L. pneumophila
Used
fungible material
Analysis
conditions
Description
TaqMan
Environmental
Mix, Internal
Method:
amplification
by “realMaster
time” PCR
Code:
ED000864
positive control
(plamidic
DNA),
Thermocycler:
7500
Real-Time
PCRprimers,
System,probe
Specificity:
Legionella
spp.
and
Legionella
Quality
controls spp. ATCC 33152 DNA as
Applied
Biosystems
Batch:
QLS030909
positive
control
Positive
control
amplification:
right
Amplification
program:
50ºC
2 min,
95ºC 10
Manufacturing
date:
08/June/2009
Negative
control
right
min.
and 42date:
cycles
ofamplification:
95ºC 15 s. and
60ºC 1 min.
Expiry
08/March/2010
Internal positive control amplification: right
Number of tests: 70
Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila
Control de proceso en qPCR
RM
Dispensar la pastilla en
un tubo con 4 mL de
agua estéril
Analisis por qPCR
Incubar durante 10 min a Tª
ambiente
Extracción/Purificación
de DNA
Preparación de la Analizar como una muestra de
muestra de trabajo
rutina
cuantitativa
Elución
Concentración
Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila
Control de proceso en qPCR
El Control de Calidad Interno permite establecer la
Tasa de Recuparación del proceso completo de
PCR (concentración de muestra, extracción/
purificación de DNA, etc.)
El uso de RM ayuda en la Validación de métodos
PCR methods, porque facilita la preparación de
muestras cuantitativas y la determinación de la
Exactitud y Precisión del método.
Análisis directo
(1.49x105 células/pastilla)
Proceso completo
(6.72x104 células/pastilla)
Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila
Rectas de calibrado
Curva de calibrado
Ct=-3,028 log[DNA]] +39,6148
R²= 0,94743
r= -0,9733
CURVA ESTANDAR
STANDARD
CURVE
50
Ct
40
30
20
10
0
0
2
4
Certificación Multisector
6
Log Nº copies
8
10
Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila
Routine qPCR control
BACuanti-PCR
RM
Dispensar la pastilla en
un tubo con 4 mL de
agua estéril
Incubar durante 10 min a
Tª ambiente
Analysis por qPCR
BACuanti-DNA
Preparación de la
muestra de
trabajo
cuantitativa
Analizar como
una muestra de
rutina
Extración/purificación de DNA
Concentratción
Elución
Conclusiones
PTs, Materiales de Referencia y Kits qPCR:
1. Facilitan la aplicación de métodos normalizados y validados.
2. Ahorra tiempo de implementación.
3. Ofrecen un sistema rápido y fácil de implementar sistemas intenos
y externos de control de la calidad.
Phone +34 966 10 55 01
Fax +34966 10 55 03
www.ielab.es
comercial@ielab.es