Cuantificación del ADN y análisis del ciclo celular en un modelo de

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ORIGINALES
Cuantificación del ADN y análisis del ciclo
celular en un modelo de hepatocarcinogénesis
Lourdes Rodríguez Fragosoa, Alejandro Nieto Rodrígueza, Teresa Cadenab,
Sara García-Jiméneza y Jorge Alberto Reyes-Esparzaa
a
b
Facultad de Farmacia. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Cuernavaca. Morelos. México.
División de Patología. Instituto Nacional de Cancerología. México.
El objetivo de este estudio fue cuantificar el
ADN y analizar el ciclo celular en muestras de
tejido hepático de ratas a quienes se les indujo un
carcinoma hepatocelular bien diferenciado. Se
cuantificó y analizó el ADN de las muestras con
carcinoma hepático mediante citometría de flujo.
Nuestros resultados mostraron la presencia de
ADN diploide en todos los grupos durante la hepatocarcinogénesis. El contenido de ADN fue normal, independientemente de las características
histopatológicas y etapa del cáncer. El análisis de
animales incluidos en el modelo de hepatocarcinogénesis mostró un incremento en la cantidad de
células hepáticas en proliferación, desde el segundo mes de tratamiento. Fue también evidente
un importante incremento en la fase G2+M, en el
sexto y octavo mes de tratamiento. Aunque hubo
variaciones en todas las fases del ciclo celular a
lo largo del desarrollo de la hepatocarcinogénesis, fue observada una actividad proliferativa
constante (fases S+G2+M) en todo el proceso. Este
modelo de hepatocarcinogénesis química inducido
en rata puede ser empleado para estudiar alteraciones celulares y moleculares que se presentan
desde etapas tempranas hasta la invasión y metástasis.
Palabras clave: ciclo celular, diploidía, proliferación, cáncer, citometría.
Rodríguez Fragoso L, Nieto Rodríguez A, Cadena T, García-Jiménez S, Reyes-Esparza JA. Cuantificación del ADN y análisis
del ciclo celular en un modelo de hepatocarcinogénesis. Rev
Oncol 2002;4(8):443-54.
Ó
INTRODUCCIÓN
El carcinoma hepatocelular (CHC) es uno de los
tumores más agresivos y por ello con pobre pronóstico1. La patogénesis multifactorial y de múltiples
etapas que caracterizan al CHC han llamado la
Correspondence: Dra. M. L. Rodríguez Fragoso.
Flavio García, 32.
Col. Presidentes Ejidales 2a Sección.
Coyoacán 04470. México, D.F.
E-mail: mlrodrig1@yahoo.com.mx
Received 23 April 2002; Revised 22 July 2002; Accepted 22 July 2002.
DNA content and cell cycle analysis
in a model of hepatocarcinogenesis
The aim of this study was to quantify DNA content and to analyze cell cycle on samples of liver tissue from rats with an induced well-differentiated hepatocellular carcinoma. For the
study we analyzed and quantified DNA by flow
cytometry. Our results showed the presence of
DNA diploid in all groups during carcinogenesis.
DNA
content
was
normal
independently of the histological features and
the stage of cancer. The analysis of animals included in the hepatocarcinogenesis model showed
an increase in the amount of liver cells in proliferation since the se-cond month of treatment. Cell
population in S-phase showed an important increase between the second and fourth months. It was
also evident an important increase in the G2+M
phase in the sixth and eighth months. Although
there were variations in all phases of cell cycle
throughout hepatocarcinogenesis, it was observed a constant proliferative activity (S+G2+M
phases) in all process. This hepatocarcinogenesis
model could be used to study the molecular and
cellular alterations present since early stages until the invasion and metastasis.
Key words: cell cycle, diploidy, proliferation, cancer,
and cytometry.
atención de un amplio grupo de investigadores
durante varias décadas. Sin embargo, aunque una
variedad de factores etiológicos ya ha sido identificada, la alteración a nivel molecular no ha sido aún definida. Entre los cánceres humanos el
carcinoma hepatocelular se caracteriza porque,
generalmente, existe la presencia de unas enfermedades hepáticas crónicas previas como la hepatitis crónica y la cirrosis hepática, en las cuales
el hígado está continuamente regenerándose después del daño hepático2-4. Esas observaciones han
llevado a pensar que la continua proliferación de
Rev Oncol 2002;4(8):443-54
443
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DEL CICLO CELULAR EN UN MODELO DE HEPATOCARCINOGÉNESIS
las células hepáticas puede causar desórdenes de
genes que están regulando el ciclo celular de estas
células
y
por
consecuencia conducen al desarrollo de este cáncer.
Una de las características fundamentales de las
células cancerosas es la pérdida de su capacidad
para controlar el crecimiento y la división. Recientes avances en oncología molecular han proporcionado una explicación, a nivel del ADN, sobre la
transformación maligna y el potencial metastático
de varios cánceres5,6. De esos estudios se concluye
que la transformación maligna puede originarse
por mutaciones no reparadas en protooncogenes y
antioncogenes o por daños genéticos ambientales,
infecciosos o de origen espontáneo. Sin embargo,
cualquiera que sea el agente causal, la consecuencia de tales mutaciones se puede manifestar en diferentes sitios de la vía transductiva en las diferentes rutas bioquímicas celulares, desde el
receptor hasta el núcleo. Como consecuencia de esto se produce un disbalance en la homeostasis de
las fuerzas reguladoras que promueven y aquellas
que restringen la proliferación celular7-9.
La mayoría de los cánceres tiene alguna anomalía
en los mecanismos que controlan la progresión
del ciclo celular. Por ejemplo, se sabe que en muchos cánceres humanos frecuentemente están alterados los mecanismos reguladores del ciclo celular que controlan la progresión de la fase
G110-13. Asimismo, estudios recientes indican que las
funciones de varios genes que controlan el ciclo
celular están alterados durante la carcinogénesis, y se sabe que esos cambios perturban tanto la
proliferación celular como la estabilidad genómica, promoviendo así la transformación celular
y acelerando el proceso de progresión tumoral.
Aunque han sido encontradas pocas alteraciones
en oncogenes conocidos, hay evidencia que involucra varios supuestos genes supresores en el desarrollo y progresión del carcinoma hepatocelular. Sin embargo, la mayoría de los genes
afectados no han sido identificados todavía, por
lo que el conocimiento de su existencia se basa en
evidencias circunstanciales relacionadas con pérdida de ramas cromosomales14,15.
La cuantificación del contenido de ADN y análisis
del ciclo celular mediante citometría de flujo es
un método conocido y utilizado para el estudio de
las características biológicas y clínicas de varios
tumores ma-lignos16, y parece ser un útil indicador para una variedad de tumores sólidos. En la
mayoría, pero no en todos los tumores, el consenso es que la presencia de un tumor aneuploide
predice una pobre tasa de supervivencia. Algunos
estudios de citometría de flujo relacionados con
carcinoma hepatocelular han sido descritos, pero
el resultado del significado del modelo de ploi-
444
día del ADN ha sido controvertido17,18. Hasta la fecha no hay informes en los que se hayan analizado
las variaciones del contenido de ADN y el ciclo
celular a través de la hepatocarcinogénesis experimental, por lo que la finalidad de este estudio
fue cuantificar el contenido de ADN y analizar el
ciclo celular en muestras de tejido hepático de
ratas a las que se les indujo químicamente un carcinoma hepatocelular bien diferenciado.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales
Se realizó en ratas Wistar macho que pesan de 120 a 150 g
y que fueron mantenidas con una dieta basal estándar
(24% de proteína). Los animales fueron mantenidos en
un ambiente de temperatura y humedad controlados y
expuestos a ciclos alternos de luz/oscuridad por períodos de 12 horas. El alimento y agua fueron administrados ad libitum. Todos los procedimientos experimentales
fueron aprobados por un comité ético.
Modelo de hepatocarcinogénesis
Se utilizó un modelo experimental de hepatocarcinogénesis química con una duración de 12 meses. Los animales
fueron sometidos a un procedimiento de selección descrito por Farber y Solt19, ligeramente modificado por Lans
et al20. Brevemente, 220 animales recibieron una dosis
única intraperitoneal de dietilnitrosamina (DEN) (200
mg/kg) disuelto en solución salina. Después de dos semanas los animales fueron alimentados con una mezcla homogénea de su dieta estándar más 0,02% de 2-acetilaminofluoreno (2-AFF), suministrado a libre demanda por dos
semanas (semana 3 y 4). Al término de la tercera semana
los animales recibieron una dosis intragástrica de tetracloruro de carbono (2 ml/kg) en una dilución 1:1 en aceite
mineral. Después de la cuarta semana los animales recibieron una solución al 0,05% de fenobarbital (FB) en el
agua para consumo, la cual ingirieron ad libitum hasta su
sacrificio. Un segundo grupo de 110 animales fue utilizado
como controles sanos, y sólo recibieron fenobarbital en
la misma dosis y vía descrita previamente. Finalmente se
utilizaron tres grupos controles constituido por 20 animales cada uno: el primero recibió DEN y 2-AAF, el segundo recibió 2-AAF y CCl4 y el tercero recibió DEN y CCl4.
Asimismo se incluyeron 20 animales que no recibieron tratamiento. No se observaron síntomas de sedación, por
efecto del fenobarbital, en ninguno de los animales a lo
largo del experimento.
Los animales fueron sacrificados en grupos de 4 a 15 en
intervalos de dos meses durante los siguientes 12 meses.
El sacrificio de los animales fue por exsanguinación, previa anestesia con dietil éter. Después del sacrificio se realizó un examen visual post mortem del hígado y del resto
de
los
órganos
en
busca de alteraciones evidentes. Los hígados fueron pesados y cortados con una hoja de bisturí en pequeñas secciones para revelar tumores no apreciables sobre la superficie del órgano.
Rev Oncol 2002;4(8):443-54
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RODRÍGUEZ FRAGOSO L, NIETO RODRÍGUEZ A, CADENA T, ET AL. CUANTIFICACIÓN DEL ADN Y ANÁLISIS
DEL CICLO CELULAR EN UN MODELO DE HEPATOCARCINOGÉNESIS
Cuantificación del ADN y análisis del ciclo
celular
Se definió como muestra diploide cuando tiene DI > 0,9 <
1,1 y como aneuploide cuando DI < 0,9 o DI > 1,1 en un mínimo del 15%-20% del total de eventos colectados en las
muestras22.
A partir de muestras tumorales se obtuvieron suspensiones
nucleares para hacer la cuantificación del ADN y el análisis del ciclo celular. Se incubaron fragmentos de aproximadamente 100 mm3 a 4° C durante 15 minutos en una solución hipotónica (5 mM Tris y 5 mM MgCl2, pH 7,4), para
producir una lisis de las células hepáticas. Tiempo después
los fragmentos fueron homogeneizados con un homogeneizador tipo Dounce en una solución hipotónica. Alícuotas
de la suspensión celular fueron procesadas de acuerdo al
procedimiento descrito previamente para el aislamiento
nuclear y el análisis del contenido de ADN21. Brevemente,
las células hepáticas fueron fijadas en etanol al 80% a
–20° C. Las muestras fueron rehidratadas en dos pasos al
100% agua. Posteriormente las células fueron digeridas
con pepsina (0,5%) en solución salina al 0,9%, pH 1,5, a 37° C
durante 30 minutos. Las muestras se pasaron a través de
una malla de nylon de 100 mm de poro, fueron lavadas con
solución amortiguadora de fosfatos (PBS) y 1 × 106 núcleos
celulares fueron incubados con tripsina (30 µg/ml) durante 10 minutos. Inmediatamente después se agregó un inhibidor de tripsina (277 µg/ml) y ribonucleasa (55 µg/ml); después fueron incubados otros 10 minutos a temperatura
ambiente. Finalmente se agregó ioduro de propidio (150
µg/ml) a la preparación nuclear y se incubaron en oscuridad
a 4° C durante 15 minutos. Al menos 20.000 núcleos fueron
analizados en un citómetro de flujo tipo FacSort con un
láser de argón ajustado para emitir luz a 488 nm. Fueron
obtenidos histogramas del área bajo la curva de FL2 (Fl2
A). El análisis de datos fue realizado con un sofware CellFit usando un modelo matemático RFIT (Becton-Dickinson,
San José, CA). Fueron utilizados núcleos de eritrocitos de
pollo y de timocitos de ternera como control estándar externo y núcleos de timocitos y hepatocitos de rata normal
como control de ploidía para identificar las células diploides. El estado de ploidía se determinó sobre la base de
la cantidad de ADN del control normal, mediante el calculo del índice de ADN (DI), el cual es un valor que expresa la cantidad de contenido de ADN con relación a un control normal.
DI =
Análisis histológico
Para el examen microscópico se fijaron muestras de tejido hepático en formaldehído al 10% y fueron embebidas
en parafina. Posteriormente el tejido fue procesado de
acuerdo al examen histológico de rutina utilizando la
tinción de hematoxilina-eosina.
Análisis estadístico
Se obtuvieron medidas de tendencia central y por la homogeneidad de los datos se utilizó ANOVA de dos vías.
Para establecer las diferencias significativas entre los
grupos se utilizó la prueba de «t» de Student para datos
independientes, aceptando diferencias significativas
cuando p < 0,0523.
RESULTADOS
Hepatocarcinogénesis química
El modelo experimental utilizado en este trabajo
per-mitió el desarrollo de un carcinoma hepatocelular bien diferenciado, caracterizado por la presencia de poblaciones relativamente homogéneas de
células alteradas desde las etapas tempranas. Fueron observadas lesiones hepáticas macroscópicas, así
como numerosos nódulos (denominados nódulos hiperplásicos) desde el segundo mes hasta el final del
tratamiento. El día del sacrificio de cada grupo de
animales control y tratados se llevó el registro del
peso corporal, el peso del hígado, así como la mortalidad a lo largo del estudio. Como se puede observar en la tabla 1 la tasa de mortalidad de los animales tratados incrementó conforme fue avanzando el
modelo experimental (p < 0,05) y se observó muerte
de animales desde el segundo mes de tratamiento.
El peso corporal tuvo una tendencia a incremen-
Canal promedio del pico G0/G1 de la muestra
Canal promedio del pico G0/G1 del control
TABLA 1. Peso y mortalidad de los animales
Meses de
tratamiento
2
4
6
8
10
12
Peso corporal (g)3
Tx1
415 ± 57*
477 ± 31*
646 ± 55
559 ± 32*
572 ± 29*
574 ± 17*
Control2
319 ± 20
426 ± 21
580 ± 18
610 ± 16
620 ± 14
635 ± 18
Peso de hígado (g)3
Tx1
19 ± 1*
20 ± 3*
21 ± 2
26 ± 3*
28 ± 3*
39 ± 10*
Control2
14 ± 1
13 ± 1
18 ± 2
19 ± 2
21 ± 4
24 ± 4
Mortalidad (muertos/total)
Tx1
Control2
2/20*
2/20*
4/20*
5/20*
7/20*
8/20*
0/10
0/10
1/10
0/10
0/10
1/10
1
Animales tratados con 2-acetilaminofluoreno (2-AAF) + dietilnitrosamina (DEN) + CCl4 + fenobarbital (FB). La administración de cada uno de ellos se especifica en la sección de material y métodos. 2 Animales control tratados únicamente con FB. 3 Cada valor
representa el promedio + EEM de 20 animales tratados y de 10 controles, respectivamente. * p < 0.05 con respecto al grupo control.
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DEL CICLO CELULAR EN UN MODELO DE HEPATOCARCINOGÉNESIS
TABLA 2. Tamaño y tipo de lesiones hepáticas
Meses
Lesiones
Animales
de
hepáticas
con
tratamiento* diámetros (mm) lesiones
2
4
6
8
10
12
<1
3
1-3
4-5
50
1-3
4-5
20
50
4-5
20-40
20-40
50
> 50
6/18
1/18
7/18
5/18
3/18
3/16
8/16
3/16
1/16
3/15
7/15
6/13
6/13
10/10
Tipo de lesiones
NH
NN
CHC
6
1
7
4
1
2
2
1
0
0
0
0
1
0
2
1
4
2
1
3
5
1
0
2
3
2
3
10
0
0
2
2
2
2
4
2
1
3
7
6
6
10
NH: nódulos hiperplásicos; NN: nódulos neoplásicos; CHC: carcinoma hepatocelular.* Tratamiento: dietilnitrosamina (DEN) + 2-acetilaminofluoreno (2-AAF) + CCl4 + fenobarbital (FB).
tar en los primeros 6 meses. Sin embargo, a partir
del octavo mes disminuyó de manera significativa
con respecto a los animales controles, p < 0,05 (tabla 1). El peso del hígado de los animales tratados
incrementó desde los primeros meses con respecto
al grupo control (p < 0.05). Fue interesante notar
que este incremento también se observó en los últimos meses de tratamiento (8, 10 y 12 meses); esto
probablemente como consecuencia de un incremento en el número y el tamaño de los nódulos.
Después de hacer el examen macroscópico del tejido
hepático de cada uno de los animales se registró el tamaño de las lesiones y junto con el estudio histológico
se de-terminó el tipo de lesiones (tabla 2). El incremento en el tamaño de las lesiones en el número de
los animales que las presentaron fueron más evidentes en los últimos meses del modelo. Asimismo, el tipo
de lesiones dejaron de ser simples alteraciones locales, vistas al inicio del tratamiento, a la aparición
del carcinoma hepatocelular y al término del mismo.
En los dos últimos meses se observó un aumento en la
cantidad de nódulos y lesiones características del
carcinoma hepatocelular, lo que hizo imposible hacer un recuento de las lesiones semejante al realizado en los meses anteriores; se podría decir que en ese
momento el tejido hepático fue sustituido en su totalidad por un carcinoma hepatocelular.
Hallazgos histopatológicos
El tratamiento químico utilizado en este modelo
experimental llevó al desarrollo de un carcinoma
hepatocelular bien diferenciado. Las muestras de
tejido hepático mostraron en los primeros 4 meses
de iniciado el tratamiento pequeños nódulos hiper-
446
plásicos distribuidos al azar (lesiones preneoplásicas). Esos nódulos fueron constituidos por hepatocitos grandes con núcleos hipercromáticos y abundante citoplasma acidófilo (fig. 1B). Además se
observaron
pequeñas
zonas
de
necrosis. Después del cuarto mes de tratamiento se
observaron grandes nódulos hepáticos formados
por hepatocitos neoplásicos que muestran atipia nuclear e hipercromasia, numerosos núcleos grandes
y acidófilos, así como mitosis atípicas. Después del
quinto mes el parénquima hepático fue sustituido
por nódulos hepáticos grandes (mayor de 1 cm de
diámetro) (fig. 1C). Esos nódulos estuvieron constituidos por hepatocitos neoplásicos y quistes con material acidófilo coloidal, además estuvieron rodeados de fibras de colágena delgadas. En ese tejido
fibroso se observaron numerosos vasos sanguíneos
y conductos biliares (fig. 1D).
Después del sexto mes todas las alteraciones histopatológicas incrementaron progresivamente en
número y tamaño (tabla 2). Hacia el octavo mes de
tratamiento se observó, en algunos nódulos o en
el parénquima internodular, la presencia de vasos sanguíneos telangiectásicos ampliamente dilatados (peliosis hepatis), la cual fue una característica bastante común, junto con grandes
conductos biliares (fig. 1E). Animales con 12 meses
de tratamiento mostraron enormes nódulos tumorales coalescentes cubriendo casi todo el tejido
hepático. Los grupos control tratados únicamente
con DEN, 2-AAF o CCl4 junto con FB mostraron el
desarrollo de pequeños nódulos tumorales y baja
mortalidad (datos no mostrados). En la figura 1
se muestra la arquitectura del tejido hepático de
animales sanos (sin ningún tratamiento).
Patrón de ploidía del ADN
La tabla 3 muestra el análisis del contenido de ADN
en los grupos incluidos en el modelo de carcinogénesis. Nuestros resultados mostraron la presencia de
ADN diploide no sólo en los animales controles, sino
en todos los grupos tratados con agentes carcinogénicos. Fue interesante notar que el contenido de
ADN en los animales incluidos en el modelo de hepatocarcinogénesis fue normal, independientemente
del patrón histopatológico y la etapa del cáncer.
Análisis del ciclo celular
Se observó que los animales controles mostraron
un gran porcentaje de núcleos celulares en la fase
Go/G1 (80%) y en una menor proporción células en
proliferación (20%). El análisis de los animales incluidos en el modelo de hepatocarcinogénesis mostró que la población de células hepáticas en proliferación incrementó tres veces desde el segundo
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A
B
D
C
Fig. 1. Estudio histológico de las secciones de hígado de ratas
en diferentes etapas de la carcinogénesis. Los animales fueron tratados como se especificó en la sección de material y
métodos y desarrollaron un carcinoma celular bien diferenciado: a) arquitectura hepática normal (H%E, 200×); b) después
de dos meses de tratamiento se observaron nódulos hiperplásicos distribuidos al azar (H&E, 400×); c) grandes nódulos neoplásicos mayores de 1 cm (flecha) fueron observados en el parénquima hepático después de 5 meses de tratamiento. Varias
estructuras quísticas con material coloidal se formaron dentro
de los nódulos. (H&E, 400×); d) después de 6 meses de tratamiento hubo presencia constante de vasos sanguíneos telangiectásicos, así como nódulos de mayor tamaño constituidos
por hepatocitos neoplásicos y quistes con material coloidal acidofílico (flecha) (H&E, 200×), y e) carcinoma celular a
los 12 meses de tratamiento. Todo el tejido sano fue sustituido
por nódulos neoplásicos rodeados por septos fibrosos con numerosos conductos biliares en neoformación (H&E, 400×).
E
mes de tratamiento, y aunque hubo variaciones esta
actividad proliferativa se mantuvo a lo largo del
desarrollo del cáncer, (p < 0,05) (fig. 2). Sin embargo, la población de células proliferando disminuyó
un 20% al octavo y duodécimo meses, aunque el porcentaje de células no llegó a ser igual a aquel observado en las células de los animales controles.
Contrariamente, la población de células en fase
Go/G1 del ciclo celular se redujo a un 50% y se mantuvo muy cercano a este porcentaje durante la carcinogénesis (p < 0,05), y aunque hubo un incremento
en el octavo y duodécimo meses éste no llegó a ser
igual al observado en los animales controles. El in-
cremento en el porcentaje de células en fase Go/G1
correlacionó con la correspondiente disminución
de la población en actividad proliferativa en esos
meses. La figura 3 muestra el porcentaje de la población de células en fase S durante la hepatocarcinogénesis. Se observó un importante incremento
entre el segundo y cuarto meses (p < 0,05). Después
de este tiempo la población de células en fase S
mostró una reducción importante, incluso en el octavo mes la cantidad de células en fase S disminuyó
por debajo de los valores de la células control (p <
0,05). En el décimo mes se observó un segundo pico
de células en fase S (p < 0,05). Por otro lado, la figu-
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TABLA 3. Contenido de ADN
Número
de animales
2
4
6
8
10
12
Control2
ADN
diploide
6
6
6
15
12
9
6
ADN
aneuploide
6/6
6/6
6/6
15/15
12/12
9/9
6/6
0/6
0/6
0/6
0/15
0/12
0/9
0/6
% de células en fase S
80
Meses
de tratamiento
Animales tratados con 2-acetilaminofluoreno (2-AAF) + dietilnitrosamina (DEN) + CCl4 + fenobarbital (FB). La administración
de cada uno de ellos se especifica en la sección de material y
métodos. 2 Animales control, tratados únicamente con FB.
% de células
100
90
80
Fase Go/Gl
*
60
*
*
*
*
*
30
*
*
*
*
20
Actividad
proliferativa
10
0
0 Control 2
4
6
8
10
12 meses
Hepatocarcinogénesis
Fig. 2. Actividad proliferativa durante la hepatocarcinogénesis. Cambios observados en las fases G0/G1 () y en
la actividad proliferativa (fases S+G2+M) (...) durante la
hepatocarcinogénesis. Las muestras fueron obtenidas de
los animales tratados con diferentes agentes carcinogénicos como se especificó en la sección de material y métodos. Cada barra representa el promedio de 10 experimentos realizados en duplicado ± EEM. * p < 0,05 con respecto
al grupo control.
448
*
50
40
30
20
*
Control 2
4
6
8
10
12 meses
Hepatocarcinogénesis
Fig. 3. Población de células hepáticas en fase S. Suspensiones de núcleos celulares se analizaron de muestras de
tumor congelado como se especificó en la sección de material y métodos. Cada barra representa el promedio de 10
experimentos realizados en duplicado ± EEM. * p < 0,05 con
respecto al grupo control.
DISCUSIÓN
El carcinoma hepatocelular es un tumor muy agresivo con pobre pronóstico24-26. Más de 250.000 casos
son diagnosticados anualmente en todo el mundo; de
ellos menos del 3% sobrevivirán 5 o más años. Desafortunadamente se sabe poco sobre las alteraciones
específicas responsables del desarrollo o progresión
del carcinoma hepatocelular humano. En años recientes ha sido extensamente estudiado el ciclo celular en células tumorales provenientes de diferentes
tejidos con el fin de investigar los mecanismos moleculares que llevan a la proliferación celular y
transformación maligna y conocer si esto puede
constituir un factor pronóstico27,28. Ahora se sabe, por
*
50
40
*
0
% de células en fase G2+M
70
*
10
1
ra 4 muestra los cambios observados en la población
de células en fases G2 + M durante la carcinogénesis. Es evidente un incremento de la población de
células en esas fases del ciclo celular en el sexto y
octavo meses (p < 0,05). Sin embargo, aunque se observó una disminución en el décimo mes, la población de células en esas fases tendió a incrementar
nuevamente en el duodécimo mes (p < 0,05).
A pesar de que existieron variaciones en todas las
fases del ciclo celular a través de la hepatocarcinogénesis, fue evidente una constante progresión
del ciclo celular (S + G2 + M) en todo el proceso.
70
60
50
*
40
*
30
20
10
*
*
0
Control 2
4
6
8
10
12 meses
Hepatocarcinogénesis
Fig. 4. Población de células hepáticas en fase G2+M. Se
utilizaron suspensiones de núcleos celulares que se analizaron en un citómetro de flujo con un láser de argón ajustado para emitir luz a 488 nm como se especificó en la sección de material y métodos. Cada barra representa el promedio de 10 experimentos realizados en duplicado ± EEM.
* p < 0,05 con respecto al grupo control.
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DEL CICLO CELULAR EN UN MODELO DE HEPATOCARCINOGÉNESIS
en seres humanos; por otro lado, nos permitió conocer las variaciones que ocurren en el ciclo celular
y el contenido de ADN, que conllevan al incremento de la proliferación celular y, por consiguiente,
al desarrollo del cáncer. El modelo de hepatocarcinogénesis utilizado fue el desarrollado previamente por FarberSolt, llamado «modelo de los hepatocitos resistentes»19, que permitió hacer el
análisis de los eventos celulares e histológicos del
carcinoma hepatocelular durante las dife- rentes
etapas de su desarrollo en un tiempo más reducido
que el de otros modelos. Durante el desarrollo del
cáncer los hepatocitos son «alterados» por la exposición a una dosis única de un carcinógeno intenso
que actúa como iniciador (dietilnitro- samina). Las
células transformadas proliferan de manera lenta
y su capacidad funcional es reducida. Estos hepatocitos llamados «resistentes» son células precursoras potenciales para el desarrollo del cáncer de hígado, pero no han adquirido la propiedad de crecer
y proliferar en forma autónoma. Los hepatocitos
«resistentes» son seleccionados y se desarrollan
ejemplo, que el núcleo de células cancerosas frecuentemente tiene un contenido anormal de ADN29-32.
El empleo de modelos animales en el estudio del
cáncer ha contribuido sustancialmente al entendimiento de procesos patológicos como el cáncer33-35. Se ha observado que los modelos de cáncer experimental inducido en animales comparten
muchas semejanzas con el comportamiento tumoral observado en los seres humanos. De hecho, datos obtenidos de esos estudios están proporcionando información para ampliar el conocimiento
del proceso de carcinogénesis, entre ellos identificar los mecanismos de control genético, los mecanismos de iniciación y progresión, el control de
la invasión y metástasis, por mencionar algunos.
Este trabajo nos permitió, por un lado, hacer un
análisis secuencial del desarrollo de las lesiones
preneoplásicas (nódulos hiperplásicos)36 y neoplásicas
del
carcinoma hepatocelular en un modelo in vivo, el cual,
como pudimos observar, mostró muchas características histológicas semejantes a las que se presentan
Modelo del «hepatocito resistente»
Fármaco
Proceso
Hallazgo
Hepatocito normal
Transformación
Dietilnitrosamina
(iniciador)
t=0
Daño permanente al ADN
Selección
Hepatocito resistente
2-acetilaminofluoreno
t=15 días
Nódulos de hepatocitos resistentes
Estímulo necrogénico
CCL4
t=30 días
Muerte celular
Proliferación activa
Nódulos de células hiperplásicas
Transformación maligna
Fig. 5. Esquema del modelo de hepatocarcinogénesis
empleado en el estudio,
desarrollado previamente
por Farber-Solt, llamado
también «modelo de los
hepatocitos resistentes».
Fenobarbital
(promotor)
t=1 mes
Células malignas lentas
12 meses
Nódulos neoplásicos
Carcinoma hepatocelular
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449
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dentro
de
nódulos
por
exposición
a
2-acetilaminofluoreno. Además de ese tratamiento
requieren de un estímulo generalizado para entrar
a proliferar; esto se logra a través de la administración de una dosis necrogénica de tetracloruro
de carbono, tras lo cual las células tienen la capacidad
de
proliferar
rápidamente hasta desarrollar nódulos hiperplásicos. Posteriormente, al exponer a los animales a fenobarbital de manera indefinida, se incrementa el
número de células y su transformación, de manera
que de ser «células tumorales latentes» pasan a
convertirse en células realmente malignas en un
proceso de propagación. Bajo ese esquema de tratamiento de los animales se aseguró el desarrollo
del carcinoma hepatocelular bien diferenciado
(fig. 5). Como se observa en la figura 1 y de los datos
reportados en la tabla 1, a los dos meses se observaron lesiones nodulares hiperplásicas pequeñas. En
este momento ya habían recibido dietilnitrosamina,
2-acetilaminofluoreno, CCl4 y hacía un mes que habían iniciado el fenobarbital, es decir, los hepatocitos «resistentes» ya habían sido seleccionados y
agrupados en nódulos hiperplásicos. Posteriormente, a tres meses de haber iniciado el tratamiento
con fenobarbital el proceso fue avanzando y los nódulos hiperplásicos pasaron de ser pequeños (< 3
mm) a grandes nódulos (hasta 50 mm), y dejaron de
ser hiperplásicos para convertirse en nódulos neoplásicos e inclusive ya típicos del carcinoma hepatocelular. Esto corrobora lo ya antes informado por
otros investigadores en relación con que es necesario que los animales reciban diferentes agentes químicos para que las células hepáticas pasen por las
etapas de iniciación, promoción y progresión de la
carcinogénesis química.
Si bien es cierto que el modelo ya ha sido desarrollado por otros investigadores, es importante señalar
que no existe un trabajo donde se haga un seguimiento de parámetros como peso corporal, peso de hígado,
mortalidad, etc. Los estudios encontrados con relación al mo-delo de carcinoma hepatocelular describen el tipo de lesión hallada y en general informan
de hallazgos histológicos encontrados posterior a
los 6 meses y asimismo describen una alta tasa de
mortalidad. En este estudio quisimos hacer el seguimiento de los diferentes parámetros antes señalados, así como la correlación entre los hallazgos histopatológicos y el estado general de los animales. El
registro del peso corporal, tanto en animales tratados como sanos, permitió comparar y relacionar las
diferencias en el peso con las características macro y
microscópicas de las lesiones tumorales en hígado.
Como se observa en la tabla 1, si bien en los primeros
6 meses hubo un incremento del peso corporal de los
animales a quienes se les indujo el daño hepático, esto pudo ser a expensas del aumento del tamaño del
450
hígado. Sin embargo, el daño hepático repercutió directamente en la salud de los animales; a partir del
octavo mes de tratamiento se empezó a observar una
disminución en el peso corporal de los animales. Esto
correlacionó con la presencia de mayor número de
lesiones neoplásicas e inclusive ya típicas de carcinoma hepatocelular.
Contrariamente a la disminución del peso corporal, se observó un aumento en el peso del hígado.
Desde el inicio del modelo se encontró la presencia de hepatomegalia en los animales sometidos al
tratamiento con los agentes carcinogénicos, dato
que se corroboró al observar un aumento en el peso del hígado de todos los animales. El incremento
en el peso del hígado en los primeros 4 meses probablemente se debió a la presencia e incremento de
los nódulos hiperplásicos. Sin embargo, el aumento
en el peso del hígado en las etapas finales del cáncer
fue
debido
probablemente
al
aumento en el número y tamaño de los nódulos neoplásicos (tablas 1 y 2).
La disminución del peso corporal es un hallazgo
clínico que se presenta en pacientes no sólo con
carcinoma hepatocelular, sino en general en todos
los tipos de cáncer, por lo que no es sorprendente
que este hallazgo lo hayamos observado en los animales con carcinoma hepatocelular. Por otro lado,
como se señaló previamente, el carcinoma hepatocelular es uno de los tumores más agresivos y por
tanto tiene un pobre pronóstico. Nosotros observamos una alta mortalidad de los animales a quienes
se les indujo el cáncer y ésta incrementó conforme
avanzó el desarrollo del cáncer hepático, lo cual
fue debido muy probablemente a una insuficiencia
hepática grave o a alguna otra complicación clínica
asociada. Este grupo de trabajo ya ha comprobado
previamente que la función hepática se deteriora
conforme avanza la carcinogénesis37.
Es importante señalar que tanto los hallazgos histopatológicos como el comportamiento clínico del
carcinoma hepatocelular que presentaron los animales durante el desarrollo de este modelo de hepatocarcino- génesis fue muy similar al observado
en los seres humanos. Sakamoto et al han informado
de la presencia de lesiones de tipo hiperplasia adenomatosa, hiperplasia adenomatosa atípica y carcinoma hepatocelular temprano en una serie de 320
carcinomas hepatocelulares en seres humanos. Asimismo han señalado que el carcinoma hepatocelular bien diferenciado se desarrolla en forma secuencial a través de las fases señaladas, sobre todo
en aquellos pacientes en quienes hay una enfermedad hepática crónica previa38. Se considera que, al
igual que durante la patogénesis de otras neoplasias malignas, como sería el cáncer colorrectal, la
acumulación de un conjunto de aberraciones podría
también ser necesaria para el desarrollo del carci-
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noma hepatocelular en etapas múltiples. En cuanto
a la evolución clínica, como ya se señaló previamente, este tipo de neoplasia es muy agresiva; por tanto,
tiene una conducta tumoral maligna típica acompañada de pérdida de peso, disfunción hepática y alta
mortalidad.
Muchos estudios han mostrado que el patrón de
ploidía del ADN puede ser un predictor del pronóstico en muchos tipos de cáncer humano; sin embargo, el significado del patrón de ploidía del
ADN en el carcinoma hepatocelular sigue siendo
aún controvertido29-31. Algunos estudios han mostrado que la aneuploidía correlaciona significativamente con el tamaño y la presencia de invasión
vascular o metástasis intrahepática. Sin embargo,
hay investigadores que no encuentran cambios en
el patrón de ploidía32. Nuestros resultados mostraron que hubo ADN diploide en el tejido hepático de todos los animales con lesiones premalignas
y malignas, incluso cuando todo el tejido hepático
fue sustituido por carcinoma hepatocelular.
En la actualidad se considera que la diploidía no
debe ser vista como un factor determinante del carácter biológicamente benigno de un tumor. Muchos tumores puramente diploides son muy agresivos. Varios estudios han mostrado la presencia de
carcinoma hepatocelular con ADN diploide teniendo un pobre pronóstico39,40. Rew ha indicado que la
presencia de ADN diploide no necesariamente implica una estructura o arreglo cromosomal preciso41.
Señala que cuando ocurre una pérdida de un fragmento cromosomal en algún sitio esta pérdida puede ser balanceada, ya sea por una translocación o
por una ganancia del ADN en cualquier sitio en la
construcción cromosomal. La diploidía pura parece
ser uno de los muchos estados citogenéticos compatibles con la replicación y supervivencia celular.
Nuestros resultados mostraron la pre- sencia de
carcinoma
hepatocelular
asociado
a
ADN
diploide en tejido hepático. Esto indica que el daño
inicial permanente al ADN responsable de la carcinogénesis pudo ser debido a deleciones o translocaciones cromosomales, mutaciones puntuales y/o
amplificación de genes que no afectaron el número
diploide de cromosomas.
Pequeños incrementos o deleciones en el número
de copias de genes y fragmentos cromosomales
pueden no detectarse en algunos tumores debido a
que la limitada construcción de los instrumentos
hacen que éstos no sean lo suficientemente sensibles para discriminar lo cercano a la diploidía.
Otro
aspecto
que
es importante considerar es que los estudios en
los cuales se han analizado múltiples muestras de
tumores individuales indican que puede haber considerable heterogeneidad en el contenido de ADN
de un sitio a otro del tumor. Por ejemplo, es posi-
ble encontrar en un mismo tumor zonas, ya sea puramente diploides o aneuploides. Aunque en nuestro estudio analizamos muestras donde fue evidente un gran tumor, sin embargo pudo haber
áreas tumorales conteniendo células con ADN
aneuploide que no detectamos por ser un porcentaje mínimo, es decir, menor del 5%. Es importante
recordar que una simple biopsia no es representativa del tumor entero; asimismo, es esencial reconocer que la diploidía y aneuploidía son parte de
un continuo y refinado proceso de reparación de
no sólo simples bases mutadas del ADN, sino también de gruesas anormalidades cromosomales, más
que dos distintas etapas existentes. El estudio de
ploidía del ADN por citometría de flujo es un método cuantitativo más que cualitativo, lo cual
puede explicar por qué una cantidad normal de
ADN, aunque con mutaciones o translocaciones de
algunos segmentos del ADN, puede tener un modelo diploide, el cual a pesar de eso falla para predecir la conducta del carcinoma hepatocelular.
En la actualidad las investigaciones con relación al
patrón de ploidía del carcinoma hepatocelular aún
son controvertidas. Si bien todos los estudios encontrados han sido hechos utilizando la técnica de
citometría de flujo, existe una amplia variación en
el patrón de ploidía mostrado. Lo interesante que
hay que hacer notar es que si bien todos los estudios
han usado la misma metodología, citometría de flujo,
ha
habido
algunas
variaciones en cuanto a las características del tejido empleado. Algunos investigadores indican que
han utilizado muestras de tejido tumoral en el cual
h
a
y
presencia de invasión vascular, de metástasis intra y
extrahepática, diferente tipo histológico, diferente
tamaño tumoral, etc.4,16-19,42,43. Esto podría explicar la
variación en el patrón de ploidía del ADN encontrado en esos estudios y por esa razón muchos investigadores señalan que no hay una relación entre el
valor pronóstico del carcinoma hepatocelular y el
patrón de ploidía que se encuentra. En relación con
nuestros resultados es importante señalar que hasta la fecha no hay estudios en la literatura sobre
análisis de ADN en modelos de hepatocarcinogénesis en animales, por lo que no es posible hacer una
comparación con otros modelos de carcinogénesis.
Además, el carcinoma hepatocelular que desarrollamos fue inducido químicamente, lo que indica que
el daño celular y genotóxico inducido a los hepatocitos puede ser diferente a quellos que ocurren durante la carcinogénesis en el hombre. Es importante
recordar que el cáncer es una enfermedad multifactorial, por lo que tal vez el patrón de ploidía
dependerá de los factores involucrados en el desarrollo del carcinoma hepatocelular.
El análisis del ciclo celular mostró datos relevan-
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tes y concordantes con los hallazgos histopatológicos. Las células del parénquima hepático normal
son células quiescentes (o estables) que normalmente muestran un bajo nivel de proliferación; sin
embargo, las células pueden sufrir una rápida división en respuesta a estímulos biológicos, químicos,
etc. La capacidad regenerativa de las células estables es mejor ejemplificada por la capacidad del hígado para regenerar después de una hepatectomía y
siguiente al daño tóxico (etanol) o vírico (hepatitis
B)44-46. La relativa dificultad del hepatocito para alcanzar respuestas de proliferación en el hígado intacto sugiere que los hepatocitos quiescentes están
bajo un estricto control de proliferación. Incluso
aunque la actividad proliferativa del hepatocito
adulto generalmente es baja, ocurre una tasa muy
baja de proliferación de estas células. Nuestros resultados estuvieron en concordancia con esto, el
tejido hepático de animales controles mostró un
80% de células hepáticas en fase Go/G1, mientras que
sólo el 20% estuvo en actividad proliferativa.
La fracción de células en fase S representa una
fracción del total de células en proliferación. La
medición de esta fracción celular puede ser de valor clínico en las etapas premalignas de un tumor
para pronosticar la malignización del mismo38, y en
caso de un cáncer, para la estimación de la actividad proliferativa del tumor y por tanto en predecir su velocidad de crecimiento. Nuestros resultados mostraron que la fase S estuvo incrementada
en etapas tempranas de la carcinogénesis. Como
mencionamos previamente, durante el primer mes
los hepatocitos sufren una serie de alteraciones
que los lleva a la transformación maligna como
consecuencia del efecto de los agentes carcinogénicos. Durante esta serie de eventos los hepatocitos pasan de una fase de proliferación lenta a activa (primer mes del esquema de tratamiento); una
vez que el hepatocito se transforma a una célula
maligna su capacidad proliferativa aumenta aún
más (a partir del segundo mes de tratamiento en este modelo). Un fenómeno interesante que se observó
fue la presencia de un segundo incremento en la fase S en el décimo mes. ¿Qué puede significar esto? En
este trabajo nosotros observamos que en el octavo
mes hubo presencia de vasos sanguíneos telangiectásicos ampliamente dilatados (peliosis hepatis) junto
con grandes conductos biliares. Estudios previos
han mostrado proliferación o infiltración de hepatocitos dentro de tabiques fibrosos y en el tracto
portal37,47,48. Creemos que previo a este tiempo ocurrió la invasión de células tumorales vía: a) invasión del tejido fibroso y /o tracto portal, y b) invasión de la pared de vasos sanguíneos de venas
portas y hepáticas. Resultados previos por este grup
o
de trabajo han mostrado la expresión del activa-
452
dor de plasminógeno tipo urocinasa, una enzima
asociada con invasión y metástasis, en los conductos
biliares en neoformación, así como en el área periportal, lo cual indica la presencia de células invasoras en esas áreas49. De hecho, trabajos previos indican la presencia de células cancerosas no sólo en
la periferia del tracto portal, sino en el centro,
entre venas, arterias y conductos, por lo que la
presencia del segundo pico de la fase S puede indicar la existencia de células tumorales invasoras en
proliferación, es decir, puede indicar que hay fenómenos de invasión y metástasis intrahepática.
Durante la fase G1 la célula responde a señales extracelulares, ya sea para avanzar hacia otra división o detener el ciclo en la etapa de reposo (Go)50,51.
Ahora se sabe que durante la transformación oncogénica varios blancos reguladores de la progresión
de la fase G1 están afectados52-54. Fue interesante notar en nuestros resultados dos incrementos en las
fases Go/G1 y G2 + M del ciclo celular (octavo y duodécimo meses). La presencia de tales incrementos indicó que hubo una prolongación de esas fases del ciclo celular. Si consideramos que G1 y G2 son las
fases caracterizadas por una expresión de genes,
síntesis de proteínas estructurales y funcionales,
necesarios para el aumento de volumen celular, y
que la fase M es el período durante el cual el material genético y el citoplasma son distribuidos equitativamente a las dos células en formación, entonces la presencia de células con fases alargadas
puede ser debido a que en ese período el tejido hepático no tuvo la suficiente cantidad de «nutrientes» necesarios para la formación y función de la
población de células proliferantes, por lo que
las células deben detenerse más tiempo de lo normal en esas fases.
Recientes estudios han mostrado que las células
pueden encontrarse en un punto de restricción
durante la fase G1, donde el ciclo puede estar parado indefinidamente si las condiciones son desfavorables para el crecimiento55,56. Ha sido informado previamente que el tiempo total de ciclo
celular para muchos tumores es igual o más largo
que el de las correspondientes células normales.
De hecho se ha concluido que el crecimiento tumoral no está comúnmente asociado con un acortamiento del ciclo celular57,58. De la misma manera, si la célula no tiene el tamaño adecuado no
ocurre la transición hacia la fase G1/S ni hacia la
fase G2/M59. Este grupo ha encontrado previamente que la función bioquímica hepática no es normal
durante la evolución del cáncer37. Esto significa
que si la función del hígado está alterada a lo
largo de la carcinogénesis puede haber períodos
donde los nutrientes no son los suficientes tanto
para la función entera del organismo como para
la proliferación de las células tumorales.
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El hecho de que hayamos encontrado dos picos al
octavo y duodécimo mes apoya la idea de que existen
dos poblaciones de células en proliferación. La primera, originada del evento inicial causante del daño
permanente al ADN que originó la proliferación y
expansión clonal de las células transformadas (inducidas por los agentes carcinogénicos). Posiblemente en esta etapa las mutaciones en las proteínas
del ciclo celular contribuyeron a la tumorigénesis
al promover la proliferación celular directamente
por permitir a la célula sobrellevar o evitar controles que ordinariamente restringen la proliferación. Como consecuencia de esto la célula no detectó alarmas internas que le señalaron la presencia
de errores en la duplicación y se-gregación de información genética. Por otro lado, la segunda población
celular
estuvo
constituida
por
otra población de células proliferativas probablemente originadas como consecuencia de la invasión
a estructuras vecinas al foco primario. La invasión
vascular ha sido mostrada en etapas tempranas del
c
a
r
cinoma hepatocelular36,39. De hecho se sabe que conforme aumenta el número de nódulos de carcinoma
hepatocelular la posibilidad de que ocurra invasión
en el tracto portal incrementa. Además, se sabe que
una vez que la célula tumoral invasora se ubica lejos del tumor primario, toma lugar un nuevo evento
de proliferación de esas células metastásicas.
En este modelo hubo dos factores que pudieron
favorecer el desarrollo de metástasis: la presencia de grandes y numerosos nódulos y la peliosis
hepatis. Este último pudo ser un factor de diseminación vascular y por tanto de metástasis intrahepática.
Actualmente se sabe que el carcinoma hepatocelular
tiene un gran potencial para producir invasión
vascular y llevar a la metástasis intrahepática
más que a otros sitios1,3.
En resumen, el modelo de hepatocarcinogénesis
química inducido en rata puede ser un buen modelo
para estudiar alteraciones moleculares asociadas a
los cambios histopatológicos que se presentan a lo
largo de la hepatocarcinogénesis. Asimismo, puede
ser un modelo para estudiar aquellos mecanismos
que controlan el ciclo celular, así como todas
aquellas moléculas asociadas al mismo. La variabilidad en las características del tejido empleado para el análisis del patrón de ploidía de este cáncer
hace difícil tener un patrón de ploidía exacto y una
correlación con el valor pronóstico. Aunado a esto,
dado que aún no hay otros trabajos en modelos animales sobre el patrón de ploidía del ADN del carcinoma hepatocelular bien diferenciado, nuestros
hallazgos no pueden reflejar lo que ocurre en el
cáncer humano ya que su origen es distinto. El hallazgo de la presencia de dos poblaciones celula-
res en proliferación indicativa de la presencia de
metástasis intrahepáticas plantea la posibilidad de
que este modelo pueda ser empleado también para
el estudio de los procesos de invasión y metástasis.
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RODRÍGUEZ FRAGOSO L, ET AL. CUANTIFICACIÓN DEL ADN Y ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR
EN UN MODELO DE HEPATOCARCINOGÉNESIS
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