TNF-alpha ELISA - IBL international

Instrucciones de Uso
TNF-alpha ELISA
Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de factor
de necrosis tumoral-α humano (TNF-α) en suero, plasma y
sobrenadantes de cultivo celular humanos.
BE55001
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
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TNF-alpha ELISA (BE55001)
ESPAÑOL
INFORMACIÓN Y MANUAL DEL PRODUCTO
1.
USO PROPUESTO
2
2.
RESUMEN
2
3.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
4
4.
REACTIVOS SUMINISTRADOS
5
5.
INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
5
6.
TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
5
7.
MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO
6
8.
PRECAUCIONES DE USO
6
9.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
7
10.
PROTOCOLO DE ENSAYO
9
11.
CALCULO DE RESULTADOS
11
12.
LÍMITES
13
13.
PRUEBAS FUNCIONALES
13
14.
INFORMACIÓN DE PEDIDOS
16
15.
RESUMEN PREPARACIÓN DE REACTIVOS
16
16.
RESUMEN DEL PROTOCOLO
17
17
REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO
18
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1.
ESPAÑOL
Uso Propuesto
El ELISA TNF-α humano total es un inmunoensayo enzimático para la detección cuantitativa del TNF-α
humano.
El ELISA TNF-α humano total es para el diagnóstico in vitro. No debe utilizarse en los
procedimientos terapéuticos.
2.
Resumen
TNF-α es una citocina multifuncional involucrada en distintos pasajes, en la homeostasis y en la
patofisiología de los mamíferos. Puede demostrar efectos biológicos opuestos que sugieren mecanismos
regulatorios complejos. TNF-α se detectó por primera vez como un factor citotóxico que produce la lisis de
ciertas células tumorales. El gen de TNF-α es miembro 2 de la superfamilia de TNF (que consta de, al
menos, 20 miembros distintos).
La liberación de TNF-α se desencadena, principalmente, por infecciones virales y endotoxinas,
lipopolisacáridos u otros componentes bacterianos, mediante el daño del tejido, el daño del ADN y por IL-1,
PDFG y el mismo TNF-α. Se expresa, principalmente, en los macrófagos, pero también en monocitos,
neutrófilos, linfocitos citolíticos naturales, mastocitos, células endoteliales y linfocitos activados. La
expresión de TNF-α en las células endoteliales y los fibroblastos puede ser producida por la IL-17.
La expresión de otras citocinas, quimiocinas, intermediarios reactivos de oxígeno, óxido de nitrógeno y
prostaglandinas se estimula mediante TNF-α. TNF-α inicialmente unido por membrana se divide en forma
enzimática mediante TACE (= ADAM17). Los monómeros solubles se suman a los homotrímeros y se
secretan en la sangre y otros líquidos biológicos. La forma unida por membrana y la forma soluble son
biológicamente activas y se unen a los receptores de TNF TNFR1 ( = TNFRSF1A, p55-60) y TNFR2 ( =
TNFRSF1B, TNFBR2, p75-80).
Una vez unidos los ligandos, los receptores forman trímeros que producen cambios en su conformación,
disociación de proteínas (SODD = silenciador de los dominios de muerte, BAG4, atanógeno 4 asociado a
Bcl2) y asociación de proteínas (TRADD = la proteína del dominio de muerte asociada a TNF-R1) y que
producen las siguientes actividades biológicas:
-
-
transcripción de factores y proteínas anti-apoptósicos involucrados en la proliferación y la inflamación de
las células a través de la unión de TRAF2 (factor 2 asociado a TNF-R) y RIPK1 (cinasa de serinatreonina 1 que interactúa con TNF-R) y activación del factor NF-κB de la transcripción.
proliferación y diferenciación de las células, pero también apoptosis a través de la unión de TRAF2, la
activación de cinasas, la activación de c-Jun y ATF2 (pasaje de JNK-MAPK).
apoptosis a través de la unión de FADD (proteína asociada a Fas con el dominio de muerte) con
TRADD y la activación de caspasas (incluida caspasa 8 = FLICE).
necrosis, una muerte celular independiente de las caspasas, con mediación de oxidasas NADPH, que
forman un complejo con TRADD y RIPK1, que produce la generación de especies de oxígeno.
TNF-R2 no contiene dominio de muerte, pero muestra su función a través de la unión directa de TRAF. En
consecuencia, las distintas funciones biológicas de TNF-α están compuestas por la proliferación y la
diferenciación celular, la oncogenia, la apoptosis o muerte celular necrótica (que incluye ciertas líneas de
células tumorales), las actividades inmunorregulatorias, el metabolismo lipídico, la coagulación y la función
endotelial. Promueve la inflamación local o generalizada (TNF-α es un pirógeno potente) y estimula la
respuesta en la fase aguda. Expresiones muy altas de TNF-α después de una infección pueden producir
choque septicémico (TNF-α es altamente citotóxico), mientras que los bajos niveles sostenidos producen
caquexia e inflamación.
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La desregulación de TNF-α es parte de muchas enfermedades:
Cáncer: Se han descrito diversas funciones de TNF-α en el cáncer, según el tipo de tumor, el microentorno
tumoral y los niveles de expresión general de TNF-α y la cinética de la expresión. Se propuso un modelo,
en los que niveles únicos y muy altos de TNF-α causan regresión del tumor y los niveles crónicos de dosis
baja se asocian con una progresión del tumor.
Lupus eritematoso generalizado: Los modelos murinos de lupus eritematoso generalizado muestran efectos
contradictorios de TNF-α: efecto anti-autoinmunitario a bajos niveles de TNF-α (la administración de TNF-α
lleva a una atenuación de los síntomas y el bloqueo de TNF-α a la generación de los síntomas de lupus
eritematoso generalizado), el efecto proinflamatorio a altos niveles de TNF-α (el bloqueo de TNF-α redujo la
enfermedad).
La inflamación intestinal crónica (enfermedad de Crohn, enteropatía inflamatoria, colitis ulcerosa): Se
demostró un efecto esencial de la actividad de TNF-α/TNF-R1 sobre la inducción de la inflamación intestinal
crónica. Se ha descrito una sobreexpresión de enteropatía inflamatoria de TNF-α en los
monocitos/macrófagos del tejido intestinal.
Psoriasis: En los pacientes con psoriasis, se demostró que TNF-α aumenta en forma generalizada y en el
tejido cutáneo. La expresión de TNF-α en las células mononucleares periféricas de la sangre era muy
elevada en pacientes en fase activa de la enfermedad y elevada en el caso de la psoriasis crónica. En un
modelo animal, se demostró que la activación dependiente de TNF-α de los linfocitos T residentes era
fundamental para el desarrollo de la psoriasis.
Trastornos pulmonares (fibrosis quística, asma): En la fibrosis quística, se observaron altos niveles de TNFα. TNF-α se sobre expresa en un asma grave y persistente. En el asma alérgica, con una exposición
reducida al antígeno, TNF-α contribuye a la liberación elevada de histamina. En un modelo de ratones para
estudiar el asma, la inflamación de las vías aéreas se produce por la activación mediada de TNF-α de la
fosfolipasa A2.
Artritis reumatoidea, espondilitis anquilosante: TNF-α tiene efectos estimulantes sobre las proteinasas que
degradan la matriz (metaloproteinasas de la matriz), la renovación del tejido y los osteoclastos, que causan
la reabsorción ósea que produce la erosión de las articulaciones. En un modelo de ratones para estudiar la
artritis reumatoidea, se observaron niveles elevados de TNF-α en la médula ósea. Las citocinas,
sintetizadas por las células sinoviales activadas por TNF-α demostraron que provocan la artritis
reumatoidea. En los pacientes con espondilitis anquilosante, se demostró que la concentración de TNF-α
era elevada en la articulación sacroilíaca.
Trasplante (enfermedad de injerto contra el anfitrión, rechazo de aloinjerto): La medición de los niveles de
TNF-α demostró ser útil en la investigación sobre trasplantes. Se vio que TNF-α era significativamente
elevado en el rechazo de aloinjerto renal. Se presentaron pruebas sobre un aumento en los niveles de
TNF-α en los trasplantes de médula ósea. Los pacientes de trasplante de médula ósea que sufrieron
complicaciones relacionadas con el trasplante, como pneumonitis intersticial y enfermedad aguda del injerto
contra el anfitrión, mostraron niveles significativamente elevados de TNF-α .
Ateroesclerosis, calcificación arterial: El mayor riesgo de sufrir infarto de miocardio recurrente,
engrosamiento ateroesclerótico de la íntima-media carotídea, trastornos en homeostasis de glucosa y
triglicéridos y ateroesclerosis relacionada con la edad se ha relacionado con los niveles circulantes de
TNF-α. Los mecanismos inducidos por TNF-α causan mayor acumulación de calcio aórtico en animales con
diabetes mellitus tipo 2.
Resistencia a la insulina y obesidad: En el tejido adiposo de modelos de roedores para estudiar la obesidad
y en personas con tejido adiposo, se observó el aumento de la expresión de TNF-α. En el tejido adiposo y
en la resistencia a la insulina, se observó inflamación crónica de bajo grado. Los mayores niveles de TNF-α
afectan la regulación del pasaje de insulina.
Enfermedades neurodegenerativas (esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad priónica,
Parkinson): TNF-α se produce a partir de microgliocitos activados y causa degeneración neuronal,
apoptosis del tejido neuronal y mayor inflamación. La administración de TNF-α causó la muerte de los
oligodendrocitos - un síntoma de la esclerosis múltiple – en cocultivos con astrocitos y microglia.
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Principio de Ensayo
Figura 1
Los pocillos de la microplaca son recubiertos con anticuerpos
anti-TNF-α humano.
Micropocillos Recubiertos
Anticuerpo para el Recubrimiento
Figura 2
Primera Incubación
El TNF-α humano presente en la muestra o el estándar se une a
los anticuerpos adsorbidos en los micropocillos. Se agrega un
anticuerpo anti-TNF-α humano conjugado a biotina que se une al
TNF-α humano capturado por los primeros anticuerpos.
Estándar o Muestra
Conjugado Biotina
Figura 3
Después de la incubación se elimina el anticuerpo anti-TNF-α
humano conjugado a biotina no unido mediante una etapa de
lavado. Se agrega una solución de estreptavidina-peroxidasa de
rábano qui se une al anticuerpo anti-TNF-α humano conjugado a
biotina.
Segunda Incubación
Estreptavidina-HRP
Figura 4
Después de la incubación se elimina la estreptavidina-HRP no
unida mediante una etapa de lavado y se agrega una solución de
Substrato reactiva a Enzima Peroxidasa a los pocillos.
Tercera Incubación
Substrato
Figura 5
Se forma un producto de color proporcional a la cantidad del
TNF-α presente en la muestra o el estándar. La reacción es
terminada por la adición de ácido y la absorbancia se mide a
450 nm. Se prepara una curva estándar a partir de 7 diluciones
estándar de TNF-α humano y se determina la concentración de
TNF-α humano en la muestra.
Substrato Reaccionado
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Reactivos Suministrados
1
bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales
anti-TNF-α humano.
1
vial (70 μL) de Conjuguado de Biotina (anticuerpos policlonales anti-TNF-α humano)
1
vial (150 µL) con Estreptavidina-HRP
2
viales de Estándar TNF-α humano liofilizados, 3000 pg/mL después de la reconstitución
1
vial del Control alto, liofilizado
1
vial del Control bajo, liofilizado
1
vial (12 mL) de Diluyente de Muestras
1
vial (5 mL) de Solución Buffer de Ensayo Concentrado 20x
(PBS con 1 % de Tween 20 y BSA al 10 %)
1
frasco (50 mL) de Solución Buffer de Lavado Concentrado 20x
(PBS con 1 % de Tween 20)
1
vial (15 mL) de Solución de Substrato (tetrametil-benzidina)
1
vial (15 mL) de Solución de Parada (1M Acido Fosfórico)
4
Tapas para placas, Adhesivas
5.
Instrucciones de Almacenamiento
Conservar los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C. Conservar
los controles liofilizados a -20 °C. Inmediatamente después de utilizarlos deberá volver a conservar los
reactivos a dicha temperatura fría (2 °C y 8 °C) y los controles a -20 °C. En las etiquetas figuran las fechas
de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos.
Sólo se podrá garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le
conservan adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda
contaminado en la primera manipulación.
6.
Toma de las Muestras y Instrucciones de Almacenamiento
Sobrenadantes de cultivos celulares, suero y plasma (EDTA, citrato, heparina) fueron probados con este
ensayo. Otras muestras biológicas pueden ser adecuadas para su uso en el ensayo. Separar el suero o
plasma del coágulo o de las células lo antes posible después de la coagulación y separación.
Prestar atención a un "Efecto Gancho" posible debido a la alta concentración de las muestras
(ver capítulo 11).
Las muestras que contienen un precipitado visible deben ser aclararadas antes de su uso en el ensayo. No
utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas.
Las muestras deben ser alícuotadas y se debe congeladar a -20 °C para evitar la pérdida de TNF-α
humano bioactivo. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se pueden almacenar ente 2 °C y
8 °C (para la estabilidad de la muestra consulte el cápitulo 13.5).
Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación. Antes del ensayo, la muestra congelada debe
alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente.
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Material Requirido Pero No Suministrado
Pipetas graduadas de 5 mL y 10 mL
Micropipetas monocanales de 5 μL a 1000 μL con puntas desechables
Micropipetas multicanales de 50 μL a 300 μL con puntas desechables
Depósito para micropipetas multicanales
Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparación de reactivos
Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulación
Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm
(opcional: 620 nm longitud de onda de referencia)
Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio
Programa estadístico informático para llevar a cabo un análisis de regresión
Precauciones de Uso
Todos los productos químicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por lo tanto,
recomendamos que este producto sea manipulado únicamente por aquellas personas que hayan sido
entrenadas en técnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas
prácticas de laboratorio. Se debe llevar ropa de protección apropiada como puedan ser las batas de
laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto
con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata
a lavar la parte afectada con abundante agua. Véase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de
seguridad para recomendaciones específicas.
Los reactivos están destinados para un uso en diagnóstico in vitro y no se deben usar en
procedimientos terapéuticos.
No mezclar o sustituir los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes.
No usar reactivos caducados.
No exponer los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubación.
No pipetear con la boca.
No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos.
Evitar el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas.
Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o látex durante la manipulación de las
muestras y reactivos.
Evitar el contacto de la solución de substrato con agentes oxidantes y metales.
Evitar salpicaduras y la generación de aerosoles.
Con el propósito de evitar una contaminación microbiológica o contaminaciones cruzadas de reactivos y
muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo
uso.
Usar recipientes limpios y específicos de reactivos para la dispensación de reactivos de sustrato.
La exposición a los ácidos inactiva el conjugado.
Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparación de los reactivos.
La solución de substrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso.
Descontaminar y disponer las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si
pudieran contener agentes infecciosos. El método preferente de descontaminación es un autoclavado
durante un mínimo de 1 hora a 121.5 °C.
Los residuos líquidos que no contengan ácido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con
hipoclorito sódico en volúmenes tales que la mezcla final contenga 1.0 % de hipoclorito sódico. Dejar
actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminación. Los residuos líquidos que contengan
ácido deben ser neutralizados previamente a la adición de hipoclorito sódico.
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Preparación de los Reactivos
Las Soluciónes de Buffer Concentradas deben de alcanzar la temperatura ambiente y ser diluídas antes
de iniciar el procedimiento del ensayo. Si en las Soluciónes de Buffer Concentradas se han formado
cristales, caliente suavemente hasta su completa disolución.
9.1. Solución Buffer de Lavado (1x)
Vierta todo el contenido (50 mL) de la Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz
aforado de 1000 mL limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para
evitar la formación de espuma.
Transfiera la solución a un frasco de lavado limpio y consérvela a una temperatura entre 2 °C y 25 °C. La
Solución Buffer de Lavado (1x) permanece estable durante 30 días
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Lavado (1x) de acuerdo a la
siguiente tabla:
Número de Tiras
Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) (mL)
Agua Destilada (mL)
1-6
25
475
1 - 12
50
950
9.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)
Vierta todo el contenido (5 mL) de la Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) en un matraz limpio
aforado de 100 mL. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada aun volumen final de 100 mL.
Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.
Conserve la solución a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C. La Solución Buffer de Ensayo permanece
estable durante 30 días.
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Ensayo (1x) de acuerdo a la
siguiente tabla:
Número de Tiras
Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) (mL)
Agua Destilada (mL)
1-6
2.5
47.5
1 - 12
5.0
95.0
9.3. Preparación de Conjugado de Biotina
Utilice el Conjugado de Biotina antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución.
Justo antes de utilizar el Conjugado de Biotina, se debe diluirlo en una proporción de 1:100 con la
Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio.
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare el Conjugado de Biotina de acuerdo a la siguiente
tabla:
Número de Tiras
1-6
1 - 12
Conjugado de Biotina (mL)
0.03
0.06
Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL)
2.97
5.94
9.4. Estreptavidina-HRP
Utilice la Estreptavidina-HRP antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución.
Justo antes de utilizar la solución concentrada de Estreptavidina-HRP, se debe diluirlo en una proporción
de 1:100 con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio.
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Estreptavidina-HRP de acuerdo a la siguiente
tabla:
Número de Tiras
1–6
1 - 12
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Estreptavidina-HRP (mL)
0.06
0.12
Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL)
5.94
11.88
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9.5. Estándar TNF-α Humano
Reconstituir el Estándar TNF-α humano añadiendo agua destilada.
El volumen de reconstitución está indicado en la etiqueta del vial del estándar. Girar o mezclar
cuidadosamente para garantizar una solubilización completa y homogénea (concentración del estándar
reconstituido = 3000 pg/mL). Permitir que el estándar reconstituido se asiente durante 10-30 minutos.
Mezclar bien previamente a realizar las diluciones.
Tras su uso los restos del estándar no pueden ser almacenados y deben ser descartados.
Las diluciones estándares pueden ser preparadas directamente en la placa multipocillo (véase 10.c) o
alternativamente en tubos (véase 9.5.1).
9.5.1. Dilución Estándar Externa
Rotular 7 tubos, uno para cada curva estándar.
S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.
Acto seguido, preparar diluciones seriadas 1:2 para la curva estándar como se indica a continuación:
Pipetear 225 µL de Diluyente de Muestras a todos los tubos.
Pipetear 225 µL de estándar reconstituido (concentración del estándar = 3000 pg/mL) en el primer tubo,
etiquetado como S1, y mezclar (concentración del estándar 1 = 1500 pg/mL).
Pipetear 225 µL de esta dilución en el segundo tubo, etiquetado como S2, y mezclar completamente antes
de la siguiente transferencia. Repetir la serie de diluciones 5 veces más de manera que se obtengan los
diferentes puntos de la curva estándar (véase figura 6).
El Diluyente de Muestras sirve como blanco.
Figura 6
Transferir 225 µL
S1
TNF-α Humano
Estándar Reconstituido
S2
S3
Diluyente de Muestras
225 µL
S4
-
S7
Descartar
225 µL
9.6. Controles
Solubilizar añadiendo 500 μL de agua destilada al controles liofilizados. Permitir que il controles liofilizados
se asiente durante 10-30 minutos. Mezclar bien previamente a realizar las diluciones. Vortear
concienzudamente para asegurar una solubilización homogénea y completa. A partir de aquí, tratar il
controles de la misma forma que las muestras. El rango del control viene indicado en el certificado de
calidad y en la etiqueta del vial. Almacenar il controles reconstituidos y alicuotado a -20 °C. Evitar ciclos
repetidos de congelación y descongelación.
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10.
Protocolo de Ensayo
a.
Determine el número de tiras necesarias para analizar el número deseado de muestras y
además añada las tiras para blancos y estándares (de color). Cada muestra, estándar, blanco y la
muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras
sobrantes y consérvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y
cerrada herméticamente, a una temperatura de 2-8 °C.
b.
Lave las tiras 2 veces con aproximadamente 400 µL de Solución Buffer de Lavado por cada
pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la
Solución Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante 10-15 segundos antes de su
aspiración. Evite rayar la superficie de los pocillos.
Tras el último lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de
papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. Utilice las tiras inmediatamente después de
lavadas o bien colóquelas boca abajo sobre un papel absorbente húmedo durante como máximo
15 minutos. No deje secar los pocillos.
c.
Dilución Estándar en la placa de microtitración
(Alternativamente, la dilución estándar puede ser preparada en tubos – véase 9.5.1)
Añadir 100 µL de Diluyente de Muestras en duplicado a todos los pocillos estándar.
Pipetear 100 µL de estándar preparado (véase Preparación del Estándar 9.5,
concentración = 3000 pg/mL) por duplicado en los pocillos A1 y A2 (véase Tabla 1). Mezclar el
contenido de los pocillos A1 y A2 por repetidas aspiraciones y expulsiones del contenido con la
pipeta (concentración del estándar 1, S1 = 1500 pg/mL), y transferir 100 µL a los pocillos B1 y B2,
respectivamente. (véase Figura 7). Cuidar de no rascar la superficie interior de los micropocillos con
la punta de la pipeta. Continuar este procedimiento 5 veces, formando dos filas de diluciones
estándar del TNF-α humano ordenadas desde 1500.0 a 23 pg/mL. Descartar 100 µL de los
contenidos de los últimos micropocillos (G1, G2) usados.
Figura 7
Transferir 100 µL
S1
TNF-α Humano
Estándar Reconstituido
27.11.14 (23)
S2
S3
Diluyente de Muestras
100 µL
S4
-
S7
Descartar
100 µL
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En caso de una dilución estándar externa (véase 9.5.1), pipetear 100 µL de estas diluciones estándares
(S1-S7) en los pocillos estándares correspondientes de acuerdo con la Tabla 1.
Tabla 1
Tabla describiendo un ejemplo de la disposición de los blancos, estándares y muestras en las tiras
de los micropocillos
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
Estándar 1
(1500 pg/mL)
Estándar 2
(750 pg/mL)
Estándar 3
(375 pg/mL)
Estándar 4
(188 pg/mL)
Estándar 5
(94 pg/mL)
Estándar 6
(47 pg/mL)
Estándar 7
(23 pg/mL)
Estándar 1
(1500 pg/mL)
Estándar 2
(750 pg/mL)
Estándar 3
(375 pg/mL)
Estándar 4
(188 pg/mL)
Estándar 5
(94 pg/mL)
Estándar 6
(47 pg/mL)
Estándar 7
(23 pg/mL)
Blanco
Blanco
3
4
Muestra 1
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 7
Muestra 8
Muestra 8
d.
Añadir 100 µL de Diluyente de Muestras en duplicado a los pocillos del blanco.
e.
Añadir 50 µL de cada Diluyente de Muestras a los pocillos con la muestra.
f.
Añadir 50 µL de cada muestra en duplicado a los pocillos designados.
g.
Prepare el Conjugado de Biotina (véase la preparación del Conjugado de Biotina 9.3)
h.
Añada 50 µL el Conjugado de Biotina a todos los pocillos.
i.
Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 2 horas en un
agitador mecánico a 400 rpm, si es posible.
j.
Prepare Estreptavidina-HRP (véase la preparación de estreptavidina-HRP 9.4).
k.
Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 6 veces de acuerdo al
punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso.
l.
Añada 100 µL de Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos, incluidos los del blanco.
m.
Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 1 hora en un
agitador mecánico a 400 rpm, si es posible.
n.
Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 6 veces de acuerdo al
punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso.
o.
Pipetee 100 μL de Solución de Substrato TMB y viértalos en todos los pocillos.
p.
Incube las tiras de microtitración a temperatura ambiente (18-25 °C) durante aproximadamente
10 minutos. Evite la exposición directa a la luz intensa.
Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reacción del substrato
(véase el siguiente punto de este protocolo) antes de que deje de ser posible registrar
correctamente los pocillos positivos.
La determinación del tiempo adecuado para el desarrollo del color, debe realizarse de
forma individual para cada ensayo.
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Se recomienda añadir la solución de parada cuando el estándar más alto presente un color azul
oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de
ELISA a 620 nm. La reacción del substrato debería ser parada cuando el Estándar 1 alcance una
DO entre 0.9 y 0.95.
q.
Detenga la reacción enzimática pipeteando rápidamente 100 µL de la Solución de Parada en cada
pocillo, incluidos los del blanco. Es importante dispensar la Solución de Parada de forma rápida y
uniforme en todos los pocillos para inactivar totalmente la enzima. Los resultados deben leerse
inmediatamente después de añadir la solución de parada o, como máximo, en el plazo de 1 hora si
las tiras se conservan a una temperatura entre 2-8 °C en un lugar oscuro.
r.
Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de
onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; los valores
comprendidos entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilizar los pocillos de blanco para medir el
blanco del lector de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la
absorbancia de las muestras y de los estandares.
Nota: En caso de incubar sin agitar, los valores de D.O. pueden ser inferiores a los indicados más
abajo. De todas formas los resultados siguen siendo válidos.
11.
CALCULO DE RESULTADOS
- Calcular los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estándares y
muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio.
- Construir una curva estándar mediante la representación de la absorbancia media obtenido para cada
estándar frente a la concentración de TNF-α humano con el valor de absorbancia en el eje-y y la
concentración en el eje-x. Se logra un buen ajuste con 5 Parameter Logistics.
- Para determinar la concentración de la TNF-α humano circulante para cada muestra, primero encontrar
el valor de absorbancia media en la ordenada y extender una línea horizontal a la curva estándar. En el
punto de intersección, extender una línea vertical al eje de abscisas y leer la concentración del TNF-α
humano.
- Si se han seguido las instrucciones de este protocolo, se han diluido 1:2 las muestras (50 µL de
muestra + 50 µL de Diluyente de Muestras), la concentración leída a partir de la curva estándar se
debe multiplicar por el factor de dilución (2x).
- Cálculo de las muestras con una concentración superior al estándar 1, puede dar lugar a
concentraciones incorrectas, bajas en TNF-α humano. Estas muestras requieren más predilución
externa según los valores esperados de TNF-α humano con el Diluyente de Muestras para
cuantificar con precisión la concentración real de TNF-α humano.
- Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones
conocidas de TNF-α humano y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores
obtenidos no están dentro del intervalo esperado del control, los resultados del análisis pueden ser no
válidos.
- En la figura 8 se muestra una representativa curva estándar. Esta curva no se puede utilizar para
obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estándar por cada grupo
de tiras ensayadas.
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Figura 8
Representativa curva estándar para el ELISA TNF-α humano. Se diluyó el TNF-α humano en serie de 2
etapas en la Diluyente de Muestras. No use esta curva estándar para obtener resultados de las pruebas. Se
debe ejecutar una curva estándar para cada grupo de tiras ensayadas.
Tabla 2
Datos típicos del ELISA TNF-α humano
Longitud de onda: 450 nm
Longitud de onda de referencia: 620 nm
1
Concentración
TNF-α humano
(pg/mL)
1500
2
750
3
375
4
188
5
94
6
47
7
23
Blanco
0
Estándar
D.O.
(450 nm)
D.O.
Media
C.V.
(%)
2.312
2.278
1.304
1.314
0.768
0.720
0.424
0.417
0.291
0.276
0.190
0.170
0.147
0.145
0.090
0.092
2.295
0.7
1.309
0.4
0.744
3.3
0.420
0.8
0.284
2.7
0.180
5.5
0.146
1.0
0.091
1.4
Los valores de DO de la curva estándar pueden variar según las condiciones de la realización del ensayo
(por ejemplo empleados del laboratorio, técnica de pipeteo, técnica de lavado o efectos de la temperatura).
Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimática y por tanto la intensidad
de color. Los valores medidos siguen siendo válidas.
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12.
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LÍMITES
-
Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva
estándar para cada prueba.
-
La contaminación de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminación cruzada
entre los reactivos puede dar resultados erróneos.
-
Se debe utilizar preferiblemente puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los
frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso y todos los productos de limpieza ser
eliminados por un enjuague minucioso.
-
Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a
resultados erróneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vaciar los pocillos completamente antes
de pipetear la Solución de Lavado fresca. Pipetear la Solución Buffer de Lavado en los pocillos como se
especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estén no cubiertos durante mucho tiempo
o que se secan.
-
Por la aplicación de radioinmunoterapia, el número de pacientes con los anticuerpos humanos IgG
antiratón (HAMA) ha aumentado significativamente. HAMA puede interferir en ensayos que utilicen
anticuerpos monoclonales murinos, y dar lugar a resultados tantos falsos positivos como falsos
negativos. Muestras de suero que contienen anticuerpos contra inmunoglobulinas murinas pueden
todavía ser ensayadas en ensayos de este tipo si se añaden inmunoglobulinas murinas (suero, líquido
ascítico o anticuerpos monoclonales no específicos) a la muestra.
13.
Pruebas Funcionales
13.1. Sensibilidad
El límite de detección de TNF-α humano definido como la concentración del analito resultando en una
absorción significativamente más alta que la del medio de dilución (media más dos desviaciones estándar),
se determinó de ser 5.0 pg/mL (media de 6 ensayos independientes).
13.2. Recuperación
13.2.1. Intra-ensayo
La recuperación del intra-ensayo se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a
cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de TNF-α
humano. Se llevaron a cabo dos curvas de estándar en cada placa. Los datos a continuación muestran la
concentración media de TNF-α humano y el coeficiente de variación para cada muestra (ver Tabla 3).
El calculado coeficiente de variación intra-ensayo total fue del 7.7 %.
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Tabla 3
La concentración media de TNF-α humano y el coeficiente de variación para cada muestra
Concentración Media
Coefficiente de
Muestra
Experimento
TNF-α humano (pg/mL)
Variación (%)
1
1
5328
6.6
2
4990
9.4
3
5474
3.4
2
1
4818
6.4
2
4149
9.9
3
4558
11.3
3
1
3523
12.2
2
2967
5.3
3
3478
5.7
4
1
2236
5.1
2
2207
2.8
3
2381
5.9
5
1
1528
6.7
2
1379
11.6
3
1310
8.4
6
1
889
2.0
2
805
9.0
3
827
7.4
7
1
607
14.9
2
492
8.2
3
507
7.3
8
1
216
6.3
2
286
10.7
3
267
8.0
13.2.2. Inter-ensayo
La recuperación inter-ensayo dentro de un laboratorio se evaluó en tres experimentos independientes.
Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes
concentraciones de TNF-α humano. Dos curvas de calibración se realizaron en cada placa. Los datos a
continuación muestran la concentración media de TNF-α humano y el coeficiente de variación calculado en
18 determinaciones de cada muestra (ver Tabla 4). El coeficiente de variación total calculado de interensayo fue del 8.1 %
Tabla 4
La concentración media de TNF-α humano y el coeficiente de variación para cada muestra
Concentración Media de
Coefficiente de
Muestra
TNF-α humano (pg/mL)
Variación (%)
1
5264
4.7
2
4508
7.5
3
3323
9.3
4
2275
4.1
5
1405
7.9
6
840
5.2
7
535
11.7
8
256
14.0
13.3. Recuperación después del Enriquecimiento
La recuperación del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo cuatro niveles de TNF-α humano en
muestras combinadas de suero normal. Las recuperaciones se determinaron en tres experimentos
independientes con 6 repeticiones cada uno. El suero no enriquecido sirvó como blanco en estos
experimentos. La recuperación varió entre 76 % a 115 % con una recuperación total media de 90 %.
Las recuperaciones dependen del suero utilizado.
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13.4. Dilución en Paralelo
Se analizaron 4 muestras de suero con diferentes concentraciones de TNF-α humano mediante 2
diluciones en serie con 4 repeticiones cada uno.
La recuperación varió entre 97.1 % a 128.6 %, con una recuperación total de 112.7 % (ver Tabla 5).
Tabla 5
Concentración
Muestra
Dilución
Expectada de TNF-α
humano (pg/mL)
1:2
1:4
2469
1
1:8
1498
1:16
890
1:2
1:4
2295
2
1:8
1463
1:16
791
1:2
1:4
2993
3
1:8
1721
1:16
876
1:2
1:4
2775
4
1:8
1560
1:16
757
Las recuperaciones dependen del suero utilizado.
Concentración
Observada TNF-α
humano (pg/mL)
4937
2996
1781
975
4590
2925
1582
1017
5986
3442
1751
969
5550
3119
1514
766
Recuperación de
Concentración
Expectada (%)
121.4
118.9
109.5
127.5
108.2
128.6
115.0
101.8
110.6
112.4
97.1
101.2
13.5. Estabilidad de Muestras
13.5.1. Estabilidad Congelación - Descongelación
Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 °C y
posteriormente descongeladas hasta 5 veces, y se determinó las concentraciones del TNF-α humano. Se
detectó una disminución significativa de la inmunoreactividad de TNF-α humano. Por consiguiente, las
muestras deben almacenarse en partes iguales a -20 °C y descongelarse solo una vez.
13.5.2. Estabilidad de Almacenamiento
Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 °C, 2-8 °C,
temperatura ambiente (TA) y a 37 °C, y la concentración de TNF-α humano fue determinada después de
las 24 horas. No se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad del TNF-α humano durante el
almacenamiento a -20 °C,y a 2-8 °C.
Una pérdida significativa de la inmunoreactividad de la TNF-α humano fue detectado durante el
almacenamiento a temperatura ambiente (TA) y a 37 °C después de las 24 h.
13.6. Especificidad
El ensayo no solo detecta TNF-α humano natural sino también TNF-α humano recombinante. La
interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas proteínas a
concentraciones fisiológicamente relevantes en un suero positivo de TNF-α humano. No se detectaron
interferencias, específicamente no con TNF-R (60 kDa y 80 kDa).
13.7. Valores Esperados
Se ensayaron grupos de 40 muestras de suero provenientes de donantes seleccionados al azar,
aparentemente sanos (hombres y mujeres) para TNF-α humano. No se encontró concentraciones
detectables de TNF-α humano en los donantes sanos. Concentraciones elevados de TNF-α humano
dependen del tipo de trastorno inmunológico.
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14.
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INFORMACIÓN DE PEDIDOS
Para los pedidos póngase en contacto con:
Véase la última página.
Para preguntas técnicas comuníquese con:
e-mail: IBL@IBL-International.com
www.IBL-International.com
15.
Resumen: Preparación de Reactivos
15.1. Solución Buffer de Lavado (1x)
Añadir 50 mL de la Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 mL de agua destilada.
Número de
Tiras
1-6
1-12
Solución Buffer de Lavado
Concentrada (mL)
25
50
Agua Destilada
(mL)
475
950
15.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)
Añadir 5 mL Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) a 95 mL de agua destilada.
Número de
Tiras
1-6
1-12
Solución Buffer de Ensayo
Concentrada (mL)
2.5
5.0
Agua Destilada
(mL)
47.5
95.0
15.3. Conjugado de Biotina
Hacer una dilución 1:100 del Conjugado de Biotina en la Solución Buffer de Ensayo (1x):
Número de Tiras
1-6
1-12
Conjugado de Biotina (mL)
0.03
0.06
Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL)
2.97
5.94
15.4. Estreptavidina-HRP
Hacer una dilución 1:100 del Estreptavidina-HRP en la Solución Buffer de Ensayo (1x):
Número de Tiras
1-6
1-12
Conjugado de Biotina (mL)
0.06
0.12
Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL)
5.94
11.88
15.5. Estándar TNF-α Humano
Reconstituir el estándar liofilizado TNF-α humano con agua destilada.
(El volumen de reconstitución se indica en la etiqueta del frasco estándar.)
15.6. Controles
Añadir 500 µL de agua destilada a los controles liofilizados.
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Resumen de Protocolo de Ensayo
1.
Determinar el número requirido de tiras de la placa de microtitulación.
2.
Lavar las tiras de la placa de microtitulación dos veces con Solución Buffer de Lavado.
3.
Dilución estándar en la placa de microtitración: Añadir 100 µL de Diluyente de Muestras,
por duplicado, a todos los pocillos estándar. Pipetear 100 µL de estándar preparado en los primeros
pocillos y crear diluciones estándar mediante la transferencia de 100 µL de pocillo a pocillo.
Deseche 100 µL de los últimos pocillos.
Alternativamente dilución estándar externa en tubos (ver 9.5.1): Pipetear 100 µL de estas diluciones
estándares en las tiras de los micropocillos.
4.
Añadir 100 μL de Diluyente de Muestras, por duplicado, a los pocillos blancos.
5.
Añadir 50 μL de Diluyente de Muestras a los pocillos de muestra.
6.
Añadir 50 μL de muestras por duplicado a los pocillos respectivos.
7.
Preparar el Conjugado de Biotina.
8.
Añadir 50 μL de Conjugado de Biotina a todos los pocillos.
9.
Cubrir las tiras e incubar 2 horas a temperatura ambiente (18-25 °C).
10.
Preparar Estreptavidina-HRP.
11.
Vaciar y lavar los pocillos 6 veces con Solución Buffer de Lavado.
12.
Añadir 100 µL de la Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos.
13.
Cubrir las tiras e incubar 1 hora a temperatura ambiente (18-25 °C).
14.
Vaciar y lavar los pocillos 6 veces con Solución Buffer de Lavado.
15.
Añadir 100 μL de Solución Substrato TMB a todos los pocillos.
16.
Incubar las tiras para approximadamente 10 minutos a temperatura ambiante (18-25 °C).
17.
Añadir 100 μL de Solución de Parada a todos los pocillos.
18.
Ajustar el fotómetro y medir la absorbancia a 450 nm.
Nota: Si han seguido las instrucciones en este protocolo las muestras han sido diluidas 1:2
(50 μL de muestra + 50 μL de Diluyente de Muestras), la concentración leída de la curva estándar
debe ser multiplicada por el factor de dilución (x 2).
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17.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
ESPAÑOL
REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO
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18:343-349.
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιμοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθμός εξετάσεων:
CONC
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IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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