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IN VESTIGACIÓ N
ACTAS UROLÓGICAS ESPAÑOLAS ABRIL 2000
CONDICIONES DE DESARROLLO DE UN
PROGRAMA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA-TRANSCRIPTASA REVERSA PARA
EL ESTADIAJE MOLECULAR DEL CÁNCER DE
PRÓSTATA
L. LLANES GONZÁLEZ, A. FERRUELO ALONSO, A. PÁEZ BORDA,
Mª.A. CABEZAS MARTÍNEZ, M. LUJÁN GALÁN, A. BERENGUER SÁNCHEZ
Unidad de Investigación Urológica. Servicio de Urología. Hospital Universitario de Getafe. Madrid.
PALABRAS CLAVE:
RT-PCR. PSA. Neoplasias prostáticas.
KEY WORDS:
RT-PCR. PSA. Prostate neoplasia.
Actas Urol Esp. 24 (4): 287-292, 2000
*Trabajo financiado parcialmente por Becas FIU 98 y FIS 97/0209.
RESUMEN
OBJETIVO: Determinar con precisión las condiciones de desarrollo de los ensayos con RT-PCR para PSA
en pacientes con cáncer de próstata.
MÉTODO: Amplificación del gen del PSA en cultivos celulares de la línea tumoral prostática humana
LNCaP con RT-PCR en condiciones hot-start, y verificación mediante digestión con enzimas de restricción
del producto de la PCR. Además se calculó el límite de detección del ensayo de PCR, mediante diluciones
seriadas de células LNCaP en células mononucleares de sangre periférica.
RESULTADOS: Hemos desarrollado un protocolo de RT-PCR de alta especificidad, fácilmente realizable
y reproducible. El límite de detección más bajo alcanzado fue de 1 célula sintetizadora de PSA por 106 células mononucleares de sangre periférica.
CONCLUSIONES: La RT-PCR es una técnica de un alto grado de sensibilidad, que permite la detección
de un pequeño número de células productoras de PSA en sangre periférica. Esta experiencia permitió establecer con precisión las condiciones de desarrollo de los ensayos de RT-PCR para PSA.
ABSTRACT
OBJECTIVE: To determine accurately the conditions for the development of tests using RT-PCR for PSA
in patients with prostate cancer.
METHOD: Gen amplification of PSA in cultures of the human prostate tumoral cell line LNCaP with RTPCR under hot-start conditions, and verification through enzyme restriction digestion of the PCR product.
Also, calculation of the PCR test limit of detection through serial dilutions of LNCaP cells in peripheral blood
mononucleate cells.
RESULTS: A highly specific, easy to perform, reproducible RT-PCR protocol has been developed. The
lowest limit of detection reached was 1 PSA synthesising cell per 106 peripheral blood mononucleate cells.
CONCLUSIONS: RT-PCR is a highly sensitive technique that allows detection of small numbers of PSA
producing cells in peripheral blood. This experience allows to establish with precision the conditions for the
development of RT-PCR tests for PSA.
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L. LLANES GONZÁLEZ, A. FERRUELO ALONSO, A. PÁEZ BORDA, Y COLS.
L
cos de cultivo de 75 cm2, el reactivo UltraspecTM
(Biotecx, Texas, EE.UU) según recomendaciones
del fabricante. Las células mononucleares se
obtuvieron a partir de una solución concentrada
de leucocitos (buffy coat), procedente de muestras
sanguíneas de donantes. El concentrado de células se diluyó 1/8 con PBS (phosphate buffered
saline) y alícuotas de 30 ml se pusieron sobre 15
ml de LymphoprepTM (Nycomed, Oslo, Noruega).
El gradiente fue centrifugado a 800 g, durante 40
minutos a 20ºC. Se aspiró de 2 a 3 ml de la capa
de células mononucleares presente en la interfase (Fig. 1), y se completó hasta 50 ml con PBS. Esta
solución se centrifugó a 250 g, 10 minutos a 20ºC.
El sobrenadante se decantó y se repitió el procedimiento anterior dos veces. Las células mononucleadas fueron mezcladas con las diferentes diluciones seriadas de células LNCaP y estas mezclas
fueron empleadas para la extracción del RNA total,
utilizando el método de Ultraspec TM (Biotecx,
Texas, EE.UU) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. El RNA total obtenido se
disolvió en 100 µL de agua libre de Rnasas. La
cuantificación del RNA total se realizó mediante
análisis espectrofotométrico a 260 nm, y la pureza del mismo a partir de la relación A260/A280.
a técnica de biología molecular conocida como
reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR, del inglés reverse transcriptase-polimerase chain reaction), proporciona
un vasto campo de estudio en el área de la urooncología.
Esta posibilidad ha permitido el desarrollo de
un escenario útil para la investigación clínica básica en cáncer de próstata, de la cual, el exponente
más conocido es el estadiaje molecular del cáncer
de próstata. Su fin es la detección de células prostáticas circulantes en los pacientes con cánceres
órgano-confinados, previo a la prostatectomía
radical en un intento de ajustar el estadiaje1. No
obstante, esta herramienta también se ha utilizado para predecir la posibilidad de recidiva de la
enfermedad después de la cirugía2. La RT-PCR en
cáncer de próstata no se ha limitado al estudio en
sangre periférica, sino que también se está investigando en ganglios linfáticos3 y médula ósea4, las
dos localizaciones más frecuentes de las metástasis de este tumor.
Las condiciones de desarrollo de los experimentos varían en manos de los diferentes investigadores. Ello obliga a establecer con precisión las
condiciones necesarias para realizar cualquier
ensayo con RT-PCR antes de iniciar los experimentos.
PROCEDIMIENTOS
Transcripción reversa (RT): Se utilizó una alícuota de 5 µg de RNA total y el resto se almacenó
a -80ºC. La RT se llevó a cabo en un volumen de
50 µL. Se calentaron 5 µg de RNA total a 65ºC
MATERIAL Y MÉTODOS
MUESTRAS
Cultivo celular: En los experimentos se utilizaron células humanas de cáncer de próstata de la
línea LNCaP (ATCC, Rockville, EE.UU), que expresan PSA. Las células se hicieron crecer en medio
RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal
termoinactivado al 10%, L-glutamina 2mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 0,1 mg/ml
(Biological Industries, Beit Haemek, Israel). El
medio fue reemplazado cada 2 días. Cuando los
cultivos alcanzaban la confluencia se despegaron
de frascos de 75 cm2 (Costar, Acton, EE.UU) con
una solución de tripsina (0,05%): EDTA (0,02%)
(Biological Industries, Beit Haemek, Israel) para
subsecuentes pases del cultivo.
FIGURA 1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica. Después de utilizar un gradiente de densidad (LymphoprepTM) se centrifugó la muestra obteniéndose una banda opaca en la interfase entre el plasma y
los hematíes.
Aislamiento de células mononucleares y extracción de RNA: Para la extracción de RNA total de las
células LNCaP se añadió directamente a los fras288
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CONDICIONES DE DESARROLLO DE UN PROGRAMA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA-TRANSCRIPTASA REVERSA
durante 2 minutos, y se enfriaron en hielo inmediatamente para evitar su renaturalización. Se
preparó la siguiente mezcla de RT, 18,5 µL para
cada muestra: 5 µL de buffer MMLV RT 10x; 5 µL
de 0,1 mol/L DDT (1,4-ditiotreína), 2,5 µL de una
mezcla de dNTPs -deoxinucleótidos trifosfato(Ecogen, SRL) a una concentración 12,5 mmol/L;
2 µL de oligodT (2 µg), 0,5 µL de inhibidor de Rnasa
(20 U; Rnasin, Promega); y 0,5 µL de transcriptasa reversa (12,5 U; MMLV, Ecogen, SRL). A cada
tubo con muestra se le añadió 15,5 µL de la mezcla de RT y se completó hasta 50 µL con agua
DEPC (dietilpirocarbonato). Toda esta mezcla se
calentó a 37ºC durante 1 hora.
nistró a cada muestra 0,5 µL de EcoTaq polimerasa (2,5 U). El programa de PCR (termociclador
PTC-100, MJ Researches) fue 94ºC durante 5
segundos y 69ºC durante 1 minuto, 40 ciclos; y
72ºC durante 7 minutos, 1 ciclo. Los productos de
la reacción fueron analizados por electroforesis en
geles de agarosa al 1,5%, con solución Tris-acetato-EDTA a 90 V. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta
en un transiluminador (Fotodyne UV21).
Control de la PCR: El mRNA de la ß-actina, una
proteína expresada por las células prostáticas, se
utilizó como control endógeno externo de la RT,
para demostrar la integridad de la extracción del
RNA y que la PCR realizada en el tubo de muestra
se había llevado a cabo5. Para la PCR se emplearon cebadores obtenidos a partir de la secuencia
conocida del cDNA de esta molécula. Los cebadores utilizados fueron:
5' CTACAATGAGCTGCGTGTGG
3' AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC
El fragmento de PCR obtenido con estos cebadores es de 528 pares de bases (pB), y comprende
la secuencia desde las posiciones 311 a 838 del
cDNA de la ß-actina (GenBank). Las condiciones
de RT-PCR fueron las anteriormente descritas.
Para controlar la presencia de falsos positivos
se realizó de manera paralela una RT-PCR a partir de la sangre de donantes femeninas sanas, en
las cuales no deben existir células sintetizadoras
de PSA, y se obtuvieron resultados negativos de
esta prueba en todos los casos.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Los
oligonucleótidos para PSA utilizados pertenecen a
regiones con una alta divergencia de secuencia
entre el cDNA de PSA y el cDNA de la kalikreína
humana tipo 2 (hK2), los cuales presentan una
elevada homología.
Los cebadores o primers utilizados fueron:
5' PSA TTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGT
3' PSA TGGTCACCTTCTGAGGGTGAACTTGC
Los cDNA para PSA y hK2 difieren en 10 posiciones dentro de la secuencia 5', y 9 posiciones
dentro de la 3'. Los cebadores utilizados pertenecen a diferentes exones del gen del PSA. Así, se
puede asegurar fácilmente la contaminación por
DNA genómico, el cual rendiría productos de
mayor tamaño. El fragmento de PCR obtenido con
estos cebadores, es de 460 pares de bases (pb) y
comprende la secuencia desde las posiciones 110
a 569 del cDNA PSA (GenBank M21895).
La PCR fue realizada en un volumen de 25 µL
con 10 µL del cDNA obtenido por RT. Se preparó
la siguiente mezcla de PCR; 5,35 µL para cada
muestra: 2,5 µL de buffer PCR 10x; 0,75 µL de 50
mmol/L de MgCl 2 (concentración final 1,5
mmol/L); 0,5 µL de una mezcla de dNTPs -deoxinucleótidos trifosfato- (Ecogen, SRL) a una concentración 12,5 mmol/L; y 10 pmol de cada primer por reacción. Para asegurar la unión específica de los primers a su secuencia complementaria en el cDNA, y evitar que la DNA polimerasa
amplifique secuencias inespecíficas que se pueden originar a bajas temperaturas, se utilizaron
condiciones hot-start (80ºC durante 3 minutos).
Una vez transcurrido el primer minuto se admi-
Verificación del producto de la PCR: A 10 µL del
producto de la PCR se le añadieron 2 µL del tampón de reacción (10X) de la enzima Cla I y 1 µL de
la enzima Cla I (New England BioLabs, MA, USA).
La mezcla de reacción fue incubada a 37ºC durante 2 horas, y los productos resultantes se analizaron mediante electroforesis en el gel de agarosa al
2% con solución Tris-acetato-EDTA a 90 V.
Determinación del límite de detección: Para
determinar el límite de detección (LD) del ensayo
de PCR se añadieron células LNCaP a células
mononucleares, en una relación de 500, 100, 50,
10 y 1 células LNCaP por 106 células mononucleares de sangre periférica y 1 célula LNCaP por 107
células mononucleares, y se ensayó la RT-PCR
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5:104
1:104
5:105
1:105
1:106
CMSP
Conto positivo
Marcadores
para determinar el número mínimo de células
expresadoras de PSA. Además, para comprobar el
LD del procedimiento completo se añadieron 2-20
células LNCaP a 8 ml de sangre de donantes femeninas (teóricamente, negativa para PSA). Células
LNCaP confluentes fueron tripsinizadas, lavadas
y contadas con un hematocitómetro, realizándose
diluciones seriadas.
Todos los procedimientos de la RT-PCR se realizaron por triplicado antes de emitir cualquier valoración final.
Contol negativo
L. LLANES GONZÁLEZ, A. FERRUELO ALONSO, A. PÁEZ BORDA, Y COLS.
460 pb
RESULTADOS
FIGURA 3. Digestión del producto obtenido por PCR (PSA)
con Cla I. Línea 1: marcadores de DNA. Línea 2: PSA.
Línea 3: Digestión del PSA con Cla I.
momento actual, continuamos realizando experimentos para determinar si es posible disminuir el
límite de detección de esta técnica.
DISCUSIÓN
La RT-PCR es una técnica de biología molecular que permite la producción en cantidades detectables de DNA, a partir de pequeñas muestras de
RNA. Este método es muy apropiado para la detección de células que expresan un mensaje de interés, como puede ser el PSA en el caso del cáncer
de próstata.
En 1992, Moreno et al.6 y Vesella et al.7, iniciaron el uso de la RT-PCR para la detección de
células prostáticas circulantes, a imagen de lo que
se había venido haciendo desde 1987 en el campo
de otros tumores sólidos, como el melanoma8, el
neuroblastoma9, el hepatoma10 y el cáncer de
mama11. Desde entonces, se ha producido una fértil línea de investigación clínica en lo que se ha
denominado el estadiaje molecular del cáncer de
próstata.
Por el momento, la principal fuente de confusión es el papel de las células tumorales circulantes. Los experimentos en animales con tumores sólidos, han sugerido que entre el 1% y el
0,01% de las células cancerosas circulantes pueden crear un depósito metastásico único, porque
el resto de las células que escapan del tumor primario mueren en la circulación12. Debido a esta
PSA + Cla I
PSA
ß - Actna
Control negativo
Marcadores
Para establecer la especificidad de nuestra técnica de RT-PCR para la detección de células expresadoras de PSA, se utilizaron células de la línea
prostática tumoral humana LNCaP.
Mediante la técnica de la RT-PCR se amplificó el
fragmento de 460 pb correspondiente al PSA. Con
la digestión con la enzima de restricción Cla I, se
comprobó que el producto de la PCR (PSA 460) era
el fragmento esperado, ya que se obtuvieron las dos
bandas de 220 y 240 pb esperadas. De esta manera, se confirmó que el producto amplificado por PCR
se correspondía con el fragmento de 460 pb (Fig. 2).
El límite de detección más bajo alcanzado con
la técnica descrita anteriormente, ha sido el de 1
célula sintetizadora de PSA por 106 células mononucleares de sangre periférica (Fig. 3). En el
460 pb
240 pb
220 pb
FIGURA 2. Límite de detección de la RT-PCR, mostrada por
electroforesis en geles de agarosa del producto de amplificación DNA después de suplementar células mononucleares de sangre periférica con LNCaP.
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ineficacia metastásica de los tumores, se cree que
los tumores primarios deben alcanzar un tamaño
crítico y/o una tasa de crecimiento que le permita liberar las suficientes células en la circulación
para continuar con el siguiente paso de la cascada de las metástasis. La mayoría de las metástasis clínicas aparecen cuando los tumores alcanzan un volumen de 1 cc, o lo que es lo mismo 109
células13. Como causas de esta elevada mortalidad de las células tumorales circulantes se han
propuesto varios mecanismos:
– Fuerzas mecánicas de cizallamiento.
– Pérdida de adhesión al sustrato.
– Toxicidad del oxígeno.
– Destrucción por células NK (natural killer) del
huésped.
Las pruebas diagnósticas disponibles en la
actualidad para la detección de metástasis
(tomografía axial computerizada, resonancia
nuclear magnética con coil endorrectal, ecografía transrectal o histología de muestras de biopsia) son capaces de detectar grandes masas
tumorales, pero tienen una menor sensibilidad
para la detección de pequeños focos de enfermedad extraprostática. Este intento de identificación de la enfermedad metastásica en su
comienzo, fue el eje fundamental sobre el que se
guió la aplicación de la RT -PCR en cáncer de
próstata. Por otro lado, el mensaje a identificar
más apropiado era el PSA porque es un marcador órgano-específico, aunque no cáncer-específico.
En experimentos animales, el número final de
metástasis se ha demostrado que es proporcional al número de células tumorales circulantes,
pero la mejor correlación se encontró con los grupos de células tumorales. Por todo lo dicho hasta
ahora, podría creerse que una vez alcanzada la
población tumoral crítica del tumor primario,
cualquier neoplasia tiene capacidad metastatizante, sin embargo para que ésto se produzca es
necesario que además las células aumenten su
grado de malignidad14.
Esta nueva aproximación al diagnóstico del
cáncer de próstata es totalmente novedosa, y por
el momento no existen conclusiones definitivas
a favor o en contra de su utilización. De demostrarse finalmente su valor, supondría un paso
adelante en la identificación de pacientes poten-
cialmente metastásicos al diagnóstico, y una
herramienta de ayuda en el estudio de la capacidad metastatizante de los tumores malignos de la
próstata.
CONCLUSIONES
1. La RT-PCR es una técnica de un alto grado
de sensibilidad, que permite la detección de un
pequeño número de células productoras de PSA
en sangre periférica, como se ha descrito en trabajos anteriores.
2. Esta técnica es de gran aplicación en el
campo de la uro-oncología básica, siendo una
herramienta de extraordinarios resultados para la
detección de células prostáticas circulantes en
pacientes con cáncer de próstata.
3. El valor de la detección de células tumorales
circulantes en el pronóstico de los pacientes tumorales en general y de los afectos por cáncer de próstata en particular, es una de las grandes incógnitas en el estudio de la biología de las metástasis.
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Dr. L. Llanes González
Servicio de Urología
Hospital Universitario de Getafe
Ctra. Toledo km. 12,500
28905 Getafe (Madrid)
(Trabajo recibido el 7 Julio de 1999)
292