utilidad de la prueba b-lactamasa

Rev. Méd. Hosp. Nal•.Niños Costa Rica 18 (1): 51- 56, 1983
UTILIDAD DE LA PRUEBA DE ,B-LACTAMASA
Dra. Carmen Brenes* y Dra. Cecilia Lizano*
INTRODUCCION
Dentro de la problemática del aumento de resistencia bacteriana a los antimicrobianos toma cada vez más importancia la creciente aparición de cepas de Stapl!Y..;
lococcus aureus de Hemop'hilus influenzae y de Neisseria gonorrhoeae resistentes
a la penicilina y' de Hemop'hilys influenzae resistentes a ampicilina (1,5,6, 7,8,9,
11,13,14,15,16,17).
Es parte primordial de este problema la gran diferencia en los reportes de sensibilidad según el método que se utilice; si se usa la dilución en agar se obtiene entre 40
y 60 % de cepas de ,S. aureus sensibles a la penicilina pero con el método de difusión del disco esa sensibilidad puede ser de 10% o menos (3).
Estos hechos obligan a corroborar la resistencia mediante la demostración de la presencia de j3-lactamasa, para lo cual existen varías métodos cuya utilidad tratamos
de demostrar, especialmente para su aplicación en el trabajo bacteriológico de
rutina.
MATERIAL Y METODOS
Se empleó el método de Bawer et al. (2) para la sensibilidad con disco; caldo nutritivo más sangre de conejo al 2 % para la sensibilidad de H.. tDfluenza~ yl~L 9QD.Q.:
rrhoeae por dilución en tubo y dilución en agar modificado, usando agar chocolate.
(4). Para la determinación de la actividad .B-Iactamasa se usaron los métodos acidimétrico y yodimétrico (10, 12, 18, 19).
Se analizó la sensibilidad de 260 cepas de S' aureu~ por los métodos de difusión, y
dilución en agar y determinación de le actividad penicilinasa, con el fín de establecer la relación entre la reacción a la penicilina y su actividad)3-lactamasa. En
72 cepas de H.influenzae, 45 de bl... gooprrhoe.aJ!, 6 de !!l. meningitidi~ y 1 de~.
flavescens se estudió la relación entre la reacción a la ampicilina y la actividad Blactamasa. Se usó para control la cepa $. aureus ATCC-6538.
METODO YODIMETR ICO
Una solución de 10.000 u/mi de penicilina G" se prepara fresca y de distribuye en
alícuotas de 0,5 mi en tubos pequeños. La bacteria se remueve de un cultivo de 18
a 24 horas de incubación y se suspende en la solución de penicilina para una densidad de 10 6 - 10 9 células (turbidez marcada). Se deja en reposo 1 hora a temperatura ambiente, se añaden 2 gotas de una solución de almidón recién preparada (contiene 1 gramo en 100 mi de agua destilada) y una gota de una solución de yodo. Se
mezcla vigorosamente por 1 minuto. Se llevan 3 controles; uno positivo y dos negativos (uno desde el principio y otro al final de la hora) {12, 19).
* Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera". San José, Costa Rica.
51
52
REVISTA MEDICA HOSPITAL NP.CIONAL DE NII'iIOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA
Si la penicilina fue hidrolizada por la .B-Iactamasa la decoloración se produce rápidamente. Los tubos control negativos se usan para demostrar la hidrólisis espontánea del almidón. Al agregar el yodo se desarrolla el color azul característico de la
reacción con el almidón. Si el color persiste por más de 10 minutos constituye una
prueba negativa e indica que las moléculas de penicilina no experimentaron rompimiento del anillo lactámico.
METODO CON TIRILLAS
Se saturan tiras de papel filtro de 5 mm de ancho con una solución que contiene
0,2 % de almidón soluble y 1 % de penicilina G en agua. Las tirillas se dejan secar
a temperatura ambiente, se protegen con papel estaño y se guardan en refrigeración
en un recipiente adecuado con desecante.
Al momento de usar, la tirilla se cubre con lugol para la tinción de Gram y se elimina el exceso de líquido. Se recogen aproximadamente 2 a 5 colonias y se aplican
en una área de 5 mm sobre la tirilla. La producción de penici linasa se evidencia por
el cambio de color púrpura a blanco en un tiempo de 1 minuto (18).
METODO ACIDIMETRICO
Se prepara una solución que contiene 250 mg/ml de ampicilina con rojo fenol al
0,05 % en agua; se ajusta a pH 8,0. Esta solución se absorbe en un capilar hasta
producir una columna líquida de 2 cm de altura. La bacteria se remueve de un
cultivo de 18 ·24 horas y se inocula en la columna de ampicilina usando un inóculo
aproximado de 10 7 bacterias. El tubo se sella con plasticina y se incuba a 37 OC por
1 hora. Se lleva un control positivo y otro negativo. Si hay producción de ,a-Iactamasa la bacteria causa un rápido cambio de color que ocurre a pH 6, 8 al producirse
acumulación de ácido penicílico (12, '18).
RESULTADOS
De 260 cepas de S. aureus 243 (94 % ) fueron resistentes a la penicilina usando el
método de difusión con discos. Por el método de dilución en agar 40 (15,4% ) fue·
ron resistentes a concentraciones 2 1,25 u/mi; 150 (57,6 % ) intermedias a 0,6 u/mi
y 70 (26,9% ) sensibles a ~ 0,3 u/mi, Cuadro 1.
De las cepas sensibles a .s: 0,3 u/mi el 71,4 % no presentaron actividad J3-lactamasa
y el 75 % de las cepas resistentes a ~ 1,25 u/mi presentaron dicha actividad. Esto
significa que un 28,6 % de las cepas que se reportaron sensibles tenían actividad
,B-Iactamasa y que un 25 % de las que se tomaron como resistentes no tenían dicha
actividad. Cuadro 2.
CUADRO 1
DISTRIBUCION DE LAS 260 CEPAS DE
SEGUN SU SENSIBILIDAD
~.
AUREUS
Reacción
R (~1 ,25 u/mI)
I (0,6 u/mil
S (S 0,3 u/mI)
No. cepas
40 (15,4010)
150 (57,6%)
70 (27%)
260 (total)
53
Brenes, C. y Lizano, C.: UTILIDAD DE LA PRUEBA DE B·LACTAMASA
CUADRO 2
RELACION ENTRE SENSIBILIDAD Y ACTIVIDAD J3-LACTAMASA
DE 260 CEPAS DE S. AU REUS
No.
CEPAS
REACCION A LA
PENICILINA
ACTIVIDAD
POSITIVA
%
No.
/3- LACTAMASA
NEGATIVA
No.
%
40
Resistente
30
75
10
25
150
Intermedia
94
62,7
56
37,3
Sensible
20
28,6
50
71,4
70
CUADRO 3
RELACION ENTRE RESISTENCIA Y ACTIVIDAD 8-LACTAMASA
No.
Cepas
Método
REACCION A LA AMPICILINA
Sensible
Intermedia
Resistente
72
Difusión
en agar
69 (95,8)*
54
Dilución
52 (96,3)
1 (1,4)
Actividad J3-lactamasa
Positiva
Negativa
2 (2,8)
2 (2,S)
70 (97,2)
2 (3,7)
2 (3,7)
52 (96,3)
* Entre paréntesi$ porcentajes de susceptibilidad.
En el Cuadro 3 se resume el resultado de la sensíbi lidad de 72 cepas de J:l. influenzae tipo b aisladas de líquido cefalorraquídeo o sangre. Con el método de difusión
modificado el halo de inhibición a la ampicilina varió entre 26-41 mm en 69 cepas
todas J3-lactamasa negativas. Dos cepas resistentes, con un halo de inhibición de O y
16mm respectivamente y positiva la ~-Iactamasa y una intermedia con halo de
25mm no produjo penicilinasa. Por dilución en tubo se probaron 36 cepas obteniéndose 100 %de sensibilidad con una MIC entre 0,6 y °115 ug/ml. Por dilución en
agar se hizo a 54 cepas de las que 52 fueron susceptibles {~ 0,3 ug/ml.l.
Se hizo prueba a 45 cepas deN. gonorrhoeae "aisladas de secreción vaginal u ocular.
Con el método de difusión en 44 el halo de inhibición a penicilina varió entre 22 y
40 mm. y la actividad J3-lactamasa fue negativa. Sólo una cepc! fue resistente y con
.B-Iactamasa positiva. Se trabajaron 6 cepas de N. menin9itidi~ todas sensibles y no
productoras de ~-Iactamasa.
COMENTARIOS Y CONCLUSIONI
El H. influenzae tipo b es un clásico ejemplo de un patógeno ampicilina sensible que
se vuelve resistente. El mecanismo de resistencia involucra la inactivación de la ampicilina por J3-lactamasa y la información genética, la cual implica la síntesis de esta
enzima que pudo haber sido introducida como una unidad de otro organismo, por
ejemplo por transferencia de un plásmido de una bacteria Gram-negativa, productora de ella. Las propiedades del plásmido tienden a ser inestables en algunos aislamientos por pérdida espontánea del fragmento cromosomal. Hay estabilidad gené-
54
REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA
tica en la producción de la enzima, propiedad que se ha demostrado haciendo numerosos subcultivos y probándola cada vez; es por lo tanto una propiedad estable,
permanece asociadél a la célula, está en un sitio accesible, y se inicia cuando una
suspensión densa de la bacteria intacta se mezcla con la penicilina.
Es importante hacer notar que la prueba de difusión usando discos o tabletas de
ampicilina sobre medio de agar puede indicar resistencia en cepas susceptibles;
con medio reforzado con los requerimientos de crecimiento de H. influenzae yl'\!.
gonorrhoeae, se necesita cuidadosa estandarización y no ha sido ampliamente estudiado. El método de dilución en tubo es menos conveniente y también requiere
control preciso del ¡náculo; el uso de caldo nutritivo reforzado con sangre de conejo
es un medio ligeramente turbio que entorpece la lectura final. El método de dilución en agar chocolate y concentraciones de ampicilina de 2,5; 1,25; 0,6; y 0,3
ug/ml nos permitió demostrar que de Jas 72 cepas de H. influenzae analizadas 60
eran sensibles (~ 0,3 ug/mll a la ampicilina, ninguna productora de ,B-Iactamasa; 2
fueron resistentes (~ 5 ug/mll y tenía actividad ~-Iactamasa. Este método es también seguro y hace menos dificultosa la medida de la susceptibilidad de ~º­
.rrhoeae a la penicilina.
Cabe insistir que un 28,6 % de las cepas de S~ureus consideradas sensibles a la penicilina tienen actividad J3-lactamasa así como un 25%delas resistentes no la manifiestan; debe, pues, ponerse atención a este fenómeno y correlacionar la prueba de
sensibilidad con la actividad enzimática.
El método yodimétrico con tiritas resultó ser el más econámico porque el material
preparado se conserva en perfectas condiciones en refrigeración hasta por 6 meses.
RESUMEN
Se demostró la necesidad de determinar la acti'vidad ~-Iactamasa. de cepas de Staphylococus aureus, Haemophilus influenzae y Neisseria relacionándola con su sensibilidad a peniciliana yampicilína.
Se trabajó con 260 cepas de S. aureus, 72 de H. influenzae tipo b, 45 de N gonorr·
hoeai!,6 de N. meningitidis y 1 de N. flavescens, todas aisladas en pacientes internados y de consulta externa del Hospital Nacional de Niños, "Dr. Carlos Sáenz He·
rrera", en los años 1981 y 1982.
Se mencionan los medios más adecuados para las pruebas de sensibilidad. También
se describen los métodos yodimétrico en tubo y con tirillas, y el acidimétrico para
,B-Iactamasa y se demuestra que son sencillos y fáciles de realizar e interpretar, económicos porque se pueden llevar a cabo con reactivos que se consiguen en todo laboratorio y no requieren aparatos especiales.
El método yodimétrico con tirillas resultó ser el más económico porque el material
preparado se conserva en perfectas condiciones en refrigeración hasta por 6 meses.
El procedimiento confirmó la resistencia a la penicilina y ampiciHna de una cepa de
gonorrhoea~, una de,.N. flavescens y una de H. influenzae. tipo b que son las 3
primeras cepas descritas en el país, con actividad ¡J-Iactamasa comprobada.
!'l.
SUMMARY
The importance of the ~ lactamase determination and its relation with the sensiti·
vity of S. aureus, H. influenzae and Neisseria to penici:lin and ampicillin, is pointed
out.
Brenes, C. y Lizano, C.: UTILIDAD DE LA PRUEBA DE B·LACTAMASA
55
This study was perfomed with 260 strains of S. aureus, 75 of H. influenzae type B,
45 of N. gonorrheae, 6 of N. meningitidis and 1 of N. flavescens all them isolated
from patients at National Children's Hospital, during 1981 and 1982.
The laboratory methods for sensitivíties and ¡3 lactamasa are evaluated and recommended for routine work. The iodimetric strip method is mentioned as simple
and economical.
The used procedure confirmed the first report in Costa Rica of resistence of
sseria strains and 1 H. influenzae type b to penicillin and ampicíllin.
2~­
BlBLlOGRAFIA
1.
Araya, O. P, Reis, E. et al. Epjdemiology and treatment of gonorrhoeae caused
by penicillinase-producing strains in Liverpool. Brit. J. Ven. Dis. 54:28,
1978.
2.
Bauer, A, Kirby, W. et al. Antibiotic susceptibility testing by a standaridized
single dish method. Amer. J. Cljn. Pathol. 45: 483, 1976.
3.
Balows, A. Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos. Ed. Med. Pan. 62,
1976.
4.
Brenes Carmen, Patricia Rivera & Idis Faingezicht. Neisseria gonorrhoeae
penicilina resistente, J3-lactamasa positiva. Primer caso descrito en Costa
Rica en prensa.
5.
Dillon,J,A, Duck,P, Thomas DJ. Molecular and phenotypic characterization
of Penicilljnase·producing Neisseria gonorrhoea from Canadian Sousas. Anti·
microb. Agents Chemother. 19: 952, 1981.
6.
Doughertz,1; J, Koller¡A.E.& Tomasz.A. Penicillin-binding proteins of penicilIin susceptible and intrinsically resistant Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob.
Agents Chemother. 18: 730,1980.
7.
Embden,I.D, Klingeren,AV et al. Penicillinase producing Neisseria gonorrho·
eae in the Netherland epidemiology and genetic and molecular characteriza·
tion of their plasmids. Antimicrob. Agents Chemother, 18: 789, 1981.
8.
Hampton.K,D, Stalling,R,A,& Wasilauskar,B.L. Comparison of slide coaglutination technique with the Miniteck System for confirmation of N. gonorrhoeae. J. Clin. Microbio!. 10:29, 1979.
9.
Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology. 3era.
Ed. Washington D.C. 1980.
10.
Morbity and Mortality Weekly Report. Penicillinase-producing Neisseria 90.
norrhoeae 28:85, 1979.
11.
Munro¡ R, Mallon.R & Daley. D. Use of intralactam for detection of J3-lactamase production by Neisseria gonorrhoeae. J. Clin. Pathol. 33: 508, 1980.
12.
Perine, p. L, Schella W et al. Evidence for two distinct types of penicillaseproducing Neisseria gonorrhoeae. Lancet 2: 993, 1977.
13.
Phillíps.l. ,B-Iactamase·producing,. penicillin resistant gonococcus. Lancet 2:
656, 1976.
56
REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NI"IOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA
14.
Semana Epidemioiógica. Ministerio Salud Pública Costa Rica 5:50, 1977.
15.
Shtibel, R.: Non-Beta-Iactamase producing Neisseria gonorrhoeae highley resistant to penicillin. lancet. 5:39, 1980.
16.
Siegel/M S, Thornsberry. C et al. Penicillinase-producing Neisseria gonorrho·
eae: results of surveillance in the United States. J. Infect. Dis 137: 170,
1978.
17.
Thornsberry,C. Rapid Laboratory test for ,B-Iactamase production by bacteria. Technical Improvement Service. Amer. Soco Clin. Pathol. 79, 1976.
18.
Wesley, C. lodometric Detection of Haemophilus influenzae j3-lactamase. Rapid Presumptive test for Ampicillin Resistance. Antirnicrob. Agents Chemother. 7: 270, 1975.