Acidos nucleicos

r
Acidos
nucleicos
ESQUEMA
17.1 ONA
Estru ctura del ONA naturaleza de las mutaciones
Estructura del ONA del Jél rdín de Mende l a
Watso n y Cri ck
Estructura del ONA varia ciones sob re un tema
Su perenrollami ento del ONA
Cromoso mas y cromatin a
Estructura de l genoma
17.2 RNA
RNA de tra nsferencia
RNA ri bosoma l
RNA mensajero
RNA 110 cod ificado r
17.3 VIRUS
Ica que se requiere para
r los procesos vitales está
ificada en la estructura molecular
DNA. En los organismos eucariotas
mayoria del DNA está densamente
paquetado en cromosomas
piejos dentro del núcleo.
625
626
CAPíTULO DIECISIETE
Ácidosnucleicos
Sinopsis
LA DETERMINACiÓN DE LA ESTRUCTURA DEL ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO POR
JAMES WATSON y FRANCIS CRICK EN LOS PRIMEROS AÑOS DE LA DÉCADA DE 1950 FUE
la culminación de una investigación que había comenzado casi un siglo antes.
Las consecuencias de su fundamental trabajo se están desplegando mientras la
información genética de diversos organismos, incluido el ser humano, se revela de
forma gradual. La estructura y el funcionamiento asombrosamente complejos del
DNA y de su compañero, el RNA, continúan fascinando a los investigadores y a los
estudi antes.
D
urante incontables siglos, los seres humanos han observado los patrones de herencia sin entender los mecanismos que transmiten de los padres a la progenie
los rasgos físicos y los procesos del desarrollo. Muchas culturas humanas han
utilizado estas observaciones para mejorar sus condiciones económicas, como en la
crianza de los animales domésticos o en los cultivos . La investigación científica de
la herencia, que en la actualidad se denomina genética, no empezó hasta el siglo XIX.
Al comienzo del siglo XX, los científicos comenzaron a admitir de forma generalizada que los rasgos físicos se heredan en unidades discretas (que después se denominaron genes) y que los cromosomas del interior del núcleo son los depositarios de la información genética. Al final, se elucidó la composición química de los cromosomas
y (tras muchas décadas de investigación) se identificó el ácido desoxirribonucleico
(DNA) como el portador de la información genética. En los decenios que siguieron al
descubrimiento de la estructura del DNA por James Watson y Francis Crick en 1953
(Fig. 17.1), emergió una nueva ciencia. La biología molecular se dedica a la investigación de la estructura de los genes y al procesamiento de la información genética.
Utilizando las tecnologías desarrolladas por biólogos moleculares y bioquímicos, los
investigadores de las ciencias de la vida han estudiado los procesos por los cuales
FIGURA 17 . 1
El primer modelo estructural completo
del DNA
Cuando James Watson (izquierda) y Francis
Crick desc ubrieron en 1953 la estructura
del DNA utilizando los datos de Rosalind
Franklin , eran estudiantes de investigación
en el Laboratorio Henry Cavendi sh de la
Universidad de Cambridge.
Sinopsis
los seres vivos organizan y procesan la información genética. Este trabajo ha revelado los siguientes principios.
1. El DNA dirige el funcionamiento de las células y se transmite a la progenie. Consiste en dos cadenas polinucleotídicas que forman una doble hélice
(Fig. 17.2). La información contenida en el DNA está codificada en la forma
de la secucncia de bases púricas y pirimídicas (véase la Figura 14.23). Un
gen es una secuencia de DNA que contiene la información (en una secuencia
de bases) necesaria para codificar un producto génico (un polipéptido o uno de
varios tipos de moléculas de RNA) y secuenci as reguladoras que controlan la
generación del producto génico. A la secuenci a completa de bases de DNA de
un organismo se le conoce como genoma. La síntesis de DNA, que se denomina replicación, implica el apareamjento complementario de las bases púricas y pirimídicas de las dos cadenas polinucIeotídicas que forman la hélice de
DNA. El funcionamiento fisiológico y genético del DNA requiere la síntesis
de copias relativamente libres de errores. En consecuencia, la mayoría de los
organismos emplean varios mecanismos de reparaoión del DNA.
2. El mecanismo por el cual se descodifica la información genética y se utiliza
para düigir los procesos celulares comienza con la síntesis de otra clase de
ácido nucleico, el ácido ribonucleico (RNA). La síntesis de RNA, llamada
transcripción (Fig. 17.3a), implica el apareamiento complementario de las
bases de los ribonucIeótidos con las bases de una molécula de DNA. Cada molécula de RNA recién sintetizada es un transcrito. El término transcriptoma
designa el conjunto completo de moléculas de RNA que se transcriben a partir
del genoma de una célula.
3. Varios tipos de RNA participan directamente en la síntesis de las enzimas,
de las proteín as estructurales y de otros polipéptidos necesarios para generar
todas las demás biomoléculas que intervienen en el funcionamiento del organismo. La secuencia de bases de cada RNA mensajero (mRNA) especifica la
secuencia primaria de un polipéptido particular. Las moléculas de RNA ribosomal (rRNA) son componentes de los ribosomas. Cada molécula de RNA de
transferencia (tRNA) está unida de modo covalente a un aminoácido específi-
o
3.3 nm
(33Á)
H
o
o
e en la cadena de éster-fosfato
e y N en
las bases
O p
i. - -i
' 2.4 nm .
(24Á)
(a)
(b)
F IGURA 17 . 2
Dos modelos de la estructura del DNA
(a) La doble hélice del DNA se representa co mo una esca lera en espiral; ésta es la conformación propuesta originalmente
por Watso n y Crick y ahora co nocida co mo DNA B. (Las propiedades estructurales de las tres formas de DNA pueden
verse en el Cuadro 17.1 , más adelante.) Los lados de la escalera represe ntan los esqueletos azúcar- fosfato. Los peldaños
representan los pares de bases. (b) En el modelo espacial. los esq ueletos azúcar-fosfato están representados por esferas
coloreadas. Los pares de bases constan de disposiciones horizontales de esferas azul oscuro. Los surcos mayor y menor
se crean al enrollarse las dos cadenas una alrededor de la otra.
627
628
CAPíTULO DIECISIETE
Ácidosnucleicos
Transcripción
Citoplasma
Rililonuc!eótidos
(a)
Traducción
Citoplasma
RNA de transferencia
(b)
FIGURA 17 .3
Panorama general del flujo de información genética
La información genética conten ida en el DNA es convertida en la secuencia lineal de aminoácidos de polipéptidos en un proceso en dos fases. Durante la
trallscripción (a) , se sintetizan moléculas de RNA a partir de una cadena de DNA mediante apareamiento de bases complementarias entre las bases del
DNA y las bases de moléculas de ribonucleósidos trifosfatados libres. Durante la segunda fase, llamada traducción (b) , las moléculas de rnRNA se unen
a ribosomas constituidos por rRNA y proteínas ribosomales. Comp lejos RNA de transferencia-aminoacilo colocan la carga de aminoácidos en el sitio
catalítico del interior del ribosoma, en un proceso que implica el apareamiento de bases complementarias entre los tripletes de bases de mRNA llamados
codones y tripletes de bases de tRNA llamados anticodones. Cuando los aminoácidos se colocan de manera correcta dentro del sitio catalítico, se forma
un enlace peptídico. Después de que la molécula de mRNA se mueve respecto al ribosoma, un nuevo codón ingresa en el sitio catalítico de éste y aparea
sus bases con las del anticodón apropiado en otro complejo aminoacilo-tRNA. Cuando un codón de terminación apropiado en el mRNA enU'a en el sitio
catalítico, el poÍipéptido recién formado se libera del ribosoma.
171 DNA
co y lo entrega al ribosoma para su incorporación en una cadena polipeptídica.
La síntesis proteínica, llamada traducción (Fig. l7.3b), OCUlTe dentro de los
ribosomas, las máquinas moleculares de ribonuc\eoproteínas que traducen las
secuencias de bases de los mRNA en las secuencias de aminoácidos de los
polipéptidos. El conjunto completo de proteínas sintetizadas por una célula
recibe el nombre de proteoma.
4. La expresión génica es el conjunto de mecanismos por los cuales las células
controlan en términos temporales la síntesis de productos génicos en respuesta
a scñales ambientales o del desarrollo. Un vasto grupo de proteínas, llamadas factores de transcripción, y de moléculas de RNA, llamadas moléculas de
RNA no codificador (ncRNA), regulan la expresión génica cuando se unen a
secuencias de DNA específicas. El término metaboloma se refiere a la suma
total de todas las moléculas de metabolitos de bajo peso molecular producidas
por una célula como resultado de su patrón de expresión génica.
El flujo de información genética puede resumirse en la siguiente secuencia, llamada dogma central:
.
GA ----.
RNA ----.
Proteína
Este diagrama ilustra que la información genética codificada en las secuencias de
bases de DNA fluye del DNA, una molécula que se replica a sí misma durante la
división celular (como lo indica la flecha circular), al RNA, que especifica la estructura primaria de las proteínas. Como se conc\pió en un principio, el dogma central
afirmaba que la información genética fluía en una sola dirección: del DNA al RNA y
a las proteínas. Sin embargo, hace algunos años se descubrió una importante excepción al dogma central. Algunos de los virus que poseen genomas de RNA también
tienen una actividad enzimática que se denomina transcriptasa inversa. Una vez que
uno de estos virus ha infectado una célula hospedadora, la transcriptasa inversa copia
el RNA vírico para formar una copia de DNA. El DNA vírico se inserta entonces en
un cromosoma del hospedador. Un ejemplo de tales virus es el VIH, que se expone
en el recuadro Bioquímica en perspectiva titulado "Modos de vida" víricos (págs.
665 a 670).
El Capítulo 17 se centra en la estructura de los ácidos nuc\eicos. Comienza con
una descripción de la estructura del DNA y las investigaciones que condujeron a su
descubrimiento. A continuación se presenta una discusión del conocimiento actual
de la estructura del genoma y de los cromosomas, así como la estructura y las funciones de las diversas formas de RNA. El capítulo termina con una descripción de los virus, complejos macromoleculares (formados por ácido nuc\eico y proteínas) que son
parásitos celulares. En el Capítulo 18 se consideran varios aspectos de la síntesis y de
las funciones de los ácidos nuc\eicos (Le., replicación y transcripción del DNA). Las
estrategias y las técnicas que se utilizan en general para aislar, purificar, caracterizar
y manipular los ácidos nuc\eicos se describen en los recuadros Métodos bioquímicos
de los Capítulos 17 y 18 (Métodos de investigación de los ácidos nuc\eicos, págs. 653
a 657 , y Genómica, págs. 700 a 707) .
17.1
DNA
El DNA está formado por dos cadenas polinuc\eotídicas enrolladas una alrededor de
la otra para formar una uoble hélice uextrógira (Fig. 17.2). La estructura del DNA es
tan característica que con frecuencia a esta molécula se le denomina la doble hélice.
Como se ha descrito (en las Secciones 1.3 y 14.3), cada monómero nucleotídico del
DNA está formado por una base nitrogenada (púrica o pirimídica), un azúcar desoxirribosa y fosfato. Los mononuc\eótidos están unidos mediante enlaces 3' ,5' -fosfodiéster. Estos enlaces unen el grupo hidroxilo 5' de la desoxirribosa de un nuc\eótido
con el grupo hidroxilo 3' del azúcar de otro nucleótido mediante un grupo fosfato
629
630
CA P íTU LO DIE C I SIETE
Ácidos nucleicos
H
"-/
N
_
H
A
H- {Nt i
I~
'
0=¡-OCH 2
N
O
N
H
O
H,C~N/H
0-
T
H)lN~O
o=t-o~
c,
HJN~N/H
O
O
O
0-
G
~R~
/
N
N
N
\
H
I
O
H
I
0 = P-
H
"'-/
O
0-
Estructura de una cadena de DNA
En cada cadena de DNA los residuos de
desox irribonuc\eótidos están conectados entre
sí medi ante enlaces 3' ,5 ' -fosfodi éster. La
secuencia de la secci ón de la cadena que se
representa en esta fig ura es S'-ATGC- 3' .
H
H~
I
Enlace
fosfodiéster
FIGURA 17 .4
OCH 2i
O
I
H
Jl-l
N
O
e
Q
0=¡-OC
0-
O
2
3'
OH
extremo 5'
Bases
extremo 3'
C
~O
"",",,",,'
0-
_
O
O~ I
/ -0
FIGURA 17 . 5
Estructura del DNA
O
En este seg mento corto de DNA se muestran
las bases e n color naranj a y los azúcares en
co lor azu l. Cada par de bases se mantiene
unido por dos o tres enlaces de hidrógeno.
Las dos cadenas de polinucleótidos son
anti paralelas . El orden de las bases de una
cadena determ ina el orden de las bases de la
otra debido al apareamiento de bases.
o»
0p
O
~~
-
O~/
O~/ O
6~
C
.,,'.'
O
G
extremo 5'
\--=-
/
~
O
G
O
O
IIIIIIIIIIII
11111111111/
0\
IIIIIIIIIIII
O
P=O
l
"nnnn,,~
/ \ _
1111111111111
O
O O
O
T
A
G
-_-:'
IIIIIIIIIIIII~
~IIIIII///III
O
"-P-O
"'"
111//////////
O
C
~
O
_
O
P
\
I
Enlace de
hidrógeno
extremo 3 '
O
Azú car
_ Enlace
fosfodiéster
17.1 DNA
631
FIGURA 1 7. 6
Estructura del DNA: dimensiones de los
pares de bases AT y GC
Se forman dos enlaces de hidrógeno en
cada par de bases AT y tres en cada par
de bases Oc. Las dimensiones globales
iguales de ambos tipos de pares de bases
permiten la formación de conformaciones
helicoidales idénticas de las dos cadenas de
polinucleótidos.
¡ - - - -- - - - - 1 . 0 8 n m - - - - - - - - - 1
1--------1.08nm - - - - - - - - - 1
Hidrógeno
Oxígeno
Nitrógeno
Carbono
C'1 de la desoxirribosa
(Fig. 17.4). La orientación antiparalela de las dos cadenas polinucleotídicas permite
que se formen enlaces de hidrógeno entre las bases nitrogenadas que están orientadas
hacia el interior de la hélice (Fig. 17.5). Existen dos clases de pares de bases (bp) en
el DNA: (1) la adenina (una purina) se aparea con la timina (una pirirnidina) (par AT)
y (2) la purina guanina se aparea con la pirimidina citosina (par GC). Debido a que
cada par de bases es perpendicular al eje largo de la hélice, la estructura global del
DNA se parece a una escalera en espiral. Se han medido con precisión las dimensiones del DNA cristalino.
1. Una vuelta de la doble hélice abarca 3.3 nm y está formada por cerca de 10.3
pares de bases. (Los cambios de pH y de concentración salina afectan estos
valores ligeramente.)
2. El diámetro de la doble hélice es de 2.4 nm. Obsérvese que el espacio interior
de la doble hélice sólo es adecuado para el apareamiento de una purina y una
pirimidina. El apareamiento de dos pirimidinas crearía un hueco , y dos purinas no embonarían en el espacio interior de la doble hélice.
3. La distancia entre los pares de bases adyacentes es de 0.33 nm . En la Figura
17.6 se presentan las dimensiones relativas de ambos tipos de pares de bases.
Debido a que se adapta a su función de almacenamiento genético en los procesos
vitales, el DNA es una molécula relativamente estable. Varios tipos de interacciones
no covalentes contribuyen con la estabilidad de su estructura helicoidal :
1. Interacciones hidrófobas. La nube de electrones del anillo de la base Jr entre
las bases púricas y pirimídicas apiladas es relativamente no polar. El agrupamiento de los componentes de las bases de los nuc1eótidos dentro de la doble
hélice es un factor estabilizador en la macromolécula tridimensional debido
a que minimiza sus interacciones con el agua, aumentando de esta forma la
entropía global.
632
CAPíTULO DIECISIETE
~C~O~N~C=EP~T~O~C=l~A=V=E____~~~}~'~_~_"_~_'
El DNA es una molécul a rel ativamente estable
formada por dos cadenas antiparalelas de polinucleótidos enrolladas una alrededor de la otra
para formar una doble hélice dextrógira.
Ácidos nucleicos
2. Enlaces de hidrógeno. Los pares de bases tan próximos forman un conjunto
preferido de enlaces de hidrógeno, tres entre los pares GC y dos entre los pares AT. El efecto de "cremallera" acumulativo de estos enlaces de hidrógeno
mantiene las cadenas en la orientación complementaria conecta.
3. Apilamiento de bases. Una vez que las cadenas polinucleotídicas antiparalelas se han acercado mediante apareamiento de bases, el apilamiento paralelo
de las bases heterocíclicas casi planas estabiliza las moléculas debido al efecto
acumulativo de las fuerzas débiles de van der Waals.
4. Hidratación. Como en el caso de las proteínas, el agua estabiliza la estructura
tridimensional de los ácidos nucleicos. Las moléculas de DNA se unen a una
cantidad significativa de moléculas de H?O. El contenido de agua del DNA B,
la conformación que se ilustra en la Figura 17.2, es de -30% en peso. Las
moléculas de H?O se unen a grupos fosfato, a átomos de oxígeno de los carbonos 3' y 5' de la ribosa y a átomos electronegativos presentes en las bases
nucleotídicas. Cuando se mide en condiciones de laboratorio, cada nucleótido
de DNA B se enlaza a unas 18 o 19 moléculas de agua. Cada fosfato puede
unirse a un máximo de seis moléculas de agua.
5. Interacciones electrostáticas. La superficie externa del DNA, que se denomina esqueleto azúcar-fosfato, posee grupos fosfato con carga negativa. La
repulsión entre los grupos fosfato adyacentes, una fuerza potencialmente desestabilizadora, es minimizada por los efectos protectores del agua sobre cationes divalentes como el Mg 2 + y moléculas policatiónicas como las poliaminas
y las histonas (véase la pág. 645).
Descríbase la forma en la que contribuyen las diferentes clases de interacciones no
covalentes con la estabilidad de la estructura helicoidal del DNA.
PREGUNTA 17.2 &;:';;:~f¡'IIII ·" ",
Cuando se calienta el DNA, se desnaturaliza, es decir, las cadenas se separan debido
a que los enlaces de hidrógeno se rompen. Cuanto más alta sea la temperatura, mayor
será el número de enlaces de hidrógeno que se rompen. Tras revisar la estructura del
DNA, determínese cuál de las siguientes moléculas se desnaturalizará primero al
aumentar la temperatura. Justifíquese la respuesta.
a. 5' -GCATTTCGGCGCGTTA-3'
3' -CGTAAAGCCGCGCAAT-5'
b. 5'-ATTGCGCTTATATGCT-3'
3'-TAACGCGAATATACGA-5'
Estructura del DNA: naturaleza de las mutaciones
El DNA está perfectamente adecuado para el almacenamiento de la información. Sin
embargo, a pesar de sus diversas características estructurales estabilizadoras, el DNA
es vulnerable a varias clases de fuerzas peljudiciales. Las colisiones de solventes, las
fluctuaciones térmicas y otros procesos dañinos espontáneos pueden Oliginar mutaciones, cambios permanentes en la secuencia de bases de las moléculas de DNA.
Además, una extensa variedad de xenobióticos, tanto naturales como artificiales,
alteran la estructura del DNA. A continuación se dan varios ejemplos de factores
mutagénicos bien conocidos.
Como ya se ha descrito (Fig. 14.24), los cambios tautoméricos son alteraciones
espontáneas de la estructura de las bases de los nucleótidos que interconvierten los
grupos amino e imino y los grupos ceto y eno\. En general los cambios tautoméricos
afectan poco a la estructura del DNA. Sin embargo, si se forman los tautómeros durante la replicación del DNA, pueden producirse apareamientos de bases erróneos.
Por ejemplo, la forma imino de la adenina no se aparea con la timina, sino con la
citosina (Fig. 17 .7). Si no se corrige de inmediato este apareamiento, se produce una
17.1 DNA
H
NH
/
'\
\
/
HC
H-N
N
\ ~"
/
/j
N
N
'\
~CH
I
'\
N
C-
\C=j
N-C
/
H
~ C-C
HC-C
/j
/
A la
d~soxirribosa
H
A la desoxirribosa O
Citosina
H
!
Adenina (amino)
H
NH •••••• .• •. N
N
'\
/~CH
/
HC-C
C-C
I
/j
'\
/
\
/
\ C=N/
HC
'\
N········· HN
N-C
/
'\
A la desoxirribosa O
Citosina
N
C- \
A la desoxirribosa
H
Adenina (imino)
FIGURA 17 . 7
La desviación tautomérica produce una mutación por transición
Al experimentar la adenina una desviación tautomérica, su forma imino
puede aparearse con la citosina. La transición se presenta en la segunda
generación de la replicac ión de l DNA cuando la ·c itosi na se aparea con
la guanin a. De esta forma se sustituye un par de bases A-T por un par
de bases G-c.
mutación por transición debido a que durante el proceso de replicación se ha incorporado una citosina en una posición que le corresponde a la timina. En una mutación
por transición se sustituye una pirimidina por otra pirimidina, o una purina por otra
purina. Las mutaciones por transición son mutaciones puntuales, cambios de la secuencia de bases del DNA que involucran a un solo par de bases. En el ejemplo que
se describe, un par de bases AT es sustituido por un par de bases OC en la segunda
generación de la replicación del DNA.
Varias reacciones hidrolíticas espontáneas también dañan al DNA. Por ejemplo,
se ha calculado que todos los días se pierden varios miles de bases pú¡;cas del DNA
de cada célula humana. En las reacciones de despurinación se rompe el enlace Nglucosilo entre una base púrica y la desoxirribosa. La protonación del N-3 y del N-7
de la guanina estimula la hidrólisis. Si los mecanismos de reparación no sustituyen
el nucleótido de purina, se producirá una mutación puntual en el ciclo siguiente de
replicación del DNA. De modo semejante, las bases pueden desaminarse de forma
espontánea. Por ejemplo, el producto desaminado de la citosina se convie¡te en uracilo mediante un cambio tautomérico. Finalmente, lo que debería ser un par de bases
CO se convierte en un par de bases AT. (El uracilo tiene una estructura semej ante a
la de la timina.)
Algunos tipos de radiaciones ionizantes (p. ej ., los rayos UV, los X Y los gamma)
pueden alterar la estructura del DNA. Los niveles bajos de radiación pueden producir
mutaciones ; los niveles elevados pueden ser letales. El daño que induce la radiación,
producido por un mecanismo de radicales libres (bien por la extracción de átomos de
hidrógeno o por la creación de ·OH y de otras ROS), incluye roturas de las cadenas,
entrecruzamientos DNA-proteína (p. ej., a través de enlaces timina-tirosina), aperturas de los anillos y modificaciones de las bases. El radical hidroxilo, que se forma por
la radiólisis del agua, así como el estrés oxidativo (Sección 10.3), dan lugar a roturas
de las cadenas y a numerosas modificaciones de las bases (p. ej., timina glicol , 5-hidroximetiluracilo y 8-hidroxiguanina).
633
634
C:APíTULO DIEC:ISIETE
Ácidosnucleicos
o
?g~rH
~N/
O
H I
O
HOH'C'CrH
N
O
I
H
H
5-Hidroximetiluracilo
Timina glicol
8-Hidroxiguanina
La concentración de 8-hidroxidesoxiguanosina (8-0HdG) en la orina se usa para medir la producción corporal de ROS. Por ejemplo, el tabaquismo causa un incremento
en la excreción de 8-0HdG hasta de 50 por ciento.
Los productos más comunes que induce la radiación UV son los dímeros de pirimidina (timina) (Fig. 17.8). La distorsión de la hélice que resulta de la formación del .
dímero obstaculiza la síntesis de DNA.
FIGURA 17 . 8
5'
3'
Estructura de los dímeros de timina
H
1
Las timinas adyacentes forman dímeros con
gran eficacia tras la absorción de luz Uv.
O
"
t
11
/N-HC"
O=C
N
C¿jC_C ~~;:~'O
I
H
1
O=C
O
butano
11
N-C
"N
;C-C/
CH 3
1
H
3'
5'
Un gran número de xenobióticos puede dañar al DNA. De estas moléculas, las
más importantes pertenecen a las clases siguientes:
1. Análogos de las bases. Debido a que sus estructuras son semejantes a las de
las bases nucleotídicas normales, los análogos de las bases pueden incorporarse al DNA. Por ejemplo, la cafeína es un análogo de la base timina. Debido
a que puede aparearse con la guanina, la incorporación de cafeína puede producir una mutación por transición .
2. Agentes alquilantes. La alquilación es un proceso en el que las sustancias
electrófilas ("ávidas de electrones") atacan a las moléculas que poseen un par
de electrones sin compartir. Cuando los electrófilos reaccionan con estas moléculas, por lo general añaden grupos alquilo que contienen carbono. La adeni na y la guanina son muy susceptibles a la alquilación, aunque la timina y la
citosina también pueden ser afectadas. Las bases alquiladas con frecuencia se
aparean de forma incorrecta (p. ej., la metilguanina se aparea con la timina en
lugar de con la citosina) lo que conduce a posibles mutaciones por transición
en las siguientes rondas de replicación. En el caso de la metilguanina, el par
GC se transforma en el par AT. Las mutaciones por transversión también pueden tener lugar cuando el grupo alquilante es voluminoso. (En una mutación
por transversión, otra clase de mutación puntual, una pirimidina se sustituye
por una purina o viceversa.) Las alquilaciones también pueden promover la
formación de un laulómero, que puede dar lugar a mutaciones de transición.
Entre los agentes alquilantes se encuentran el dimetilsulfato y la dimetilnitrosamina. La mitomicina C es un agente alquilante con doble función . Puede
impedir la síntesis de DNA entrecruzando las bases de guanina. Los mecanismos de reparación del DNA (Sección 18.1) por lo general eliminan el anillo
de la base anormal antes de la replicación, lo que reduce la frecuencia de las
mutaciones.
17.1 DNA
3. Agentes no alquilantes. La estructura del DNA puede modificarse por diversas sustancias químicas además de los agentes alquilantes. El ácido nitroso (HNO?), que procede de las nitrosaminas y del nitrito sódico (NaNO?),
desamina las bases. (Tanto las nitrosaminas como el NaN0 2 se encuentran
en carnes procesadas y en cualquier embutido preservado con sal de encurtir
hecho con nitrito.) El HN0 2 convierte la adenina, la guanina y la citosina en
hipoxantina, xantina y uracilo, respectivamente. Los hidrocarburos aromáticos policíclicos son también mutagénicos (p. ej., el benzo[a]pireno que se encuentra en el humo del cigarro, también una fuente de nitrosaminas). Una vez
consumidas, estas moléculas pueden convertirse en derivados muy reactivos
mediante reacciones de biotransformación como las que cataliza el citocromo
P450' Los derivados reactivos pueden después formar aductos de la mayoría de
las bases. El daño se produce en primera instancia debido a que esta modificación química impide el apareamiento de bases.
4. Agentes intercaladores. Determinadas moléculas planas pueden distorsionar
al DNA al insertarse (intercalarse) entre los pares de bases apilados de la doble
hélice (Fig. 17.9). Bien se eliminan pares de bases adyacentes o se insertan
pares de bases nuevos . Si no se cOlTigen, las eliminaciones o las adiciones producen las llamadas mutaciones por desplazamiento del marco de lectura (se
describen en el Capítulo 19). Además, los cromosomas pueden romperse. Los
colorantes de acridina son ejemplos de agentes intercaladores. La quinacrina
es un colorante de acridina que se utiliza para tratar el paludismo y las tenias
intestinales.
~CO-=--N,-,,-C=E=-=-P--,-T-=--O~C=lA-,,~V,-=E_
_
635
€)?'.~
El DNA es vu lnerable a determinados tipos
de fuerzas perjudiciales que pueden
provocar mutaciones, cambios permanentes
de su secuencia de bases.
Anaranjado de acridina
(a)
Acridina
FIGURA 17 .9
Agente intercalador
(b)
¿Cómo afectan cada una de las sustancias o condiciones siguientes a la estructura
del DNA?
a. etanol, b. calor, c. dimetilsulfato, d. ácido nitroso y e. quinacrina.
Un agente intercalador es una molécula plana
capaz de insertarse entre pares de bases del
DNA. El agente intercalador anaranjado de
acridina (a) , un colorante acridínico, se inserta
entre dos pares de bases adyacentes (b) e
interfiere en la replicación del DNA. Cuando
e l anaranjado de acridina está unido al DNA ,
la radiación UV induce una fluorescencia
verde. (Véase en la Secc. 13.2 una descripción
de la fluorescencia.)
636
CAPíTULO DIECISIETE
Ácidosnucleicos
Considérese cada uno de los compuestos siguientes. ¿A qué clase de xenobióticos perjudiciales para el DNA pertenecen?
H'Cl~)
O
N
N
I
CH 3
Cafeína
Benzo[a]pireno
Cloruro etílico
La acumulación de daño oxidativo en el DNA parece ser la causa principal del envejecimiento de los mamíferos. Los animales que tienen tasas metabólicas elevadas
(Le., que emplean grandes cantidades de oxígeno) o que eliminan grandes cantidades de
bases modificadas en la orina, en general tienen vidas más cortas. La eliminación
de cantidades relativamente grandes de bases oxidadas indica una reducción de la
capacidad de impedir el daño oxidativo. A pesar de las pruebas sustanciales de que
los radicales de oxígeno dañan al DNA, aún no es claro cuáles son los radicales
que producen el daño. Además del radical hidroxilo, sugiéranse otros posibles culpables. Algunos tejidos soportan un mayor daño oxidativo que otros. Por ejemplo, se
piensa que el cerebro humano sufre un mayor daño oxidativo que el resto de los tejidos durante un lapso promedio de vida. Sugiéranse dos razones para este fenómeno.
Estructura del DNA: del jardín de Mendel a Watson y Crick
Según la perspectiva vigente, la estructura del DNA es elegante y obvia. El DNA es
en la actualidad un Ícono cultural, un sinónimo del concepto de almacenamiento y
recuperación de la información. La estructura correcta del DNA la propusieron en
1953 James Watson y Francis Crick. La investigación que condujo a este notable
descubrimiento es instructiva por diversas razones. En primer lugar, como sucede
con frecuencia en la investigación científica, el camino hacia la elucidación de la estructura del DNA fue largo, frustrante y tortuoso. Los seres vivos son tan complejos
que es extraordinariamente difícil discernir cualquier aspecto de su función. Se añade
a este obstáculo la propensión de los científicos (y otros seres humanos) a rechazar
o ignorar la información nueva que no se ajusta con comodidad con las ideologías
populares del momento. Este último problema tal vez sea inevitable, debido a que
el método científico requiere un determinado grado de escepticismo. (Por ejemplo,
¿cómo se distingue entre conceptos innovadores no comprobados e ideas equivocadas?) Sin embargo, el escepticismo puede confundirse a menudo con una adhesión
poco imaginativa a la situación actual. Albert Szent-Gyorgyi (Premio Nobel de fisiología o medicina, 1937), quien identificó el ácido ascórbico como la vitamina C y
realizó contribuciones significativas para elucidar el proceso de la contracción muscular y el ciclo del ácido cítrico, señaló en un momento: "El descubrimiento consiste
en ver lo que todo el mundo ha visto y pensar lo que nadie ha pensado."
Una segunda razón más concreta para la duración del proceso de descubrimiento
es que el desarrollo de nuevos conceptos con frecuencia requiere la integración de
la información de varias disciplinas científicas. Por ejemplo, el modelo del DNA se
basó en descubrimientos de biología descriptiva y experimental, genética, química
orgánica y física. Los avances científicos significativos los hacen con frecuencia personas imaginativas y afanosas que tienen la buena suerte de trabajar cuando se dispone de información y de tecnología suficientes para resolver los problemas científicos
171 DNA
que les interesan. Los investigadores de esta clase con más talento suelen ayudar a
crear nuevas tecnologías.
La revolución científica que finalmente condujo al modelo del DNA comenzó en
la tranquilidad del jardín de la abadía de un oscuro monje austriaco que se llamaba
Gregor Mendel. Él descubrió las reglas básicas de la herencia cultivando guisantes.
En 1865, Mendel publicó los resultados de sus experimentos de reproducción en el
Journal 01 the Brunn Natural History Society. Aunque envió copias de esta publicación a biólogos eminentes de toda Europa, su trabajo fue ignorado hasta 1900. En
ese año, varios botánicos de forma independiente redescubrieron la publicación de
Mendel y se dieron cuenta de su importancia. Este largo retraso se debió en parte a la
naturaleza descriptiva de la biología del siglo XIX; pocos biólogos estaban familiarizados con las matemáticas que Mendel utilizó para analizar sus datos. En 1900, muchos biólogos no sólo tenían conocimientos de matemáticas, sino también un marco
de referencia proporcionado por los principios de Mendel, debido a que muchos de
los detalles de la meiosis, de la mitosis y de la fertilización ya eran de conocimiento
público.
Asombrosamente, se estaba investigando casi al mismo tiempo la sustancia que
constituía las unidades de la herencia a las que Mendel se refería en su trabajo. El
descubrimiento de la "nucleína", que posteriormente se denominó ácido nucleico, lo
realizó Friedrich Miescher, un patólogo suizo, en 1869. Trabajando con los núcleos
de las células purulentas, Miescher extrajo la nucleína y descubrió que era ácida y
que contenía una gran cantidad de fosfato. (Aunque Joseph Lister publicó en 1867
sus descubrimientos sobre la cirugía antiséptica, los hospitales continuaron siendo
una fuente abundante de secreciones purulentas durante los años siguientes.) De
modo interesante, Miescher creyó (erróneamente) que la nucleína era un compuesto
de almacenamiento de fosfato.
La composición química del DNA la determinaron en gran medida Albrecht Kossel, entre 1882 y 1897, Y P.A. Levene, en la década de 1920 cuando se descubrieron
las técnicas analíticas adecuadas. Por desgracia, Levene creyó erróneamente que el
DNA era una molécula pequeña y sencilla en términos relativos. Su concepto, que se
denominó hipótesis del tetranucleótido, retrasó de manera significativa más investigaciones del DNA. En su lugar, las proteínas (los otros componentes principales de
los núcleos) se consideraban como los posibles transportadores de la información
genética. (A finales del siglo XIX se aceptaba en general que el núcleo contenía la
información genética.)
Mientras que los genetistas se centraban en la investigación de los mecanismos
de la herencia y los químicos elucidaban las estructuras de los componentes de
los ácidos nucleicos, los microbiólogos ponían a punto métodos para estudiar los
cultivos bacterianos. En 1928, mientras investigaba una epidemia mortal de neumonía en Gran Bretaña, Fred Griffith realizó una serie notable de experimentos
con dos cepas de neumococos (Fig. 17.10). Una cepa bacteriana, que se denominaba la forma lisa (o de tipo S) debido a que estaba recubierta con una cápsula de
polisacáridos, es patógena. La forma rugosa (o de tipo R) carece de la cápsula y
no es patógena. Griffith observó que los ratones inoculados con una mezcla de las
bacterias R vivas y las S destruidas por el calor, morían. Quedó asombrado cuando
ais ló las bacterias S vivas de los ratones muertos. Aunque esta transformación de
las bacterias R en bacterias S se confirmó en otros laboratorios, el descubrimiento
de Griffith se recibió con un escepticismo considerable. (El concepto de transmisión de la información genética entre las células bacterianas no se aceptó hasta la
década de 1950.)
En 1944, Oswald Avery y sus colegas Colin MacLeod y Maclyn McCarty comunicaron su cuidadoso aislamiento y la identificación del DNA como el agente transformador de los experimentos de Griffith. No todo el mundo aceptó esta conclusión
uebido a que su muestra ue DNA tenía trazas de impurezas proteínicas. Avery y
McCarty demostraron después que la digestión del DNA por parte de la desoxirribonucleasa (DNasa) inactivaba al agente transformador. (Al final, se determinó que el
DNA que transforma los neumococos R en la forma S codifica una enzima necesaria
para sintetizar la cápsula gelatinosa de polisacárido. Esta cápsula protege a las bacterias del sistema inmunitario del animal y aumenta la adherencia y colonización de
los tejidos del hospedador.)
637
638
CAPíTULO DIECISIETE
Ácidosnucleicos
Tipo R
(no virulento)
+
Tipo S
(virulento pero
atenuado por calor)
+
Tipo R
+
Tipo S
(atenuado por calor)
+
No se recuperan
bacterias
No se recuperan
bacterias
Se recupera
el tipo S, virulento
FIGURA 17 . 10
Experimento de Fred Griffith
En el experimento de Griffith , una mezcla de neumococos R no virulentos y neumococos S virulentos
atenuados por calor causó la muerte de los ratones. De éstos se recuperaron neumococos S virulentos.
Otro experimento que confirmó que el DNA es el material genético lo realizaron
Alfred Hershey y Martha Chase en 1952 (Fig. 17.11). Utilizando el bacteriófago T2,
estos investigadores demostraron las funciones independientes del ácidu nucleico y
de las proteínas del virus. (Los baeteriófagos, que también se denominanfagos, son
un tipo de virus que infectan a las bacterias.) Cuando el fago T2 infecta una célula
de Eseheriehia eoli, obliga a la bacteria a sintetizar varios cientos de virus nuevos.
A los 30 minutos de la infección la célula muere al romperse, liberando la progenie
vírica. En la primera fase de su experimento, Hershey y Chase incubaron bacterias
infectadas con el fago T2 en un medio de cultivo que contenía 35S (para marcar la
proteína) y 32p (para marcar el DNA). En la segunda fase, se recogía el virus marcado
radiactivamente y se le permitía que infectara bacterias sin marcar. Justo después, el
cultivo de bacterias infectadas se sometía a fuerzas de cizallamiento en una trituradora. Este tratamiento eliminaba al fago de sus sitios de unión en la superficie externa
de la pared de la célula bacteriana. Tras la separación de las partículas víricas vacías
mediante centrifugación, se analizaba la radiactividad de las bacterias. Se encontró
que las células contenían 32p (confirmando así la función del DNA en la "transformación" de las bacterias en productoras de virus), mientras que la mayoría del
35S permanecía en el sobrenadante. Además, las muestras de las bacterias infectadas
marcadas producían algo de progenie vírica marcada con 32p.
A principios de la década de 1950, estaba claro que el DNA era el material genético. Debido a que los investigadores también reconocían que la información genética
era esencial para todos los procesos vitales, determinar la estructura del DNA se convirtió en una prioridad obvia. Linus Pauling (del California Institute ofTeehnology),
Maurice Wilkins y Rosalind Franklin (del King 's College, de Londres), y Watson
y Crick (Cambridge University) se pusieron todos a trabajar con este objetivo. La
estructura propuesta por Watson y Crick en el número del 25 de abril de 1953 de la
revista Nature se basaba en su modelo a escala.
Considerando la forma en la que la comunidad científica respondió a otros conceptos que señalaban al DNA como el material genético, la aceptación de la estructura de Watson y Crick fue particularmente rápida. En 1962 se concedió el Premio
Nobel de Química a Watson, Crick y Wilkins.
.17.'1 DNA
+
Virus marcado con
32p
639
y 35 8
+
E. coli cultivada en
32p
y
35 8
te
E. coli no marcada
Trituradora.
Virus marcados con
32p
y
35 8
•
Lisis
32p
(a)
(b)
(e)
FI GURA 17 . 11
Experimento de Hershey y Chase
(a) Se preparó un fago radiomareado inoculando el virus en cultivos bacterianos que contenían los radioisótopos. (b) Cuando el fago marcado infectó
bacterias no marcadas, sólo el DNA del fago marcado se detectó en las bacterias. Parte de la etiqueta 32p se localiza en la progenie vírica. (e) Imagen del
bacteriófago T4 en el momento de lisar una célula de E. coli.
La información que se utilizó para construir este modelo fue la siguiente:
1. Las estructuras químicas y las dimensiones moleculares de la desoxirribosa,
de las bases nitrogenadas y del fosfato.
2. Las proporciones 1: 1 de adenina:timina y guanina:citosina del DNA aislado de
una gran vmiedad de especies que había investigado Erwin Chargaff entre 1948
y 1952. (Estas proporciones 1: 1 se suelen denominar reglas de Chargaff.)
3. Los magníficos estudios de difracción de rayos X realizados por Rosalind
Franklin (Fig. 17.12) que indicaron que el DNA era una molécula simétrica y
probablemente una hélice.
4. El diámetro y el paso de la hélice calculados por Wilkins y su colega Alex
Stokes a partir de otros estudios de difracción de rayos X.
S. La demostración más reciente hecha por Linus Pauling de que podían encontrarse proteínas, otra cIase de moléculas complejas, en una conformación
helicoidal.
640
CAPíTULO DIECISIETE
Ácidosnucleicos
FIGURA 17 . 12
Estudio de difracción de rayos X de DNA
hecho por Rosalind Franklin y R. Gosling
Obsérvese la simetría del patrón de di fracción
de rayos X.
Estructura del ONA: variaciones sobre un tema
Oe'" ~.~
-'CO
-'--N
_C
_E
_P_T_O--'C_lA
_V
_E_ _......
El modelo de la estructura del DNA propuesto
en 1953 por James Watson y Francis Crick
se basaba en información procedente de los
esfuerzos de muchas personas.
La estructura descubierta por Watson y Crick, que se denomina DNA B, representa
la sal sódica del DNA en condiciones de humedad elevada. El DNA puede asumir
diferentes conformaciones debido a que la desoxirribosa es flexible y a que los enlaces glucosídicos CI-N giran. (Recuérdese que los anillos de furanosa tienen una
conformación plegada.)
Cuando el DNA se deshidrata parcialmente -esto es, cuando el número de moléculas de agua unidas a cada nucleótido disminuye a unas 13 o 14-, la molécula
asume la forma A (Fig. 17.13 Y Cuadro 17 . 1). En el DNA A, los pares de bases no se
encuentran formando ángulos rectos con el eje de la hélice, sino que se inclinan 20°
alejándose de la horizontal. Además, la distancia entre los pares de bases adyacentes
se reduce ligeramente, por lo que se encuentran 11 bp por vuelta de la hélice, en lugar
de los 10.4 bp que se observan en la forma B . Cada vuelta de la doble hélice se produce en 2 .5 nm, en lugar de en 3.3 nm, y el diámetro de la molécula se expande a cerca
de 2.6 nm, a diferencia de los 2.4 nm que se observan en el DNA B. La forma A del
DNA se observa cuando éste se extrae con solventes como el etanol. La importancia
del DNA A en las condiciones celulares radica en que la estructura de los dúplex de
RNA y los dúplex de RNA/DNA que se forman durante la transcripción se asemejan
a la estructura del DNA A.
La forma Z del DNA (que se llama así por su conformación en "zig-zag") se
diferencia en gran medida de la forma B. El DNA Z (D = 1.8 nm), que es considerablemente más angosto que el DNA B (D = 2.4 nm), está enrollado en una espiral
levógira que tiene 12 bp por vuelta. Cada vuelta del DNA Z se produce en 4.5 nm , en
comparación con los 3.3 nm del DNA B. Los segmentos de DNA con bases púricas
y pirimídicas alternas (en especial CGCGCG) son los que con mayor probabilidad
adoptan la configuración Z . En el DNA Z , las bases se apilan con un patrón dimérico
levógiro y escalonado, lo cual le proporciona al DNA la apariencia de zigzag y su
superficie plana sin surcos. Las regiones del DNA con abundantes repeticiones de
las bases CG a menudo son reguladoras, y se unen a proteínas específicas que inician o que bloquean la transcripción. Aunque no es clara la importancia fisiológica
del DNA Z , se sabe que determinados procesos relevantes como la metilación y el
superenrollamiento negativo (que se discute en la pág. 642) estabilizan la forma Z.
Además, se ha observado que se forman segmentos cortos como consecuencia de la
tensión de torsión durante la transcripción.
17.1 DNA 641
Forma A
Forma Z
Forma B
F I GURA 17 . 13
DNA A,DNA By DNA Z
Como el DNA es una molécula flexible, puede adoptar diferentes configuraciones, dependiendo de
su sec uencia de pares de bases y/o de las condiciones en que se realice su aislamiento. Cada forma
molecular de la figura posee el mismo número de pares de bases. En el Cuadro 17.1 se exponen las
dimensiones de estas tres estructuras de DNA .
CUADRO 17 . 1
Propiedades estructurales seleccionadas
de los DNA B, A Y Z
DNA B (estructura
de Watson-Crick)
DNAA
DNAZ
Di ámetro de la hélice
2.4nm
2.6 nm
1.8nm
Pares de bases por vuel ta de hélice
/O
11
12
Ascenso de la hélice por par de bases
3.3Á
2.3Á
3.8Á
Rotación de la hélice
Dextrógira
Dex trógira
Levógira
Se ha observado que determinados segmentos del DNA tienen estructuras de orden superior, entre las que se encuentran las estructuras cruciformes, que como su
nombre lo indica se asemejan a una cruz. Es probable que se formen cuando una
secuencia de DNA contiene un palíndromo, una secuencia que proporciona la mi sma
información cuando se lee hacia delante o hacia atrás (p. ej., "DÁBALE ARROZ A
LA ZORRA EL ABAD"). En comparación con los palíndromos del lenguaje, las
"letras" se leen en un sentido en una de las cadenas complementarias del DNA y en
el sentido opuesto en la otra cadena. La mitad del palíndromo en cada cadena es complementaria con la otra mitad. Las secuencias de DNA que forman palíndromos, que
pueden constar de algunas o de miles de bases, se denominan repeticiones invertidas.
En uno de los mecani smos que se han propuesto, la formación de las disposiciones
cruciformes comienza con una pequeña burbuja, o estructura protocruciforme, y continúa a medida que se generan apareamientos intracatenarios de bases.
642
CAPÍTU LO 01 ECISI ETE
Ácidos nucleicos
I
C- T
A
\
-------ATATCGACTCCGATAT------1 1 1 1 1 11
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
-------TATAGCTGAGGCTATA-------
\
C
/
G- C
C- G
T-A
A-T
T- A
A- T
----~)
~
,--T-A
A- T
T- A
A-T
G-C
C- G
I
\
T
G
--~\
'G_ A)
El empaquetamiento de las grandes moléculas de DNA para colocarlas dentro de
las células requiere un superenrollamiento. Para que éste se produzca, una sola cadena del dúplex de DNA debe mellarse y luego sobregirarse o relajarse antes de que
el hueco se vuelva a tapar. (Una "mella" es un cOlte en una sola cadena del DNA de
doble hélice.) Los cambios pequeños de la forma del DNA dependen de la secuencia.
Por ejemplo, cuatro pares AT secuenciales producen una curvatura en la molécula.
Sin embargo, el doblamiento o el enrollamiento significativo alrededor de proteínas
asociadas requiere un superenrollamiento.
Superenrollamiento del ONA
En la actualidad se sabe que el superenrollamiento del DNA, que en un tiempo se
consideró como un artefacto de las técnicas de extracción del DNA, facilita diversos
procesos biológicos. Entre los ejemplos se encuentran el empaquetamiento compacto, la replicación y la transcripción del DNA (Capítulo 18). Debido a que el superenrollaDÚento del DNA es un proceso dinámico tridimensional, la información que
proporcionan las ilustraciones bidimensionales es limitada. Por lo tanto, considérese
el siguiente experimento para entender el superenrollamiento. Se deposita una larga
molécula lineal de DNA sobre una superficie plana. Tras juntarse los extremos, estos
se sellan para formar un círculo desplegado (Fig. 17.l4a). Debido a que esta molécula
está sellada sin regiones laxas o sobregiradas, se dice que la hélice está relajada y permanece plana sobre una superficie. Si la molécula circular de DNA relaj ada se sujeta
y se enrolla unas pocas veces, adopta la forma que se muestra en la Figura 17 .14b.
Cuando esta molécula enrollada se vuelve a depositar sobre la superficie plana, gira
para eliminar el enrollamiento.
Cuando el DNA está laxo, gira a la derecha para aliviar la tensión y se produce
un superenrollamiento negativo. En la naturaleza, la mayoría de las moléculas de
DNA exhiben superenrollamiento negativo . Cada una gira sobre sí misma para formar un superenrollamiento entrelazado (Fig. 17.15). Mientras una molécula de DNA
se encuentra en esta conformación, contiene energía potencial en forma de fuerza de
torsión (el impulso que tiende a causar rotación) . A su vez, la energía almacenada
facilita la separación de las cadenas durante procesos como la replicación y la transcripción del DNA (Fig. 17.16). El DNA sobregirado da vuelta a la izquierda para
liberar el esfuerzo y sufre superenrollamiento positivo. Los superenrollamientos que
se forman durante la separación de las cadenas en la replicación del DNA interfieren
con la actividad de la maquinaria de replicación. Son eliminados por enzimas llamadas topoisomerasas (p. ej. , la girasa de DNA en E. coli) , que realizan cortes reversibles los cuales permiten que los segmentos de DNA superenrollados se desenrollen.
Cromosomas y cromatina
El DNA, que contiene los genes (las unidades de la herencia) , está empaquetado
en estructuras que se denominan cromosomas. Al principio el término cromosoma
sólo se refería a las estructuras densas que se teñían de tono oscuro, observables en
17.1 DNA
643
FIGURA 17 . 14
5' 3'
DNA lineal, DNA circular y enrollamiento
del DNA
3' 5'
IXl~~~~ Molécula de DNA lineal de doble cadena
(a) Formación de una molécula relajada de
DNA. (b) Cuando una molécula relajada se
tuerce, vuelve a su estructura plana una vez
que se ha liberado.
Molécula de DNA circular
(a)
(b)
FIGURA 17 . 1 5
Superenrollamientos
Los superenrollamientos se producen en dos
formas principales: (a) toroidal y (b) entrelazada.
(a)
(b)
el interior de las células eucariotas durante la meiosis o la mitosis. Sin embargo, este
término se utiliza también en la actualidad para describir a las moléculas de DNA de
las células procariotas. La estructura física y la organización genética de los cromosomas procariotas y eucariota'i son muy diferentes .
644
[:;APíTULO DIE[:;ISIETE
Ácidosnucleicos
Girasa
+
ATP
(b) DNA superenrollado laxo
(a) DNA relajado
(e) DNA tensionado laxo
FIGURA 17 . 16
Efecto de la tensión sobre una molécula circular de DNA
Cuando una molécula de ONA con superenrollamiento negativo es forzada a yacer en un plano , se reintroduce la tensión aliviada por la formación
del superenrollamie nto negativo. La rotura y la nueva formación de los enlaces fo sfodi éster permiten la conversión de una forma circular rel ajada
(a) en la form a superenrollada negativamente (b). El alivio de la ten sión que produce el proceso de superenrollamiento se reintroduce cuando la
molécul a laxa se fuerza a descan sar en un plano (e) .
PROCARIOTAS En los procariotas, como E. eoli, un cromosoma es una molécula
de DNA circular que está enlazada y emollada de forma que puede comprimirse en
un espacio relativamente pequeño (1 ¡,Lm X 2 ¡,Lm). No obstante, debe accederse de
forma fácil a la información de esta molécula muy condensada. El cromosoma de E.
eoli (que tiene una circunferencia de 1.6 ¡,Lm) consta de un DNA superenrollado que
forma un complejo con un núcleo proteínico (Fig. 17.17).
En esta estructura, que se denomina nucleoide, el cromosoma está unido al núcleo
proteínico en al menos 40 sitios. Esta característica estructural produce una serie de
lazos que limitan el desenrollamiento del DNA superenrollado si se introduce una rotura en la cadena. La compresión se refuerza aún más mediante el empaquetamiento
con proteínas estructurales que se unen al DNA bacteriano y facilitan el doblamiento
y el superenrollamiento. En las archaea, el DNA se empaqueta con histonas cuya
estructura es similar a la propia de las histonas eucariotas.
Además, las poliaminas (moléculas policatiónicas como la espermidina y la espermina) ayudan también a conseguir la estructura tan comprimida del cromosoma.
+
+
+
H3N-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2-CH2-CH2-CH2-NH3
Espermidina
+
+
+
+
H3N-CH2-CH2-CH2-NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2-CH2-CH2-CH2-NH3
Espermina
Cuando las poliaminas con carga positiva se unen al esqueleto del DNA cargado negativamente evitan la repulsión de cargas entre las espirales adyacentes de DNA.
17.1 DNA
645
FIGURA 17 . 17
Cromosoma de E. coli
El cromosoma circular de E. coli forma un
complejo con un núcleo proteínico. Debido
a que el cromosoma (3 X 106 bp) está
superenrollado, el cromosoma completo sólo
mide 2 ¡.lm. La unión de cada uno de los lazos
de DNA al núcleo proteínico puede impedir
que se desenrede el cromosoma completo
superenrollado cuando se rompe una cadena .
•
EUCARIOTAS En comparación con las prckariotas, las eucariotas poseen genomas que son extraordinariamente grandes. Dependiendo de las especies, los cromosomas de las eucariotas varían en longitud y en número. Por ejemplo, el ser humano
tiene 23 pares de cromosomas con un total de cerca de 3000 millones de bp. La
mosca de la fruta Drosophila melanogaster tiene cuatro pares de cromosomas con
180 millones de bp, y el maíz (Zea mays) tiene 10 pares de cromosomas con un total
de 6600 millones de bp.
Cada cromosoma eucariótico consta de una sola molécula lineal de DNA que forma un complejo con histonas para originar las nucleohistonas. Se emplea el término
cromatina para describir el complejo formado por DNA e histonas. También se unen
a la cromatina varios tipos de proteínas que no son histonas. Algunos ejemplos son
las enzimas que participan en la replicación y en la reparación del DNA, y una gran
cantidad de factores de transcripción de diferentes tipos.
Las histonas son un grupo de proteínas básicas pequeñas que se encuentran en
todos los organismos eucariotas. La unión de las histonas al DNA da lugar a la formación de nucleosomas, que son las unidades estructurales de los cromosomas eucariotas. Las histonas, que son de cinco clases principales (Hl, H2A, H2B , H3 Y
H4), tienen estructuras primarias semejantes entre las especies eucariotas. En las
micrografías electrónicas, la cromatina tiene aspecto de cuentas. Cada una de estas
"cuentas" es un nucleosoma, que está formado por un segmento de DNA superenrollado que forma un rizado toroidal alrededor de un núcleo de ocho histonas (dos
copias de cada una de las histonas H2A, H2B , H3 Y H4.
Cada una de las histonas centrales altamente conservadas (Fig. 17.9a) contiene
una característica estructural en común llamada pliegue de histona: tres hélices a
separadas por dos segmentos cortos no estructurados. Las colas terminales N de las
histonas centrales constan de unos 25 a 40 residuos de aminoácidos que sobresalen
de los nucleosomas. Varios tipos de modificaciones covalentes de los residuos de la
cola (p. ej ., acetilación y metilación) cambian las propiedades estructurales y funcionales de las histonas, que a su vez modifican la accesibilidad del DNA a factores
de transcripción. Tales cambios reciben el nombre de modificaciones epigenéticas.
El núcleo de histona se forma cuando dos conjuntos de H2A y H2B constituyen dos
heterodímeros de cabeza a cola y las histonas H3 y las H4 forman dos juegos de heterodímeros de cabeza a cola. A continuación los heterodímeros H3·H4 se unen para
formar un tetrámero H3 2o H4 2 (Fig. 17.19b). El ensamblaje del nucleosoma comienza
..• ti..,e
e....
8
FIGURA 17. 18
Micrografía electrónica de cromatina
Una muestra de cromatina extendida para la
micrografía electrónica. Nótese la estructura
de "cuentas en un collar" de este material que
contiene DNA.
COMPAN10N
9N.
Visítese el sitio de Internet
de apoyo en www.ouo.comlus/mckee.
para consultar el recuadro Bioquímica
en perspectiva titulado Epigenética y
epigenoma: herencia genética más allá de
las secuencias de bases de DNA.
646
Ácidos nucleicos
CAPÍTULO DIECISIETE
Pliegue de histona
Cola terminal N
Ii
H2A
N =====~~)__~__ ~
N ==========~L
H2B
:~
C'
C
e
(a)
Dímero H2A·H28
Tetrámero H3·H4
e
(b)
N
N
N
(e)
FIGURA 17 . 19
Histonas centrales
Cada nucleosoma contiene ocho histonas: dos de cada una de H2A , H2B , H3 Y H4. Cada una de estas
moléculas contiene un dominio globular llamado pliegue de histona y un largo dominio terminal N
no estructurado. (a) Estos dominios se ilustran como moléculas lineales con cilindros que representan
hélices 0. . (b) La formación del núcleo de histonas comienza con la unión de H2A y de H2B , para crear
un dímero, y dos moléculas de H3 y dos de H4 se combinan para formar un tetrámero. El tetrámero
H3 2·H4 2 se une entonces al DNA. La estructura del nucleosoma se completa (c) cuando dos dímeros
H2A·H2B se unen al tetrámero,
17.1 DNA
647
cuando el tetrámero H3 2 ·H42 se une al DNA. Cuando los dos dímeros H2A·H2B se
unen al tetrámero, el ensamblaje del nucleosoma está completo (Fig. 17.19c). Una
molécula de histona Hl se une al nucleosoma en el punto en que el DNA entra y sale,
y actúa como una pinza que impide el desenroUamiento del nucleosoma (Fig. 17.20).
Alrededor de 145 bp están en contacto con cada octámero de histonas. Un tramo
adicional de 60 bp de DNA de enlace conecta nucleosomas adyacentes.
H1 unida
F I GURA 17 . 20
Histona HI
~~'---
Cromatina
cromosoma
Fibra condensada
(30 nm de diámetro)
Andamiaje de proteínas histonas
DNAde
enlace
I
Nucleosoma (11 nm de diámetro)
L
~...,----DNA
(2 nm) de diámetro
FIG URA 17 .21
Cromatina
La cromatina nuclear contiene muchos niveles de estructura enrollada.
La unión de HI a dos sitios diferentes
en el DNA del nucleosoma estabiliza el
enrollamiento del DNA alrededor del octámero
de histonas.
648
CAPíTULO DIECISIETE
FIGURA 17 .22
Cromatina
En una estructura propuesta del ti lamento de
200 nm , la fibra de 30 nm forma un lazo y
se une a un andamiaje nuclear formado por
proteínas.
CONCEPTOS CLAVE
• Cada cromosoma procariota consta de una
molécula circular de DNA superenrollado que forma un complejo con un núcleo
proteínico .
• Cada cromosoma eucariota consta de una
so la molécula de DNA lineal que forma
complejos con las histonas para formar una
nucleohistona.
Acidosnucleicos
Como preparativo para la división celular, la cromatina se compacta (unas 10000
veces) para formar cromosomas. Los nucleosomas se enrollan en una estructura de orden superior que se denominafibra de 30 nm (Fig. 17.21). La fibra de 30 nm se enrolla
aún más para formar filamentos de 200 nm. La estructura tridimensional de los filamentos de 200 nm contiene una multitud de lazos superenrollados unidos a un complejo
proteínico central que se denomina andamiaje nuclear (Fig. 17.22). Durante la interfase
del ciclo celular, la cromatina se encuentra en dos formas . La heterocromatina está
tan condensada que es inactiva en términos de transcripción. Una pequeña porción de
la heterocromatina de cada célula se halla en todas las células de un organismo individua\. Otras porciones de heterocromatina difieren en un patrón específico de tejido. La
eucromatina, una forma menos condensada de cromatina, tiene niveles variables de
actividad transcripcional. La eucromatina que puede experimentar transcripción es la
menos condensada. La inactiva es un tanto más condensada, pero no tanto como la heterocromatina. No se ha dilucidado el mecanismo por el cual la cromatina se condensa '
de forma reversible, pero se piensa que las modificaciones covalentes de las histonas
tienen una participación significativa.
DNA DE lOS ORGANElOS Las mitocondrias y los cloroplastos son organelos
semiautónomos, es decir, poseen DNA y su propia versión de la maquinaria de síntesis de proteínas. Estos organelos, que pueden reproducirse mediante fisión binaria,
requieren también una contribución sustancial de proteínas y de otras moléculas que
son codificadas por el genoma nuclear. Por ejemplo, el DNA mitocondrial (mtDNA)
codifica dos rRNA, 22 tRNA y varias proteínas, la mayoría de las cuales se utilizan
en el transporte de electrones. El resto de las proteínas mitocondriales se sintetizan en
el citoplasma y se transportan al interior de las mitocondrias. De forma semejante, el
genoma de los cloroplastos codifica varias clases de RNA y determinadas proteínas,
muchas de las cuales están asociadas directamente con la fotosíntesis. Las actividades de los genomas nucleares y de los organelos están muy coordinadas. Por consiguiente, con frecuencia son difíciles de discernir sus contribuciones individuales con
la función del organelo. Debido a que se cree que las mitocondrias y los cloroplastos
descienden de las bacterias de vida libre, no es sorprendente que sean susceptibles a
las acciones de los antibióticos (p. ej., el cloranfenicol y la eritromicina) si sus concentraciones son suficientemente elevadas. Muchas de estas moléculas se usan (o se
han utilizado) en la práctica clínica debido a que inhiben algún aspecto de la función
del genoma bacteriano.
~Ii~ig~.
Compárense las características estructurales que diferencian al DNA B del DNA A
y del DNA Z. ¿Qué se sabe sobre las propiedades funcionales de estas variantes del
DNA B, la estructura de Watson-Crick?
¿Cuáles son los componentes proteínicos más importantes de los cromosomas de las
células procariotas y de las eucariotas? ¿Cuáles son sus funciones?
Explíquense las relaciones jerárquicas entre los componentes siguientes: genomas,
genes , nucleosomas , cromosomas y cromatina.
Descríbanse las pruebas que utilizaron James Watson y Francis Crick para construir
su modelo de la estructura del DNA.
171 DNA
649
Estructura del genoma
El gen ama de cada ser vivo es el conjunto completo de instrucciones hereditarias
que se requieren para sustentar todos los procesos vitales, es decir, el sistema operativo del organismo. Cada gen ama contiene los genes, las unidades de la herencia
que determinan la estructura primaria de los productos génicos (polipéptidos y moléculas de RNA). Los geno mas se diferencian en cuanto a su tamaño, su forma y
la complejidad de su secuencia. El tamaño genómico -el número de nucleótidos
apareados, que se relaciona de manera aproximada con la complejidad del organismo- varía en un intervalo enorme desde menos de 106 bp en algunas especies
de Mycoplasma (la bacteria más pequeña que se conoce) hasta más de 10 10 bp en
determinadas plantas. La mayoría de los genomas procariotas son más pequeños
que los eucariotas. A diferencia de los genomas procariotas, que suelen con.star de
moléculas únicas de DNA circular, los genomas eucariotas están divididos en dos o
más moléculas de DNA lineal. Sin embargo, la diferencia más significativa entre los
genomas procariotas y los eucariotas es la capacidad de codificac;ión mucho mayor
del DNA de los últimos. De manera sorprendente, la mayoría de las secuencias
eucariotas no codifican productos génicos. Por esta razón, cada tipo de genoma se
considerará por separado. En la Figura 17.23 se comparan segmentos cortos de los
genomas de varios eucariotas con el de E. eolio
GENOMAS PROCARIOTAS Las investigaciones de los cromosomas procariotas,
en especial aquellos de varias cepas de E. eoli, han descubierto lo siguiente:
1. Tamaño del genoma. Como se ha descrito, la mayoría de los genomas procariotas son relativamente pequeños, con un número de genes mucho menor
que el de los eucariotas. El cromosoma de E. eoli contiene unas 4.6 megabases
(Mb) que codifican alrededor de 4300 genes. (Una Mb es 1 X 106 bases.)
2. Capacidad codificadora. Los genes de los procariotas son compactos y continuos ; es decir, contienen poco, si es que tienen algo, DNA no codificador
entre las secuencias génicas o dentro de ellas. Esto contrasta con el DNA
eucariota, en el que un porcentaje significativo del DNA puede encontrarse en
una forma no codificadora.
(a) Ser humano
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pm~
V29-1
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10
O
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11
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30
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50
30
40
50
(b) Saccharomyces cerevisiae (levadura)
10
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20
(e) Zea mays (maíz)
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Adh1-F
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30
40
50
30
40
50
(d) Escherichia coli
10
O
20
CLAVE
Gen
11 Intrón
[1 Seudogén
humano
[1 Repetición en todo
el genoma
[TI
FIGURA 17. 23
Comparación de segmentos de 50 kb de los
genomas de algunos organismos eucariotas
con el genoma del procaI"iota E. coli
Gen de tRNA
Como se indica, los genomas de organismos
como (a) el ser humano. (b) SacchaIV1I7yces
cere,úiae. (e) el maíz, y (d) E. coli pueden
variar considerablemente en cuanto a su
comp lejid ad y a sus densidad de genes. Los
genes se indican con letras y/o con números.
El ser humano y otros eucariotas complejos
tienen genes interrumpidos por intrones y
secuencias no funcionales denominadas
seudogenes, que se asemejan a los verdaderos
genes. Obsérvese también que las bacterias
tienen menos repeticiones repartidas por
el genoma (segmentos repetitivos no
codificadores), si es que tienen alguna.
650
CAPíTULO DIECISIETE
Ácidosnucleicos
3. Expresión génica. La regul ación de muchos genes con funciones relaciona_
das se potencia al organizarlos en operones. Un operón es un conjunto de
genes ligados que están regulados como una unidad. Alrededor de una cuarta
parte de los genes de E. eoli están organizados en operones.
Recuérdese que los procariotas también suelen poseer pequeñas piezas adicionales
de DNA (véase la pág. 42) llamadas plásmidos, que son en general circulares, aunque
no siempre. Los plásmidos de forma habitual tienen genes que no están presentes en
el cromosoma principal. Aunque estos genes por lo general no son esenciales para el
crecimiento y la supervivencia de la bacteria, pueden codificar biomoléculas que proporcionan a la célula una ventaja de crecimiento o supervivenci a: resistencia a antibióticos, capacidades metabólicas singulares (p. ej ., fijación de nitrógeno y degradación
de fuentes de energía únicas como los compuestos aromáticos) o virulencia (p. ej.,
toxinas u otros facto res que debilitan los mecanismos de defensa del hospedador) .
GENOMAS EUCARIOTAS La organización de la información genética en los cromosomas eucariotas es mucho más compleja que la que se observa en los procariotas.
Los genomas nucleares eucariotas poseen las características singulares siguientes:
1. Tamaño del genoma. Los genomas eucari otas tienden a ser mucho más grandes que los de los procariotas. Sin embargo, en los eucariotas superiores, el
tamaño del genoma no es necesariamente una medida de la complejidad del
organismo. Por ejemplo, recuérdese que el geno ma haploide del ser humano
tiene 3200 Mb. Los genomas de los guisantes y de la salamandra tienen 5000
Mb Y 90 000 Mb, en tal orden.
2. Capacidad codificadora. Aunque existe una enorme capacidad codificadora,
la mayoría de las secuencias de DNA de los eucariotas no parecen tener funciones de codificación; es decir, no tienen regiones reguladoras intactas que
inicien la transcripción (la producción de transcritos de RNA) . Aún se desconocen las funciones de estas secuencias no codificadoras; es probable que
algunas de e ll as tengan funciones reguladoras o estructurales. Se ha calculado
que no más del 1.5% del genoma humano codifica proteínas.
3. Continuidad codificadora. La mayoría de los genes eucariotas investigados
hasta el momento son discontinuos. Las secuencias no codificadoras (que se
denominan intrones o secuencias intercaladas) están entremezcladas entre las
secuencias denominadas exones (secuenci as que se expresan), que codifican
un producto génico (cualquiera de las diversas moléculas de RNA, algunas de
las cuales dictan la traducción de proteínas) . Las secuencias intrónicas, que
pueden ser mucho más largas que los exones en un gen codificador de proteína, se eliminan de los transcritos de RNA primarios por un mecani smo de
corte y empalme (Sección 18.2) para producir moléculas funcionales de RNA.
La existencia de exones y de intrones permite a las células eucariotas producir más
de un polipéptido a partir de cada gen. Utilizando un proceso denominado corte y
empalme alternativo (pág. 722), es posible unir varias combinaciones de exones para
formar diversos mRNA . Por ejemplo, las reestructurac iones aleatorias de sec uencias
génicas que codifican los receptores de antígenos de las inmunoglobulinas tienen un
cometido fundamental en la generación de los millones de linfocitos y anticuerpos
producidos por el sistema inmunitario de los mamíferos . Uno de los resultados más
sorprendentes de la investigación del genoma y de los proyectos genómicos (esfuerzos científicos multinac ional es que determinan las secuencias genómicas completas
de organismos selecc ionados) es el descubrimie nto de que los genes constituyen una
proporción pequeña de los genomas de los eucariotas. La mayoría de las secuencias de DNA de estos organismos son no codificadoras; es decir, no especifican las
estructuras primarias de polipéptidos o de moléculas de RNA. Las secuencias intergénicas, o sea las que no codifican productos gé nicos, a menudo se les ll amaba
"DNA basura" porque se pensó que no tenían funciones útiles. Aunque siguen sin
determinarse las actividades de la mayoría de las secuencias intergénicas, las secuencias mismas se han analizado y clasificado. La siguiente discusión se concentra en
secuencias de DNA de los tipos que existen e n el genoma humano.
De las -3200 Mb del genoma humano, cerca del 38% son genes y secuencias
relacionadas (Fig. 17.24). La porción de estas secuenci as que codifica productos gé-
17.1 DNA
651
FIGURA 17 . 24
Genoma humano
Única
o'",~
Otras
_~,ú~ ,~,e"
~·~e
'"
...
15% ...
(96%)
Secuencias
relacionadas
38%
DNA
intergénico: 62%
0:.,30%7 /
(Fragmentos génicos
y seudogenes)
Genes y
secuencias
relacionadas:
regiones
intergénicas:
,
'
,
"
\, /
La mayoría de las secuencias de DNA del
geno ma humano no codifican productos
génicos. Cerca del 62% de estas secuencias
son DNA intergénico, que a su vez puede
dividirse en repeticiones entremezcladas
ampliamente en el genoma, microsatélites y
otras regiones intergénicas. En el ser humano,
38% de las secuenc ias son genes y otras
secuenc ias re lacionadas, de las cuales só lo 4%
codifican productos génicos. Las secuenc ias
re lac ionadas con genes representan el resto.
Repeticiones en
todo el genoma
nicos (polipéptidos y moléculas de RNA funcionales) es de un 4%. Según distintas
estimaciones hay entre 25 000 Y 40 000 genes humanos . (Nótese que este amplio
intervalo de valores estimados es el resultado de usar diferentes algoritmos en el análisis de las secuencias genómicas. Un algoritmo es un conjunto de reglas que sigue un
programa de cómputo diseñado para identificar determinados patrones de secuencia
del DNA.) Del número total de genes identificados, menos de 2500 codifican moléculas de RNA ; el resto codifica proteínas. Las funciones de casi un cuarto de los
genes codificadores de proteínas conocidos (Fig. 17.25) se relacionan con la síntesis
y la reparación de DNA y con la expresión génica. Las proteínas de transducción de
señales son codificadas por alrededor del 21 % de los genes y cerca del 17% codifica
funciones bioquímicas generales de las células (i.e., enzimas metabólicas). Los genes
restantes , -38 %, codifican una serie de proteínas implicadas en procesos de transporte (p. ej ., conductos iónicos), el plegamiento de proteínas (chaperones moleculares y
subunidades proteasómicas), proteínas estructurales (p. ej., actina, miosina, tubulina
y sus proteínas accesorias) y proteínas inmunitarias (p. ej ., anticuerpos). Entre las
secuencias génicas relacionadas se incluyen los seudogenes (copias de genes no funcionales y desactivadas) y fragmentos génicos.
Poco más del 60% del genoma humano consta de secuencias intergénicas. Si bien
se desconocen sus funciones, se han identificado e investigado varias clases de secuencias repetitivas. Existen dos clases generales: las repeticiones en tándem y las
repeticiones entremezcladas en todo el genoma. A continuación se describen con
brevedad cada una de ellas.
Las repeticiones en tándem son secuencias de DNA en las que muchas copias
están dispuestas cerca unas de otras. Estas secuencias se denominaron originalmente
DNA satélite debido a que forman una banda separada o "satélite" cuando se fracciona en trozos el DNA genómico y se centrifuga para separar los fragmentos mediante centrifugación por gradiente de densidad (véase el recuadro Métodos bioquímjcos titulado Métodos de investigación de los ácidos nucleicos, págs. 653 a 657).
Las longitudes de las secuencias repetidas varían desde menos de 10 bp hasta más
de 2000 bp. Las extensiones totales de las repeticiones en tándem suelen variar entre
105 Y 107 bp. Determinados tipos de repeticiones en tándem desempeñan funciones
estructurales en los centrómeros (las estructuras que contienen cinetocoros, las cuales unen los cromosomas al huso mitótico durante la mitosis y la meiosis) y los telómeros (las estructuras de los extremos de los cromosomas que amortiguan la pérdida
de secuencias codificadoras esenciales tras una ronda de replicación del DNA). Dos
Expresión, replicación
y mantenimiento
del genoma
Otras actividades
diversas
Funciones
bioquímicas
generales de
la célula
FIGURA 17 . 25
Genes que codifican proteínas humanas
C lasificaciones de genes codificadores de
proteínas conocidos. Se ha calculado que hasta
la fecha se desconocen las funciones de 13 000
de los 30 000 genes posibles.
652
CA P ÍTU LO DIE C I SIETE
~CO-=-:N,-, -C=-=E:c..P-.T-=C. .OS~CL=-A=V-=-E_ _€»'-, '--• En el genoma de cada organismo. la información que se requiere para dirigir los procesos
vita les se organiza de forma que pueda almace narse y utilizarse de forma eficiente.
• Los genomas de diferentes tipos de organi smos se diferencian en su tamaño y en sus
niveles de complejidad.
Ácidos nucleicos
clases relativamente pequeñas de secuencias repetitivas se denominan minisatélites y
microsatélites. Los minisatélites tienen secuencias repetidas en tándem de 10 a 100
bp, con longitudes totales de entre 102 y 10 5 bp_ Los telómeros contienen agregados
de minisatélites. En los microsatélites, también llamados repeticiones de secuencia
única (SSR), existe una secuencia central de una a cuatro bp que se repite en tándem
de lOa 100 veces. Se desconoce la mayor parte de las funciones de estas secuencias
repetitivas. Debido a su gran número en los genomas y a su naturaleza pleomórfica
(Le., que varían en cada organismo individual), los minisatélites y los microsatélites
se utilizan como marcadores en el di agnóstico de enfermedades genéticas y en las
investigaciones forenses (véase el recuadro Bioquímica en perspectiva titulado Investigaciones forenses, págs. 658 a 659).
Como su nombre lo implica, las repeticiones entremezcladas en todo el genoma son secuencias repetitivas que están dispersas por el genoma. La mayoría
de estas secuencias son el resultado de eventos de transposición (Secc. 18.1), un'
mecanismo por el cual determinadas secuencias de DNA , que reciben el nombre
de elementos genéticos móviles, pueden duplicarse y moverse dentro del genoma. Los elementos transponibles del DNA, que se denominan transposones, se
escinden a sí mismos y luego se insertan en otro sitio. Con mayor frecuencia, sin
embargo, los mecanismos de transposición implican un RNA transcrito intermediario. Estos últimos elementos del DNA se denomin an transposones de RNA o
retroposones (o retrotransposones).
Los retroposones con longitudes de más de 5 kb se denominan LINE (elementos nucleares entremezclados largos). Las secuencias UNE contienen un promotor
(una secuencia de bases en flujo ascendente de un gen, necesaria para el inicio de la
transcripción) fuel1e, una secuencia de integración (una secuencia de bases necesaria
para la integración en otra molécula de DNA) y las secuencias codificadoras para las
enzimas de transposición. Los UNE han experimentado replicación y mutación con
el tiempo, y sólo un pequeño porcentaje de ellos son funcionales. Se calcula que en el
ser humano una de cada 1200 mutaciones es resultado de la inserción de un UNE.
Un ejemplo es la hemofilia A (un trastorno de la coagulación), que ocurre cuando una
secuencia UNE se inserta en el gen que codifica el factor de la coagulación VIII.
Los SINE (elementos nucleares entremezclados cortos) tienen menos de 500 bp;
aunque contienen secuencias de inserción, no pueden transponerse sin la ayuda de
una secuencia UNE funcional. Los SINE se han expandido mucho con el tiempo
hasta constituir 11 % del genoma humano, con más de un millón de copias. La única
inserción de SINE vinculada con enfermedades humanas implica el elemento Alu,
que media recombinaciones, inserciones, deleciones y reordenamientos cromosómicoso Más de 20 enfermedades genéticas distintas del ser humano se han atribuido a
mutaciones mediadas por la subfamilia Alu de SINE. Se han observado inserciones
mediadas por el Alu que causan hemofilia B (factor de la coagulación IX defectuoso)
y determinadas recombinaciones desiguales debidas a inserciones mediadas por Alu
que se vinculan con la enfermedad de Lesch-Nyhan (pág. 547) y con la enfermedad
de Tay-Sachs (pág. 385). La recombinaóón (Secc. 18.1) es la "mezcla" de secuencias de DNA mediante entrecruzamiento de cromosomas homólogos en las células
que dan origen a los óvulos o a los espermatozoides. La recombinación desigual es
un proceso aberrante que causa mutaciones por inserción o por deleción.
Defínanse los siguientes términos:
a. repeticiones en tándem
e. exones
b. centrómero
f. microsatélites
c. DNA satélite
g. transposi ción
d. intrones
Compárense los tamaños y la capacidad codificadora de los genomas de los procariotas con los de los eucariotas. ¿Qué otras características los diferencian?
17.1 DNA 653
MÉTODOS
BIOQuíMICOS
Métodos de investigación
de los ácidos nucleicos
as técnicas que se utilizan para el aislamiento, la purificación
y la caracterización de las biomoléculas aprovechan sus propiedades físicas y químicas. La mayoría de las técnicas que
se emplean en la investigación sobre los ácidos nucleicos se fundamentan en las diferencias de peso o de morfología moleculares,
en las secuencias de bases o en el apareamiento complementario
de bases. Las técnicas como la croma.tografía, la electroforesis y
la ultracentrifugación, que se han utilizado con éxito 'en la investigación proteínica, se han adaptado también para su uso con los
ácidos nucleicos. Además, se han puesto a punto otras técnicas
que explotan las características singulares de los ácidos nucleicoso Por ejemplo, en determinadas circunstancias los dúplex de
DNA se fusionan (se separan) y se vuelven a asociar (se aparean
la bases para formar de nuevo el dúplex) de forma reversible. Una
de las diversas técnicas que explotan este fenómeno, que se denomina hibridación de Southem, suele emplearse para localizar
secuencias específicas (y con frecuencia raras) de ácidos nucleicoso Tras describir con brevedad diversas técnicas que se utilizan
para purificar y caracterizar a los ácidos nucleicos, se bosqueja el
método habitual para determinar las secuencias de DNA. En el
recuadro Métodos bioquímicos titulado Genómica del Capítulo
18 (págs. 700 a 707) se describen técnicas más complejas.
Cuando ya se han fragmentado las células bacterianas o cuando
los núcleos eucariotas ya se han aislado, se extraen sus ácidos nucleicos y se eliminan las proteínas, lo cual puede lograrse mediante
varios métodos. El ácido nucleico bacteriano suele precipitarse tratando las preparaciones celulares con álcali y lisozima (una enzima
que degrada las paredes de las células bacterianas al romper los enlaces glucosídicos). Las proteínas parcialmente degradadas se extraen
utilizando detenrunadas combinaciones de solventes (p. ej., fenol y
clorofOlmo). De igual manera, los núcleos eucanotas pueden tratarse
con detergentes o solventes para liberar sus ácidos nucleicos. Dependiendo del tipo de ácido nucleico que quiera aislarse, para eliminar la
otra clase se utilizan enzimas específicas. Por ejemplo, la RNasa elimina el RNA de las preparaciones de ácidos nucleicos, dejando intacto el DNA. Éste se purifica después mediante centrifugación.
Todas las muestras de ácidos nucleicos deben manejarse con
cuidado. En primer lugar, los ácidos nucleicos son susceptibles a
las acciones de un grupo de enzimas que se denominannucleasas.
Además de las enzimas de esta clase que se liberan durante la
extracción celular, las nucleasas pueden introducirse del entorno,
por ejemplo, de las manos del experimentador. En segundo lugar,
los ácidos nucleicos de peso molecular elevado, principalmente el
DNA, son sensibles a las agresiones de cizallamiento. Los procedimientos de purificación, por lo tanto, deben ser suaves, aplicando las menores agresiones mecánicas posibles.
L
Técnicas adaptadas del uso
con otras biomoléculas
Muchas de las técnicas que se utilizan en los procedimientos de
purificación de proteínas se han adaptado también para su uso con
los ácidos nucleicos. Por ejemplo, se han empleado varios tipos
de cromatografía (p. ej ., intercambio iónico, filtración en geles y
afinidad) en diversas fases de la purificación de los ácidos nucleicos y en el aislamiento de sus secuencias individuales. Debido a
su rapidez, la HPLC (cromatografía líquida de alta presión) ha
sustituido a muchas técnicas cromatográficas de separación más
lentas cuando se emplean muestras pequeñas.
Una clase de cromatografía en columna que utiliza un gel de fosfato cálcico que se denomina hidroxiapatita ha sido especialmente útil
en la investigación de los ácidos nuc1eicos. La hidroxiapatita se une
a las moléculas de ácido nucleiéo de doble cadena con mayor fuerza
que a las moléculas de cadena indiVIdual, por lo que puede separarse
de fOl1lla eficaz el DNA bicatenario (dsDNA) del DNA de cadena
individual (ssDNA), del RNA y de las proteínas contaminantes el uyendo la columna con concentraciones crecientes de amortiguador de
fosfato. La utilización de las columnas de hidroxiapatita recientemente se ha sustituido en gran medida por una fonna de cromatografía por
afinidad en la que las moléculas de la matriz de la columna se han unido de fOlma covalente a la avidina, una pequeña proteína que se une
sólo a la biotina. La matriz puede elaborarse con un ligando biotinilado específico, como una sonda de ssDNA (de secuencia conocida). Si
se aplica a la columna una mezcla que contenga el ssDNA, a éste se
unirán secuencias específicas complementatias a la sonda, mientras
que el resto de la muestra atravesará la columna. Las moléculas diana
unidas pueden entonces eluirse de la columna en fonna casi pura.
El movimiento de las moléculas de ácido nucleico en un campo
eléctrico depende de su peso molecular y de su estructura ttidimensiona!. Sin embargo, debido a que las moléculas de DNA suelen tener pesos moleculares grandes, su capacidad para penetrar algunas
preparaciones de geles (p. ej., poliacrilamida) está lilrutada. Aunque las secuencias de DNA con menos de 500 bp pueden separarse
mediante geles de poliacrilamida con poros muy grandes, con las
moléculas de DNA más grandes deben utilizarse geles más porosos. Los geles de agarosa, que están fonnados por un polisacárido
entrecruzado, se utilizan para separar las moléculas de DNA con
longitudes entre 500 bp y -ISO kilobases (kb). Las secuencias más
grandes se aíslan con una variación de la electroforesis en gel de
agarosa en la que se alternan dos campos eléctricos (perpendiculares uno al otro). Las moléculas de DNA se orientan cada vez que
el campo eléctrico cambia, lo que da lugar a una separación muy
eficaz y precisa de grupos heterogéneos de moléculas de DNA. Los
tiempos de reotientación disminuyen con el tamaño del DNA.
La centrifugación por gradiente de densidad con cloruro de cesio (CsCI) se ha utilizado mucho en la investigación de los ácidos
nucleicos (véase el recuadro Métodos bioquímicos titulado Tecnología celular, págs. 67 a 68). A velocidades elevadas, se establece un gradiente lineal de CsC!. Las mezclas de DNA, RNA Y proteínas que migran a través de este gradiente se separan en bandas
individuales en posiciones en las que sus densidades son iguales
a la densidad del CsCJ. Las moléculas de DNA con altas concentraciones de guanina y citosina son más densas que las que tienen
proporciones mayores de adenina y timina. Esta diferencia ayuda a
separar las mezclas heterogéneas de fragmentos de DNA.
654
CAPíTULO DIECISIETE
MÉTODOS
Ácidos nucleicos
BIOQuíMICOS
cont
Técnicas que explotan las características estructurales singulares de los ácidos nucleicos
Diversas propiedades únicas de los ácidos nucleicos (p. ej., la absorción de luz UV de longitudes de onda específicas y su tendencia
a formar complejos de doble cadena de fOlllla reversible) se explotan en la investigación de los ácidos nucleicos. A continuación se
describen de forma concisa diversos usos de estas propiedades.
ONA monocatenario
Jrr.
Las bases púricas y pirimídicas abso rben luz UV debido a
sus estructuras aromát icas , A pH 7 esta absorción es muy fuerte
a 260 nm . Sin em bargo, c uando las bases nitrogenadas se incorporan e n secuencias de polinucleótidos, varias fuerzas no covale ntes impulsa n interacc iones cercanas entre ellas. Esto reduce
su absorción de luz Uv. Este efecto hipocrómico es una ayuda
invaluable en los estudios de los ácidos nucleicos. Por ejemplo,
las variaciones de absorción se utilizan de forma hab itual para
detectar la rotura de la estructura de doble cade na del DNA o la
división hidrolític a de las cadenas de polinucleótidos med ia nte
e nzimas.
Las fuerzas de unión que mantienen juntas las cadenas complementarias del DNA pueden romperse, Este proceso, que se
denomina desnaturalización (Fig. 17 A), lo estimulan el calor,
las concen traciones salin as bajas y los valores de pH extremos.
(E l calentamiento es e l método más comú n de desnaturalización
en las investigaciones de los ácidos nucleicos debido a que puede
controlarse con facilidad,) Cuando se calienta con lentitud una soluc ión de DNA, la absorc ión a 260 nm permanece constante hasta
que se alcanza una temperatura umbra l. En este mome nto aumenta la absorbancia de la muestra (Fig. 178). El cambio de absorbancia lo produce e l desapilamiento de las bases y la rotura del
aparea miento de bases. La temperatura a la que se desnaturaliza
la mitad de la muestra de DNA, que se denomina temperatura de
fusión (TIll ) , varía e ntre las mol écul as de DNA según su composic ión de bases. [Recuérdese que e l número de e nlaces de hidró-
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1.04
25 31
ONA renaturalizado
37 43 49 55 61 67 73 79 85 91
Temperatura (oC)
FIGURA 178
Desnaturalización del DNA
FIGURA 17A
Desnaturalización y renaturalización del DNA
En cond iciones adecuadas, el ONA que se ha desnaturalizado
puede naturalizarse de nuevo, es decir, las cadenas con sec uenc ias
complementarias vuelven a formar una doble hélice.
(a) Cuando el DNA nati vo se ca li enta, su absorbancia no camb ia hasta
que se alcanza una temperatura determinada. La "temperatura de fusión"
T de una molécula de DNA varía con su composición de bases. (b)
C';;ando el DNA desnaturalizado se enfría, su absorbancia cae, pero a
lo largo de una curva diferente. No vuelve a su valor de absorbancia
original. (e) El ONA rehibridado (renalllrali zado) puede prepararse
manteni endo la temperatura 2SOC por debajo de la temperatura de
desnaturalización durante un largo periodo.
17.1 DNA
MÉTODOS
BIOQuíMICOS
655
cont
FIGURA 17C
Patrón de la secuencia de DNA del genoma del ratón
El grado de repetición de los segmentos del DNA total del ratón se
determina midiendo los valores de Col de varias fracciones del genoma. La
línea punteada señala los valores calculados. La cinética de reasociación
de los genomas eucariotas generalmente revela tres clases primarias
de secuencias: secuencias repetitivas que se rehibridan con rapidez (a),
secuencias de complejidad intermedia (b) y secuencias únicas que se
rehibridan con lentitud (c).
106
104
105
103
10 2
1O
Cot (moles x s/Iitro)
FIGURA 170
~ -- Molécula de DNA
1
1
~
-'\..-/-./--../~-'1 ----./,
'-
!
2
\
\ \
~
Electroforesis en gel de agarosa
\\
\
\
\
\ \
\\
_____ Fragmentos
separados
por tamaño
, , ,\
'b=====_=~
Filtro de
nitrocelulosa
Gel
Fragmentos de DNA
'"~~'-.---~
J -. J/
(1) El análisis del DNA comienza con su digestión por medio
de una enzima de restricción. (2) Los fragmentos de DNA se
separan mediante electroforesis en gel de agarosa. (3) Los
fragmentos de DNA se transfieren a un papel filtrante de
nitrocelulosa en condiciones desnaturalizantes. (4) El ssDNA
sobre el papel filtrante de nitrocelulosa se hibrida con una
sonda de ssDNA marcada radiactivamente. (5) Cualquier DNA
hibridado puede verse mediante autorradiografía.
Enzimas de restricción
/ ___ ---..r-
--,~
Hibridación de Southern
Bandas de DNA
/
/
\
::::::::-:::.:::::::::=:-:'=:::::::::::::::::-::::::::::-::::::,
----\..---'~-
'----------------'~
Flujo del
amortiguador
Filtro de
nitrocelulosa - con los fragmentos
en las mismas
posiciones que en
el gel
• •
• •
•
• •
\
\\
,
,
\\
" "
\ \
\ "\
•
Hibridación con sondas
radiactivas de DNA,
lavado yautorradiografía
\
\
, , - - - - - Autorradiografía que muestra los
fragmentos híbridos de DNA
Gel que
contiene las
bandas de DNA
Filtro de
nitrocelulosa
Material
absorbente
Transferencia de
los fragmentos al filtro
656
CAPíTULO DIECISIETE
MÉTODOS
Ácidosnucleicos
BIOQuíMICOS
Corte
5'
cont
Corte
•
GAATTC
•
3'
CTTAAG
CTTAAG
5'
GAATTC
111111111111111 1 11 1 11111111111
3'
t
t
Corte
Corte
5' - - - - G
AATTC
111
1111111I 1 1 1
3' - - - - CTTAA
G
AATTC - - - - 3'
1 11111111 I II I f 11 1 1111111
G - - - - CTTAA
G - - - - 5'
FIGURA 17E
Enzimas de restricción
Las endonucleasas de restricción son enzimas aisladas de bacterias que cortan el
DNA en secuencias específicas. En este ejemplo, la enzima EcoRI (que se obtiene
de E. coli) hace cortes escalonados que dan lugar a la formación de "extremos
adherentes". Un "extremo adherente" es un extremo de cadena individual de un
fragmento de DNA bicatenario. Los extremos adherentes facilitan la formación de
DNA recombinante porque un segmento monocatenario de un fragmento de DNA
puede hibridarse con un extremo adherente complementario de otro fragmento de
DNA. Algunas enzimas de restricción hacen lo que se denomina "cortes romos".
Véase una exposición del DNA recombinante en el recuadro Métodos bioquímicos
del Capítulo 18 titulado Genómica, págs. 700 a 707.)
geno entre los pares GC y AT Y las interacciones de apilamiento
de las bases afectan la estabilidad del DNA. (Véase la pág. 632.)
Por lo tanto, para "fundir" las moléculas de DNA con un contenido elevado de G y C se requiere más energía.] Si las cadenas de
DNA separadas se mantienen a una temperatura aproximadamente 25°C por debajo de la T rn durante un tiempo prolongado, la renaturalización es posible. La renaturalización, o reasociación, no
ocurre de manera instantánea debido a que las cadenas exploran
varias configuraciones hasta que alcanzan la más estable (i.e., en
la que se aparean las regiones complementarias).
La fusión del DNA es muy útil en la hibridación de los ácidos
nucleicos. Las moléculas de DNA de cadena individual de diferentes procedencias se asocian ("hibridan") si hay una homología
significativa de secuencia (i.e., semejanzas estructurales). Si una
muestra de DNA se fracciona en trozos pequeños uniformes, la
velocidad de reasociación depende de la concentración
de cadenas de DNA y de las semejanzas estructurales
entre ellas. Las velocidades de reasociación han proporcionado información valiosa sobre la estructura del
genoma. Por ejemplo, los organismos varían en el número y en los tipos de secuencias únicas que contiene
su genoma. (Una secuencia singular sólo sucede una
vez por genoma haploide.) El número relativo de secuencias únicas y repetidas puede determinarse construyendo una curva Cot, que proporciona una medida
de renaturalización (donde Ca es la concentración de
ssDNA en moles/litro y t es el tiempo transcurrido en
segundos). Los científicos han determinado a partir de
curvas Cal que la velocidad de reasociación desciende
al hacerse los genomas mayores y más complejos. En
la Figura 17C se presenta la frecuencia de secuencias
de DNA únicas y repetidas, que se determina al medir
las velocidades de reasociación del genoma del ratón.
La hibridación también puede utilizarse para situar
y/o identificar genes específicos u otras secuencias
de DNA. Por ejemplo, se puede estudiar el ssDNA de
dos procedencias diferentes (p. ej., células tumorales
y células normales) para comprobar diferencias de secuencia. Si se biotinila un conjunto de ssDNA, después
los híbridos de doble cadena se unen a una columna
de avidina. Si hay alguna secuencia sin hibridar, ésta
Polimerasa de DNA I
+ 4 dNTPs +
1
I
--'-'~_--'-". Cebador
marcado
I
I
ddATP
ddTTP
ddCTP
~
~
~
I
ddGTP
~
T
T
A
G
A
C
C
C
G
A
Gel de
acrilamida
T
A
A
G
C
C
C
G
FIGURA 17F
Método de terminación de cadena de Sanger
C
A
Se elige un cebador específico de forma que la síntesis de DNA
comience en el punto de interés. La síntesi s de DNA continúa hasta que
se incorpora un didesox inucl eótido radiactivo y se termina la cadena. A
continuac ión se separan mediante electroforesis en gel los productos de
las reacciones y se analizan a través de autorradiografía. Los fragmentos
migran según el tamaño. La secuencia se determina ·'Ieyendo" el gel.
/
Secuencia
de DNA de la
cadena original
17.1 DNA
MÉTODOS
BIOQuíMICOS
657
cont
atraviesa la columna y luego puede aislarse y ser identificada. En
la hibridación de Southern (Fig. 17D), sondas de DNA o RNA
(secuencias con identidades conocidas) marcadas radiactivamente
localizan una secuencia complementaria en medio de un digerido
de DNA, que en general contiene un gran número de fragmentos
heterogéneos de dicha molécula. Un digerido de DNA se obtiene
tratando una muestra de DNA con enzimas de restricción que cortan en secuencias específicas de nucleótidos (Fig. 17E). (Las enzimas de restricción que producen las bacterias, las protegen contra
las infecciones víricas cortando el DNA del virus en secuencias
específicas .) Una vez digerida la muestra, se separan los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa según sus tamaños .
Tras bañar el gel en NaOH 0.5 M, un proceso que convierte el dsDNA en ssDNA, los fragmentos se transfieren a un papel filtrante
de nitrocelulosa colocándolos sobre una esponja húmeda en una
bandeja con un amortiguador con concentración salina elevada.
(La nitrocelulosa tiene la propiedad única de unirse con firmeza
al ssDNA.) Se coloca papel filtrante seco absorbente en contacto
directo con el emparedado filtro de nitrocelulosa/gel de agarosa.
Al pasar el amortiguador a través del gel y del papel filtrante por
capilaridad, se transfiere el DNA y queda unido de forma permanente al filtro de nitrocelulosa. (La transferencia del DNA al
filtro produce el "manchado" característico de esta técnica.) A
continuación se expone el filtro de nitrocelulosa a la sonda marcada radiactivamente, la cual se une a cualquier 'ssDNA con una
secuencia complementaria. Por ejemplo, un mRNA que codifique
la ¡3-globina se une específicamente al gen de dicha proteína, aunque el mRNA de la ¡3-globina carezca de los intrones en el gen . Al
parecer existe un apareamiento de bases suficiente entre las dos
moléculas de cadena individual para localizar el gen.
Secuenciación del DNA
La determinación de la secuencia de nucleótidos del DNA ha proporcionado datos valiosos en campos como la bioquímica, la medicina y la biología evolutiva. El análisis de las largas secuencias de
DNA comienza con la formación de fragmentos menores utilizando
una clase de enzima de restricción. A continuación, cada fragmento
se secuencia de forma independiente por el método de terminación
de cadena. Igual que con las determinaciones de la estructura primaria de las proteínas, estos pasos se repiten con un conjunto distinto de fragmentos de polinucleótidos (que se generan mediante
otra clase de enzima de restricción) que se solapen con el primer
conjunto. La información de la secuencia de ambos conjuntos de
experimentos ordena los fragmentos en la secuencia completa.
La secuenciación del DNA mediante el método de terminación de cadena (Fig. 17F), diseñado por Frederick Sanger,
utiliza enzimas de restricción para romper grandes segmentos
de DNA en fragmentos más pequeños. Cada fragmento se separa en dos cadenas, una de las cuales se utiliza como molde
para producir una copia complementaria. La muestra se divide
después en cuatro tubos de ensayo. A cada tubo se añaden las
sustancias que se requieren para la síntesis de DNA [p. ej ., la
enzima polimerasa de DNA, los c uatro desoxÍlTibonucleótidos
trifosfatados y un cebador (un segmento corto de una cadena
de DNA complementaria) marcado con 32p] . Seleccionando el
cebador apropiado, el investigador determina en sitio en que se
iniciará la secuenciación.
Además de un molde, materiales para la síntesis de DNA y
un cebador, cada uno de los cuatro tubos contiene un derivado
de 2' ,3' -didesoxinucleótido diferente. (Los derivados didesoxi
son análogos sintéticos de los nucleótidos en los que los grupos
hidroxi de los carbonos 2' y 3' se han sustituido por hidrógenos.) Los didesoxinucleótidos pueden incorporarse a la cadena
polinucleotídica creciente pero no pueden formar un enlace fosfodiéster con otro nucleótido. Como consecuencia, cuando se
incorpora un didesoxinucleótido se termina la cadena. Debido a
que se utilizan cantidades pequeñas de didesoxinucleótidos, se
incorporan al azar en las cadenas crecientes de polinucleótidos.
Por lo tanto , cada tubo contiene una mezcla de fragmentos de
DNA con cadenas de diferente longitud . Cada cadena recién
sintetizada acaba en un residuo de didesoxinucleótido. Los productos de reacción de cada tubo se separan mediante electroforesis en gel y se analizan juntos mediante autorradiografía. Cada
banda del autorradiograma corrcspondc a un polinucleótido que
se diferencia en un nucleótido menos del que le precede en una
de los cuatro carriles del autorradiogr<;lma. Obsérvese que el
polinucleótido más pequeño aparece en el fondo del gel debido
a que se mueve más rápido que las moléculas más grandes.
Una versión automatizada del método de Sanger permite la
secuenciación rápida y eficiente del DNA. En lugar de utilizar
cebadores con marcas radiactivas, emplea didesoxinucleótidos
etiquetados con fluorescencia. Debido a que cada análogo didesoxi tiene una fluorescencia diferente, el proceso completo
puede realizarse en un único tubo de ensayo. Después se cargan
los productos de la reacción y el experimento se realiza en un
solo gel de electroforesis. Tras explorar el gel con un detector,
un ordenador determina la secuencia de las bandas coloreadas
(Fig. 17G).
GCG ACA T CAC T CCA GC TTG AA GCA GTT C TT C TCGT C TT C TGTTTTGT C T AAC TTGT C TT CC TT C TT C T C TT CC TGTTT AA G AA GAG AA
500
510
520
530
540
550
560
570
580
FIGURA 17G
Secuenciación automática del DNA
Utilizando marcadores fluorescentes en los didesoxinucleótidos , un detector puede explorar un gel con rapidez y determinar la secuencia a partir del
orden de los colores de las bandas .
•
658
CAPíTU LO DI EC I SIETE
Ácidos nuc[eicos
BIOQuíMICA EN PERSPECTIVA
Investigaciones forenses
¿Cómo se utiliza el análisis de DNA en la investigación de crímenes violentos? El DNA persiste durante muchos años en muestras biológicas deshidratadas
(p. ej. , sangre, saliva, pelo y semen) y en los huesos. Por consiguiente, el DNA puede utilizarse como prueba en cualquier tipo
de investigación forense en la que se disponga de esas muestras.
Las técnicas de análisis de DNA que se utilizan de forma habitual
para verificar la identidad de las víctimas y/o de los autores de
crímenes violentos se denominan tipificación de DNA , o perfil
de DNA. La tipificación de DNA requiere el análisis de varias secuencias muy variables que se denominan marcadores. Utilizando conjuntos de secuencias variables, los investigadores pueden
proporcionar perfiles genéticos identificativos únicos para cada
ser humano.
Desde la década de 1990, en numerosos casos judiciales la
tipificación de DNA ha proporcionado información decisiva
acerca de la presencia o ausencia de un acusado en el lugar de un
crimen. Las técnicas de las que se dispone varían en su capacidad
para diferenciar personas y en la velocidad con la que pueden
obtenerse los resultados. La identificación genética, que introdujo en 1985 el genetista británico Alec Jeffreys, es una variante
de la hibridación de Southern. En esta técnica, se comparan las
características de las bandas de los minisatélites de DNA (véase
la pág. 652) de diferentes personas; por ejemplo, muestras de
DNA del lugar del delito con las de los sospechosos (Fig. 17H).
Cuando la cantidad de DNA que se extrae de la muestra del lugar
del delito es demasiado pequeña para poder analizarla, se amplifica por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
una técnica usada para amplificar el número de copias de DNA
de una muestra diminuta. Es posible obtener hasta 109 copias.
(Véase la pág. 703.) Por consiguiente, el DNA de una sola célula
es suficiente para realizar un análisis de identificación genética.
Se aísla el genoma completo de cada muestra y se trata con una
enzima de restricción. (Las enzimas de restricción son un grupo de enzimas producidas por bacterias que cortan moléculas de
DNA en sitios específicos de la secuencia de bases. En células
bacterianas , impiden o " restringen" la replicación de DNA externo, por lo común vírico.)
Debido a las variaciones genéticas . las secuencias minisatélite de DNA se fragmentan de forma diferente. (Estas diferencias
genéticas se denominan polimorfismos de la longitud de los
fragmentos de restricción, o RFLP.) Tras separar los fragmentos de restricción según su tamaño, por medio de electroforesis
en gel de agarosa, y transferirlos a papel filtrante de nitroce lulosa, se exponen a so ndas marcadas radiactivamente. Debido a
que los tamaños de los fragmentos que se unen a estas sondas se
diferencian de una perso na a otra, se han utilizado con éxito los
patrones de bandas para condenar o absolver a sospechosos de
casos criminales.
Aunque los análisis de RFLP son un método exacto, tienen
limitaciones. Entre ellas se encuentran las cantidades susta nciales
de tiempo (6 a 8 semanas), el trabajo y la experiencia que se requieren para obtener los perfiles de DNA. Una metodología más
reciente que analiza
repeticiones cortas en
tándem (STR) (secuencias
de DNA con repeticiones de
entre 2 y 4 bp, que se denominan
microsatélites, véase la pág. 652) tiene un poder de discriminación mucho mayor que los RFLP y es rápida en términos relativos
(varias horas).
Además, las secuencias STR son lo suficientemente robustas
para que esta técnica pueda utilizarse con éxito a fin de analizar
muestras degradadas. Después de que se ha extraído el DNA de
una muestra, varias secuencias STR diana se amplifican por medio de la PCR y se unen a moléculas de colorante fluorescente .
En Estados Unidos se emplean 13 marcadores de DNA polimórficos (muy diversos) centrales para generar perfiles genéticos
y lograr distinguir individuos. El perfil de DNA, que se produce
cuando se separan los productos de la PCR en un gel electroforético, es el patrón y el número de repeticiones de cada secuencia
diana sobre el gel. La detección por fluorescencia incrementa la
sensibilidad de la técnica. A diferencia de los RFLP, las técnicas
de tipificación de DNA que se basan en las STR pueden automatizarse con facilidad . Si se comparan los perfiles de DNA de
ejemplares individuales y se determina que son idénticos, se dice
que las muestras son compatibles . Si los perfiles de DNA que
FIGURA 17H
Manejo forense de la identificación genética
En muchos juicios. el análisis de los RFLP (polimorfismos de la long itud
de los fragmentos de restricción) de muestras biológicas recuperadas
en e l lugar de un delito proporciona una prueba concluyente de que un
acusado (o un convicto) dejó o no rastros de su DNA úni co en la escena
de un crimen.
17.2 RNA
PERSPECTIVA cont
se comparan no son idénticos, se dice que proceden de orígenes
diferentes . Los resultados se dan en términos de probabilidades de
una compatibilidad aleatoria (la probabilidad de que una persona
elegida al azar tenga un perfil de DNA idéntico al de la muestra
659
de interés, como el dejado en el lugar del crimen). La utilización
de varios marcadores y la sensibilidad de la metodología reducen
la probabilidad de compatibilidad aleatoria hasta al menos uno en
varios miles de millones.
RESUMEN : Los científicos forenses utilizan una técnica llam ada PCR para
amplificar el ONA recuperado del sitio de un crimen y generar el perfil genético único que
distingue a un individuo de todos los demás.
17.2
RNA
Durante muchos años se consideró que los ácidos ribonucleicos eran una clase de
polinucleótidos que participaban en algún aspecto de la síntesis de proteínas. Sin
embargo, una serie de pruebas que se acumulan con rapidez revelaron que los RNA
son moléculas sorprendentemente versátiles que realizan funciones que antes se pensaba que eran competencia exclusiva de proteinas. Son ejemplos la regulación de la
expresión génica, la diferenciación celular, la impronta genómica y la catálisis. Las
propiedades funcionales de los RNA se deben a su estructura. La estructura primaria
de los polilTibonucleótidos es similar a la de sus contrapartes de DNA, pero existen
varias diferencias.
1. El azúcar del RNA es ribosa en lugar de la desoxirribosa del DNA. La presencia del grupo 2' -OH de la ribosa hace al RNA más reactivo que el DNA.
2. Las bases nitrogenadas del RNA se diferencian en cierta medida de las que
se observan en el DNA. En lugar de timina, las moléculas de RNA utilizan
Ul·acilo. Además, las bases de algunas moléculas de RNA son modificadas por
diversas enzimas (p. ej ., metilasas, tiolasas y desaminasas).
3. A diferencia de la doble hélice del DNA, el RNA es monocatenario. Por esta
razón, el RNA puede enrollarse sobre sí mismo y formar estructuras tridimensionales singulares y con frecuencia bastante complejas (Fig. 17.26). La
forma de estas estructuras la determina el apareamiento de bases complementarias de secuencias específicas de RNA, así como el apilamiento de bases
y las interacciones que ocurren entre regiones de doble cadena (formadas a
partir de regiones monocatenarias de la misma molécula o entre regiones monocatenarias de moléculas vecinas) y lazos de RNA libres. En las regiones
de doble cadena se aplican las reglas del apareamiento de bases, donde se
unen A-U, G-U y G-c. Las regiones de RNA en lazo o de cadena individual
(ssRNA) contienen varias bases modificadas en las moléculas de RNA maduro no mensajero. La composición de bases del RNA no sigue las reglas de
Chargaff, porque las moléculas de RNA son monocatenarias.
4. Las moléculas de RNA tienen propiedades catalíticas debido a que pueden
formar estructuras tridimensionales complejas con hendiduras de unión . La
mayoría de las moléculas de RNA catalítico, que se conocen como ribozimas,
catalizan autoesci sión o la rotura de otros RNA. Sin embargo, el ejemplo más
notable de actividad de ribozima es la formación de enlaces peptídicos dentro
de los ribosomas. Suele requerirse un ion magnesio como cofactor para la
catálisis por RNA, porque el Mg2+ estabiliza los estados de transición .
Los clases más destacadas de RNA son el RNA de transferencia, el RNA ribosomal y el RNA mensajero . A continuación se consideran la estructura y la función
Horquilla
A = púrpura
C = rojo
G = verde
U = amarillo
Cadena
individual
(a)
Lazo axial
(b)
FIGURA 17 . 26
Estl"Uctura secundaria del RNA
(a) En las molécul as de RNA se producen
muchos tipos diferentes de estructuras
secundarias. (b) Lazo ax ial. Obsérvese que
las horquillas y los lazos axiales de RNA se
forman a causa de las sec uencias repetitivas
invertidas de los palíndromos de DNA (véase
la pág. 641).
660
CA p íTU LO DIE C I SIETE
Ácidos nucleicos
de cada una de estas moléculas. Se describen también algunos ejemplos de otras
clases menos abundantes de RNA, denominadas moléculas de RNA no codificadoras
(ncRNA).
RNA de transferencia
Las moléculas de RNA de transferencia (tRNA) transportan los aminoácidos a los
ribosomas para su ensamblaje en las proteínas. Representan alrededor del 15% del
RNA celular y la longitud promedio de una molécula de tRNA es de 75 nucleótidos.
Debido a que cada una de estas moléculas se une a un aminoácido específico, las
células poseen al menos una clase de tRNA para cada uno de los 20 aminoácidos
estándar. La estructura tridimensional de las moléculas de tRNA, que se asemeja a
una hoja de trébol alabeada (Fig. 17.27), es consecuencia en primera instancia de un
gran apareamiento de bases intracatenario. Las moléculas de tRNA contienen diversas bases modificadas. Entre ellas se encuentran la seudouridina, la 4-tiouridina, la
l-metilguanosina y la dihidrouridina:
o
~0N-H
~;lN~O
I
Ribosa
Seudouridina
Ribosa
4-Tiouridina
Ribosa
Dihidrouridina
Ribosa
1-Metilguanosina
La estructura del tRNA le permite realizar dos funciones esenciales en las que intervienen el extremo 3' y el lazo anticodón. El extremo 3' forma un enlace covalente
3'
/ Unión del aminoácido
OH
(a)
0-
~'- Tallo anticodón
FIGURA 17 .27
RNA de transferencia
(a) Estructura tridimensional de una molécula
de tRNA. (b) Representación esquemática
de una molécula de tRNA. Se indican las
posiciones de las bases que no varían y de las
bases que varían con poca frecuencia.
\
(b)
Py
'--v----'
Anticodón
Brazo variable
17.2 RNA
con un aminoácido específico. (Esta especificidad es posible gracias a que las enzimas llamadas sintetasas de aminoacil-tRNA unen cada aminoácido con su tRNA
correspondiente.) El lazo anticodón contiene una secuencia de tres pares de bases
que es complementaria con un triplete de bases del DNA que codifica un aminoácido
específico. La relación conformacional entre el extremo 3' Y el lazo anticodón permite al tRNA alinear de manera correcta el aminoácido que porta durante la síntesis
proteínica. (Véase el Capítulo 19.) Los tRNA también poseen otras tres características
estructurales notables, denominadas lazo D, lazo T\jiC, y lazo variable. (La letra griega
psi, \ji, representa la seudouridina, una base modificada.) Estas estructuras facilitan la
unión específica a la sintetasa de aminoacil-tRNA apropiada y el alineamiento correcto del aminoacil-tRNA dentro del andamiaje nucleoproteínico del ribosoma. El lazo D
se conoce así porque contiene dihidrouridina. De modo similar, el lazo T\jiC contiene
la secuencia de bases timina, seudouridina y citosina. Los tRNA pueden clasificarse
con base en la longitud de su lazo variable. La mayOlía (cerca del 80%) de los tRNA
tienen lazos variables con 4 o 5 nucleótidos, mientras que otros tienen lazos variables
de hasta 20 nucleótidos.
RNA ribosomal
El RNA ribosomal (rRNA) es la forma más abundante de RNA en las células. (En la
mayoría de las células, el rRNA constituye aproximadamente el 80% del RNA total.)
La estructura secundaria del rRNA es muy compleja (Fig. 17.28). Aunque existen
diferencias entre las especies en las secuencias primarias de nucleótidos del rRNA,
la estructura tridimensional global de esta clase de moléculas está conservada. Como
sugiere su nombre, el rRNA es un componente de los ribosomas.
Como se ha descrito, los ribosomas son complejos ribonucleoproteínicos citoplásmicos que sintetizan las proteínas. Los ribosomas de las células procariotas y de las
eucariotas tienen una forma y función semejantes, aunque se diferencian en tamaño
y composición química. Ambos tipos de ribosomas constan de dos subunidades de
tamaño desigual , que en general se denominan en términos de sus valores de S.
(S es una abreviatura de la unidad de Svedberg [o de sedimentación], que es una medida de la velocidad de sedimentación en una centrífuga. Debido a que la velocidad
de sedimentación depende del peso molecular y de la forma de una partícula, los
valores de S no son necesariamente aditivos.) Los ribosomas procariotas (70 S) están
formados por una subunidad 50 S Y una subunidad 30 S, mientras que los ribosomas
eucariotas (80 S) contienen una subunidad 60 S y una subunidad 40 S.
En cada tipo de subunidad ribosomal se encuentran varias clases diferentes de
rRNA y de proteínas. La subunidad ribosomal grande de E. coli, por ejemplo, contiene rRNA 5 S y 23 S y 34 polipéptidos. La subunidad ribosomal pequeña de E.
coli contiene un rRNA 16 S Y 21 polipéptidos. U na subunidad ribosomal eucariota
grande típica contiene tres rRNA (5 S, 5.8 S y 28 S) Y 49 polipéptidos; la subunidad
pequeña contiene un rRNA 18 S y alrededor de 30 polipéptidos. El rRNA sirve como
un andamiaje para el autoensamble de proteínas para formar la subunidad ribosomal
nativa y al parecer tiene funciones enzimáticas, en especial en las procariotas. (El
rRNA desnudo puede realizar con lentitud la función ribosomal nonnal.)
RNA mensajero
Como su nombre sugiere, el RNA mensajero (mRNA) es el transportador de la información genética desde el DNA para la síntesis de proteínas. Las moléculas de mRNA,
que constituyen cerca del 5% del RNA celular, varían considerablemente de tamaño.
Por ejemplo, el número de bases del mRNA de E. coli varía de 500 a 6000.
El mRNA procariota y el eucariota se diferencian en varios aspectos. En primer
lugar, muchos mRNA procariotas son policistrónicos, es decir, contienen información que codifica varias cadenas polipeptídicas. Por el contrario, el mRNA eucariota
codifica un solo polipéptido y por lo tanto se denomina monocistrónico. (Un cistrón
es una secuencia de DNA que contiene la información que codifica un polipéptido
y varias señales que se requieren para la función del ribosoma.) En segundo lugar,
los mRNA procariotas y los eucariotas se procesan de forma diferente. Al contrario
661
662
CAPíTULO DIECISIETE
Ácidosnucleicos
FIGURA 17 .28
Estructura del rRNA
Aunque difieren sus sec uencias, la estructura
tridimensional de estos rRNA de (a) E. coli
y de (b) Saccharomyces cerevisiae (una
levadura) parecen muy semej antes.
(b)
(a)
que los mRNA procariotas, que se traducen en proteínas por medio de los ribosomas
mientras que se sintetizan o inmediatamente después, los mRNA eucariotas se modifican en gran medida. Estas modificaciones incluyen la formación de un casquete
(la unión de una 7-metilguanosina al residuo terminal S' ), el corte y empalme (la .
eliminación de los intrones) y la unión de un polímero de adenilato que se denomina
cola de poli (A). (En el Capítulo 18 se describen cada uno de estos procesos.)
RNA no codificador
Como ya se mencionó, el conjunto total de transcritos de RNA producidos por
una célula se denomina transcriptoma. El análisis de transcriptomas ha revelado una
cantidad muy grande de RNA no codificadores (nc) funcionales. El conocimiento
actual, aunque incompleto, sugiere que los ncRNA forman una extensa y compleja
red reguladora. Entre los ncRNA más importantes están el microRNA, el RNA corto
interferente y el RNA nucleolar corto. Los microRNA (miRNA) y los RNA cortos
interferentes (siRNA) son de los ncRNA más pequeños y ambos intervienen en un
proceso de degradación de RNA llamado interferencia del RNA (RNAi). La RNAi,
alguna vez llamada silenciamiento del RNA, probablemente surgió como un mecanismo de defensa. Se emplea para desactivar o degradar moléculas de RNA con dos
fines: (1) regular la expresión génica en procesos de desarrollo mediante desactivación de genes seleccionados y (2) proteger células contra genomas de RNA vírico.
Los RNA nucleolares cortos (snoRNA) son RNA monocatenarios que contienen
de 70 a 1000 nucleótidos; facilitan modificaciones químicas del rRNA dentro del
nucléolo. Codificados dentro de los intrones de los genes de rRNA, los snoRNA son
un componente de la ribonucleoproteína nucleolar pequeña (snoRNP) . La función de
los snoRNA (más de 100 en el ser humano) es guiar la snoRNP por medio de apareamiento de bases hacia el sitio de secuencia específico en un rRNA diana. Las modificaciones que OCUlTen durante el procesamiento del rRNA incluyen la metilación del
2/-0H de la ribosa y la isomerización de uridina para formar seudouridina.
"),~
"O-~
OH OH
Uridina
Seudouridina
17.3 Virus
Hay cinco RNA nucleares cortos (snRNA): Ul, U2, U4, U5 y U6. Constituidos por
100 a 300 nucleótidos, los snRNA se combinan con varias proteínas para formar ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP o "snurps"). Junto con otras proteínas, las
snRNP constituyen una máquina molecular llamada empalmosoma debido a su función: el corte y empalme es un paso clave en el procesamiento de los mRNA eucariotas.
Los empalmosomas escinden intrones del pre-mRNA y luego unen los exones.
Cuando se transcribe un gen, sólo una cadena de DNA actúa como molde para la
síntesis de la molécula de RNA. Esta cadena se denomina antisentido (o no codificadora); la cadena de DNA que no se transcribe se denomina cadena con sentido (o
codificadora). La secuencia de bases de la cadena codificadora es la versión de DNA
del mRNA que se utiliza para sintetizar el producto polipeptídico del gen. El RNA
antisentido (el transcrito de la cadena de DNA antisentido) participa en la regulación
de la transcripción y de la traducción . Un RNA antisentido puede unirse específicamente a un mRNA correspondiente e impedir la traducción.
Debido a que la unión mRNA-RNA antisentido es tan específica, las moléculas
no codificadoras se consideran herramientas de investigación prometedoras. Numerosos investigadores están utilizando las moléculas de RNA antisentido para estudiar
la función eucariota activando y desactivando de forma selectiva genes específicos.
La denominada genética inversa es también útil en la investigación médica. Aunque
se han encontrado problemas serios en la investigación de elementos antisentido (p.
ej., la inserción ineficaz de los oligonucleótidos dentro de las células y los elevados
costos de fabricación), la tecnología antisentido ha proporcionado ya un conocimiento valioso de los mecani smos de varias enfeQlledades (p. ej., cáncer e infecciones
víricas).
Considerando la siguiente secuencia de DNA con sentido:
SI -GCATICGAATIGCAGACTCCTGCAATICGGCAAT-3 I
Determínese la secuencia de su cadena complementaria. A continuación descífrense
las secuencias del mRNA y del RNA antisentido. (Recuérdese que en la estructura
del RNA, la T se cambia por U. De tal manera que una A en la cadena de DNA se
aparea con un U al sintetizarse el RNA.)
17.3 VIRUS
Los virus carecen de la mayoría de las propiedades que diferencian a lo vivo de lo
muerto. Por ejemplo, los virus no pueden realizar sus propias actividades metabólicas. Sin embargo, en condiciones adecuadas pueden causar estragos en los seres
vivos. Los virus, que a menudo se describen como parásitos intracelulares obligados,
también pueden considerarse como elementos genéticos móviles debido a su estructura, es decir, cada uno de ellos consta de un trozo de ácido nucleico encerrado dentro
de una cubierta protectora. Una vez que un virus ha infectado una célula hospedadora, su ácido nucleico puede secuestrar al de la célula y a su maquinaria de síntesis de
proteínas. Al acumularse los componentes del virus , se producen nuevas partícul as
víricas completas que luego libera la célula hospedadora. En muchas circunstancias,
se produce tal cantidad de virus que la célula hospedadora se lisa (se rompe). Por otra
parte, el ácido nucleico del virus puede insertarse en un cromosoma del hospedador,
lo que da lugar a la transformación de la célula, como se expone en el recuadro Bioquímica en perspectiva titulado "Modos de vida" víricos (págs. 665 a 670).
Los virus han fascinado a los bioquímicos desde que se sospechó su existencia
a finales del siglo XIX. Impulsada en gran medida por la actuación de los virus en
numerosas enfermedades, la investigación vírica ha beneficiado en gran medida a la
bioquímica. Debido a que los virus subvierten la función celular normal para producir nuevos virus, una infección vírica puede proporcionar una visión única del metabolismo celular. Por ejemplo, la infección de las células animales ha proporcionado
663
CONCEPTOS CLAVE
• El RNA es un ácido nucleico que participa en
varios aspectos de la síntesis de proteínas y
en el control de la expresión génica.
• Las clases más abundantes de RNA son el
RNA de transferencia, el RNA ribosomal y
el RNA mensajero.
• Algunos RNA no codificadores de importancia son el miRNA, el siRNA, el snoRNA y
el snRNA .
664
CAPÍTULO DIECISIETE
una información inestimable y relativamente inequívoca sobre los mecanismos que
glucosilan a las proteínas recién sintetizadas. Además, se han elucidado diversos mecanismos genéticos eucariotas con la ayuda de los virus y/o de las enzimas víricas. La .
investigación vírica también ha proporcionado información sustancial con relación
a la estructura del genoma de los organismos eucariotas y de los procariotas y a la
carcinogénesis (los mecanismos por los que las células normales se transforman en
células cancerosas). Por ejemplo, investigaciones recientes revelan que la infección
por uno o más tipos de virus del papiloma humano es un prerrequisito para el desarrollo dc cáncer cervicouterino. Por último, los virus han sido inestimables en la
creación de la tecnología del DNA recombinante.
(a)
Estructura de los virus
(b)
(e)
~
¿
(d)
Ácidosnucleicos
&
(e)
(1)
FIGURA 17 . 29
Virus representativos
(a) Poxv irus. (b) Rabdovirus. (e) Virus de la
parotiditi s. (d) Baeteriófago de col a flexible.
(e) Viru s del herpes. (f) Virus del papiloma.
&
_CO
-,--N
_C
_E_P_TO
-,--S
- ,-Cl_A_V_E_ _
=_:::;;;,
• Los virus están formados por un ácido nuc\eieo encerrado en una cubierta protectora.
El ácido nuc\eico puede ser DNA o RNA de
cadena individual o de doble cadena.
• En los virus sencillos la cubierta protectora,
que se denomina eápside, está formada por
proteínas.
• En los viru s más compl ejos la nueleocápside, formada por ácido nuc\eico y prote ínas,
está rodeada por una cubierta membranosa
que procede de la ¡mem.brflpa d!; célula '
.,
.
hospedadora.
la
Desde 1892, cuando el investigador ruso Dmitri 1vanovski aisló por vez primera'
el virus del mosaico del tabaco, se han identificado cuantiosos virus. Debido a que
no están claros sus orígenes y su desarrollo evolutivo, la clasificación científica de
los virus ha sido difícil. Con frecuencia, los virus se han asignado a grupos según
propiedades como su aspecto microscópico (p. ej. , los rabdovirus tienen un aspecto
con forma de bala), las estructuras anatómicas donde se aislaron por primera vez (p.
ej., los adenovims se descubrieron en las glándulas adenoideas, una clase de tejido
linfoide) o los síntomas que producen en los organismos hospedadores (p. ej., los
virus del herpes producen empciones cutáneas que se diseminan, y el virus del papiloma induce la formación de papilomas, un tipo de verruga). En los últimos años,
los científicos han tratado de crear un sistema de clasificación sistemático basado
principalmente en la estructura vírica, aunque otros factores son también importantes
(p. ej. , el hospedador y la enfermedad que producen).
Los virus se presentan en un conjunto desconcertante de tamaños y formas. Los
viriones (partículas víricas completas) tienen un diámetro que oscila entre 10 y
-400 nm . Aunque la mayoría de los virus son demasiado pequeños para poder verse
con el microscopio óptico, unos pocos (p. ej., los poxvirus) pueden verse debido a
que son tan grandes como las bacterias más pequeñas.
Los viriones simples están formados por una cápside (una cubierta proteínica
construida por moléculas proteínicas entrelazadas denominadas capsómeros), que
encierra al ácido nucleico. (El término nucleocápside suele utilizarse para describir
el complejo formado por la cápside y el ácido nucleico.) La mayoría de las cápsides
son helicoidales o icosaédricas (estructuras de 20 lados formadas por capsómeros
triangulares). El ácido nucleico componente de los viriones es DNA o RNA. Aunque
la mayoría de los virus poseen DNA de bicatenario (dsDNA) o RNA de cadena individual (ssRNA) , se han observado algunos genomas con DNA de cadena sencilla
(ssDNA) y RNA dúplex (dsRNA). Existen dos clases de genomas ssRNA. Un genoma de RNA de sentido positivo [( + )ssRNA] actúa como un rnRNA gigante, es decir,
dirige la síntesis de un largo polipéptido que se rompe y se procesa en moléculas más
pequeñas. Un genoma de RNA de sentido negativo [( - )ssRNA] es complementario
de la secuencia de bases que dirige la síntesis de las proteínas del virus. Los vims
que utilizan genomas (- )ssRNA deben proporcionar una enzima, que se denomina
transcriptasa inversa, que sintetiza el rnRNA.
En los virus más complejos, la nucleocápside está rodeada por una cubierta membranosa, que en general procede de la membrana plasmática o nuclear de la célula
hospedadora. Las proteínas de la cubierta, que codifica el genoma del virus, se insertan en la cubierta membranosa durante el ensamblaje del virión. Las proteínas
que sobresalen de la superficie de la cubierta, que se denominan espículas, se cree que
participan en la unión del virus a la célula hospedadora. En la Figura 17.29 se presentan algunos vims representativos.
17.3 Virus 66 5
BIOQuíMICA EN PERSPECTIVA
"Modos de vida" víricos
¿Cómo infectan y dañan los virus a las células
hospedadoras? A pesar de la diversidad de las estructuras Bacteriófago T4
de los virus y de las clases de células hospedadoras que infectan, en
el ciclo vital de todos los virus hay varios pasos básicos: infección
(penetración del virión o de su ácido nucleico en la célula hospedadora), replicación (expresión del genoma del virus), maduración
(ensamblaje de los componentes del virus en los viriones) y liberación (emisión de los nuevos viriones por la célula hospedadora).
, Cada clase de virus debe ex plotar alguna de las reacciones metabólicas normales de sus células hospedadoras para completar el ciclo
vital debido a que los virus normalmente sólo poseen la informa1
ción genética suficiente para especificar la síntesis de sus propios
componentes. Por esta razón , existen numerosas variaciones sobre
; estos pasos básicos. Este punto puede demostrarse comparando los
ciclos vitales de dos virus muy estudiados: el bacteriófago T4 y el
,1
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
El bacteriófago T4 (Fig.
171) es un virus grande con
una cabeza icosaédrica y un a
cola larga y compleja semejante a la estructura del T2 (pág. 638).
La cabeza contiene dsDNA y la cola se engancha a la célula hospedadora e inyecta el DNA viral.
El ciclo vital del T4 (fig. · 17J) comienza con la adsorción del
~irión a la superficie de una célula de E. coli. Debido a que la pared de la célula bacteriana es rígida, el virión completo no puede
penetrar en el interior y en su lugar se inyecta el DNA flexionando
y encogiendo el aparato de la cola. Una vez que ha entrado el
DNA en la célula, el proceso infeccioso se completa y comienza
la fase siguiente (replicación).
Fibras de la cola
CITOPLASMA
(a)
(b)
FIGURA 171
Bacteriófago T4
(a) Estructura de un bucteriófago T4 intacto. (b) Penetración de la pared celular del hospedador por un bacteriófago e inyección del DNA vírico
(vDNA ). El vDNA dirige la síntes is. por parte de la célula hospedadora. de unas 30 proteínas que facilitan la producción de nuevos viriones.
'
666
CAPíTULO DIECISIETE
l BIOQuíMICA
Ácidos nucleicos
EN PERSPECTIVA cont
FIGURA 17.1
Ciclo vital del bacteriófago T4
Las partículas del virus se adsorben
sobre la superfic ie de la célula
bacteriana y se inyecta el genoma
de l virus (infecc ión). Si el virus entra
en la fase líti ca, la maq uinaria de la
célula hospedadora se d iri ge hac ia
la producc ión y liberac ión de nuevas
partícul as del virus. Si el virus entra
en la fase li sogénica, e l genoma del
virus se integra en el DNA de la
célul a hospedadora y después puede
entrar en la fase lítica.
Fase
lisogénica(
'"
Fase \ .
lítica ~
El DNA del virus se inserta en
el cromosoma del hospedador
_ ...Á
)
)
17.3 Virus
BIOQuíMICA EN PERSPECTIVA
667
cont
A los 2 minutos de la inyección del DNA del fago T4 en una célula
de E. eoli, se detiene la síntesis de DNA, de RNA y de proteínas y
comienza la producción del mRNA del fago. El mRNA del fago codifica la síntesis de proteínas de la cápside y parte de las enzimas que se
requieren para la replicación del genoma del virus y para el ensamblaje
de los componentes del virión. Además, se sintetizan otras enzimas
que debilitan la pared celular de la célula hospedadora, de forma que
puedan liberarse nuevos fagos para nuevas rondas de infección. Cerca
de 22 minutos después de ser inyectado el DNA vírico (vDNA), la
célula hospedadora (llena de varios centenares de nuevos viriones) se
lisa. Tras la liberación, los virioncs se enganchan a bacterias cercanas,
iniciando de esta fOlma nuevas infecciones.
El bacteriófago que inicia este denominado ciclo lítico se denomina virulento debido a que destruye sus células hospedadoras. Sin embargo, muchos fagos no destruyen en principio a sus
hospedadores. Los denominados fagos temperados o lisogénicos
integran su genoma en el de la célula hospedadora. (El término
lisogenia describe una condición en la que el genoma del fago
se integra en el cromosoma del hospedador.) El genoma del virus
integrado (que se denomina profago) se copia junto con el DNA
del hospedador durante la división cel ul ar un tiempo indefinido.
En ocasiones, los fagos lisogénicos pueden entrar en una fase
lítica. Determinadas condiciones externas, como la luz UV o la
radiación ionizan te, activan al profago, el cual dirige la síntesis de
nuevos viriones. Algunas veces, una célula bacter-iana que se lisa
libera unos pocos viriones que contienen parte del DNA bacteriano junto con el DNA del fago. Cuando un virión así infecta una
nueva célula hospedadora, este DNA se introduce en el genoma
del hospedador. Este proceso se denomina transducción.
VIH
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente causal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida). Si no se
trata, el sida es una enfermedad mortal debido a que el VIH destruye el sistema inmunitario del cuerpo, dejándolo sin defensas
frente a organismos patógenos (p. ej. , bacterias, protozoos, hongos y otros virus) y a algunas formas de cáncer.
El VIH (Fig. 17K) pertenece a un grupo singular de virus RNA
denominados retrovirus. Los retrovirus se denominan así debido
a que contienen una actividad enzimática que se denomina transcriptasa inversa, la cual sintetiza una copia de DNA a partir de un
genoma ssRNA. Un retrovirus típico consta de un genoma RNA
encemldo en una cápside proteínica. Enrollada alrededor de la
cápside se encuentra una cubierta membranosa que se forma a
partir de la bicapa lipídica de la célula hospedadora.
En el ciclo reproductor del retrovirus VIH (Fig . 17L), el proceso infeccioso comienza cuando e l virus se une a una célula
hospedadora. La unión, que tiene lugar entre la superficie g lucoproteínica del virus y los receptores específicos de la membrana plasmática, inicia un proceso de fusión entre la membrana de
la célula hospedadora y la membrana del virus. A continuación,
la cápside del virus se libera dentro del citoplasma y la transcriptasa inversa del virus cataliza la síntesis de una cadena de DNA que
es complementaria del RNA del virus. Esta actividad enzimática
cataliza también la conversión del DNA de cadena individual en
una molécula bicatenaria. La vers ión del DNA dúplex del genoma
vírico se traslada después al núcleo, donde se integra en el cromosoma de l hospedador. El genoma provírico integrado, que actúa
como un profago, se replica cada vez que la célula sintetiza DNA.
Los transcritos de mRNA que se producen cuando se transcribe el
genoma del virus dirigen la síntesis de numerosas copias de sus
proteínas. Los nuevos virus, que se crean como copias del genoma de RNA del virus, se empaquetan con proteínas del virus y se
liberan de la célula hospedadora por un proceso de "gemación".
El VIH contiene un núcleo cilíndrico dentro de su cápside.
Además de dos copias de su genoma (+ )-ssRNA, el núcleo contiene varias enzimas: transcriptasa inversa, ribonucleasa, integrasa
y proteasa. Las moléculas de RNA están recubiertas con varias
copias de dos proteínas de bajo peso molecular, p7 y p9. (Los números en los nombres de éstas y otras proteínas indican su masa
en kilodaltones; por ejemplo, p7 es una proteína con un a masa de
7ld).) El propio núcleo COI) forma de bala está formado por centenúes de copias de p6 y las copias de p 17 forman un recubrimiento
interno de la cubierta del virus. La envoltura del VIH contiene dos
proteínas víricas importantes, gp120 y gp41, además de proteínas
del hospedador.
La infección por el VIH se produce debido a la exposición directa del tOlTente sanguíneo de una persona a los líquidos corporales de una persona infectada. La mayoría de los casos de infección
por VIH se deben a contacto sexual, transfusiones sanguíneas y
transmisión perinatal de la madre al hijo. Una vez que el VIH ha
entrado en el cuerpo, se cree que infecta a las células que portan el
antígeno CD4 en sus membranas plasmáticas. El grupo principal
de células que ataca el VIH son los linfocitos T-4 colaboradores
del sistema inmunitario. Esas células desempeñan una fUIlción
esencial en la regu lación de las actividades de otras células del sistema inmunitario. Ahora se sabe que la infección de las células T
requiere la interacción del complejo gp120-CD4 con un receptor
de quimiocinas, que actúa como correceptor. (Los agentes quimiotácticos del sistema inmunitario, llamados quimiocinas, estim ul an la unión de las células T al unirse a receptores locali zados
sobre la membrana plasmática de las células T.) En las primeras
fases de la infección, el cOITeceptor CCR5 (o menos a menudo el
CXCR4) ayuda al VIH a entrar en las cél ul as; otras células que
se sabe son infectadas por el VIH son ciertas células intestinales
y del sistema nervioso central. Pruebas recientes sugieren que los
seres humanos con dos copias de un gen que codifica una variante
del receptor CCR5, CCR5-6.32, son resistentes a la infección por
el VIH. Al parecer e l CCR5-6.32 también protege contra la peste
y la viruela, pero aún conside rando las tres enfermedades, la parte
de la población que se beneficia es relativamente pequeña.
Una vez que la proteína gp 120 de la cubierta del VIH se une al
antígeno CD4 y al receptor de quimiocinas en la célula T, la cubierta del virus se fusiona con la membrana plasmática de la célula
hospedadora. Las dos cadenas de RNA se liberan al citoplasma. La
transcriptasa inversa, un heterodímero con varias actividades enzimáti cas, catali za a continuación la síntesis de un ssDNA utilizando
como molde el vRNA. La activ idad RNasa heterodimérica degrada
posteriormente el vRNA (RNA vira l). La misma proteína produce
un vDNA bicatenario mediante la formac ión de una cadena complementaria del ssDNA. La integrasa del virus integra e l vDNA en
el cromosoma de la célula hospedadora. El DNA provírico permanece latente hasta que la célu la T infectada específica se activa por
una respuesta inmunitaria. El DNA provírico puede a continuación
dirigir la síntesis de componentes del virus por parte de la célula.
Los virus recién sintetizados brotan de la célula infectada.
668
CAPíTULO DIECISIETE
Ác idosnucleicos
BIOQU ¡MI CA ÉN PERSPECTIVA
cont
gp41 - - - - - - - - - =
HLA de
clase 11 DR
HLA de
clase I
p6
p17
p24
Proteasa
Lípido
RNA
RT
FIGURA 17K
Estructura del VIH
La superficie del virus es una bicapa lipídica en la que están embebidas las glucoproteínas víricas gp 120 Y gp41 Y las proteínas
de membrana HLA (antígenos leucocitarios humanos) que se han cogido de las células hospedadoras. (Las proteínas HLA
son señales que protegen la partícula vírica del sistema inmunitario. que en general busca y destruye los invasores extraños.)
Recubriendo el interior de la cubierta hay centenares de copias de la proteína estructural p17. Dos copias del genoma de RNA
están contenidas dentro de una cápside con forma de bala formada por p6 y p24. Unidas al RNA están p7 y p9. Las enzimas
asociadas con el genoma del virus son la transcriptasa inversa (RT), la integrasa y la proteasa.
Las investigaciones recientes que utilizan chips con matrices
microscópicas de DNA (véase el recuadro Métodos bioquímicos
titulado Genómica en el Cap. 18, págs. 700 a 707) han proporcionado algunos de los detalles sobre los mecanismos moleculares
por medio de los cuales el VIH deteriora el funcionamiento de
los linfocitos T-4. Controlando la expresión del mRNA de más
de 6000 genes de manera sim ultánea, los investigadores han rastreado las consecuencias de la infección por el VIH. Han observado
que a los 30 minutos de la infección, se suprime la expresión de
alrededor de 500 genes celulares y 200 se han activado. En horas,
el mRNA de la célula hospedadora se ha sustituido en gran medida por mRNA del virus. El virus ha inutilizado la capacidad de
la célula para generar energía y reparar el daño del DNA que ha
causado el virus.
La muerte celular se desencadena por varios mecanismos, entre los que se encuentran los siguientes:
1. La activación vírica de los genes que inducen la apoptosis (muerte celular programada), un mecanismo celular
normal mediante el cual las células responden a señales
externas como las que ocun'en durante los procesos del
desarrollo.
2. El brote simultáneo de numerosas partículas víricas de la
membrana celular puede desganar la membrana y producir
fugas masivas que no pueden repararse.
17.3 Virus
Partícula del VIH
FIGURA 17L
Ciclo reproductor del VIH, un retrovirus
Tras unirse la partícula del virus a los receptores de superficie sobre la célula hospedadora (a), su cubierta se funde con la membrana
plasmática de la célula (b) , liberando así la cápside y su contenido [(vRNA) y varias enzimas del virus] al citoplasma (e). La enzima
del virus transcriptasa inversa cataliza la síntesis de una cadena de DNA complementaria del vRNA (d) y luego procede a formar una
segunda cadena de DNA que es complementaria de la primera. A continuación, el DNA bicatenario del virus (vDNA) se transfiere al
núcleo, donde se integra a sí mismo en un cromosoma del hospedador con la ayuda de la integrasa vírica (e). El provirus (el genoma
vírico integrado) se replica cada vez que la célula sintetiza un nuevo DNA. La transcripción del DNA del virus da lugar a la formación
de dos copias de transcritos de RNA: moléculas de RNA que actúan como el genoma vírico (f) y moléculas que codifican la síntesis de
proteínas del virus (p. ej. , transcriptasa inversa, proteínas de la cápside, proteínas de la cubierta e integrasa del virus) (g). Las moléculas
proteínicas se combinan con el genoma de vRNA durante la creación de nuevos virus (h) que brotan de la superficie de la célula
hospedadora (i) y luego proceden a infectar a otras células (j).
66 9
670
CAPíTULO DIECISIETE
Ácidosnucleicos
BIOQU íMICA EN PERSPECTIVA
cont
4. La unión de moléculas de superficie gp 120 a los receptores
CD4 de células normales cercanas conduce a la formación
de grandes masas celulares multinucleadas no funcionales
que se denominan sincitios.
membranas que recubren el encéfalo y la médula espinal), la toxoplasmosis (lesiones cerebrales, daño cardiaco, trastornos renales y
anomalías fetales) , las infecciones por citomegalovirus (neumonía, insuficiencia renal , daño hepático y ceguera) y la tuberculosis.
La infección por el VIH está también asociada con varios tipos de
cáncer, el más común de los cuales es un cáncer poco frecuente
de la piel que se denomina sarcoma de Kaposi.
La infección por el VIH progresa a través de varias fases, cuya
longitud puede variar considerablemente de una persona a otra.
Los síntomas primarios, que aparecen en general pronto tras la exposición inicial al virus y que duran varias semanas son fiebre, letargia, cefalea y otros trastornos neurológicos, diarrea y adenomegalia. (Los anticuerpos frente al VIH son detectables durante este
periodo.) La exacerbación de estos síntomas, que recibe el nombre
de complejo relacionado con el sida (ARC), a menudo puede repetirse. Finalmente, el sistema inmunitario queda tan afectado que
la persona se hace susceptible a enfermedades oportunistas graves
y se dice que ha desarrollado sida. El tiempo que se requiere para
la aparición de este síndrome puede variar de 2 años a 8 o 10 años.
Por razones desconocidas, unos pocos pacientes no presentan sida
aun después de 15 años de la infección por el VIH. (Recientemente
se ha sugerido que algunas de estas personas están infectadas con
variantes atenuadas del VIH.) Algunas de las enfermedades más
frecuentes relacionadas con el sida son la neumonía por Pneumocystis carinii, la meningitis por criptococos (inflamación de las
No existe cura para el sida. El tratamiento busca suprimir los
síntomas (p. ej., antibióticos para las infecciones) y lentificar la
reproducción del virus. Las tasas de mortalidad han disminuido
desde 1995 debido a la introducción de un protocolo de tratamiento que se denomina tratamiento con antirretrovíricos muy
activos (HAART), que consiste en combinaciones de fármacos
de las categorías siguientes: (1) inhibidores nucleósidos de la
transcriptasa inversa (NRTI) (p. ej., azidotirnidina, que también
se denomina zidovudina o AZT), (2) inhibidores no nucleósidos
de la transcriptasa inversa (NNRTI) (p. ej., efavirenz) e inhibidores de la proteasa (p. ej. , indinavir). Los NRTI y NNRTI inhiben
la síntesis del vDNA que cataliza la transcriptasa inversa. Los
inhibidores de la proteasa son una clase de fármacos que evitan
el procesamiento de la proteína del virus que se requiere para el
ensamblaje de los nuevos viriones.
Debido a que el genoma vírico muta con frecuencia (i.e., sus
antígenos de superficie se alteran), la obtención de una vacuna
para el sida es problemática.
3. La liberación masiva de vims recién fOlmados por una célula, dirigida por el provims, puede destruir tanto a la célula
que llega a desintegrarla.
RESUMEN : La infección vírica altera el funcionamiento celular. Al suprimir algunos
genes celulares y activar otros, el gen ama vírico dirige las células hospedadoras para que
produzcan nuevos virus en un proceso que a menudo causa la muerte celular.
Recuérdese que según el dogma central, el flujo de la información genética va de
DNA a RNA y luego a proteínas. Los retrovirus son una excepción a esta regla. Las
alteraciones del dogma central que se observan en los retrovirus y otros virus RNA
pueden ilustrarse de la forma siguiente:
Compárese esta ilustración con la original del dogma central (pág. 629). Descríbanse
las implicaciones de cada componente de estas figuras.
Lecturas recomendadas
67 1
Resumen del capítulo
l. La información que se requiere para dirigir todos los procesos
vitales está almacenada en la secuencia de nucleótidos del
DNA. Éste está formado por dos cadenas antiparalelas de
polinucleótidos enrolladas una sobre la otra para formar una
doble hélice dextrógira. Los enlaces desoxirribosa-fosfodiéster forman los esqueletos de la doble hélice y las bases de los
nucleótidos se proyectan hacia su interior. Los apareamientos
de bases de los nucleótidos se forman debido a los enlaces de
hidrógeno que se forman entre determinadas bases: adenina
con ti mina y citosina con guanina.
2. Varios tipos de interacciones no covalentes contribuyen a la
estabilidad de la estructura del DNA: interacciones hidrófobas
y de van der Waals entre bases heterocíclicas apiladas, enlaces
de hidrógeno entre pares de bases GC y AT, e hidratación con
moléculas de agua. La decodificación de la información genética contenida en el DNA requiere una maquinaria molecular
constituida principalmente por proteínas.
3. Las mutaciones son cambios de la estructura del DNA , que
pueden producirse por colisiones con las moléculas de un
solvente, fluctuaciones térmicas, ROS , radiación o xe nobióticos. En una mutación por transición, una base pirimídica es
sustituida por otra pirimidina o una base púrica es sustituida
por otra purina. En una mutación por transversión, una base
púrica es sustituida por una pirimídica, o a la inversa.
4. El DNA puede tener varias conformaciones dependiendo de
la secuencia de nucleótidos y del grado de hidratación de la
doble hélice. Además de la estructura clásica determinada
por Watson y Crick (DNA B), se han observado también las
conformaciones DNA A Y DNA Z. El superenrollamiento
del DNA es una característica esencial de diversos procesos
biológicos, como el empaquetamiento, la replicación y la
transcripción del DNA.
5. Cada cromosoma eucariota está formado por nucleohistonas ,
un complejo que se forma por el enrollamiento de una única
molécula de DNA alrededor de un octámero de histonas
para formar un nucleosoma. Varios tipos de modificación
covalente de las histonas (p. ej. , acetilación y meti lación)
cambian la estructura y la función de las histonas de los nucleosomas. Los DNA de las mitocondrias y de los cloroplastos son semejantes al de los cromosomas que se encuentran
en las procariotas.
6. Un genoma es el conjunto completo de instrucciones heredadas que se requieren para sustentar los procesos vitales de un
organismo. Aunque existen algunas semejanzas, los genomas
de las procariotas y de las eucariotas difieren sustancialmente
COMPANION
OH
W E B S I T E
7.
8.
9.
JO.
en cuanto a tamaño, capacidad de codificación, mecanismos
de expresión génica y continuidad de codificación.
La mayoría de las secuencias de DNA del ser humano no
codifican proteínas ni RNA funcionales. Existen dos clases
generales de secuencias intergénicas: repeticiones en tándem
y repeticiones entremezcladas ampliamente en el genoma. Los
elementos genéticos móviles pueden duplicarse y desplazarse
en el genoma. Los retroposones pueden causar enfermedades
al insertarse en genes o en secuencias rcguladoras. Las modificaciones covalentes del DNA y de las histonas pueden causar
cambios en la expresión génica.
El RNA se diferencia del DNA en que contiene ribosa (en lug¡u'
de desoxin'ibosa), tiene una composición de bases algo distinta
yen general es de cadena individual. Las formas de RNA que
participan en la síntesis de proteínas son el RNA de transferencia, el ribosomal y el mensajero. Las moléculas de RNA
de transferencia tienen aminoácidos específicos unidos a ellas
por enzimas específicas y los transportan a los ribusomas para
su incorporación en las proteínas que se sintetizan, donde se
alinean de manera correcta durante la síntesis de proteínas. Los
RNA ribosomales son componentes de los ribosomas, donde
constituyen sitios de actividad catalítica. El RNA mensajero
contiene dentro de su secuencia de nucleótidos las instrucciones
de codificación para sintetizar un polipéptido específico. Existen varias clases de RNA no codificadores, con diversas funciones en la regulación y en la protección del genoma. Algunos
ejemplos son elmiRNA, el siRNA, el snoRNA y el nsnRNA.
Los virus son parásitos intracelulares obligados. Aunque son
acelulares y no pueden realizar actividades metabólicas por sí
mismos, los virus pueden causar estragos en los seres vivos.
Cada clase de virus infecta una clase específica de hospedador
(o conjunto pequeño de hospedadores). Un virus hace esto
debido a que puede inyectar su genoma o introducir toda la
partícula vírica en la célula hospedadora. Cada virus posee
la capacidad de utilizar los procesos metabólicos de la célula
hospedadora para fabricar copias nuevas de sí mismo, denominadas viriones. Los virus poseen genomas de dsDNA, ssDNA,
dsRNA o ssRNA.
El VIH es un retrovirus que produce el sida. Los retrovirus son
una clase de virus RNA que poseen una actividad transcriptasa inversa que convierte su genoma RNA en una molécula de
DNA. Este vDNA después se inserta en el genoma de la célula
hospedadora, produciendo una infección permanente. Por último, la infección por el VIH destruye el sistema inmunitario de
las personas infectadas .
El lector incrementará su aprendizaje visitando el sitio de red de apoyo de bioquímica
en www.oup.com/us/mckee. donde podrá resolver un examen de opción múltiple
sobre ácidos nucleicos a fin de prepararse para los exámenes de su curso .
Lecturas recomendadas
Beck, s., and Olek, A. (eds.), The Epigenome: Molecular Hide and
Seek, Wiley-VCH, Weinheim , Gennany, 2003.
Biel, M. , Wascholowski , v. , and Giannis , A. , Epigenetics- An
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6 7 2
CAP í TULO DI E C I S I ETE
Ácidosnucleicos
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Palabras clave
agente intercalador, 635
epigenético, 645
min isatélites, 652
ribozima, 659
agente no a[qui lante, 635
empalmosomas, 663
mutación por transición, 633
RNA cortos interferentes, 662
alquilación, 634
exón,650
mutación por transversión, 634
RNA de transferencia, 660
análogos de [as bases, 634
expresión génica, 629
mutaciones puntuales, 633
apoptosis, 668
eucromatina, 648
nucleohistonas, 645
biología molecular, 626
genes, 626
nucleosomas, 645
cadena antisentido, 663
genética, 626
operón, 650
cadena con sentido, 663
genoma,627
perfil de DNA, 658
centró meros, 651
heterocromatina, 648
ciclo lítico, 667
hibridación, 656
polimorfismo de la longitud de
los fragmen tos de restricción,
658
cistrón,661
hibridac ión de Southern, 657
cromatina, 645
hidroxiapatita, 653
profago, 667
proteoma, 629
RNA mensajero, 661
RNA no codificador, 662
RNA nuclear corto, 663
RNA nucleo[ar corto, 662
RNA ribosomal, 661
secuencias intergénicas, 650
SINE, 652
telómeros, 65 1
cromosoma, 642
huellas de DNA, 658
desnaturalización, 654
identificación genética, 658
intrón, 650
repetición entremezclada en todo
el genoma, 652
traducción, 629
DNAA,640
DNA B, 640
LINE, 652
repeticiones en tándem, 651
transcriptoma,627
DNA satélite, 651
lisogenia, 667
repeticiones cortas en tándem, 658
DNA Z, 640
metaboloma, 629
replicación, 627
efecto hipocrómico, 654
método de term inación de cadena, 657
retro posones, 652
microRNA, 662
ribonucleoproteína nuclear pequeña, 663
elemento genético móv il , 652
elementos transponibles del DNA,
652
microsatélites. 652
reglas de Chargaff, 639
retrovirus, 667
tipificación de DNA, 658
transcripción, 627
transcrito, 627
transducción, 667
transposición, 652
transposó n, 652
transposo nes de RNA, 652
Preguntas de revisión
Estas preguntas están disei'iadas para poner a prueba el conocimiento del lector sobre los conceptos clave expuestos en este capítulo,
antes de pasar al siguiente. El lector puede comparar sus respuestas con las soluciones que se proporcionan al fina l del libro yen la Guía
de estudio de apoyo, si así lo desea.
l . Defínanse los siguientes té rminos:
a . genética
b. rep licación
c. transcripción
d. esqueleto azúcar-fosfato
e. bacteriófago
2. Existen varias formas estructurales de l DNA. Menciónen se y
·-descríbase cada forma .
Preguntas de revisión
3. Descríbase la estructura de orden superior del DNA que se
denomina superenrollamiento.
4. Defínanse los siguientes términos:
-a. reglas de Chargaff
b. efecto hipocrómico
c. transposón
d. familia Alu
e. tran scriptoma
5. Escríbanse tres propiedades biológicas facilitadas por el superenrollamiento.
6. Menciónense tres diferencias entre el DNA de las eucari otas y
el de las procariotas.
7. Descríbase la estructu ra de un nucleosoma.
8. Defínanse los siguientes términos:
a. DNA satélite
b. corte y empalme
c. método de terminación de la cadena
d. desnaturali zac ión del DNA
e. retroposón
~Descríbanse las diferencias estructurales entre el RNA y el
DNA.
10. ¿Cuáles son las tres formas más com unes del RNA? ¿Qué
funciones tienen en la célula?
11. El DNA Z recibe su nombre de la conformación en zig-zag
de los grupos fosfato. ¿Qué características de la molécula de
DNA permiten que se forme esta estructura distintiva?
12. Existe un par de bases cada 0 .33 nm de DNA y la longitud
total del DNA de una cél ula humana es de 2
Calcúlese el
número de pares de bases de una sola célula. Suponiendo que
en el cuerpo humano hay 10 14 células, calcúlese la longitud
total del DNA. Compárese esta distancia con la que existe
entre la Tierra y el Sol ( 1.5 X 108 km).
13. Defínanse los siguientes términos:
- a. telómero
b. minisatélite
c. perfil de DNA
d. intrón
e. exón
14. Una muestra de DNA contiene 2 1% de adeni na. ¿Cuál es su
composición porcentual de bases?
15. La temperatura de fusión de una molécula de DNA incrementa al aumentar el contenido de bases Gc. ¿Por qué?
16. Defínanse los siguientes términos:
a. transversión
b. e pigenética
c. agente intercalador
m.
d. UNE
e. SINE
J 2.--.?rganícense los términos siguientes de forma jerárquica:
a. cromosoma
b. gen
c. nucleosoma
d. par de bases nucleotídicas
673
18. Proporciónese la cadena complementaria y el RNA de transcripción que se produce a partir del siguiente segmento de
DNA:
5' -AGGGGCCGTTATCGTT- 3'
19. Defínanse los siguientes términos:
a. transcriptoma
b. RNA no codificador
c. RNA corto nucleolar
d. microsatélite
e. RNA corto interferente
20. ¿Qué son las poliaminas y cuál es su función e n la estructura
deIDNA?
21. Defínanse los siguiente s términos :
a. cadeña consentido
b. efecto hipocrómico
c. transposición
d. transcrito
e. elemento genético móvi{
22. Descríbanse las características estructurales que estabil izan las
moléculas de RNA.
23 . ¿Cómo se retienen los patrones de metilación del DNA de una
generación celular a la siguiente? Véase el recuadro Bioquímica e n perspectiva disponible en línea sobre epigenética y el
epigenoma.
24. ¿Qué causaría más daño a una célula: un error en la replicación del DNA o un error en su transcripción?
25. Cuando un hidrocarburo aromático se intercala entre dos pares
de bases api ladas, ¿qué efecto es posible en la estructura del
DNA?
26. ¿Qué efectos pueden tener las moléculas de hidrocarburos
intercaladas e n la replicación del DNA?
27. La AZT se usa en el tratamiento del sida. Examínese su estructura y sugiérase su mecanismo de acción.
AZT
28. Las reglas de Chargaff se aplican al DNA, pero no al RNA.
¿Por qué?
29. ¿Cómo y por qué se modifican las bases del tRNA?
30. ¿Cómo afecta el agua la estructura del DNA?
674
CAPíTULO DIECISIETE
Ácidosnucleicos
Preguntas para ra.zonar
El objetivo de estas preguntas es reforzar la comprensión de todos los conceptos clave expuestos en el libro hasta el momento. Esfactible
que no tengan sólu una respuesta currecta. Los autores proporcionan soluciones posibles a estas preguntas al final del libro y en la Guía
de estudio de apoyo, para referencia del lector.
de sus genes. Durante este proceso, varios cientos de genes
31. En condiciones fisiológicas , el DNA se encuentra en forma de
mitocondriales se transfirieron al genoma nuclear. Sin embarDNA B. Sin embargo, las horquillas de RNA y los híbridos
go, las mitocondrias ret iene n un genoma con la capacidad de
DNA-RNA adoptan la estructura de DNA A. Considerando las
producir varias proteínas de transporte de electrones. Revísese
diferencias estructurales cntre el DNA y el RNA, explíquese
el transporte electrón ico mitocondrial y sugiérase una razón
este fenómeno.
por la cual estos organelos generadores de energía retuvieron
32. ¿Qué características estructurales de l DNA producen la forlos genes que producen este conjunto de moléculas.
mación de los surcos mayor y menor?
45. J2!1rante el proceso infeccioso, los virus pueden incorporar
33. Explíquese en términos generales cómo participan las polisegmentos del genoma del hospedador en sus estructuras.
aminas en la consec ución de una estructura muy comprim ida
Explíq uese el modo en que este fenómeno puede contribuir a
del DNA.
la aparición de nuevas enfermedades o exacerbar patologías
34. Al co ntrario de la doble hélice del DNA, el RNA se encuentra
existentes.
como una cadena individual. ¿Qué efectos tiene esto sobre la
46. Se ha calculado que cada grupo fosfato del DNA B puede
estructura del RNA?
formar enlaces de hidrógeno con seis moléculas de agua.
35. Jerome Vinograd encontró que el DNA circular de un polioEsbócese un diagrama de un en lace fosfodiéster de DNA con
mavirus se separa en dos bandas diferentes cuando se centrifusus moléculas de agua unidas.
ga. Una banda consta de DNA superenrollado y la otra de
47. Los agentes alquilantes son compuestos que reaccionan con
DNA laxo. ¿Cómo podría identificarse cada banda?
grupos hidro xi lo y amino para formar moléculas alquiladas.
36. El 5-bromouracilo es un análogo de la timina que normalmente se aparea con la aden ina. Sin embargo, el 5-bromouracilo a
Por ejemplo:
menudo se aparea con la guanina. ¿Por qué?
37. El flujo de información genética va del DNA al RNA y a las
proteínas. En determinados virus, el flujo de información va
del RNA al DNA. ¿Es posible que dicho flujo de información
comience desde las proteínas? ¿Por qué?
38. El VIH es un retrovirus. Sugiéranse razones por las que la
producción de una vacuna para evitar la infección por el VIH
es tan difícil de conseguir.
39._ Se desea aislar DNA mitocondrial sin rastros de DNA nuclear.
¿Cómo se realizaría esta tarea?
N-Metilaminocitosina
Citosina
40. A diferencia del DNA de en lace y del DNA desproteinizado,
Cuando un individuo se expone accidentalmente a estas
los segmentos de DNA enro llados en los núcleos de histonas
son relativamente resistentes a las acc iones hidrolíticas de las
sustancias, diversos sistemas fisiológicos son afectados a
través de alteraciones del genoma. No es raro que una de las
nucleasas. ¿Por qué?
consecuencias sea cáncer (prol iferación celular descontrolada
41. El conjunto de moléculas de mRNA presente dentro de una
a causa del daño genómico) cuando ocurre una serie de tales
célula cambia con el tiempo. Explíquese la causa.
exposiciones. Aplicando los conocimientos adquiridos sobre
42. El DNA y el RNA son moléculas con gran cantidad de inforel genoma, sugiérase en términos generales cómo podría
mación. Explíquense la significancia y las implicaciones de
producirse cáncer.
esta afimlación.
48. ~os gemelos idénticos comienzan la vida con genomas y
43. Se ha resuelto finalmente el caso de un asesinato de un niño
de 10 años en un pequeño poblado gracias a los esfuerzos de
- - epigenomas idénticos. ¿Cómo cambian éstos con la edad?
Sugiérase el modo en que podrían usarse tales cambios como
un detective que aprovechó una nueva base de datos estatal de
un recurso forense. [Sugerencia: Consúltese el recuadro BioDNA que contiene muestras de DNA de criminales condenados. Explíqllese cómo se resolvió este caso, comenzando co n
química en perspectiva disponib le en línea sobre epigenética y
la llegada de una unidad de peritos forenses al lugar del asesiel epigenoma, cO'Tespondiente a este capítulo.]
49. Se ha sugerido que el DNA de restos fósiles podría extraerse,
nato. ¿Qué avances tecnológicos hicieron posible la resolución
clonarse y emplearse para revivir especies extintas. Coméntedel caso?
se sobre la factibilidad de esta idea.
44. Algunos organismos se encuentran bajo considerable presión
50. El fluorouracilo es un análogo estructural de la timina. El flúor
para aligerar sus genomas a fin de operar de manera más
promueve la enolización. ¿Cómo se utiliza este efecto en el
eficiente. Como resultado, las mitocondrias de las eucariotas
tratamiento del cáncer?
han perdido en mayor o menor grado la abrumadora mayoría