Resumen: E-077 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Efecto de la adición de productos de Maillard y ácido ascórbico sobre la estabilidad oxidativa de un sistema modelo lipídico Romero, Ana M. - Doval, Mirtha M. - Sturla, Mario A. - Judis, María A. Facultad de Agroindustrias- UNNE. Cdte. Fernández 755, Sáenz Peña (3700), Chaco. Argentina. Te-Fax: 03732-420137. E-mail: judis@fai.unne.edu.ar ANTECEDENTES Las reacciones de Maillard ocurren durante el procesado y almacenamiento de alimentos. Se consideran responsables del “browning” no enzimático e involucran compuestos carbonílicos y aminoácidos o proteínas que conducen a la formación de una compleja serie de productos de reacción, que son conocidos como los PRMs. (Jing y Kitts, 2002). Además de los azúcares reductores, otros compuestos carbonílicos, como los productos secundarios de la oxidación lipídica (aldehídos, cetonas, epóxidos) son capaces de reaccionar con grupos aminos para producir PRMs en alimentos que contienen grasas, cuando son procesados y/o sometidos al calor. Aunque la reacciones de Maillard pueden producir ocasionalmente algún efecto indeseable, son consideradas de gran interés en la industria de los alimentos porque entre sus productos se incluyen precursores naturales de sabores, aromas y componentes coloreados deseables; y porque producen compuestos que exhiben propiedades antioxidantes particularmente en sistemas lipídicos (Brun-Mérimée y col., 2004). Los mecanismos por los que los PRMs actúan como antioxidantes no están claros todavía, pero se considera que los factores más importantes que promueven la inhibición de las reacciones de oxidación de lípidos son: el poder reductor de las estructuras de enodiol que se forman, la propiedad donadora de electrones, las propiedades quelantes de metales de transición de las melanoidinas producidas y la actividad capturadora de especies de oxígeno reactivo de los compuestos de Amadori y melanoidinas, que se desarrollan durante el proceso (Billaud y col, 2004). El malonaldehído (MAD) es el producto secundario principal de la oxidación lipídica en alimentos cárnicos y puede reaccionar con las proteínas musculares produciendo uniones covalentes y uniones cruzadas de moléculas de alto peso molecular (Tironi y col, 2002). Las proteínas sarcoplásmicas (miógeno, globulina, hemoglobina y mioglobina), componentes musculares, son entonces susceptibles a las reacciones de Maillard. Por otra parte, el ácido ascórbico o vitamina C ha sido también utilizado por sus propiedades antioxidantes para extender la vida media de los productos cárnicos. Varios investigadores reportaron que dependiendo de su concentración y de la presencia de iones metálicos, éste puede actuar como un prooxidante o como un inhibidor de la oxidación lipídica (Djenane y col, 2002). Según Elliot (1999) el efecto antioxidante de la vitamina C se debe a la inhibición del oxígeno singulete, y funciona como un sinergista cuando es usado en combinación con otros antioxidantes por promoción o regeneración de las propiedades antioxidantes de estos últimos. Cuando la vitamina C fue usada en combinación con extracto de romero y con taurina, los efectos antioxidantes sobre un sistema cárnico fueron más efectivos que con la vitamina sola (Sánchez- Escalante y col, 2001). El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto antioxidante del agregado de un producto de Maillard de origen cárnico sobre un sistema modelo ácido linoleico puro y evaluar además el efecto sinérgico de la adición de ácido ascórbico. MATERIALES Y MÉTODOS Preparación de los PRMs: Una solución de proteínas sarcoplásmicas de carne bovina, extraída según Wagner y Añon (1985), fue sometida a un tratamiento térmico de 80 ºC durante 4 h con el aldehído malónico (MAD), preparado por hidrólisis ácida del 1,1,3,3-tetraetoxipropano, en una proporción de 1: 3,5. El extracto seco de la fracción soluble de los MRPs formados, fue obtenido por concentración al vacío y utilizado en distintas concentraciones para los ensayos posteriores. Evaluación de la actividad antioxidante de los PRMs: Ácido linoleico (ISN Biomedicals, 99% de pureza), fraccionado en recipientes abiertos con una relación superficie/peso de 1,56 cm2/g, fue usado como sistema lipídico y los PRMs fueron adicionados en concentraciones de 0%, 1% y 10% p/p. La oxidación lipídica fue acelerada por calentamiento en estufa a 80 ºC durante 4 h en la oscuridad, y el seguimiento de la misma se efectuó midiendo la evolución de los siguientes parámetros: formación de Dienos Conjugados (DC) según la técnica de Aubourg (1998) y expresados en ml/mg de muestra; Valor de Peróxidos (PV) a través del método del tiocianato férrico adaptado de Zainol (2003), y expresado en meq. O2/Kg de muestra; y formación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) cuantificadas utilizando una solución de TBA-TCA (ácido tiobarbitúrico-ácido tricloroacético) expresándose los Resumen: E-077 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 resultados en mg MAD/Kg de materia seca. El antioxidante sintético butirilhidroxianisol (BHA) al 0,01% fue usado como control. La actividad antioxidante al tiempo final del ensayo fue calculada para cada indicador como porcentaje de reducción de la peroxidación (PR%) teniendo en cuenta un control sin antioxidante: PR%= [(Valor del indicador de peroxidación sin antioxidante) – (Valor del indicador de peroxidación con antioxidante)/(Valor del indicador de peroxidación sin antioxidante)] x 100 Evaluación del efecto sinérgico por agregado de Vitamina C: Ácido ascórbico (L(+) Ascórbico 99.7% Merck) en concentración de 0,1% fue adicionado al sistema modelo ácido linoleico solo y al sistema ácido linoleico - PRMs 1%. Las muestras fueron sometidas a las mismas condiciones de oxidación y la evaluación de la actividad antioxidante fue seguida midiendo la evolución de los indicadores mencionados en el punto anterior. Análisis estadístico: fue realizado con el software STATGRAPHICS Plus Profesional Versión B 4.0 para Windows. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS Actividad antioxidante de los PRMs: en la Tabla 1, se muestra la evolución de los indicadores de las diferentes etapas de oxidación durante el proceso, para el ácido linoleico. Los resultados obtenidos nos permiten inferir que los PRMs solubles obtenidos a partir de las proteínas sarcoplásmicas y el malonaldehído poseen actividad antioxidante, dependiendo la intensidad del efecto inhibitorio sobre la oxidación del sistema lipídico, de la concentración utilizada y de la etapa de oxidación considerada. Con respecto a la formación de dienos conjugados, marcadores de la primera etapa de oxidación, los PRMs adicionados no mostraron un efecto inhibitorio apreciable ni diferencias significativas para las distintas concentraciones utilizadas. Considerando lo expresado por Billaud y col (2004), respecto de los mecanismos por los que los productos de Maillard actúan como antioxidantes, podríamos suponer que la fracción soluble extraída en este experimento contiene proporciones reducidas de compuestos responsables de la actividad capturadora de especies de oxígeno reactivas o que los mismos evidencian poca actividad sobre matrices lipofílicas. Esto estaría de acuerdo con lo expresado por Wagner y col. (2002), quienes encontraron que el efecto antioxidante de los PRMs difiere de acuerdo con la matriz sobre la que actúa y con la solubilidad de la fracción utilizada. Si analizamos los datos obtenidos para el valor de peróxidos, la mayor concentración de antioxidante utilizada mostró mayor efectividad durante casi todo el tiempo de oxidación, exceptuando los primeros 30 minutos en los que ejerció un efecto prooxidante. Esta habilidad capturadora de radicales, incluyendo la de radicales hidroxilo y superóxido, puede ser explicada por la formación de productos que contienen al menos un grupo hidroxilo en la reacción de Maillard. Sobre la formación de productos secundarios de la oxidación lipídica, examinado a través del análisis de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, ambas concentraciones de los PRMs ensayadas evidenciaron un apreciable efecto inhibitorio, siendo el efecto de la mayor concentración utilizada comparable al del antioxidante sintético durante casi todo el período de calentamiento. Según Mastrocola y col. (2000) el desarrollo de la reacción de Maillard conduce a la formación de estructuras reductoras, tales como la formación de enodioles y de compuestos amino reductantes, que pueden interrumpir la reacción de oxidación por donación de un hidrógeno. Tabla 1. Evolución de los DC, VP y TBARS sobre el sistema ácido linoleico con la adición de PRMs al 0%,!% , 10% y el control BHA Tiempo (h) MRP 0% 0,0 5,223 0,5 5,109 1,0 5,394 1,5 5,625 2,0 5,571 2,5 5,233 3,0 4,833 3,5 4,833 4,0 5,895 Dienos MRP MRP 1% 10% 4,762 4,762 4,515 5,588 4,919 4,553 5,159 4,840 5,433 5,113 4,978 4,859 5,058 4,679 5,030 4,545 4,868 4,827 BHA 0,01% 5,223 5,109 5,202 5,625 5,424 5,233 4,570 4,833 5,268 MRP 0% 3,711 5,612 22,695 41,639 54,381 58,098 55,238 53,464 65,757 Peroxido MRP MRP 10% 1% 1,948 1,948 13,786 7,473 20,249 9,632 24,103 16,907 33,773 22,375 30,846 18,918 48,133 24,797 45,900 22,239 58,847 29,827 BHA 0,01% 3,711 1,963 0,998 0,643 0,716 1,029 1,384 1,578 1,395 MRP 0% 23,163 33,803 55,531 75,377 86,167 86,493 80,776 79,151 97,658 TBARS MRP MRP 1% 10% 24,928 24,928 35,384 26,919 26,412 22,190 45,516 29,448 36,436 26,881 38,456 22,676 52,617 32,062 47,664 30,476 56,776 26,444 BHA 0,01% 23,163 18,884 22,770 28,066 30,634 28,945 24,085 19,747 22,251 Resumen: E-077 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Evaluación del efecto sinérgico por el agregado de Vitamina C: analizando los porcentajes de reducción de la peroxidación para los antioxidantes utilizados y para sus combinaciones al tiempo final del ensayo (Tabla 2), es posible observar que para la formación de dienos conjugados la adición del ácido ascórbico a los PRMs al 1%, no sólo no mostró efecto sinérgico sobre la actividad antioxidante de las mismas sino que además el porcentaje de reducción fue el menor, comparado con los otros antioxidantes. En el caso del valor de peróxidos (valores marcados con asterisco) los porcentajes de reducción, a las 4h, fueron muy elevados debido a la presencia de vitamina C que permanecía aún sin degradar en el sistema, esto interfería con la técnica de detección del indicador. Este efecto fue desapareciendo a medida que pasaba el tiempo, obteniéndose valores más bajos y de efectos sinérgicos. A las 24 horas los valores obtenidos fueron: 30,62% ( porcentaje de reducción) con el agregado de ascórbico solo y 51,66 % con la mezcla de ascórbico y PRMs. Para las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, la combinación de vitamina C con PRMs al 1% mostró un importante efecto sinérgico, resultando el porcentaje de reducción de la peroxidación para dicha combinación más efectiva que los correspondientes a los PRMs al 10 % y al BHA. Esto nos estaría indicando que la vitamina C podría actuar regenerando los PRMs oxidados, debido a la habilidad del ácido ascórbico para reducir los intermediarios reactivos producidos durante la oxidación. (Elliot 1999). Tabla 2. Porcentajes de reducción de la peroxidación del ácido linoleico Porcentaje de Reducción (PR %) Antioxidante Dienos Conjugados Valor de Peróxido TBARS 1 % PRM 17,42 10,51 41,86 10 % PRM 18,11 54,64 72,92 0,1% A A 12,18 99,90 * 50,06 0,1% A A + 1% PRM 4,51 99,91 * 81,24 0,01 % BHA 10,64 97,88 77,22 CONCLUSIONES Los productos de Maillard formados a partir de las proteínas sarcoplásmicas extraídas de carne bovina y malonaldehído (producto secundario de la oxidación lipídica) ejercieron actividad antioxidante en todas las etapas de oxidación del sistema lipídico elegido, siendo éste más intenso en las concentraciones mayores ensayadas. El principal efecto observado para la fracción soluble usada fue el poder reductor, el que podría atribuirse a la presencia mayoritaria en dicha fracción de sustancias que poseen esa propiedad. La acción sinérgica del ácido ascórbico sobre los PMRs, pudo ser observada claramente también en la tercer etapa del proceso de oxidación lipídica (sobre las TBARs), lo que indicaría el efecto protector ejercido por el ácido ascórbico sobre la degradación de las sustancias antioxidantes de los PMRs. Los resultados presentados en este estudio sugieren que la modificación de las proteínas por los productos de la peroxidación lipídica pueden constituir un mecanismo de prevención de la rancidez oxidativa, y que la adición de vitamina C a sistemas alimentarios cárnicos sometidos a cocción podría intensificar este efecto inhibitorio sobre la peroxidación. BIBLIOGRAFIA Aubourg, S. (1998). Lipid Changes During Long-Term Storage of Canned Tuna (Thunnus alalunga). Zlebensm Unters Forsch. 206: 33-37. 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