DEFICIENCIA DE ADHESION LEUCOCITARIA BOVINA (BLAD

DEFICIENCIA DE ADHESION
LEUCOCITARIA BOVINA (BLAD)
Trabajo presentado por Manuel Felez en la
asignatura de Biotecnología aplicada a la patología
molecular
Profesora coordinadora : Pilar Zaragoza Fernández
Índice:
Descubrimiento e importancia de la enfermedad...............2
Síntomas y lesiones............................................................2
Base genético-fisiológica de la enfermedad.......................3
Diagnóstico de la enfermedad............................................7
Tratamiento de la enfermedad..........................................10
Bibliografía.......................................................................10
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B.L.A.D.
Descubrimiento e importancia de la enfermedad
La deficiencia de adhesión leucocitaria bovina, más conocida como BLAD
(bovine leuckocyte adhesion deficiency) es una granulocitopatía bovina que fue descrita
por primera vez en una vaquilla Holstein Friesian por Hagemoser et al. (1983) en
EEUU. Esta patología se caracterizó por una susceptibilidad aumentada a la acción de
agentes infecciosos durante los dos años de vida del animal. Estos autores
documentaron en el animal estudiado una función alterada de los neutrófilos. Pese a una
alta neutrofilia era incapaz de iniciar una respuesta inflamatoria. Posteriormente
Nagahata et al. (1987) describieron en Japón una enfermedad similar, caracterizada por
un síndrome granulocitopático, que afectó a terneros y vaquillas Holstein Friesian
descendientes de ganado proveniente de EE.UU.
El BLAD es una grave enfermedad desde el punto de vista económico. Esta
enfermedad genética ha llegado a causar por sí sola tan grandes pérdidas económicas,
que la declaración de los heterocigotos destinados a la reproducción es de obligado
cumplimiento. Afecta fundamentalmente a la raza Holstein Friesian, la raza lechera más
productiva a nivel mundial.
También se han descrito enfermedades similares en otras especies. En humanos
se llama LAD (deficiencia de adhesión leucocitaria), y el CLAD observado en los
perros de la raza Setter irlandés también presentan síntomas muy parecidos.
Síntomas y lesiones
Los síntomas de esta enfermedad no se manifiestan hasta el séptimo día después
del nacimiento. Hasta entonces, los terneros pueden parecer totalmente sanos, pero tras
la primera semana de vida, comienzan los siguientes síntomas y lesiones:
- Anorexia, caquexia y retrasos en el crecimiento
- Infecciones bacterianas continuas y fiebre elevada
- Dermatitis, úlceras de decúbito y alopecias
- Neutrofilia progresiva y muy temprana en el curso de la
enfermedad
- Neumonía crónica
- Hipertrofia de los ganglios linfáticos superficiales
- Úlceras e inflamaciones granulomatosas de las membranas
mucosas orales y gingivitis
- Diarrea crónica recurrente
- Muerte alrededor de las siete semanas, aunque en algunos casos
pueden sobrevivir durante meses
Tras la muerte, en la necropsia a nivel macroscópico se puede observar lo
siguiente:
- Adenitis y necrosis de ganglios linfáticos en la mayoría de las
vísceras, particularmente en el mesenterio
- Pielonefritis granulomatosa
- Serositis en rumen
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Mucosa necrosada en íleon, con hiperplasia de folículos linfoides,
e infiltración de células plasmáticas, linfocitos y macrófagos
Edema en las áreas paracorticales del encéfalo
Congestión esplénica y calcificaciones en el estroma y vasos
esplénicos
Y profundizando un poco más, a nivel microscópico, hallaríamos:
- Ausencia de neutrófilos en la lámina propia de tejidos inflamados
- Macrófagos con estructuras citoplásmicas con restos bacterianos
- Hiperplasia mieloide granulocítica
- En los vasos sanguíneos del hígado, riñón, corazón, pulmón,
glándulas salivares, abomaso y encéfalo aparece una marcada
leucocitosis neutrofílica
- Marcada retención neutrofílica en el bazo
Base genético-fisiológica de la enfermedad
Para comprender un poco el mecanismo de esta enfermedad, deberemos recordar
algunos mecanismos fisiológicos vistos en otras asignaturas.
Cuando un tejido del organismo de un vertebrado sufre alguna infección o
lesión, se produce una inflamación para combatir el agente causal del daño, si lo
hubiese, y para reparar el tejido afectado.
Por un lado, se produce una vasodilatación, con aumento de la permeabilidad
capilar, lo que supone que entre al tejido fluido rico en complemento,
inmunoglobulinas, y otras proteínas séricas.
También se origina una coagulación sanguínea local: las células endoteliales son
inducidas a expresar moléculas que desencadenan la cascada enzimática de coagulación
sanguínea, de modo que los capilares quedan ocluidos. Esto es importante como
mecanismo para evitar que el microorganismo entre a circulación y se disemine a todo
el cuerpo.
Mientras tanto, el fluido que se ha vertido al espacio tisular desde el plasma
transporta al patógeno, bien solo o englobado por células fagocíticas y presentadoras de
antígeno, por la linfa hasta los ganglios linfáticos regionales, donde se va a iniciar la
respuesta inmune específica.
Por otro lado, el endotelio produce moléculas de adhesión celular. Ello hace que
aumente la capacidad de los leucocitos polimorfonucleados (fundamentalmente
neutrófilos) y de los monocitos a adherirse a dicho endotelio, lo que les llevará a la
extravasación (paso al tejido inflamado). Una vez fuera del vaso, dichas células
fagocíticas migran bajo el estímulo de las citoquinas quimioatrayentes, hasta que llegan
al foco de la infección.
La extravasación de los leucocitos ocurre en cuatro fases:
- Fase de rodamiento: los leucocitos primero interactúan de modo
débil con las células endoteliales (van "rodando" de una célula a
otra). Esta primera interacción se debe a contactos entre
carbohidratos de glucoproteínas del leucocito (como la s-LeX) y
la E-selectina de las células endoteliales, inducida por el TNF-α.
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Adhesión más fuerte, debida ahora a interacciones entre las
moléculas de ICAM-1 también inducidas por el TNF-a en el
endotelio y moléculas de integrinas del leucocito (como la LFA1). Lo interesante aquí es resaltar que normalmente la interacción
entre ICAM-1 y LFA-1 es débil, pero que la IL-8 secretada por
macrófagos tisulares cercanos al endotelio induce un cambio
conformacional en la LFA-1 del fagocito circulante que aumenta
enormemente su afinidad hacia la ICAM-1.
Diapédesis: el fagocito pasa entre dos células endoteliales, y entra
al tejido.
Migración del leucocito fagocítico hasta el lugar de infección bajo
el influjo de citoquinas quimioatrayentes.
Aunque aparentemente sencillo, éste es un proceso complejo cuya eficacia
depende de numerosos factores. En primer lugar, debe haber leucocitos. Los leucocitos
tienen que ser “llamados” mediante unas señales químicas que previamente han tenido
que producir otras células, y éstos han de ser capaces de detectar dicho estímulo.
Después, se tienen que adherir a la pared del vaso y realizar la diapédesis. Una vez fuera
del vaso, deben migrar al lugar donde se encuentra la infección y ser capaces de
combatirla. Un fallo en cualquiera de estos pasos y el proceso de la inflamación se
podría ver drásticamente alterado. En el caso de esta enfermedad, el paso que falla es la
adhesión al endotelio vascular.
Las responsables de las adhesiones entre las células son unas glicoproteínas
llamadas “moléculas de adhesión celular”. Estas moléculas se dividen en 5 familias:
cadherinas, super gen inmunoglobulinas, selectinas, proteoglicano, e integrinas. Un
defecto en una proteína de esta última familia es el causante del BLAD.
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Las integrinas son unas proteínas heterodiméricas transmembrana formadas por
dos cadenas polipeptídicas unidas no covalentemente. Se unen a diferentes ligandos y
transmiten señales a través del citoesqueleto. Estas moléculas son receptoras de matriz y
son expresadas en una variedad de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. Su
expresión se regula por la diferenciación celular y por el estímulo inflamatorio, y éstas
modulan funciones celulares específicas:
- Crecimiento
- Maduración
- Migración
- Proliferación
- Citotoxicidad
- Fagocitosis
De toda la familia de las integrinas, el grupo de moléculas cuya alteración
originarían el BLAD son las β-2-integrinas (Leu-CAM o CD11/CD18), que sólo se
expresan en leucocitos. Éstas intervienen en:
- Funciones leucocitarias
- Quimiotaxis de fagocitos
- Adhesión de leucocitos a sustratos
- Fagocitosis de microorganismos opsonizados
- Adhesión leucocitaria al endotelio activado
Cada una de estas moléculas contiene dos subunidades, α y β, asociadas no
covalentemente, con una estructura α1β1. Todas estas glicoproteínas comparten una
subunidad β idéntica (CD18) y se distinguen inmunológicamente por su subunidad α,
designada CD11a, CD11b y CD11c, para LFA-1α, Mac-1α y p150.95α,
respectivamente.
El BLAD se debe a un defecto de la expresión de la proteína CD18, por una
secuencia anormal del gen, que origina la falta de la subunidad α en una integrina β2 de
las membranas de los neutrófilos aislados de animales enfermos.
Al realizar la secuenciación de la proteína CD18 se observa que en el alelo raro,
aparecen dos puntos de mutación, una silenciosa y una transición que origina la
sustitución de una adenina por una guanina. Los textos no coinciden en el lugar exacto
del cambio de base en el que sucede dicha mutación, aunque todos coinciden que es en
el aminoácido 128 de la secuencia de la proteína donde repercute la mutación,
originando el cambio de una glicina por el ácido aspártico.
Se trata de una mutación autosómica recesiva (no he encontrado el cromosoma
donde sucede) que cumple perfectamente las leyes mendelianas al tener una penetrancia
y expresividad completas. Así que si cruzásemos un animal sano con otro portador, la
mitad de la descendencia sería sana y la otra mitad portadora, por lo que se podría
controlar la enfermedad dirigiendo bien los cruces entre portadores. Sin embargo, si
llegasen a cruzarse dos portadores, el 25% de la descendencia manifestaría la
enfermedad y moriría. El hecho de intentar controlar los cruces siempre es un riesgo de
que una línea reproductora pueda originar casi la mitad de los portadores de una cabaña,
como sucedió en Estados Unidos a mediados de los noventa con la descendencia de
C.M Ivanhoe Bell.
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Diagnóstico de la enfermedad
Para realizar el diagnóstico de enfermos y portadores, la técnica de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988) acoplada a la digestión con
enzimas de restricción (RFLP) ha demostrado que identifica inequívocamente el
genotipo del ganado en un locus determinado (Kehrli et al., 1990; Shuster et al., 1992;
Tammen et al., 1996; Felmer y Butendieck, 1996).
En primer lugar, se deberá proceder a la toma de muestras. Podremos optar entre
coger una muestra de sangre, de semen, o de leche, dependiendo del estado del animal.
Si tomásemos muestra de sangre, la obtendríamos de la vena coccígea. La sangre
debería ser entera, por lo que tendríamos que añadir EDTA como coagulante, ya que el
citrato sódico o la heparina ejercen un efecto indeseable para el ADN a la hora de
amplificarlo. El semen lo obtendríamos directamente de alguna de las pajuelas de
inseminación que se hubiesen preparado del animal. También se podría tomar muestra
de leche de una vaca en lactación. En este caso deberíamos coger dos muestras: una
para la posterior extracción de ADN, utilizando bicromato potásico como conservante, y
otra muestra para enviarla al laboratorio de referencia, conservada con bronopol, para
conocer los distintos parámetros de composición de la leche de cada individuo,
especialmente del número de células somáticas.
Una vez obtenidas las muestras, extraeremos el ADN de ellas. A partir de una
muestra de sangre, tendremos dos métodos de extracción: el método “standard” y el
método “rápido”. El método “standard” se basa en seguir una serie de centrifugaciones
y agitaciones que aíslen los leucocitos y dañen su membrana para posteriormente
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extraer su ADN con lavados de alcohol etílico y resuspendiendo en tampón T.E. En el
método “rápido”, diseñado por OSTA y cols., (1994), se realizan sucesivos lavados con
tampón N.E. con centrifugaciones tras cada lavado. Cuando tenemos los leucocitos
disgregados, digerimos el precipitado con el alcohol y lo conservamos a muy bajas
temperaturas. Cuando lo descongelemos para utilizar ese ADN, deberemos hacerlo a
temperaturas próximas a 0ºC.
Si la muestra la tomamos de semen, existen tres métodos de extracción de ADN:
método “standard”, método “rápido” A y método “rápido” B. El método “standard” es
muy similar al citado anteriormente para la sangre, con la particularidad de que
trabajaremos con tubos que tengan las paredes siliconadas para que no perdamos los
espermatozoides en el proceso. En el método “rápido” A, la muestra se lava y centrífuga
con NaCl y después se resuspende en una solución de NaOH y DITHIOTREITOL para
luego someterla a 100ºC durante 10 minutos. Una vez hecho esto, se resuspende en
tampón TrisClH para neutralizar la muestra, y se recoge el sobrenadante. El método
“rápido” B, como el método “rápido” de la muestra de sangre, también estaría destinado
para conservar en congelación.
En el caso de que la muestra sea de leche, sólo existe el método “rápido”. En
este caso, se comienza centrifugando la muestra para eliminar la grasa y el suero y
quedarnos con las células. Luego se efectúan los lavados con el tampón, se resuspende
en una solución de digestión a temperaturas muy bajas y una vez digerida se sube la
temperatura a 99ºC para inactivar la proteinasa K. Finalmente, se vuelve a congelar a
temperaturas bajo cero para su conservación.
Una vez extraído el ADN, se amplifica in vitro mediante PCR. Para ello
utilizaremos agua pura, tampón de Taq polimerasa, Cl2Mg, los dNTP’s, la Taq DNA
polimerasa, y los cebadores. En este caso, las secuencias de los cebadores, en dirección
5’-3’, serán las siguientes:
5’ TCCGGAGGGCCAAGGGCTA 3’
5’ GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG 3’
Tampoco olvidaremos añadir unas gotas de aceite mineral para evitar la
evaporación de la muestra. El proceso se iniciará con una temperatura de unos 94ºC
para la desnaturalización del ADN, y luego cada ciclo estará formado por tres fases:
desnaturalización (94ºC 30 segundos), hibridación (56ºC 60 segundos) y extensión
(72ºC 30 segundos). Una vez realizados los ciclos deseados, se reducirá la temperatura a
4ºC hasta que se extraigan los tubos del termociclador, para conservar el material
amplificado.
Finalmente, realizaremos la digestión del producto realizado y la visualización
de los resultados. En este caso, para diferenciar las variantes alélicas, se utilizan dos
enzimas de restricción: Taq I y Hae III. Taq I reconoce en el alelo normal la secuencia
que contiene la base que puede mutar y sólo cortará cuando el alelo no esté mutado. Por
ello, en el homocigoto normal aparecerán 2 bandas en la electroforesis posterior, 3
aparecerán en el heterocigoto, y una en el homocigoto mutado. En el caso de Hae III,
tiene 2 puntos de unión. Uno es la secuencia en la que se produce la mutación y, a
diferencia de Taq I, cortará cuando tenga lugar el cambio de base. En la otra secuencia
reconocida por Hae III (que es la misma secuencia que la de la mutación, sólo que en
otro lado del gen), como es una zona estable, cortará prácticamente siempre por ahí. De
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este modo, en el homocigoto normal aparecerán 2 bandas, en el heterocigoto aparecerán
4 y en el homocigoto mutante aparecerán 3.
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Tratamiento de la enfermedad
La enfermedad en sí, a nivel individual no se puede curar; sin embargo, sí se
podría prevenir en la población, haciendo una selección negativa contra el alelo
defectuoso. Si un individuo destinado a la reproducción es portador de BLAD, el
propietario está obligado a declararlo. Aun así, no es tan fácil erradicar dicha
enfermedad, puesto que los individuos que la portan han sido muy seleccionados y son
muy productivos, por lo que mientras quepa la posibilidad de intentar dirigir los cruces
para no tener homocigotos enfermos, los propietarios anteponen la rentabilidad de su
ganado.
Bibliografía:
· FELMER D., Ricardo, BUTENDIECK B., Norberto, BUTENDIECK B., Bárbara et
al. DETECCIÓN DE UN DEFECTO GENÉTICO EN BOVINOS MEDIANTE
UNA PRUEBA DE ADN. Agric. Téc. [online]. ene. 2001, vol.61, no.1 [citado 10
Mayo 2007], p.42-50. Disponible en la World Wide Web:
<http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S036528072001000100005&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0365-2807.
· Arch. Zootec. 49: 505-508. 2000
OBTENCIÓN DE DNA PARA EL ESTUDIO DE BLAD EN TOROS DE
ARGENTINA Y ESPAÑA
Schifferli, C.2, M. Villaroel1, M.V. Arruga1,
·Moléculas Adhesión.
T.M. MsC Juan Luis Castillo N.
Departamento de Especialidades Médicas
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http://www.inflamacion.co.cl/pdf/adhesion.pdf
· Curso de Inmunología General
Enrique Iánez Pareja
Departamento de Microbiología
Universidad de Granada
http://66.102.9.104/search?q=cache:jNNLcW6zttkJ:www.ugr.es/~eianez/inmuno/cap_1
7.htm+fases+de+la+extravasaci%C3%B3n+de+neutr%C3%B3filos+diap%C3%A9desi
s&hl=es&ct=clnk&cd=1&gl=es
· “DETECCIÓN DE PORTADORES DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS
MEDIANTE BIOTECNOLOGÍA GENÉTICA. APLICACIÓN A UN EJEMPLO
CONCRETO: BLAD (DEFICIENCIA DE ADHESIÓN LEUCOCITARIA BOVINA)”
Memoria presentada por D. Francisco José Vázquez Bringas para optar al grado de
Licenciado en Veterinaria.
Zaragoza. 1994
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