1 INOCULACIÓN DE EMBRIONES DE POLLO CON LÍQUIDO CÉFALO-RAQUÍDEO DE PACIENTES ESQUIZOFRÉNICOS. ESTUDIO INMUNO-ELECTROMICROSCÓPICO. S Mesa-Castillo Hospital Psiquiátrico de La Habana. Ciudad de la Habana, Cuba. Correspondencia: Dr. Segundo Mesa Castillo. Calle 9, No. 13305. Aldabó, Ciudad de la Habana, Cuba. E-mail: segundo@infomed.sld.cu 2 INOCULATION OF CHICKEN EMBRYOS WITH CEREBROSPINAL FLUID FROM SCHIZOPHRENIC PATIENTS. IMMUNO-ELECTRON MICROSCOPE STUDY. Segundo Mesa Castillo Psychiatric Hospital of Havana e-mail: segundo@infomed.sld.cu SUMMARY. Introduction. The viral hypothesis of schizophrenia has been considered among the possible etiologies of the disease. Objectives. Different intents of experimental transmission in laboratory animals and in tissue culture using inocules from samples of patient has been reported since the beginig of the last century. Patient and methods. The results obtained of the immuno-electronmicroscopic studies in brain samples from chicken embryos inoculated with cerebrospinal fluid from a female hebephrenic schizophrenic patient are presented. Results. The obtained results are similar to those observed in previous studies of brains from adults’ dead schizophrenic patients and in the brain of aborted fetuses from schizophrenic mothers. These results are related to the presence of particles and a phenomenon of abnormal replication of membranes. Conclusion. The presence of herpes simplex hominis type I virus (HSV-1) antigen in particles and membrane structures in the observed samples constitute an element in favour of the slow viral hypothesis considered for this disease by this virus. The obtained results are compared with those obtained by other authors using the same inoculation techniques. Key words. Cerebrospinal fluid. Chicken embryos. Electron microscopy. Fetuses. Herpes virus. Inoculation. Schizophrenia. INOCULACIÓN DE EMBRIONES DE POLLO CON LÍQUIDO CÉFALO-RAQUÍDEO DE PACIENTES ESQUIZOFRÉNICOS. ESTUDIO INMUNO-ELECTROMICROSCÓPICO. Segundo Mesa Castillo Hospital Psiquiátrico de la Habana, Cuba Correo electrónico: segundo@infomed.sld.cu RESUMEN. Introducción. La hipótesis viral de la esquizofrenia se ha considerado entre las posibles etiologías de la enfermedad. Objetivos. Diferentes intentos de transmisión experimental en animales de 3 laboratorio y en cultivos de tejido usando inóculos procedentes de muestras de pacientes se han reportado desde principios el siglo pasado. Pacientes y métodos. En el presente trabajo se presentan los resultados obtenidos del estudio inmuno-electromicroscópico en muestras de cerebros de embriones de pollo inoculados con líquido cefalorraquídeo de una paciente esquizofrénica hebefrénica. Resultados. Los resultados obtenidos son similares a los observados por nosotros en estudios previos en cerebros de esquizofrénicos adultos fallecidos y en cerebros abortados de fetos de madres esquizofrénicas. Estos resultados se relacionan con la presencia de partículas y con un fenómeno de replicación anormal de membranas en el sistema nervioso de los embriones inoculados. Conclusiones. La presencia de antígeno del virus herpes simplex hominis tipo I (HSV-1) en partículas y en estructuras de membrana en las muestras observadas constituyen un elemento a favor de la hipótesis viral lenta planteada para la enfermedad por este virus. Se comparan los resultados obtenidos con los de otros autores usando la mismas técnicas de inoculación. Palabras claves. Embriones de pollo. Esquizofrenia. Fetos. Inoculación. Líquido céfalo-raquídeo. Microscopía electrónica. Virus herpes. INTRODUCCIÓN. La inoculación de animales de experimentación en el estudio de las enfermedades humanas ha sido una herramienta útil para investigar la posible etiología infecciosa. La utilización de este método de investigación en la esquizofrenia tiene sus primeros antecedentes en los trabajos de inoculación de cerebros de conejos con líquido cefalorraquídeo (LCR) y secreciones faríngeas que siguieron a la pandemia de encefalitis por el virus de la influenza a principios del siglo pasado al pensarse en una posible etiología infecciosa en la esquizofrenia por observarse cuadros de psicosis indiferenciables clínicamente de esta enfermedad durante esta pandemia [1-3]. En la década del 50 dos grupos de investigadores, unos de origen soviético y otros italianos, realizaron pruebas de aislamiento de virus en embriones de pollo, reportando resultados contradictorios al utilizar LCR de pacientes esquizofrénicos como inóculo [4-6]. La falta de un desarrollo adecuado de la virología y la inmunología en estas primeras observaciones determinó aparentemente un estancamiento en el avance de las investigaciones virológicas de la enfermedad. La trasmisión exitosa en dos formas de demencia a primates en la década del 60 [7,8] influyó posiblemente en nuevos intentos de aislamiento de virus en la esquizofrenia, en los trabajos de 4 investigadores ingleses en la década del 70, ahora con técnicas más desarrolladas en cultivos de tejidos, comprobándose que los LCR de la tercera parte de los pacientes esquizofrénicos estudiados, eran capaces de producir efectos citopáticos en cultivos de fibroblastos de embriones humanos. Sin embargo, este efecto no podía trasmitirse a otros cultivos v no se inhibía por inhibidores del ácido nucleico ni de la síntesis proteica, era relativamente termoestable y parecía a estar asociado con partículas de 30 a 60 nm de diámetro. En animales inoculados con este LCR en su descendencia se encontraron algunos con anomalías congénitas que incluían anomalías del sistema nervioso central. Se consideró la posibilidad de una forma viral no replicable. En los estudios realizados en nuestro país en cerebros de fetos procedentes de madres esquizofrénicas, con técnicas inmuno-electromicroscópicas, se encontraron partículas y cuerpos de inclusión dentro de las neuronas que reaccionaban en forma positiva con el antisuero antiherpes simplex hominis tipo I y que morfológica e inmunológicamente eran similares a las partículas e inclusiones encontradas en estudios anteriores en cerebros de pacientes esquizofrénicos adultos [9,10]. Con estos resultados y considerando los primeros trabajos ya referidos, se utilizó LCR que por razones médicas había sido necesario analizar de una paciente esquizofrénica hebefrénica -cuyo feto había sido estudiado con técnicas de inmuno-electromieroscopía- inoculándose este LCR en embriones de pollo, aplicándose las mismas técnicas inmunoelectromicroscópicas. Los resultados de esta investigación son los que se exponen a continuación comparándose los mismos con estudios realizados por otros autores con técnicas de inoculación de LCR de pacientes esquizofrénicos en animales de experimentación y en cultivos de tejidos. MATERIAL Y METODO Se inocularon con LCR de la paciente L.M.S. con criterio diagnóstico para la investigación de esquizofrenia hebefrénica [11], diez huevos de un día de incubación. La inoculación se realizó en la cámara de aire con una décima de cc de LCR, continuándose el proceso normal de incubación. Dos días después se pusieron a incubar cinco huevos controles inoculados con una décima de cc de agua destilada. Al terminar el proceso de incubación se sacrificaron los pollos recién nacidos (inoculados y controles) haciéndose trepanación del cráneo y obteniendo en todos los casos el hemisferio cerebral izquierdo, estudiándose para técnicas de microscopía electrónica e inmuno-electromicroscopía 6 pollos inoculados con LCR y 3 controles inoculados con agua destilada, procediéndose a su fijación inmediata en 5 glutaraldehído-paraformaldehído al 1% durante una hora. Se realizaron dos lavados en buffer fosfato de cinco minutos cada uno. Se procedió posteriormente al bloqueo de la peroxidosa endógena con metanol más peróxido de hidrógeno durante treinta minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se lavó con varios volúmenes de PBS durante 15 minutos. Se lavó con TRIS, tres volúmenes por cinco minutos cada vez. Se usó suero normal de chivo diluido al 1:5. Se añadió después el antisuero durante 24 horas, procediéndose posteriormente al lavado con TRIS (tres volúmenes cinco minutos cada uno). DAB, ocho minutos, a temperatura ambiente y lavado con TRIS, post-fijación con tetróxido de osmio al uno por ciento durante treinta minutos, lavado con buffer fosfato (3 X 15 minutos), etanol al treinta por ciento durante cinco minutos, al cincuenta por ciento durante cinco minutos, al setenta por ciento durante diez minutos y etanol absoluto (3 X 20 minutos). Oxido de propileno (3 X 15 minutos): procediéndose a la inclusión en Epón I durante sesenta minutos, Epón II durante toda la noche, terminándose la inclusión definitiva Se hicieron inclusiones para bloques con diluciones del antisuero al 1/10 y al 1/20, bloques controles de cada dilución, bloques de los controles más control de los bloques controles en cada dilución y técnica general. Se procesaron un total de 87 muestras en los laboratorios de microscopía electrónica del Centro Nacional de Investigaciones Científicas de Cuba y del Departamento de Patología del Instituto de Nefrología. Los trabajos de inoculación se realizaron en el Departamento de Embriología del Instituto de Ciencias Médicas de Cuba. Los pollos inoculados estudiados fueron enumerados del 1 al 6 y los controles 7, 8 y 9. Análisis digital de imágenes. Las imágenes obtenidas en los negativos de inmuno-electromicroscopía en las que no se pudo definir una morfología viral mediante el análisis visual directo de las mismas, fueron procesadas con un analizador de imágenes diseñado por EICISUFI que utiliza el programa IMPROSOR. Previamente las imágenes a analizar fueron captadas en un monitor dé video de 512 X 512 pixels, mediante una cámara de video AVC-3250. Se utilizó también una microcomputadora NEC-XA de propósito general y un digitalizador de imágenes ED-1182. Las imágenes así obtenidas fueron digitalizadas y filtradas en el programa, mejorándose el contraste de las mismas, lo que permitió poner en evidencia mediante un tratamiento de seudocolor, los diferentes niveles de grises de las partículas estudiadas. Todas estas experiencias se realizaron previo consentimiento familiar y de la paciente de la que se obtuvo el líquido céfalo-raquídeo con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Psiquiátrico de la Habana. 6 RESULTADOS Los pollos inoculados presentaron las siguientes alteraciones: No. 1. Parálisis de alas y patas (figura l). No. 2. Paraparesia y anomalía congénita de los dedos de las dos patas. No. 3. Paraparesia y anomalía congénita de los dedos de una pata. No. 4. Falta de desarrollo trófico y motor. No. 5. Pollo de aspecto normal. No. 6. Pollo dentro del huevo con atrofia del hemisferio cerebral izquierdo (sin desarrollo y sin vitalidad). Dos huevos no desarrollaron embrión. Otros dos huevos con muy poco desarrollo del embrión. De los 10 huevos inoculados entre no nacidos (falta de desarrollo del embrión) y nacidos con problemas: 9 para un 90%. De los pollos controles de 5 huevos, 2 con embriones muertos dentro de los huevos, un pollo que hubo que ayudarlo a salir del huevo. Todos sin anomalías congénitas. En dos huevos no se formó embrión. Los hemisferios cerebrales y cerebelo en todos los casos fueron normales. Se estudiaron además como controles dos pollos nacidos de incubación normal con gallina ninguno presentó anomalía congénita. El examen al microscopio electrónico mostró las siguientes alteraciones en el cerebro de los pollos inoculados: 1. Presencia de inclusiones intranucleares en neuronas y células endoteliales similares morfológicamente a las estructuras laminares descritas en el cerebro de fetos y en adultos esquizofrénicos. Estas inclusiones reaccionaron en ocasiones en forma positiva con el antisuero antiherpes simplex hominis tipo I. 2. Replicación aumentada de las estructuras laminares que normalmente existen en el tejido nervioso. En algunas de estas estructuras se observó la misma reacción que en 1. 3. Presencia de puntos de reacción con el antisuero en la cromatina nuclear relacionado con estructuras de membranas que se encuentran dentro del rango de medida de partículas virales en el núcleo de neuronas. 4. Presencia del fenómeno de replicación de las estructuras laminares con formación de partículas de igual constitución de membranas, observada en cerebros de esquizofrénicos adultos y en el feto de madre esquizofrénica, que reaccionan en ocasiones con el antisuero antiherpes simplex. 5. Presencia de estructuras laminares en la envoltura de los hematíes en los capilares cerebrales. 7 6. Presencia de antígeno de herpes simplex en estructuras de membranas, dentro del núcleo, en el citoplasma y en las prolongaciones celulares de neuronas y células del endotelio vascular fundamentalmente. 7. Un análisis digital mostró la presencia de partículas con un núcleo central y una cápsula periférica en los sitios de reacción antígeno-anticuerpo (figura 2 y 3). DISCUSIÓN. Los cuadros de psicosis indiferenciables clínicamente de la esquizofrenia que siguieron a la pandemia por el virus de la influenza v de la encefalitis de Von Economo a principios del siglo pasado hicieron pensar en la posibilidad de una relación entre esta enfermedad y la etiología viral 2. Un ejemplo de ello se expresa en el pensamiento de Karl Menninger en 1922 cuando expresó: "Estoy persuadido que la demencia precoz (esquizofrenia) es al menos en la mayor parte de los casos una somatopsicosis, la manifestación psíquica de una encefalitis" [12]. No es hasta la década de los 50 en que se hacen los primeros intentos serios para aislar un virus del LCR de pacientes esquizofrénicos. Un desarrollo inadecuado de las técnicas virológicas e inmunológicas en ese momento, parece haber contribuido a la no continuación de estos trabajos a pesar de haberse reportado efectos citopáticos en embriones de pollo después de la inoculación. En 1979 se reporta por Tyrrell y colaboradores que el LCR de un 35% de pacientes esquizofrénicos tenía efectos citopáticos cuando era inoculado en fibroblastos de embrión humano [13]. Sin embargo este hallazgo no era específico para la esquizofrenia, ya que el LCR de pacientes con trastornos afectivos producía igual efecto en igual proporción. Se desconoce aún si este efecto se debía a una toxina o a un virus. La imposibilidad por una parte de trasmitir este efecto citopático de cultivo a cultivo y su persistencia a pesar del uso de inhibidores de la síntesis proteica y de DNA o RNA sugería más la posibilidad tóxica que virológica, a menos que se tratara de una forma viral no convencional. En 1983 Baker reporta los resultados de la inoculación intracerebral a monos de la América del Sur con el LCR que había producido efectos citopáticos en cultivos de tejidos [14]. Este autor señala alteraciones de conducta en una parte de los animales inoculados que se caracterizaba por disminución de la actividad normal y cambios en la conducta social que semejaban los síntomas del defecto esquizofrénico, por el contrario, la inyección de LCR que no producía efectos citopáticos, no provocaba tales alteraciones de conducta. En el estudio de la descendencia de los animales inoculados se reportaron anomalías congénitas: defecto del cierre del cráneo con encefalocele v cambios de coloración de la cola en 8 algunos de ellos. Libiková en 1983 reporta efectos similares a los descritos por Baker en cultivos SIRC y HEL con determinación de antígeno HSV-1 por técnicas de inmuno-fluorescencia [15]. Sin embargo, otros intentos de reproducir los síntomas descritos por Baker mediante la inoculación intracraneal directa o mediante la utilización de tejido cerebral de pacientes fallecidos fueron infructuosos. Debido a los resultados obtenidos por investigadores soviéticos en la observación ultraestructural de cerebros de embriones procedentes de madres esquizofrénicas de un aumento de estructuras de membrana a las que denominaron “lamelosomas” [16] confirmado por nosotros en esquizofrénicos adultos, en fetos de madres esquizofrénicas y en animales experimentalmente inoculados con líquido céfalo-raquídeo [17] , así como la presencia de partículas intranucleares semejantes al virus del herpes simplex que reaccionaron con el antisuero para este virus [18]. Considerando una posible trasmisión de tipo vertical en la enfermedad inoculamos embriones de pollo con LCR de la paciente esquizofrénica hebefrénica cuyo feto se había estudiado por inmuno-electromicroscopía. Aparte de constituir un método relativamente fácil de investigación, nos permitía observar células embrionarias del sistema nervioso, susceptibles de infección viral, así como observar el posible desarrollo de anomalías congénitas en los embriones inoculados. Sin embargo tuvimos en cuenta en nuestros trabajos que el comportamiento biológico de los virus lentos no es siempre igual ya que mientras se ha logrado la trasmisión exitosa en animales de laboratorio de las formas virales menos convencionales, no ha sucedido lo mismo con las formas más convencionales, como es el caso del virus de la leucoencefalopatía multifocal progresiva y el de la panencefalitis esclerosante subaguda. La presencia en algunos de los animales estudiados por nosotros de anomalías (parálisis de alas y patas, deformación de los dedos de las patas, atrofia de un hemisferio cerebral) puede relacionarse con el hallazgo de los efectos citopáticos ya citados en la década del 50 y los resultados referidos por otros investigadores en otros animales y en cultivos de tejidos también citados; sin embargo este hallazgo y la presencia de antígeno de herpes simplex en nuestros trabajos en embriones de pollo, debe hacemos considerar las siguientes posibilidades: a) La trasmisión a los embriones se debe a la gran difusión en la naturaleza del herpes virus sin que se relacione con la esquizofrenia. b) Una posible reacción no específica del antisuero en el tejido nervioso. 9 c) El LCR pudo actuar como un inductor no específico (toxina) en el desarrollo de las estructuras de membrana y de las inclusiones intranucleares, así como de las anomalías descritas. d) El LCR era portador de partículas virales que reprodujeron los efectos encontrados en el feto y en el cerebro de esquizofrénicos adultos y la reacción con el antisuero fue específica para el herpes simplex hominis tipo 1. e) Estos resultados pueden estar relacionados con los descritos en este trabajo por otros investigadores en el desarrollo de anomalías congénitas en otras especies de animales inoculados con LCR de pacientes esquizofrénicos y de efectos citopáticos en cultivos de tejidos. f) La multiplicación del virus (HSV-1) puede estar relacionada con los trastornos inmunológicos que se observan en la enfermedad y no necesariamente se relacionan con su etiología. Se ha reportado por otros autores la posible relación del HSV-1 y la esquizofrenia en diferentes experiencias como son el aumento del título de anticuerpos contra este virus, la presencia de antígeno o del genoma viral utilizando diferentes técnicas de investigación [19-30]. La etiología viral de la esquizofrenia continúa considerándose entre las hipótesis que tratan de explicar el origen de la enfermedad. Una teoría que se maneja hoy con frecuencia es la que relaciona la enfermedad con un trastorno del neurodesarrollo en las primeras etapas de la vida intrauterina. La acción de un virus actuando en esta primera etapa del desarrollo también se ha incluido dentro de los posibles factores ambientales, interactuando con factores de tipo genético. El virus herpes simplex hominis tipo I por sus características de permanecer latente en el sistema nervioso central, de evolucionar en forma de crisis y remisiones en sus manifestaciones clínicas, de afectar el lóbulo temporal, asiento del sistema límbico y sustrato anatómico de la esquizofrenia y de replicarse entre otros factores por la acción de situaciones estresantes como ocurre también en esta enfermedad se le ha considerado como un posible candidato entre los agentes virales a considerar. De todos los elementos señalados, se deriva la necesidad de continuar y ampliar el marco de esta investigación en mayor número de experiencias y con técnicas inmunológicas más específicas. Estos resultados pueden contribuir a la demostración de la posible trasmisión de tipo vertical planteada en la enfermedad, así como al estudio de los mecanismos que influyen en la posible trasmisión horizontal y en el desarrollo de una prueba biológica diagnóstica. La inoculación asociada a medicamentos antivirales (acyclovir, interferón) puede contribuir al estudio de la susceptibilidad del herpes virus de estar este agente relacionado con la etiología de la esquizofrenia. 10 AGRADECIMIENTOS Agradecemos la valiosa colaboración técnica y profesional de los Centros: Hospital Psiquiátrico de la Habana, Dpto. de Embriología del Instituto de Ciencias Médicas de Cuba, Instituto de Hematología e Inmunología y Laboratorios de Microscopía Electrónica del Hospital “Hermanos Ameijeiras”, del Instituto de Nefrología y del Centro Nacional de Investigaciones Científicas de Cuba BIBLIOGRAFIA 1. Goodall E. The exciting cause of certain states, at present classified under schizophrenia by psychiatrists, may be infection. J Ment Sci 1932 ; 78 : 746-55. 2. Meninger KA. Influenza and schizophrenia. An analysis of post-influenza “dementia praecox” as of 1918 and five years later. Am J Psychiatry 1926; 5: 469-529. 3. Meninger KA. Influenza and schizophrenia. 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