Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo FITOVIRUS M. Sc. Ing. Agr. Alfredo SOTO Año 2015 GENERALIDADES Y NATURALEZA DE LOS VIRUS: Un virus (de la palabra latina virus, toxina o veneno), son entidades infecciosas submicroscópicas que constituyen un caso particular de parasitismo. Todos los organismos vivos poseen a la vez dos ácidos nucleicos, ADN y ARN, ácidos ambos que posibilitan que esos organismos cumplan con el proceso de síntesis de la materia orgánica a partir de los elementos y compuestos orgánicos o inorgánicos, y a la vez, que desarrollen su crecimiento y reproducción con continuidad genética. Los virus vegetales son agentes biológicos potencialmente patógenos compuesto por una cápside (o cápsida) de proteínas que envuelve al ácido nucléico, que puede ser ADN o ARN. Esta estructura puede a su vez estar rodeada por la envoltura vírica, una capa lipídica con diferentes proteínas, dependiendo del virus. El ciclo vital de un virus siempre necesita de la maquinaria metabólica de una célula para poder replicar su material genético, produciendo muchas copias del virus original. En dicho proceso reside la capacidad destructora de los virus, ya que pueden perjudicar a la célula hasta destruirla. Pueden infectar células eucarióticas o procarióticas (en cuyo caso se les llama bacteriófagos, o simplemente fagos). Algunos indicios parecen demostrar que existen virus que infectan a otros virus (viroides). Además tienen una composición química bien definida y permanente capaz de producir reacciones inmunológicas propias de cada virus. Ninguna de estas características existen en otros organismos infecciosos, de modo que los que poseen estas propiedades son virus, sean ellos parásitos de vertebrados, invertebrados, plantas, hongos o bacterias. En nuestro curso desarrollaremos el tema de aquellos virus parásitos de vegetales. ANTECEDENTES Durante mucho tiempo se pensó que sólo los hongos eran capaces de producir enfermedades en las plantas, ya a fines del siglo XIX T.J.Burril y Erwin Smith demostraron que las bacterias también podían causar enfermedad en las plantas. En cuanto a la etiología de otras enfermedades como el “listado del tulipán”, “el mosaico del abutilón” y “la degeneración de la papa “ permanecía sin conocerse, hasta que en las primeras décadas del siglo XX, otros investigadores demostraron que entidades de morfología desconocida (los virus) eran también capaces de producir enfermedades en las plantas. Hasta que los virus pudieron ser visualizados por el microscopio electrónico todas las enfermedades transmisibles por injerto y/o diversos vectores, eran consideradas causadas por virus, pero desde 1.960 en que los investigadores Ishiie y Doi comprobaron que algunas de estas enfermedades eran causadas por organismos semejantes a los micoplasmas humanos, buena parte de estas enfermedades trasmisibles a través de injertos y/o vectores pasaron al campo de estudio de la Bacteriología, no obstante, con respecto a la historia de los virus como causante de enfermedades debemos decir que ya en la antiguedad, sin conocer el porqué de ello, se utilizaba la trasmisión por injerto para perpetuar algunas características foliares o florales que se destacaban . Ejemplo: “Mosaico del abutilón”, “Quebrado del tulipan” (1.576). 1 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo En 1.882 Mayer estudió el Mosaico del Tabaco, demostrando que esta enfermedad puede ser transmitida a una planta sana de tabaco por inoculación de savia de la planta infectada. Chamberland, en 1.884, había desarrollado los filtros de porcelana que retenían las bacterias. Dimitri Ivanovski (1892) fue el primero en demostrar que la infectividad de la savia proveniente de plantas de tabaco con mosaico se mantenía aún después de haber atravesado los filtros. Este investigador buscaba el agente causante de la enfermedad denominada mosaico del tabaco, y llegó a la conclusión de que debía tratarse de una toxina o de un organismo más pequeño que las bacterias, pues el agente atravesaba los filtros que retenían las bacterias. Denominó a estos agentes patógenos virus filtrables. Igual comprobación hicieron Loeffler y Frosch (1898) con el virus de la fiebre aftosa de los bovinos. En 1898 Beijerinck, bacteriólogo de amplia experiencia tomando como base las investigaciones de Adolf Mayer, trató de determinar si el mosaico del tabaco se debía a algún microorganismo, llegando a su teoría del “contagium vivum fluidum” cuya naturaleza no pudo precisar. Supuso además, que otras clorosis y mosaicos infecciosos podrían tener el mismo origen reafirmando con su hipótesis el concepto de la existencia de un nuevo grupo de agentes patógenos en las plantas más pequeñas que las bacterias, pero de naturaleza desconocida. Baur (1904) estudiando el mosaico del abutilón fue el investigador que por primera vez introdujo la palabra virus en su significación actual al decir que “la causa de los mosaicos era una entidad no viviente altamente organizada que denominó virus”. Otros investigadores demostraron que ciertos insectos, especialmente los áfidos eran capaces de transmitir los virus tanto en la naturaleza como experimentalmente, logrando un conocimiento de gran importancia para la epidemiología de los virus. Las primeras comprobaciones fueron hechas por Botjes (1920) trabajando con el virus del enrollamiento de la hoja de papa y Myzus persicae y otros áfidos. En 1935, con la invención del microscopio electrónico y los estudios de Stanley en E.E.U.U. se conocieron hechos transcendentes sobre la naturaleza de los virus. En 1935 Bawden determinó que plantas infectadas con el virus X de la papa, contenían antígenos específicos fácilmente detectables y Bawden y Pirie en base a esta especificidad establecieron la relación de tres razas del mosaico del tabaco con características sintomatológicas diferentes. Fueron los investigadores que dieron los primeros pasos para el desarrollo de la serología viral. En 1936 Bawden determinó que el ácido ribonucleico es el elemento principal en la constitución de este virus. Kausche et al (1939), fotografiaron por primera vez un virus, el VMT, con lo que lograron además determinar su forma y dimensión. Posteriormente Gierer y Schramn (1956) aislaron al ácido nucleico y comprobaron su infectividad. Investigaciones posteriores determinaron que el ácido ribonucleico es el material genético del virus del mosaico del tabaco y de los virus en general. Los virus causan considerables pérdidas a la agricultura. Por ejemplo: En 1950 en “Wheat streak mosaic virus” causó el 10% de pérdida en la producción total de trigo de EEUU. 2 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo En 1960 “Sugar beet yellows” causó el 60% de pérdidas en remolacha en Gran Bretaña ESPECIES QUE AFECTAN E IMPORTANCIA PARA LA AGRICULTURA Los virus parasitan a vertebrados e invertebrados, plantas, bacterias y hongos. En cuanto a los que nos interesan en este curso diremos que existen gran cantidad de Angiospermas atacadas por virus pero en general el número de especies atacadas corresponde a plantas herbáceas de las familias de las solanáceas, chenopodiaceas, leguminosas, compuestas y cucurbitáceas. También son afectadas algunas especies leñosas. En cuanto a las gimnospermas eran consideradas inmunes hasta que en la década de los 60 varios autores informaron sobre la existencia de algunos virus en coníferas (no más de 10 virus). ANTECEDENTES EN ARGENTINA En 1950 se perdieron casi 15.000.000 de plantas de cítricos en Argentina debido a la “tristeza de los citrus”. En Argentina, las variedades de caña de azúcar: criolla morada y criolla rayada, se perdieron por aparición del “mosaico de la caña de azúcar”. ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA PARTÍCULA VIRAL. La partícula viral o virión consta de una parte central el ácido nucleico encasillado en una proteína de recubrimiento llamada cápside o cápsido constituida a su vez por un número de subunidades repetitivas, más pequeñas, los capsómeros. La síntesis de proteínas de recubrimiento se forma por la unión encadenada de cientos de aminoácidos, y es el ácido nucleico el portador de la información genética y quien controla la síntesis de proteínas y codifica la forma en que deben conectarse los aminoácidos en una cadena o polipéptido. A su vez esta secuencia la determinan los genes. Las moléculas de ARN fabrican las proteínas al unir los aminoácidos en pequeñas unidades esféricas conocidas como ribosomas. La proteína viral por sí sola carece de virulencia. En cambio el ácido extraído sin el cápsido, cuando se lo combina con una proteína celular con afinidades específicas hacia el virus, es capaz de reconstruir la partícula con sus características infecciosas. Las funciones de la proteína son: Recubrimiento y protección, ayuda en todo proceso biológico, establecer la especificidad antigénica del virus que le dio origen, dar forma y dimensión al virus. Características de los virus Podemos agrupar las características definitorias de los virus en torno a tres cuestiones: su tamaño, el hecho de que sean cristalizables y el hecho de que sean parásitos intracelulares obligados. Estas tres cuestiones colocan a los virus en la frontera entre lo vivo y lo inerte. Tamaño Los virus son estructuras extraordinariamente pequeñas. Sus tamaños se expresan en nanómetros (1 nanómetro es la milmillonésima parte de un metro). Para tener una idea mejor del tamaño de los virus podemos calcular que aproximadamente 3.333 partículas de VMT (300 nm de longitud) puestas una detrás de la otra, alcanzan 1 milímetro. Las dimensiones oscilan entre, 17 a 75 nm de diámetro para partículas isodiamétricas y 300 x 16 nm como el TMV (bastones rígidos) y 10 a 12 nm de diámetro y 500-2000 nm de largo como PVX, PVY y los 3 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo closterovirus (filamentos flexuosos). Cristalización Los virus son cristalizables, como demostró W. Stanley en 1935. Esto significa que las partículas víricas tienen formas geométricas y que son idénticas entre sí, lo cual las separa de la irregularidad característica de los organismos, y las acerca a las características de los minerales. Parásitos intracelulares obligados Los virus son parásitos intracelulares obligados. Desde los años treinta se sabe que la composición química de los virus se reduce a un ácido nucleico y una envuelta proteínica. Para que el ácido nucleico pueda replicarse, necesita utilizar la maquinaria enzimatica y estructural de una célula viva, y por otra parte, solamente dentro de una célula viva tienen los virus las funciones de autoconservación, que junto con la reproducción, caracterizan a los seres vivos. Ésta condición es la causa de que muchísimos virus sean conocidos como gérmenes patógenos que producen enfermedades en plantas y animales, e incluso en las bacterias. Estructura de los virus Un virus está compuesto de una molécula de ácido nucleico y una envoltura proteínica. Ésta es la estructura básica de un virus, aunque algunos de ellos pueden añadir a esto la presencia de alguna enzima, bien junto al ácido nucleico, como la transcriptasa inversa de los retrovirus, bien en la envoltura, para facilitar la apertura de una brecha en la membrana de la célula hospedadora. A la unidad formada por el ácido nucleico y la envoltura proteínica se le denomina también virión. El ácido nucleico es solamente de un tipo, ADN o ARN, nunca los dos. Atendiendo al tipo de ácido nucleico se distinguen cuatro clases de virus: ADN de cadena doble ADN de cadena sencilla ARN de cadena doble ARN de cadena sencilla EL ÁCIDO NUCLEICO Los virus son esencialmente nucleoproteinas que contienen un solo ácido nucleico, el único capaz de infectar células vivas, siendo el portador de la información genética. Hasta hace poco tiempo, se creía que el ácido nucleico de los virus de las plantas era el ARN, pero se comprobó que algunos podían estar constituidos por ADN , como “el virus del mosaico del coliflor”, “el virus del mosaico del clavel”, “el curly top”. La función del ácido nucleico es: ser responsable de la infectividad y ser el portador de la información genética. Los ácidos nucleicos son macromoléculas formadas por la repetición de un monómero llamado nucleótido, unidos mediante enlaces fosfodiéster. Estos se unen entre sí por un grupo fosfato, formando largas cadenas o polímeros o polinucleótidos. Pueden alcanzar tamaños gigantes, siendo las moléculas más grandes que se conocen, constituídas por millones de nucleótidos. Son las moléculas que tienen la información genética de los organismos y son las responsables de su transmisión hereditaria. 4 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo Existen dos tipos de ácidos nucléicos, ADN y ARN, que se diferencian en: El azúcar (pentosa) que contienen: la desoxirribosa en el ADN y ribosa en el ARN. Los nucleótidos son las unidades que forman los ácidos nucleicos. Cada nucleótido es una molécula relativamente compleja, compuesta por la unión de tres unidades: un monosacárido (una pentosa), una base nitrogenada (púrica (Adenina, Guanina) o pirimidínica (Citosina, Timina y Uracilo) y uno o varios grupos fosfato (ácido fosfórico). Tanto la base nitrogenada como los grupos fosfato están unidos a la pentosa. La unión formada por la pentosa y la base nitrogenada se denomina nucleósido. Tanto el ADN como el ARN son largas moléculas en forma de espiral o cadena constituidas por muchas unidades denominadas nucleótidos. El VMT posee ARN y 6.400 nucleótidos. Cada nucleótido está constituído por un glúcido, una base nitrogenada y puentes de fosfato. En el ARN, las bases nitrogenadas son adenina (A) y guanina (G) que corresponden a las bases purinas y citocinina (C ) y uracilo (U) bases pirimídicas. En el ADN las bases nitrogenadas son Ay G y CyT (timina). La proporción y también el orden en el que se hallan repartidas estas bases a lo largo de la cadena, son propias de cada virus y constantes para el ácido nucleico de un espiral dado, constituyendo el código genético de cada virus. El peso molecular del ADN es generalmente mayor que el del ARN. “El cambio de orden establecido en un sólo nucleótido por mutación puede variar el poder patogénico del virus” y “el agrupamiento espacial de los nucleótidos es la clave de la especificidad de cada entidad viral”. 5 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo MORFOLOGÍA Tipos de cápsidas Se distinguen tres tipos distintos de cápsidas atendiendo a su simetría: Cápsida helicoidal Típica de virus vegetales y bacteriófagos. Ejemplo típico: TMV o virus del mosaico del tabaco, que tiene 2.130 capsómeros idénticos que se disponen helicoidalmente alrededor del ARN monocatenario del TMV. Todos los capsómeros estan constituídos por una proteína de 158 aminoácidos. Cápsida icosaédrica Típica de virus animales y en menor medida de vegetales y fagos. Los capsómeros se disponen formando un icosaedro. Mediante difracción de rayos X se ha visto que presenta simetría rotacional 5:3:2, de tal manera que se pueden distinguir dentro de la partícula tres ejes distintos: Quinarios - vértices Ternarios - centros de caras opuestas Binarios - centro de aristas Estas cápsidas tienen dos tipos distintos de capsómeros, siempre constituídos por varias 6 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo proteínas: Pentameros o pentones: capsómeros de cinco monómeros que se localizan en los vértices de la cápsida. Hexámeros o hexones: seis monómeros situados en las caras del icosaedro. El número total de capsómeros se puede calcular a partir de la siguiente expresión matemática: N = 10(n − 1)2 + 2 siendo n el número de capsómeros que ocupa cada arista. El menor número es, por tanto, 12 (si n = 2). El fago ØX174 tiene 12 capsómeros. En algunos virus icosaédricos aparecen púas o espículas, que son estructuras de fijación a la célula hospedadora, estructuras de anclaje. Cápsida compleja: Típica de un bacteriófago Esquema de virus con cápside compleja El virión tiene al menos dos partes, una cabeza o nucleocápsida y una cola (a los virus que presentan cola se les llama urófagos). La cabeza puede ser de dos tipos: icosaédrica (virus bacterianos de la serie P) o una cabeza constituida por un prisma hexagonal y en cada extremo una pirámide hexagonal (de la serie T-par, como el fago T2). La cola puede ser muy sencilla, a veces un tubo hueco que sale de un extremo de la cabeza; o ser más compleja. El caso extremo son los fagos T-par que presentan simetría doble, cúbica y helicoidal. El virión de la serie T-par tiene 3 partes: cabeza, cuello y cola. De la cabeza parte un tubo hueco que contacta con una estructura anular no contráctil (cuello). A continuación la cola, con una vaina contráctil de 24 anillos que termina en una estructura hexagonal perforada llamada placa basal. De cada vértice de la placa basal parte una fibra basal contráctil y debajo de ella puede haber 6 espinas o púas caudales. Los virus de forma variada son los bacteriófagos con cuerpo, cabeza y cola y que son patógenos de bacterias y cianobacterias. En su cabeza encierran el ácido nucleico, y la cola es el dispositivo inyector, que actúa como una jeringa hipodérmica. 7 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo La morfología de todos los virus puede encuadrarse dentro de tres formas según su apariencia geométrica: formas alargadas, esféricas (isodiamétricas) y baciliformes. También existen otros de formas variadas como los bacteriófagos. La forma del virión en los alargados puede a su vez ser rígida como el VMT o flexuosa como el grupo de los Potyvirus (PVY, PVS) Icosaédricos: los capsómeros, que suelen ser de varios tipos, se ajustan formando un icosaedro regular (es decir, 20 caras triangulares y 12 vértices), y dejando un hueco central donde se sitúa el ácido nucleico fuertemente apelotonado. Algunos forman poliedros con más caras que el icosaedro. Los virus patógenos de plantas son en su mayoría de forma icosaédrica constituidos por un núcleo central rodeado de una envoltura de partículas semejantes, tomando un aspecto muriforme ( aspecto de ladrillos pegados unos con otros) con diámetros que varían entre 27 y 32 nm (nanómetros). Muchos virus isométricos o cuasi isométricos (grupo 12 mosaico virus, Bromovirus, Comovirus, Cucumovirus, Ilarvirus) tienen el genoma dividido entre 2 o más partículas. Todos los virus de las plantas con genoma dividido pueden ser clasificados en 2 grandes grupos: virus con genoma bipartite y con genoma tripartite. Proteína La Proteína es una sustancia química que forma parte de la materia fundamental de la célula. Son moléculas formadas por una gran cantidad de aminoácidos. Generalmente se disuelven en agua o en soluciones acuosas de sales minerales diluidas. Entre ellas, figuran las enzimas, ciertas hormonas y albúmina o clara de huevo. son indispensables en la alimentación. Las proteínas (del griego Proteion, primero) son macromoléculas de peso molecular elevado, formadas por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Pueden presentar una o varias cadenas. Las proteínas son biomoléculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido: oligopéptido: número de aminoácidos <10 polipéptido: número de aminoácidos > 10 proteína: número de aminoácidos > 50 Las más abundantes de las biomoléculas. Constituyen más del 50 por ciento de las células. Son sustancias muy versátiles. Se forman en el ribosoma a partir de la información suministrada por los genes. Anticuerpos Las bases de los métodos de diagnóstico de virus fue establecida por la serología cuyo fundamento consiste en la reacción antígeno - anticuerpo. Al inyectarse en el cuerpo de un animal de sangre caliente (conejo, ratón, etc), los antígenos (virus) provocan la formación de 8 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo anticuerpos específicos, proteínas del tipo de la γ-globulina. Los anticuerpos integran el sistema inmunológico cuya misión es la defensa del organismo contra los agentes patógenos, los cuales también se forman cuando antígenos se introducen artificialmente. In vitro, fuera del cuerpo animal, los anticuerpos reaccionan con un proceso de floculación con sus antígenos correspondientes y pueden, por lo tanto, utilizarse como reactivos altamente específicos. Después de la formación en células especiales, los anticuerpos pasan a la sangre, estando presentes en el suero sanguíneo, que es el líquido que queda luego de coagular la sangre. El suero sanguíneo que contiene anticuerpos específicos se denomina antisuero. Un prerrequisito para los antígenos es que posean una molécula suficientemente grande. Las macromoléculas tales como las nucleoproteínas, incluyendo muchos virus vegetales, constituyen buenos antígenos. La antigenicidad de los virus vegetales se determina mediante “determinantes antigénicas”, grupos químicos en la envoltura proteica que rodea el ácido nucleico. Los anticuerpos son proteínas (glicoproteínas: proteínas unidas a azúcares) (inmunoglobulinas) secretadas por un tipo particular de células, llamadas linfocitos B. Su propósito es reconocer cuerpos extraños invasores como las bacterias y mantener al organismo libre de ellos. Su producción está regida por el sistema linfático. Cada molécula de anticuerpo está compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas (tetrapéptido) unidas por puentes disulfuro (-S-S-). En las cuatro cadenas, iguales dos a dos, se diferencian: Cadenas ligeras L (light): están compuestas por alrededor de 220 aminoácidos, con dos regiones, una variable de 110 aminoacidos en el extremo amino-terminal, y una constante de 110 aminoácidos en el extremo carboxi-terminal. Cadenas pesadas H (heavy) : formadas por 440 amninoácidos, excepto dos tipos que tiene 550. Al igual que en las ligeras se diferencian dos regiones, una variable de 110 aminoáci- 9 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo dos en el extremo amnino-terminal, y una constante de 330-440 en el extremo carboxi-terminal. Existen dos clases de cadenas ligeras, kappa y lambda, que pueden ser diferenciadas por antisueros específicos. Cada tipo de cadena tiene un dominio variable (VH y VL, respectivamente) y otros constantes (CH y CL) determinados por la secuencia de aminoácidos. Los dominios variables están unidos a los constantes por regiones J (de Joining, unión). Las dos cadenas pesadas H se unen entre si mediante dos puentes disulfuro, y cada una de ellas se une a una cadena ligera L mediante otros puentes disulfuro que se produce a nivel del extremo carboxi-terminal de la cadena ligera, adquiriendo asi una forma de Y. Cada brazo de la Y, o fragmento Fab (de antigen binding Fragment), se une al antígeno de forma independiente, o sea que el anticuerpo es bivalente. El resto de la molécula, o fragmento Fc (porque cristaliza con facilidad) no participa en la unión con el antígeno sino que es reconocido por los receptores celulares específicos, y contribuyendo así al proceso mediante el cual el antígeno es destruido. La mayoría de los anticuerpos se diferencian de otras proteínas por no presentar catálisis enzimática en su función, por lo que tradicionalmente se consideran proteínas de reconocimiento de superficies moleculares. Clasificación En el ser humano existen cinco clases de anticuerpos, conocidas por el nombre de inmunoglobulinas: G (IgG), A (IgA), M (IgM), D (IgD), E (IgE), que difieren en tamaño, carga eléctrica, composición de aminoácidos y azúcares. La inmunoglobulina G representa el 80% del total. La IgG, esta inmunoglobulina puede atacar a cualquier tipo de patógeno, por ejemplo virus, bacterias y hongos, bloqueando sus toxinas. Tiene cuatro subtipos, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. IgA representa alrededor del 15 al 20% de las inmunoglobulinas de la sangre. Actúa contrapatógenos que contactan con la superficie corporal, ingeridos o inhalados. Existen dos formas: IgA1 e IgA2. IgM es una inmunoglobulina que puede detectar el tipo de ABO sanguíneo de una persona. También es importante en el diagnóstico de fase aguda de distintas infecciones. IgD constituye alrededor del 1% en la membrana plasmática de los linfocitos B. Participa en el desarrollo de células de memoria en los linfocitos B. IgE es una inmunoglobulina que se encuentra en la membrana de los basófilos y del mastocito. Participa en las reacciones de hipersensibilidad, y en la respuesta a parásitos. Anticuerpo monoclonal Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogéneo producido por un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y no detectado generalmente más que como determinante antigénico Clasificación de los virus Los virus se clasifican atendiendo al tipo de ácido nucleico que contienen, a las características de la envoltura y al tipo de células que infectan. Combinando esos caracteres, y por ese orden de importancia, se han creado unos 30 grupos de virus. En esta clasificación consideraremos tres grupos según el tipo de células que infecten, y en cada grupo se citarán los ejemplos más destacados y sus otras características definitorias. Virus que infectan células vegetales Son los primeros que se descubrieron (virus del mosaico del tabaco, Ivanovski, 1892). La 10 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo mayor parte de ellos contienen ARN monocatenario y cápsida helicoidal, y carecen de envoltura lipoproteica. El virus del mosaico del tabaco es un ejemplo. Algunos reovirus (virus con RNA bicatenario, icosaédricos y sin envoltura lipoproteica) producen tumores en las heridas de las plantas. En este grupo hay también virus con ADN y cápsida icosaédrica, como el del estriado del maíz o el del mosaico de la coliflor. Clasificación: Lista de familias de acuerdo al tipo de genoma dsDNA Familia Huésped(s) Unallocated dsDNA viruses ssDNA Familia Circoviridae Geminiviridae Nanoviridae Parvoviridae ss satellite DNAs Unallocated ssDNA viruses Huésped(s) vertebrados plantas plantas invertebrados, vertebrados plantas dsRNA Familia Birnaviridae Chrysoviridae ds satellite RNAs Hypoviridae Partitiviridae Reoviridae Totiviridae Unallocated dsRNA viruses Huésped(s) invertebrados, vertebrados plantas, hongos hongos hongos hongos, plantas hongos, invertebrados, plantas, vertebrados hongos, protozoarios ssRNA+ Familia Arteriviridae Astroviridae Barnaviridae Bromoviridae Caliciviridae Closteroviridae Huésped(s) vertebrados vertebrados hongos plantas vertebrados plantas 11 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo Comoviridae Coronaviridae Dicistroviridae Flaviviridae Flexiviridae Hepeviridae Luteoviridae Marnaviridae Narnaviridae Nodaviridae Picornaviridae Potyviridae Roniviridae Sequiviridae ssRNA satellite viruses Tetraviridae Togaviridae Tombusviridae Tymoviridae Unallocated ssRNA+ viruses ssRNAFamilia Arenaviridae Bornaviridae Bunyaviridae Filoviridae Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Rhabdoviridae Unallocated ssRNA- viruses ssRNA Familia Avsunviroidae Pospiviroidae ss satellite RNAs Unallocated viroids Ejemplo: Familia Comoviridae Flexiviridae plantas vertebrados invertebrados vertebrados plantas vertebrados plantas protozoarios hongos invertebrados, vertebrados vertebrados plantas vertebrados plantas invertebrados, plantas invertebrados vertebrados plantas plantas Huésped(s) vertebrados vertebrados plantas, vertebrados vertebrados vertebrados vertebrados plantas, vertebrados Huésped(s) plantas plantas plantas plantas Género Nepovirus Vitivirus Especie Grapevine fanleaf virus Grapevine virus A Acrónimo GFLV GVA De todas maneras los fito virus que nos interesan están comprendidos en 15 familias que agrupan a 80 géneros Bromoviridae Bunyaviridae Caulimoviridae 12 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo Closteroviridae Comoviridae Geminiviridae Partitiviridae Potyviridae Luteoviridae Nanoviridae Reoviridae Rhabdoviridae Sequiviridae Tombusviridae Tymoviridae COMPORTAMIENTO DE LOS VIRUS IN VITRO Y FACTORES QUE AFECTAN LA INFECTIVIDAD Infectividad de los jugos extraídos: Fuera de la célula viva, los virus transmisibles por inoculación mecánica a especies herbáceas, se comportan como muchos microorganismos, siendo sensibles a las temperaturas, a determinados compuestos químicos, a enzimas, a radiaciones, etc. Además cada virus tiene su propio comportamiento lo que puede ser usado para su identificación y uno de estos comportamientos es la infectividad en relación a la temperatura, punto final de dilución y longevidad “in vitro”. Estas propiedades, que pueden ser aplicadas a todos los virus transmisibles por jugos se conocen como constantes físicas del virus y serán vistas en un trabajo práctico. Sólo a modo de referencia las definiremos aquí: PIT: Punto de inactivación térmica: Es la máxima temperatura que soporta el jugo viral durante 10 minutos, sin perder su infectividad.Ej. V.M.T. 93ºC. T.S.W.V 42ºC LIV: Longevidad in vitro: Es el tiempo máximo que permanece “in vitro” un jugo viral extraído de plantas enfermas y mantenido a” temperatura de laboratorio”.Para algunos virus es sólo de algunas horas como el Virus del Mosaico del Manzano, otros en cambio, como el VMT,permanecen infecciosos después de 50 años de almacenamiento en condiciones de laboratorio. PDF: Punto de dilución final: Es la mayor dilución que soporta un jugo viral sin perder su infectividad. Varía según el virus y la raza que se considere. En el “Chenopodium mosaic virus” oscila entre 1:100.000 y 1:100.000.000.Otros como el “celery yellow spot virus” se inactivan en diluciones de 1:50 y el VMT soporta diluciones de 1: 1.000.000 . PERSISTENCIA DE LA INFECTIVIDAD FUERA DE LA CÉLULA VIVA Desecación: Se refiere al mantenimiento de los virus en hojas secas de plantas infectadas Muchos no sobreviven en el material seco, otros en cambio como el VMT pueden ser obtenidos con facilidad de tabacos manufacturados ( lo verán en el trabajo práctico). Conservación en tejidos deshidratados: 13 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo Algunos pueden mantenerse deshidratados y a temperaturas entre 1-3 ºC como el barley stripe mosaic virus, cucumber mosaic virus, que tuvieron una longevidad de 15 a 17 años. Acción de compuestos químicos: Muchos compuestos químicos actúan en la inactivación de los virus y su forma de actuar puede clasificarse en tres grupos: - La inhibición o neutralización es reversible: La acción del virus se pone de manifiesto cuando se neutraliza el agente inhibidor. Ej: Tripsina sobre el VMT. - La inhibición o neutralización no es fácilmente reversible: Esto ocurre con la aplicación de formaldehido, ácido nitroso, peróxido de hidrógeno, rayos x y rayos ultravioletas.La perdida de infectividad no es acompañada por cambios en la naturaleza del virus que mantiene sus propiedades fisicoquímicas. - Pérdida de infectividad por desnaturalización o destrucción del virus: Ej: bicloruro de Hg, cianuro de K, éter, alcohol etílico, etc. VIRUS SATÉLITE, VIROIDES, VIRUSOIDES, RNAs SATÉLITE Además de los virus comunes, que constan de una o más bandas (cadenas) de ácido nucleico contenido en una cápside formada por uno o más tipos de moléculas proteínas, y que pueden multiplicarse y causar infección, cuando menos otros cuatro tipos de patógenos parecidos a los virus están asociados con las enfermedades de las plantas. En primer término, los virus satélites son virus asociados a ciertos virus, pero dependen de ellos para propagarse e infectar a las plantas y, además, reducen la capacidad de los virus comunes para multiplicarse y causar enfermedad; es decir, los virus satélite actúan como parásitos de los virus comunes con los que se asocian. Segundo, los viroides son pequeñas moléculas de RNA (compuestas por 250 a 400 nucleótidos) circular, desnudo y de una sola cadena capaces de producir enfermedades en las plantas. Tercero, los virusoides son pequeñas moléculas de RNA; los virusoides forman parte del material genético de esos virus y, en consecuencia, establecen una relación obligatoria con ellos, de modo que ninguno puede propagarse e infectar a su hospedante cuando falta alguno de ellos. Cuarto, los RNAs satélites son pequeñas moléculas de RNA lineal que existen en los viriones de ciertos virus multiparticulados. Los RNAs satélite pueden estar relacionados al RNA del virus o de la planta hospedante y, en general, atenúan los efectos de las infecciones virales y quiza representan una respuesta protectiva del hospedante a la infección viral. PENETRACIÓN, INFECCIÓN, TRASLACIÓN, REPLICACIÓN Penetración: Los virus no pueden penetrar por sus medios en las células de los huéspedes susceptibles. La mayoría lo hace a través de una herida producida por un vector (ácaros, nemátodos, hongos, etc.) o por abrasión mecánica con ruptura de las células epidérmicas de hojas y tallos, ó naturalmente por injerto de tejidos de plantas infectadas a plantas normales. El virus requiere un tipo de herida especial ubicada en un sitio particular sensible de la célula. La herida debe ser leve, ya que si es muy grande puede inhibir la infección porque la célula puede morir. La inoculación mecánica introduce al virus en la epidermis, algunas veces en los pelos o tricomas.. 14 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo Infección: Cuando un virus ha penetrado en una célula se producen los siguientes pasos: 1) El virus pierde rápidamente su capa proteica 2) Luego empieza a sintetizar proteina, codificada por el RNA del virus. Entre las nuevas proteinas sintéticas se encuentra una enzima la RNA sintetasa. 3) Ésta forma RNA complementario sobre el molde del RNA viral 4) La RNA sintetasa utiliza el RNA complementario como molde y sintetiza nuevas moléculas de RNA viral 5) El RNA viral es usado como RNA mensajero y a través del sistema ribosómico de la planta sintetiza la proteina del virus 6) Se produce el ensamble entre la proteina y el ácido nucleico del virus. Lepine (1964) indica que cuando un virus ha penetrado en una célula se produce en primer término, la desaparición del virus, durante una fase cuya duración puede ser más o menos prolongada, horas, días, no se encuentra traza del mismo, es la denominada fase del eclipse, es un periodo de latencia en que la célula parece aún normal. Debemos remarcar que los virus no se comportan como organismos autónomos dentro de la célula, pues es indispensable que los componentes de ambos se integren para la multiplicación de los virus y desde que se establece la integración, toda la célula debe ser considerada como una simple unidad productora de virus, perdiendo todas sus funciones específicas. Traslocación: La principal vía por la cual los virus se desplazan de célula a célula la constituyen los plasmodesmos, que son estructuras tubulares de unos 25 a 30 nm de diámetro. Algunos virus se mueven de célula a célula, al estado de ácido nucleico y otros como partículas virales o viriones. Existe evidencia que el movimiento viral a través de los plasmodesmos es facilitado por una proteína viral que codifica este movimiento. Lo anterior hace referencia a la difusión de los virus de célula a célula, es decir a “corta distancia”, pero existen otros como los luteovirus (barley yellow dwarf virus”, “potato leaf roll virus”) que son inoculados por sus vectores en los tejidos vasculares (floema o xilema o en ambos a la vez), trasladándose a través de estos vasos con relativa rapidez al resto de la planta (80cm/hora). El virus se traslada en forma pasiva como lo es el transporte de cualquier metabolito y lo hace como partícula entera. Replicación: Los virus no se reproducen como las bacterias, los hongos u otros microorganismos. No tienen ningún tipo de organización reproductora. El mecanismo por el que se multiplica fue explicado anteriormente. La capacidad del ácido nucléico viral para autoduplicarse y sintetizar sus proteinas, sólo ocurre en las células del hospedante, con el cual debe tener afinidades específicas. La multiplicación es intracelular y ella se encuentra vinculada más particularmente a regiones de tejido con células ricas en ácido nucleicos (células embrionarias jóvenes con tejidos en vías de desarrollo rápido). La multiplicación del virus dentro de la célula puede ocurrir tanto en el núcleo de la misma como en el citoplasma. DISTRIBUCIÓN DEL VIRUS EN LA PLANTA Es variable, por lo general se piensa que un virus sistemático se reparte uniformemente en todos los tejidos, pero existen factores que hacen que la distribución sea muy irregular. Ej: 15 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo VM del nabo, mayor concentración en hojas que en los tallos y raíces. Los virus que producen mosaicos se concentran más en las partes amarillas o verde amarillas que en las verdes. Otros se concentran en un tejido únicamente por ejemplo: Virus de la tristeza de los citrus, sólo en el floema. MANIFESTACIÓN DE SÍNTOMAS Los síntomas causados por los virus en las plantas son consecuencia de una infección y de la multiplicación de los mismos en las células del vegetal. No obstante, muchos pueden multiplicarse sin que el hospedante manifieste reacción alguna aparente. A estos virus se los denomina “latentes” y a las plantas que los llevan “portadores”. Esto resulta de gran importancia en el comercio de plantas. Los síntomas pueden ser locales o sistémicos. Los síntomas locales, son frecuentes en plantas herbáceas, en infecciones experimentales o de invernáculo y dependen más del hospedante que del virus mismo. Se supone que realizada la infección, se produce, como reacción de la planta una necrosis de los tejidos adyacentes, lo cual no permite que el virus se traslade al resto de la planta. Ejemplo: Gomphrena globosa, para PXV, Nicotiana glutinosa y Nicotiana tabacum var. Xhanty paraTMV, etc. Los síntomas sistémicos, son los producidos por los virus con mayor frecuencia en la naturaleza. Es una infección generalizada, pero se debe tener en cuenta que algunos virus no alcanzan a infectar todos los tejidos del huésped. La alteración del color normal es el síntoma más común en las plantas afectadas por virus. No obstante podemos ordenarlos de la siguiente manera: A- Alteraciones macroscópicas en los tallos y en las hojas Cambios de color Síntomas en hojas: Estos síntomas producen una reducción total o parcial en la producción de clorofila y/o de la destrucción de cloroplastos y por ende del pigmento clorofiliano. 1- 2- 3- Aclaramiento de nervaduras: El color de las nervaduras es más claro que el normal. Empieza en la base de los foliolos como resultado de la infección primaria. Este síntoma es transitorio y comúnmente precede a los mosaicos. Mosaico: Son áreas pálidas o cloróticas en las hojas, que a veces predominan, dejando porciones de tejido normal como “islas” o manchas delimitadas por las nervaduras. Cuando los mosaicos están asociados con las nervaduras: Bandeamiento de nervaduras (vein banding): hay tejido claro u oscuro a los lados de las nervaduras principales en forma irregular. Mosaico internerval: el tejido clorótico está restringido al área entre las nervaduras primarias de la hoja. Moteado: Áreas o manchas pequeñas de forma más o menos circulares de bordes generalmente difusos no delimitados por nervaduras. Estas manchas tienen el aspecto de peca o mota. 16 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo 4- Amarillamientos: Esto implica pérdida de color verde de las hojas debido a la falta de clorofila y al incremento de carotenos y xantofilas. Puede ser total o parcial, o el color verde puede ser reemplazado por amarillo brillante. Variaciones: Clorosis: Disminución del tenor de clorofila y por ende del color verde. El color verde normal no es uniforme en una parte o en todo el follaje. Generalmente, la clorosis empieza en la parte apical de la planta en hojas que desarrollan después la infección. Cálico: Son áreas grandes de color amarillo brillante con bordes irregulares que se presentan dispersos en todo el follaje. Aucuba: Son manchas pequeñas, a veces redondeadas, o puntos de color amarillo brillante que aparecen irregularmente en las hojas. Estas manchas pueden coalescer, pero aún pueden ser individualizadas. Modelos en amarillo: Estos incluyen líneas amarillas con formas definidas tales como anillos, anillos incompletos o arcos y líneas sinuosas. Amarillamiento de nervaduras: Color amarillo brillante en nervaduras que contrasta fuertemente con el color verde de la lámina de la hoja. 5- Pigmentación anormal: Producción excesiva de algunas sustancias y su traslocación irregular. Antocianescencia: Producción anormal y acumulación de antocianina, las hojas muestran una gama de coloraciones púrpura, rojo o azul. Estas pueden estar asociadas a cambios de forma de la hoja. Bronceado: Necrosis de células epidérmicas. Este síntoma aparece por la producción de melanina o sustancias similares que producen color marrón o negro. B- Variación de forma, tamaño y textura 1- Hojas pequeñas: Comparadas las hojas de la planta enferma con la sana se puede ver la diferencia de tamaño, puede estar asociada a cambios de color y de tamaño de planta. 2- Enrollamiento: Es un enrollado severo y hacia arriba de los foliolos que tienen como eje la nervadura central. Es más severo hacia la punta del foliolo en el caso de papa, tomate y hacia los bordes como en el caso de vid. La textura también se ve afectada. En inglés se usa el término “leafrolling”. 3- Encrespamiento: Los márgenes de la hoja muestran una apariencia ondulada. Puede asociarse a mosaico o moteado. 4- Deformación: Las hojas pierden su forma normal por elongación o ensanchamiento de la lámina. Está asociada con en engrosamiento y deformación de las nervaduras. 5- Rugosidad: La superficie de la hoja es irregular debido a la presencia de llagas o el crecimiento desproporcionado de las nervaduras o espacios internervales. 6- Hojas coriáceas: Las hojas o foliolos se rajan fácilmente y crujen cuando se aprietan con las manos. Esto se debe a la acumulación de almidón en las células foliares por un impedimento en las traslocación de carbohidratos. Se asocia al enrollamiento. 7- Enación: Sobrecrecimientos de tejidos, especialmente a lo largo de las nervaduras principales, pero puede presentarse en la lámina foliar. C- Variación del ángulo de inserción de las hojas: Son difíciles de distinguir 17 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo 1- Erectez: Las hojas forman ángulos agudos (menor de 60º) de inserción en relación con el tallo. Las plantas que muestran este síntoma crecen más que las plantas sanas y el follaje en su conjunto adopta forma cilíndrica. 2- Epinastia: Las hojas forman ángulos obtusos (mayor de 90º) en relación con el tallo. Comúnmente, una curvatura en el pecíolo es parte del síntoma. D- Necrosis foliar: Ocasiona caída de hojas, empezando por las inferiores. Algunas pueden permanecer colgadas del tallo. 1- Necrosis apical: Se llama acronecrosis. La necrosis puede empezar en la punta de la planta y en los extremos de las ramas, puede descender y afectar las hojas y/o toda la planta. 2- Necrosis sistémica: Estrías necróticas, manchas o anillos distribuidos en una parte o en todo el follaje, sin ningún patrón definido. 3- Necrosis de nervaduras: Se observa especialmente en el envés, puede presentarse en toda la nervadura, parcialmente o como estrías necróticas. E- Variaciones del aspecto general de la planta 1- Enanismo: Las plantas emergen tardíamente y son más pequeñas que las sanas. Otras pueden empezar a desarrollarse normalmente pero luego detienen su crecimiento y muestran un grado de deformación de tallos y hojas. 2- Detención del crecimiento: Se diferencia del anterior por las plantas pequeñas no muestran deformación. 3- Debilidad: Tallos delgados y débiles e incapaces de soportar el follaje reducido. Plantas que se tienden sobre el suelo. 4- Arrosetamiento: Hojas pequeñas y severamente encrespadas o rugosas, crecen en apículos terminales sobre el tallo. Se lo suela llamar “bouquet”. 5- Escoba de brujas: Proliferación de ramas axilares en tallos principales. Asociada a clorosis, reducción del tamaño de hojas y detención del crecimiento. F- Alteraciones macroscópicas: Puede ocurrir en tubérculos de papa, sarmientos de vid, etc. 1- Tubérculo ahusado: Disminución gradual del diámetro de los tubérculos y más severa hacia el extremo del estolón. 2- Elongación: Cuando el órgano muestra el mismo diámetro en toda su sección. Ejemplo un tubérculo de papa de una variedad redondeada como Kennebec. 3- Tubérculos aéreos: Se producen en las axilas de las hojas. 4- Sobrecrecimientos: Abultamientos en las yemas o en otras partes de la planta. 5- Rajaduras: Tubérculos, sarmientos, ramas o troncos rajados. 6- Flacidez: Pérdida de consistencia de un órgano. 7- Disminución en número y tamaño: baja producción por menor número de frutos y menor tamaño de los mismos. G- Necrosis de órganos 1- Patrones necróticos: Son líneas, arcos o anillos en la superficie o internos. 2- Necrosis en red: Líneas necróticas que forman una malla. 3- Necrosis internas: Manchas o puntos necróticos. 18 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo H- Efecto en los brotes 1- Ahilamiento: Los brotes son largos y muy delgados. 2- Necrosis de los brotes: Parcial o total. Los brotes pueden mostrar estrías o manchas necróticas. I- Síntomas en flores 1- Quebrado: Pétalos con alternancia de colores blanco y el color normal de la flor. J- Síntomas en tallos 1- Acanaladura en la madera debajo de la corteza. 2- Descamación. 3- Deformación. K- Síntomas en raíces 1- Alteración del floema: por inhibición en la traslocación de nutrientes, obstrucción del floema. 2- Tumores. L- Síntomas que afectan a toda la planta 1- Marchitamiento, 2- Enanismo 3- Muerte repentina o prematura M- Síntomas internos 1- Necrosis subcorticales. 2- Necrosis de la madera. 3- Alteraciones microscópicas: El examen del tejido infectado con virus bajo el microscopio de luz o electrónico puede revelar la existencia de alteraciones en las células, agregados de partículas virales o la presencia de inclusiones. Las inclusiones más comunes son observadas como una característica de infección con un virus determinado. Estas inclusiones pueden ser valiosas para la identificación de un virus. Inclusiones en forma de partículas: Estas partículas pueden ser observadas en forma individual y dispersa en la célula, pero más comúnmente formas agregados sueltos o compactos y generalmente en infecciones crónicas. Los cristales de virus son agregados compactos que tienen las partículas arregladas en capas bidimensionales, y se presentan como capas simples repetidas, dando origen a una estructura tridimensional. También hay cristales construidos de materiales celulares u organelas sin partículas virales. Un paracristal es otro tipo de arreglo que no tiene el orden tridimensional del cristal y que usualmente se observa en el microscopio electrónico como una estructura en forma de agujas. Los más frecuentes son los cuerpos X. Estos cuerpos se presentan en forma de granulaciones densas, de 5 a 30 nmsin membrana definida. No se sabe aún qué relación tienen con la formación de los virus, o si son consecuencias de reacciones 19 Cátedra de Fitopatología Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Cuyo celulares del huésped, debidas a la infección (Ej: algunas razas del VMT, “tobacco etch”, “bean yellow mosaic”, “cotton leaf simple” y otros) Inclusiones complejas: Pueden consistir en combinaciones de partículas virales, organelas del huésped y estructuras proteínicas inducidas por el virus. Las inclusiones más comunes son las cilíndricas inducidas por los potyvirus. En secciones transversales vemos estas inclusiones cilíndricas como brazos curvados que convergen alrededor de un canal central. Estos se denominan comúnmente “aspas de molino” o “pinwheels“. Los brazos o aspas se ven como rollos cuando se extienden o como componentes laminares (LIC) en células infectadas con PVX. Estas inclusiones se ven al microscopio electrónico como capas rectas o curvas, lisas o decoradas. Cristales intranucleares e inclusiones membranosas citoplasmáticas han sido asociados con infecciones de PVY. Disturbios en las células y organelas: Es muy común observar desorganización y destrucción de las organelas celulares con la mayoría de la infecciones virales. El tipo de células afectadas depende de la localización del virus o del sitio de replicación. Potato leaf roll virus (PLRV), Grapevine leaf roll associated (1-10) virus (GLRaV) afectan las células del floema, pero también las células acompañantes, donde podemos observar un colapso total. PVY, PVX, PVS, PVT, APLV y APMV se han hallado afectando principalmente células del parénquima y tricomas, pero también pueden producir alteraciones en las células del floema. APLV produce en los cloroplastos vesículas periféricas a lo largo de la membrana. En general puede observarse en las células infectadas por virus una vacuolización extensa, reducción en el número de crestas de las mitocondrias, y rugosidad del plasmalema y de las paredes celulares. Un incremento en la cantidad de ribosomas o mitocondrias también parece ser una característica común de células infectadas con virus. Bibliografía: http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromovibac/cromovibac.htm#t mv Conti, M. et al (2000) Principales virus de la plantas hortícolas. Ed. Mundi-Prensa, 206 pp. Blancard, D. et al (2011) Enfermedades del Tomate Ed. Mundi-Prensa, 679 pp. Salazar, L. F. (1995) Los virus de la papa y su control. Ed. CIP, Lima, Perú 20