TRABAJO PRÁCTICO N° 6 FERTILIZANTES BIOLÓGICOS: DESARROLLO Y CONTROL DE CALIDAD DE INOCULANTES Objetivos • • • • Conocer los parámetros para la selección de cepas. Conocer las metodologías y procedimientos microbiológicos para la evaluación y control de los inoculantes más utilizados en la actualidad. Adquirir habilidades y/o destrezas para la evaluación de la inoculación a campo. Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal. Fertilizantes Fertilizantes no biológicos •Formulados con compuestos químicos orgánicos: compost, lombricompuesto, estiércol, abonos verdes, etc. •Formulados con compuestos inorgánicos: fosfato de amonio, nitrato de amonio, etc. Fertilizantes biológicos •Formulados con organismos vivos Productos que contienen uno o varios microorganismos como principal componente Inoculantes o Fertilizantes biológicos Microorganismos Seleccionados Viables Benéficos Para favorecer la nutrición y/o promover el crecimiento de las plantas. Inoculantes o Fertilizantes biológicos PGPR (promotores del crecimiento) Fijadores de N2 Microorganismos solubilizadores de P de vida libre Hongos micorríticos Mezcla de microorganismos no definidos Rizobios Azospirillum sp. Anabaena INOCULANTE Fertilizante biológico que se aplica a la semilla en el momento de la siembra Clasificación de Inoculantes Líquidos Según el soporte Sólidos (turba) Según la cantidad de cepas que contengan Una: Monocepa Varias: Multicepa Inoculante efectivo • • • • • • Formulado con microorganismos seleccionados por su capacidad fijadora. Microorganismos específicos para el cultivo a tratar y adaptados a las condiciones ambientales del lugar del cultivo. Con un número adecuado de microorganismos. Ley Nº 20466/80. Presentar un soporte que proteja al rizobio, de fácil aplicación y buena adherencia a la semilla. No deben poseer contaminantes. Envase adecuado y con instrucciones claras Inoculante efectivo CEPA + SOPORTE = CALIDAD Eficiencia (Especificidad y adaptación) que garantice viabilidad de microorganismos Desarrollo de un inoculante para leguminosas nódulos cortar la raíz lavar extraer los nódulos seleccionar nódulos turgentes macerar en 1 mL de H2O estéril enjuagar con H2O estéril desinfectar con H2O2 (5 minutos) colorear (Gram -) incubar incubar estriar en medio YEM repicar (pico de flauta) conservar Aislamiento de microorganismos: rizobios Raíz de leguminosa 1º Extraer los nódulos 3º Enjuagar con H2O estéril 2º Desinfectar con H2O2 (20%) 5 minutos Aislamiento de microorganismos: rizobios 5º 4º Colocar los nódulos en un tubo con 1mL de agua estéril Macerar con varilla de vidrio 8º Incubar a 28-30° C 7º Estriar en medio YEM 6º Extraer una alícuota Aislamiento de microorganismos: rizobios Cultivo de rizobio 9º Colorear y observar 11º Incubar y conservar 10º Repicar a “pico de flauta” Producción de inoculante Primera etapa: Selección de cepas Testigo Testigo medio sin N sin inocular medio con N sin inocular Tratamientos Control medio sin N inoculado con cepa eficiente medio sin N inoculados con cepas a testear Selección de cepas: parámetros de evaluación Ensayos de infectividad: Cantidad de nódulos Ubicación en la raíz Selección de cepas: parámetros de evaluación Ensayos de infectividad: Tamaño de nódulos Calidad al corte (color rojo) Actividad fijadora de nitrógeno. Selección de cepas: parámetros de evaluación Ensayos de efectividad: • Nodulación • Materia seca • % de nitrógeno Evaluación final a campo: • Nodulación • Peso seco de nódulos • % de nitrógeno • Rendimiento en grano Producción de inoculante Segunda etapa: Preparación a nivel industrial Producción de inoculantes Mangueras Tapones Biodigestores Filtro de aire Mechero Aireador Producción de inoculantes Planta industrial Control de calidad de inoculantes inoculante sólido (X g + X mL de solución salina estéril) Inoculante sólido suspensión Para inoculante sólido 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 9 mL de solución salina estéril 10 -2 1 mL 10 -3 -4 10 -5 10 10 -6 1 mL 10 -7 10 -8 1 mL medio Y.E.M. incubar calcular Control de calidad de inoculantes Para inoculante líquido Inoculación a campo Preparación del inoculante 1º - Dilución: para una distribución más homogénea 2º - El volumen total de líquido (agua + inoculante + curasemilla) para la dilución, depende del tamaño de las semillas: • • semillas grandes: hasta 2,4 litros cada 100 kg de semilla (Soja: 900 mL / 100 kg) semillas chicas: hasta 4 litros cada 100 kg de semillas (Alfalfa: 1000 mL / 100 kg) Inoculación a campo Recomendaciones generales Realizar la inoculación a la sombra. Inocular la cantidad necesaria para un día de siembra. Si debe aplicar curasemillas, realice la mezcla de ambos productos respetando el volumen de agua y sembrar inmediatamente. Inoculación a campo No conservar el inoculante mezclado con el curasemillas durante mucho tiempo. No usar herramientas o recipientes que hayan estado en contacto con combustibles o pesticidas. Inoculación a campo Si en la inoculación también aplicamos curasemillas, debemos respetar las normas para manejo seguro de agroquímicos Inoculación a campo Utilizar protección en rostro y cuerpo No mezclar y/o conservar los productos en botellas de bebida TRABAJO DE LABORATORIO 1. Aislamiento de rizobios y visualización de bacteroides a partir de nódulos de leguminosas. a- Cortar las raíces de plantas noduladas. b- Lavar las raíces con cuidado y sin romper los nódulos. c- Extraer de 5 a 10 nódulos turgentes d- Desinfectar los nódulos extraídos con agua oxigenada durante 5 minutos. e- Enjuagar los nódulos con agua destilada estéril. f- Macerar los nódulos extraídos en 2 mL de agua destilada estéril. g- Realizar estrías en medio Y.E.M. e incubar durante 7 días a 28- 30°C. h- A partir del macerado realizar una coloración de Gram. i- Visualizar el carácter Gram y la forma de los bacteroides. TRABAJO DE LABORATORIO Nódulos (A; B; C) y bacteroides (D; E; F) de P. sativum (arveja). TRABAJO DE LABORATORIO 2. Control de inoculantes para soja. a- Bajo condiciones de asepsia, realizar la siembra de 2 inoculantes para soja. b- Realizar diluciones al décimo (1/10) en solución salina estéril. c- Sembrar 1 mL de las últimas tres diluciones en cajas de Petri estériles, utilizando 20 mL de medio Y.E.M. previamente fundido y atemperado a 45- 50 °C. d- Incubar durante 7 días a 28- 30°C.