Estudio de los mecanismos que regulan la expresión y función del

Estudio de los mecanismos que regulan la expresión y
función del ligando de muerte TRAIL en células T
normales y leucémicas.
Tesis Doctoral presentada por Jorge C. Morales Camino para optar al título de Doctor
por la Universidad de Granada.
Directora de la Tesis: María del Carmen Ruiz-Ruiz.
Instituto de Biopatología y Medicina Regenerativa
Universidad de Granada
Granada, mayo 2008
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Jorge Carlos Morales Camino
D.L.: GR.1255-2008
ISBN: 978-84-691-4418-3
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AUTORIZACIÓN PARA LA PRESENTACIÓN DE LA TESIS
Dª. MARIA DEL CARMEN RUIZ RUIZ, PROFESORA DEL DEPARTAMENTO
DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR 3 E INMUNOLOGIA DE LA
UNIVERSIDAD DE GRANADA.
CERTIFICA: que la presente tesis titulada “ESTUDIO DE LOS MECANISMOS
QUE REGULAN LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL LIGANDO DE MUERTE
TRAIL EN CÉLULAS T NORMALES Y LEUCÉMICAS”, de la que es autor
JORGE CARLOS MORALES CAMINO, superó el programa de Doctorado
“Inmunología Celular y Molecular” y que ha sido dirigida bajo su dirección en el
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 3 e Inmunología, Universidad de
Granada.
Revisado el presente trabajo, la directora considera que tiene la calidad científica
necesaria para ser defendido ante el Tribunal que se designe al efecto, por lo que:
AUTORIZA la presentación de la referida Tesis para su defensa y mantenimiento de
acuerdo con lo previsto en la legislación vigente.
Y para que conste y surta sus efectos en el expediente correspondiente, expido la
presente certificación en Granada, 24 de Abril de 2008.
Dra. Maria del Carmen Ruiz Ruiz
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Esta tesis ha sido posible gracias a la ayuda y apoyo de mucha gente, tanto en el
terreno personal como en el laboral…y para no seguir un orden estricto, iré dando las
gracias conforme me vengan a la mente. Principalmente se lo agradezco a mis padres, a
mi familia en general, porque me han aguantado los continuos cambios de humor y me
han dando ánimo los últimos…29 años. Pero si hablamos de aguante, me parece que a
quien más debería agradecer en esta tesis (y me estoy planteando hacerle un altar, la
verdad) es a mi jefa. La Mari, antes conocida como Mari Carmen, la de ratos que hemos
echado discutiendo, gritando, riendo, diseñando experimentos y, últimamente,
soltándome broncas por ser tan coñazo. No me imagino haber hecho este trabajo sin ti,
mezcla de jefa, mentora y hermana mayor. Si alguna vez pensaba en que esto no era lo
mío, solo ver tu esfuerzo me levantaba el ánimo para seguir repitiendo experimentos.
Me has educado casi tanto como persona como investigador, aunque la verdad, creo que
en lo segundo tus enseñanzas han sido más productivas…. Cuando te conocí, tan joven,
sonriente y al mismo tiempo tan seria y formal, ¡quien no querría hacer la tesis contigo!
Bueno, creo que voy a parar, que esto se está pareciendo a una declaración más que a
unos agradecimientos. De todas manera, no puedo quejarme del laboratorio en el que
me ha tocado trabajar, entre Enrique, Ana e Ignacio, siempre he tenido una palabra
amable, una broma en el momento justo o la ayuda que he necesitado cuando no he
sabido como seguir....y entre mis compañeros, bueno, a algunos le cortaba la cabeza,
pero a esos los incluiré en los agradecimientos para que “no se sientan mal”. Si es que
sois más amigos que compañeros de trabajo: Irene, ¿con quien discutiré, iré al cine, de
viaje o le lloraré a las tres de la madrugada cuando nos vayamos cada uno por un lado?;
Ester, compañera de fiestas, siempre con la sonrisa, no olvides que siempre serás mi
“favorita”; Zulema, es imposible ser más buena conmigo; Mª José, eres el mejor equipo
que se puede tener, tanto en el laboratorio como delante de una caña; Diana, has llegado
para quedarte con mi puesto como alborotador del laboratorio,¡eres mi alma gemela!;
Raquel, tú y yo somos la prueba de que dos personas pueden ser amigos ¡sin tener ni
una sola opinión en común!; a Api y Sara les agradezco en bloque, porque son una
unidad, las risas, abrazos y las mil tonterías, ¡si es que he tenido mil madres en este
laboratorio!; Juandi (esta es la única vez que te llamaré como te gusta), gracias por las
fiestas que nos hemos pegado y las tardes juntos en el laboratorio, al principio de los
tiempos; gracias a Domingo por no haber intentado matarme después de todas las cosas
que te digo siempre, ¡lo tuyo si que es paciencia!; Claudia, no te puedes imaginar la
tranquilidad que me transmite el mero hecho de escuchar tu voz; Gustavo, gracias por
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ser tan buen amigo y por haberme ayudado al principio, cuando no sabía ni lo que era
una pipeta; Lucía, me entran ganas de adoptarte todos los días y por ultimo, a Osmany y
Girish, esto…um…gracias…
Cómo me enrollo…bueno, por supuesto le agradezco a Abelardo y a Javier por
haberme ayudado en los seminarios, con los reactivos, planteamiento de experimentos y
hasta adopción en sus laboratorios. Y a toda la gente que ha trabajado con ellos, gracias
por enseñarme técnicas y por vuestra amistad Men, Menchu, Gema, Rocío, Rosario,
Griselda, Jose Antonio, Jose Manuel, Marién, Andreina, Celina y David.
Y por último pero no por ello menos importante, a todos mis amigos que aunque no
hayan estado nunca en el laboratorio, han tenido que escuchar la palabra “TRAIL” hasta
la saciedad, en especial a Eva, que tiene que aguantarme todos los días en casa y que es
la que mejor me da las palmaditas en la espalda cuando más lo necesito.
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ÍNDICE
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I. Introducción
1. Apoptosis ………………………………………………………………………….. 19
1.1 Apoptosis y Equilibrio ……………………………………………………….... 19
1.2 Maquinaria de muerte celular: Caspasas ……………………………………... 20
1.3 Rutas de inducción de apoptosis ……………………………………………..... 23
1.3.1 Ruta intrínseca ………………………………………………………... 23
1.3.2 Ruta extrínseca ……………………………………………………….. 29
1.4 Regulación de la apoptosis …………………………………………………..... 32
2. TRAIL y sus receptores …………………………………………………………. 35
2.1 TRAIL …………………………………………………………..…………….. 35
2.2 Receptores de TRAIL ……………………………..………………………...... 35
2.3 Regulación de la expresión de TRAIL ………………………………………... 37
2.4 Papel fisiológico de TRAIL ………………….………………………………... 39
3. TRAIL en terapia antitumoral ……………………….………………….….….... 41
3.1 Regulación de la expresión de FLIP …………………….……………...……... 41
3.2 Ruta de MAPK ……………………………………….…………………...….. 43
3.3 Ruta de PI3K ………………………………………..….……………………... 44
3.4 Ruta de NF-κB ………………………………………....…………………….... 46
3.5 Regulación del ciclo celular……………….....……………….……………….. 48
3.5.1 Proteínas reguladoras del ciclo celular (CDKs) ……….……………... 48
3.5.2 Organización del citoesqueleto …………..…………..………..…….... 48
4. Epigenética ……………………….……...………………….…...………………... 49
4.1 Metilación del ADN ……………………...…………………………….……... 50
4.2 “Código de Histonas” ………………………….……………….……………... 51
4.2.1 Metilación de histonas ………….………………………………….…... 52
4.2.2 Ubiquitinación de histonas ………………………...…………………... 52
4.2.3 Fosforilación de histonas …………………..…………………………... 53
13
4.2.4 Poli-ADP-ribosilación de histonas ….…………………………………. 53
4.3 Acetilación de histonas …………………..……………………………..……... 54
4.3.1 Histona acetil transferasas (HAT) …………………..…..……………... 54
4.3.2 Histona deacetilasas (HDAC) …………………..…………….………... 55
4.4 Histona deacetilasas y cáncer …………………..……………………………... 60
4.4.1 HDAC y proliferación celular …………………..…..…..……………... 60
4.4.2 HDAC y diferenciación hematopoyética …………..………..…..……... 60
4.4.3 HDAC, angiogénesis y metástasis. ………………………….…..……... 61
4.4.4 HDAC y factores de transcripción …………………..…………..……... 61
4.5 Inhibidores de histona deacetilasas (HDACi) ………….…………..…..……... 63
4.6 HDACi y TRAIL …………………………………………………..…..……... 65
II. Materiales y Métodos ………………………….……...………………….…...…... 69
III. Objetivos ………..……………….……...………………….…...………………... 73
IV. Resultados
1. Regulación de la expresión de TRAIL en células T activadas …………..…….. 87
1.1 Activación del promotor de TRAIL en células T en respuesta al tratamiento
simultáneo con ionomicina y PMA ......………..…..……………............................ 87
1.2 Regulación de la expresión y función de TRAIL por ciclosporina A en
células T activadas ………………………………….….…………..…..……..…… 89
2. Mecanismos que regulan la resistencia a TRAIL en linfocitos T
primarios humanos …...……………………….………….…....……………....... 91
2.1 Resistencia de linfocitos T primarios en reposo y activados a la
inducción de apoptosis por TRAIL ……………………….......…….….…..……… 91
2.2 Expresión de proteínas involucradas en la ruta de señalización de
14
TRAIL en linfocitos T en reposo y activados ……………………....…………..….. 93
2.3 Efecto de diferentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL en la
resistencia de linfocitos T primarios humanos ……….……………....…………… 96
2.4 La inhibición de NF-κB sensibiliza a linfocitos T activados a la
apoptosis mediada por TRAIL ………….....…………….…………..…..………… 98
2.5 BAY 11-7085 regula la expresión de receptores de TRAIL y de
genes anti-apoptóticos en linfocitos T activados ….………………………...…… 104
3. Regulación de la sensibilidad a TRAIL en células T leucémicas …………..… 107
3.1 Efecto de diferentes agentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL
en células T leucémicas ………….……………………...….….…………..…..… 107
3.2 Regulación por VPA y LY 294002 de factores implicados en la
ruta de
señalización de TRAIL en líneas leucémicas T ………….……...….…. 111
3.3 Potenciación por HDACi de la apoptosis mediada por TRAIL
en líneas leucémicas T sensibles ………….……..………….….…………..…..… 113
3.4 HDACi potencian la activación de caspasas y las señales
mitocondriales mediadas por TRAIL en líneas leucémicas T …………...…….…. 118
3.5 Regulación por HDACi de proteínas involucradas en la ruta de
señalización de TRAIL en células T leucémicas ………….…………………….... 121
V. Discusión …...………..………………………………….…………......…....…… 133
VI. Conclusiones …...…...……………………………………….….....……….….... 149
VII. Bibliografía ………………………….................................................………….153
VIII. Publicaciones…………………………….................................................……. 191
15
16
I. INTRODUCCIÓN
17
18
1. APOPTOSIS
1.1 Apoptosis y Equilibrio
El concepto del Yin y el Yang surgido de la filosofía oriental nos recuerda la
naturaleza dual del Universo. Dos fuerzas opuestas pero complementarias que rigen las
reglas de la vida y que nos muestran que nada existe en estado puro. El concepto de
muerte unida a la vida por lazos que se cruzan tejiendo una compleja trama se
encuadrara
dentro
de
este
pensamiento.
Pero
no
es
necesario
ponernos
transcendentales…al fin y al cabo, los organismos pluricelulares han seguido esta
norma desde su aparición sin ni siquiera tener consciencia de ello. La vida para todos
los organismos metazoicos requiere la eliminación de células innecesarias, infectadas o
dañadas. La renovación de tejidos, la angiogénesis, así como la homeostasis del sistema
inmunológico, requieren de manera constante la muerte de algunas células para
mantener la vida del organismo completo. Pero no somos organismos perfectos. Todos
los procesos vitales llevan asociados errores y la regulación del plan de muerte celular
no es una excepción. Enfermedades neurodegenerativas y autoinmunes son el resultado
de un plan imperfecto en la búsqueda del equilibrio entre la vida y la muerte celular. Y
la patología más común por ausencia de muerte celular es el cáncer. Las células
neoplásicas acumulan alteraciones genéticas que les permiten sobrevivir, a pesar de la
ausencia de factores de supervivencia y las condiciones de hipoxia y estrés oxidativo, y
que con el tiempo determinan la expansión del tumor hasta formar una masa de células
que han perdido su función, que sufren una proliferación y una diferenciación celular
alteradas y que presentan una movilidad y capacidad invasiva incrementadas (Frisch
and Screaton, 2001; Ionov et al., 2000; Reed, 1999; Tschopp et al., 1999).
La eliminación de las células no funcionales, o disfuncionales en el caso de las
diferentes patologías, es llevado a cabo por un mecanismo de muerte celular
programada denominado apoptosis (Kerr et al., 1972) caracterizado por un conjunto de
cambios bioquímicos y morfológicos (Wyllie et al., 1980) que incluye la condensación
del citoplasma así como la compactación de la cromatina dando lugar a densos
agregados que se deslocalizan para situarse junto a la membrana nuclear y que
posteriormente serán degradados por endonucleasas en fragmentos oligonucleosomales
de 180 pares de bases o múltiplo de éstos. De forma paralela tiene lugar la dilatación del
19
retículo endoplasmático dando lugar a formación de vesículas que confieren a la célula
el fenotipo típico en forma de “burbujas” (zeosis). Por último, la célula se fragmenta en
los denominados cuerpos apoptóticos que son fagocitados por macrófagos y otras
células circundantes gracias a la exposición en superficie de marcadores como la
fosfatidilserina, normalmente en la cara interna de la membrana plasmática de la célula
íntegra (Hengartner, 2000), evitando así la propagación del material intracelular y su
exposición al sistema inmune que conllevaría al desarrollo de una respuesta
inflamatoria.
IN D U C C IO N
D E A P O P T O S IS
CELULA NORM AL
C o n d e n s a c ió n d e la c r o m a tin a
D is m in u c ió n d e l v o lu m e n c e lu la r
R E C O N O C IM IE N T O
Y F A G O C IT O S IS
CELULA EN
A P O P T O S IS
F r a g m e n ta c ió n n u c le a r
F o r m a c ió n d e e s tr u c tu r a s p r o tu b e r a n te s
D iv is ió n d e la c é lu la e n c u e r p o s a p o p tó tic o s
CUERPO S
A P O P T O T IC O S
Figura 1. Cambios morfológicos de la célula durante el proceso de muerte por apoptosis
1.2 Maquinaria de muerte celular: Caspasas
Las CASPASAS, Cysteine ASPartyl-specific proteASES, son las proteasas
encargadas de llevar a cabo los cambios morfológicos citados para las células
apoptóticas (Cryns and Yuan, 1998). Son una familia de cisteín-proteasas que tienen
especificidad de corte en residuos de aspártico (Asp). Estas enzimas se encuentran
expresadas de forma constitutiva en forma de proenzimas o zimógenos inactivos que
requieren de proteolisis para activarse (Thornberry and Lazebnik, 1998). Todas las
caspasas presentan características similares en cuanto a su estructura y especificidad por
el sustrato. Los aminoácidos de la enzima que se unen al sustrato, denominados S4-S3-
20
S2-S1, reconocen una secuencia tetrapeptídica en las proteínas diana denominada P4-P3P2-P1 a la que cortan en el extremo carboxilo de P1. Esta secuencia se caracteriza por la
absoluta necesidad del residuo de aspártico en la posición P1, mientras que el residuo en
P2 es variable y en posición P3 se suele encontrar un residuo de glutamina. El residuo en
P4 es siempre un aminoácido hidrofóbico, alifático o un residuo de aspártico. Los
aminoácidos de los sitios S3 y S1 son prácticamente idénticos en las distintas caspasas,
mientras que los que participan en la unión al sustrato, S4 y S2, varían significativamente
originando distintas especificidades por el sustrato en las posiciones P4 y P2.
Las caspasas están constituidas por un dominio N-terminal de longitud variable,
seguido de una subunidad larga de unos 20 kDa y una corta de 10 kDa en la región Cterminal. Su actividad proteolítica reside en un residuo de cisteína que forma parte de
una secuencia pentapeptídica conservada QACXG y se encuentra en la subunidad
grande, mientras que los residuos que forman el sitio de unión para el sustrato se
localizan tanto en la subunidad grande como en la pequeña, aunque el residuo
dominante para la especificidad de sustrato se localiza en la subunidad pequeña. Su
activación requiere de la escisión de estas tres subunidades para formar un tetrámero,
integrado por dos subunidades largas y dos cortas, que presentará dos sitios activos de
catálisis (Wolf and Green, 1999). Esta proteolisis tiene lugar en dos fases: en la primera
se separa la subunidad grande junto con el prodominio, de la subunidad pequeña, y en la
segunda fase este prodominio es escindido. La presencia de aspártico en los sitios de
separación de las subunidades se relaciona con la capacidad de las caspasas para autoactivarse o ser activadas por otras caspasas dentro de la cascada apoptótica.
Hasta la fecha han sido descritas 12 caspasas en humanos, denominadas caspasas -1
a -10, además de las caspasas-12 y -14 (Pistritto et al., 2002). La enzima denominada en
un primer momento caspasa-13 fue posteriormente identificada como un homólogo
bovino de la caspasa-4 humana (Koenig et al., 2001) y las caspasas -11 es una enzima
murina homóloga a la caspasas -4 humana (Lamkanfi et al., 2002). Recientemente se ha
descrito la denominada caspasa-15 en otras especies.
Según su función dentro de la cascada de señalización apoptótica, las caspasas
pueden clasificarse en iniciadoras o efectoras.
Las caspasas iniciadoras son las primeras en activarse tras un estímulo apoptótico
gracias a la presencia en su prodominio de motivos de interacción proteína-proteína que
les permiten asociarse a proteínas adaptadoras con dominios homólogos. Existen dos
21
tipos de motivos de interacción con proteínas: dominios efectores de muerte (DED),
presentes en las caspasas -8 y –10, y dominios de activación y reclutamiento de
caspasas (CARD), en las caspasas -2 y –9. El reclutamiento de las caspasas iniciadoras
por proteínas adaptadoras determinó la aparición de la teoría de activación por un
mecanismo de autocatálisis por proximidad (Salvesen, 1999). Estudios más recientes
han demostrado, sin embargo, que la activación de caspasas iniciadoras no requiere
cortes proteolíticos sino un cambio conformacional que tiene lugar tras la
homodimerización de las formas proenzimáticas monoméricas (Boatright et al., 2003).
El conjunto de caspasas efectoras está integrado por las caspasas -3, -6 y -7,
carentes de dominios DED y CARD, que se activan por procesamiento mediado por
caspasas iniciadoras. Las caspasas efectoras son las encargadas de degradar los distintos
sustratos celulares que provocan los cambios morfológicos y bioquímicos
característicos de la muerte por apoptosis.
Figura 2. Esquema de capasas.
Con la flecha gruesa se muestra el
primer corte proteolítico entre la
subunidad grande y la pequeña.
Las flechas finas indican otros
sitios adicionales de corte. Los
segmentos sombreados indican las
regiones que corresponden a los
bucles que constituyen la cavidad
catalítica. (Adaptado de Shy, Y.
Mol Cell 2002).
Además de las caspasas implicadas en apoptosis existen otros miembros de esta
familia, caspasas -1, -4, -5, -11 y –13, que participan en la respuesta inflamatoria.
22
1.3 Rutas de inducción de apoptosis
Existen dos rutas interconectadas de activación del proceso apoptótico:
-
Ruta intrínseca o mitocondrial, disparada por distintos tipos de estrés como es
el caso de la radiación y del tratamiento con drogas genotóxicas que causan
daños en el ADN.
-
Ruta extrínseca, mediada por receptores de muerte de la superfamilia del factor
de necrosis tumoral (TNF) y fundamental en procesos fisiológicos como la
muerte celular inducida por activación (AICD) o la citotoxicidad mediada por
linfocitos T CD8+ o células NK.
1.3.1 Ruta intrínseca
La mitocondria juega un papel fundamental en esta ruta apoptótica al actuar como
reservorio de proteínas de localización intermembranal cuya salida al citoplasma por
permeabilización de la membrana mitocondrial externa (PMME) constituye el inicio de
un conjunto de reacciones en cadena que va a tener como consecuencia la entrada en
apoptosis de la célula en respuesta a estímulos tan diversos como la deprivación de
factores de crecimiento, la sobreexpresión de c-Myc, el tratamiento con drogas
quimioterapéuticas, actinomicina D, radiación ultravioleta (UV), estaurosporina, o
glucocorticoides (Duan et al., 2003; Han et al., 2001; Munk et al., 2007; Sutherland et
al., 2006; Wang et al., 2007; Zhou et al., 2005).
Esta PMME suele ir acompañada de una pérdida del potencial de membrana
mitocondrial. Dos mecanismos han sido propuestos para explicar la PMME:
-
La formación del poro de permeabilidad transitoria (PPT), que permitiría el
paso de agua y moléculas de bajo peso molecular provocando la pérdida del
equilibrio iónico así como el incremento en el volumen de la matriz mitocondrial
por exceso de hidratación que desencadenaría la ruptura de la membrana
mitocondrial externa. Este poro está formado, entre otros componentes, por el
transportador de nucleótidos de adenina (ANT) a nivel de la membrana
mitocondrial interna y el canal de aniones voltaje dependiente (VDAC) de la
membrana externa. En condiciones fisiológicas es necesario para el
23
mantenimiento de la función energética mitocondrial (Mattson and Kroemer,
2003).
-
La formación de canales proteicos constituidos por la dimerización de distintos
componentes pro-apoptóticos de la familia de Bcl-2 que actuarían directamente
sobre la membrana mitocondrial externa, o bien de largos poros derivados de la
asociación de dichas proteínas pro-apoptóticas de la familia de Bcl-2 con
distintos componentes lipídicos (Green and Kroemer, 2004).
Existe una tercera posibilidad surgida de la asociación de los dos modelos
anteriores, en la que miembros pro-apoptóticos de la familia de Bcl-2, como Bax,
interaccionarían con proteínas del PPT como VDAC para permitir la salida de
citocromo C a través de la membrana mitocondrial externa (Shimizu et al., 1999), o
ANT para formar canales iónicos en la membrana mitocondrial interna (Marzo et al.,
1998).
Figura 3. Mecanismos propuestos para la PMME. a) Apertura del PPT; b) Canal de Bax; c) Canal
Bax/ANT; d) Poro lipídico o complejo proteolipídico. La figura a) pertenece a mecanismos de la primera
clase, que implican al PPT y a la membrana mitocondrial interna. Las figuras b), c) y d) pertenecen a la
segunda clase de mecanismos que implican a las proteínas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2.
24
Como consecuencia de la PMME en la mitocondria tienen lugar los siguientes
eventos:
Destrucción de la cadena de transporte electrónico.
Este proceso determina la pérdida de la capacidad celular para llevar a cabo la
fosforilación oxidativa y, por tanto, provoca una caída en la producción de ATP, de
manera que la célula no podrá llevar a cabo sus funciones metabólicas (Bradbury et
al., 2000).
Alteración del potencial de oxidación-reducción (redox).
La mitocondria es la principal productora de anión superóxido en la célula.
Existen distintos mecanismos que amortiguan la generación de especies reactivas de
oxígeno (ROS) evitando su acción citotóxica, pero la alteración del potencial redox
provoca la inactivación dichos mecanismos o disminuye su capacidad,
incrementándose la peroxidación lipídica que originará la ruptura de las membranas
celulares (Le Bras et al., 2005).
Liberación de proteínas del espacio intermembrana de la mitocondria al
citosol.
Se trata de proteínas con capacidad para activar caspasas y nucleasas o neutralizar
inhibidores citosólicos de la cascada apoptótica. Las más relevantes son:
-
AIF ( Apoptosis Inducing Factor). Flavoproteína de localización mitocondrial
con capacidad de traslocación al núcleo en respuesta a estímulos apoptogénicos
produciendo la fragmentación del ADN y la compactación de la cromatina
(Wang et al., 2002b).
-
Endonucleasa G. Actúa de forma conjunta a AIF en la fragmentación del ADN
nuclear. En ambos casos esta fragmentación es independiente de la actividad
caspasa (Li et al., 2001).
-
Citocromo C. Por asociación con la proteína adaptadora Apaf-1, y en presencia
de ATP, el citocromo c liberado de la mitocondria conlleva a la formación del
complejo denominado apoptosoma donde se recluta y se activa la caspasa-9
iniciadora. (Zou et al., 1999).
-
Smac/Diablo. Proteína con capacidad de unión e inactivación de proteínas
antiapoptóticas de la familia IAP (proteínas inhibidoras de apoptosis) que a su
25
vez mantienen inactivas a la caspasa-9 y a las caspasas efectoras –3 y -7 (Du et
al., 2000).
-
Omi/HtrA2. Serín-proteasa con capacidad de unión a los IAPs de forma análoga
a la proteína Smac. En ambas proteínas, Smac y Omi, se ha descrito la capacidad
de inducción de apoptosis independiente de su interacción con las proteínas IAPs
(Liston et al., 2003).
Célula normal
Célula apoptótica
Mitocondria
apoptosoma
Núcleo
Núcleo
Figura 4. Activacióm mitocondrial tras el estímulo apoptótico. Las proteínas “sólo BH3” se unen
a Bcl-2 y dejan el camino libre para que las proteínas tipo Bax formen canales en la membrana
mitocondrial que permitan la liberación de citocromo c, Smac/DIABLO, AIF y Omi, entre otros
factores. Con la salida del citocromo c se forma el apoptosoma, Smac/Diablo y Omi se unen a los
IAPs, pudiéndose así activarse la caspasa-9 y caspasas efectoras. (Adaptada de Adams, J.
Genes&Dev 2003).
Como ya se ha mencionado anteriormente, proteínas de la familia de Bcl-2 juegan
un papel fundamental en la activación y regulación de la ruta mitocondrial. La proteína
antiapoptótica Bcl-2, que da nombre a toda la familia, recibió dicha denominación tras
haber sido identificada inicialmente en linfomas B foliculares que presentaban la
translocación t(14;18). Al translocarse el gen que codifica Bcl-2 desde el cromosoma 18
al 14, se ubica tras el promotor de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, de forma
que Bcl-2 se transcribe de forma constitutiva, bloqueando la muerte por apoptosis
(Cleary and Sklar, 1987). Existe una veintena de proteínas homólogas que constituyen
26
la familia de proteínas Bcl-2, caracterizadas por presentar al menos uno de los cuatro
dominios de homología denominados BH (BH1-BH4) (Ottilie et al., 1997).
Distinguimos tres grupos en los que pueden clasificarse las proteínas de esta familia:
Grupo I: Miembros anti-apoptóticos
Grupo II: Miembros pro-apoptóticos tipo Bax
Grupo III: Miembros pro-apoptóticos “BH3-only”
Miembros pro-apoptóticos tipo Bax
Este grupo se encuentra constituido por las proteínas Bax, Bak y Bok/Mtd, que
presentan los dominios BH1-BH3. Bax y Bak presentan una amplia distribución
mientras que Bok se localiza únicamente a nivel de los tejidos reproductores (Hsu et al.,
1997; Krajewski et al., 1996), lo que determina que tan sólo los dos primeros puedan
considerarse esenciales para el correcto desarrollo de la apoptosis celular, como se ha
observado en distintas modelos murinos deficientes para Bax y Bak (Lindsten et al.,
2000).
En respuesta al estímulo apoptótico, estas proteínas forman canales de
permeabilización en la membrana mitocondrial o interaccionan con las proteínas
formadoras de canales provocando la PMME. Mientras que Bak y Bok se encuentran
constitutivamente unidos a la membrana mitocondrial en células sanas (Griffiths et al.,
1999), Bax requiere del estímulo apoptótico para modificar su extremo C-terminal
hidrofóbico y traslocarse a la mitocondria, en cuya membrana externa se inserta de
manera estable (Borner, 2003; Nechushtan et al., 1999).
Por otra parte, la acción de estas proteínas pro-apoptóticas parece extenderse hasta el
retículo endoplasmático, donde median la apoptosis en respuesta a estímulos que
provocan la salida de calcio (Scorrano et al., 2003).
Miembros pro-apoptóticos “BH3-only”
A este subgrupo pertenecen proteínas como Bad, Bim, Blk, Hrk y Bid (Huang and
Strasser, 2000), emparentadas entre sí y con el resto de miembros de la familia Bcl-2 tan
sólo por presentar el dominio BH3. Parecen actuar como sensores y mediadores de la
27
apoptosis que permiten la transmisión de señales de muerte bien por unión y
neutralización de los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 (Cory and Adams,
2002) o por activación directa de Bax y Bak (Wei et al., 2000), pero que son incapaces
de inducir apoptosis en ausencia de estos últimos (Zong et al., 2001).
Bid se presenta como una proteína fundamental en la inducción de apoptosis al
conectar las dos rutas de inducción de apoptosis, intrínseca y extrínseca, como más
adelante explicaremos (Luo et al., 1998).
Miembros antiapoptóticos
Comparten con el resto de proteínas de la familia la presencia de dominios BH, de
los que se requieren más de tres para llevar a cabo su función anti-apoptótica.
Pertenecen a este grupo las proteínas Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Bfl1-1, Bcl-w y Mcl-1. Los
dominios BH1-BH4 intervienen en las interacciones con otras proteínas de la familia y
con moléculas localizadas en la cara citoplasmática de las membranas intracelulares
como la membrana mitocondrial externa, retículo endoplasmático y envuelta nuclear.
Los dominios BH1-BH3 forman un surco hidrofóbico estabilizado por BH4 (Petros et
al., 2001) que le permite interaccionar con el dominio BH3 de los miembros proapoptóticos “BH3-only” y los “tipo Bax” de esta misma familia (Sattler et al., 1997).
Bcl-2 es una proteína de 26 kDa que posee los cuatro dominios típicos BH1-BH4. Se
localiza fundamentalmente en la cara citoplasmática de la membrana externa
mitocondrial constituyendo una estructura en forma de poro que permite regular el flujo
de sustancias entre este orgánulo y el citoplasma en respuesta a posibles daños.
Bcl-XL es una de las proteínas más estrechamente relacionada con Bcl-2, tanto en su
estructura como en su función. Posee los cuatro dominios BH y su peso molecular es de
30 kDa. Su sobreexpresión puede mediar una resistencia significativa a la muerte
celular por apoptosis dependiente de deprivación de factor de crecimiento (Zinkel et al.,
2006).
Ambas proteínas actúan como inhibidores de la apoptosis formando heterodímeros
con Bax y Bak e inhibiendo su función, evitando así la salida de citocromo c y otros
factores apoptogénicos de la mitocondria (Yang et al., 1997). Por otra parte, su
capacidad anti-apoptótica incluye la unión al extremo C-terminal de la proteína Apaf-1,
evitando con ello la asociación y activación de la caspasa-9 (Hu et al., 1998).
28
Mcl-1 es una proteína de 37 kDa ampliamente expresada en distintos tipos de tejidos
y que guarda una gran homología con Bcl-2, aunque presenta una capacidad antiapoptótica reducida respecto a dicha proteína cuando se une a distintos miembros proapoptóticos de la familia, como Bax, Bak, Bim, Puma y Noxa (Chen et al., 2005; Wang
et al., 1998b). Aun así, Mcl-1 sufre una rápida degradación en respuesta a distintos
estímulos apoptóticos, lo que revela su papel en la regulación de la supervivencia
celular (Cuconati et al., 2003; Chao et al., 1998; Nijhawan et al., 2003).
1.3.2 Ruta extrínseca
En situaciones tanto fisiológicas como patológicas, la célula puede entrar en
apoptosis en respuesta al estímulo desencadenado por la unión de los denominados
ligandos de muerte a sus receptores específicos. Se trata de proteínas transmembrana
tipo II pertenecientes a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), como
FasL/CD95L o TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand), que presentan en
su región extracelular los denominados dominios de homología a TNF (THD) a través
de los cuales se asocian a sus receptores (Bodmer et al., 2002). Estos ligandos son
expresados por distintas células del sistema inmunológico como linfocitos T, células
NK, monocitos y células dendríticas, participando y permitiendo la eliminación de
células que han cumplido su función, células infectadas, autorreactivas y metaplásicas
(Greil et al., 1998; Perlman et al., 2001; Singh et al., 1999; Yang et al., 2001; Zhang et
al., 2004).
Los receptores pro-apoptóticos a los que se unen estos ligandos son proteínas
transmembrana tipo I de la superfamilia de TNF y reciben el nombre de receptores de
muerte. Se caracterizan por presentar en su región intracelular los denominados
dominios de muerte (DD) a través de los cuales va a transmitir el impulso apoptótico.
Existen además receptores anti-apoptóticos o “decoy” en los que la unión del ligando
no transmite la señal de apoptosis y entre los que podemos incluir receptores solubles
(Gruss and Dower, 1995).
Ambos tipos de receptores presentan en su región
extracelular unos dominios ricos en cisteínas (CRDs) que se asocian con las regiones
THD de los ligandos de muerte por medio de puentes disulfuro formando multímeros
funcionales (Banner et al., 1993).
29
Ligandos
Receptores
Figura 5. Ligandos y receptores de la familia de TNF. En gris se representan los dominios ricos en
cisteínas (CRDs); con un rectángulo negro se representan los dominios transmembrana; y finalmente,
con un rectángulo sombreado se representan los dominios de muerte.
La unión del ligando de muerte a su receptor pro-apoptótico va a tener como
consecuencia la trimerización del receptor y el reclutamiento de proteínas
citoplasmáticas adaptadoras con dominios DD homólogos al del receptor, para formar
así el denominado complejo inductor de señales de muerte (DISC). Además de
dominios DD, algunas de estas proteínas adaptadoras, como FADD, presentan
dominios efectores de muerte (DED), que van a permitir el reclutamiento y activación
de las caspasas iniciadoras -8 ó -10 a nivel del DISC (Kischkel et al., 2000).
30
FasL/CD95L
Fas/CD95
FADD
Bax, Bak
DISC
procaspasa-8, -10
Mitocondria
Fragmentación de Bid
tBid
Casp-8*, -10*
Bcl-2
Citocromo c
Apaf-1
dATP/ATP
Casp-3*, -7*
Apoptosoma
procaspasa-9
Casp-9*
APOPTOSIS
Figura 6. Señalización de apoptosis inducida por el sistema FasL/Fas en células tipo I y tipo II
En función de la necesidad de la ruta intrínseca para la inducción efectiva de la
apoptosis tras la activación de los receptores de muerte, las células pueden clasificarse
en tipo I si no requieren de la vía mitocondrial o en tipo II si requieren la participación
de este orgánulo (Scaffidi et al., 1998). En las células tipo I, las caspasas iniciadoras
activadas a nivel del DISC a su vez activan directamente a las caspasas efectoras -3 y -7
que provocarán finalmente la muerte celular por apoptosis.
En las células tipo II, la caspasa-8, además de cortar y activar a las caspasas
efectoras, corta a la proteína “BH3-only” Bid. Tras el corte por la caspasa, los
fragmentos C-terminal de 15 kDa y N-terminal de 7 kDa se asocian provocando un
cambio en la conformación del denominado cBid ( Bid cortado), que se traslocará a la
membrana mitocondrial provocando su permeabilización y así la liberación de factores
apoptogénicos al citoplasma (Li et al., 1998; Lutter et al., 2001; van Gurp et al., 2003).
Esta PMME está mediada, como ya se ha explicado, por la interacción de cBid con Bcl2 y Bcl-XL inactivando la función de estas proteínas anti-apoptóticas. Además cBid se
une y activa directamente a Bax y a Bak (Eskes et al., 2000; Wei et al., 2000). Se ha
postulado también las hipótesis de la homooligomerización de cBid para formar canales
en la membrana externa mitocondrial, aunque este hecho solo se ha demostrado in
31
vitro(Grinberg et al., 2002), así como de su capacidad para desestabilizar la bicapa
lipidica de la membrana, lo que determinaría la salida al citoplasma de elementos del
espacio intermembrana (Oh et al., 2005). Sea cual fuere el mecanismo de acción de
cBid, una vez liberados los factores pro-apoptóticos de la mitocondria se induce la
formación del apoptosoma y la activación de la caspasa-9 iniciadora, que en este caso
será la principal responsable de la activación de las caspasas efectoras (Zou et al.,
1999). El requerimiento del corte de Bid y la participación de la mitocondria en las
células tipo II parece deberse a una activación insuficiente de caspasa-8 en el DISC
como para generar la suficiente activación de caspasas efectoras que desencadenen la
muerte de la célula.
Por otra parte, y de forma independiente a la colaboración entre ambas rutas, en los
dos tipos de células la señal apoptótica se ve incrementada y prolongada gracias a la
capacidad de la caspasa-3 efectora de activar a la caspasa-8 por un mecanismo de
retroalimentación tanto a través de la caspasa -6 como directamente, siendo este último
el principal mecanismo responsable de la potenciación de la apoptosis en algunas
modelos de células tumorales resistentes la inducción de esta forma de muerte celular
(Yang et al., 2006).
1.4 Regulación de la apoptosis.
Debido al elevado numero de señales que pueden inducir el inicio de la muerte
celular por apoptosis es necesaria la existencia de mecanismos que regulen de manera
estricta la entrada en este proceso, de manera que no ocurra de forma accidental, y solo
tenga lugar en aquellas situaciones en las que sea necesario para conservar la
homeostasis del organismo. Alteraciones en los mecanismos de control de la apoptosis
modifican la sensibilidad o resistencia de las células a la inducción de este tipo de
muerte celular y pueden desencadenar patologías como el cáncer. Entre estos
mecanismos podemos señalar el balance de receptores pro- y anti-apoptóticos (Zhang et
al., 2000) y los niveles intracelulares de proteínas antiapoptóticas como FLIP o los
miembros de las familias de IAP y Bcl-2.
IAPs. Se han descrito hasta 8 proteínas inhibidoras de la apoptosis en humanos,
con capacidad para evitar la actividad de las caspasas -3, -7 y -9 (Deveraux et al., 1997;
32
Shiozaki and Shi, 2004): XIAP, cIAP1, cIAP2, IAP asociado a melanoma (ML-IAP),
proteína inhibidora de la apoptosis neuronal (NAIP), survivina y bruce (Wright and
Duckett, 2005).
Figura 7. Mecanismo de acción de XIAP
Estas proteínas inhibidoras de la apoptosis con capacidad de unión e inactivación de
caspasas tanto iniciadoras como efectoras llevan a cabo su acción a través de los
denominados dominios BIR (Baculoviral IAP Repeat), 80 aminoácidos plegados
alrededor de una atómo de Zinc y que reciben su nombre de la identificación por
primera vez de estas proteínas en células infectadas por baculovirus incapaces de sufrir
apoptosis mediada por caspasas. Pero es el dominio contiguo RING el encargado de la
destrucción de la caspasa, pues actúa como una ligasa de ubiquitina que promueve la
degradación por el proteasoma del propio IAP asociado a la enzima (Yang and Li,
2000). Junto al dominio RING, tanto en c-IAP1 como en c-IAP2 se localiza un dominio
33
CARD que sugiere que estas IAPs podrían regular directa o indirectamente el
procesamiento de las caspasas a través de interacciones por dicho dominio.
FLIP.- Flice Inhibitory Protein o FLIP de origen viral fue descubierto por
primera vez en linfocitos T citotóxicos donde el virus trataba de mantener con vida a la
célula infectada para lograr con éxito su etapa de replicación, evitando la apoptosis
mediada por receptores de muerte (Bertin et al., 1997; Thome et al., 1997). En humanos,
encontramos dos isoformas de la proteína obtenidas por procesamiento alternativo del
ARNm y denominadas por su longitud FLIP largo (FLIPL), de 55 kDa, y FLIP corto
(FLIPS), de 26 kDa (Hu et al., 1997). Ambas isoformas se caracterizan por presentar en
su estructura dos dominios DED, necesarios para cumplir su función inhibidora de
apoptosis, pues a través de éstos pueden asociarse por interacciones homeotípicas con la
proteína adaptadora FADD y ser reclutadas en el DISC en lugar de las caspasas
iniciadoras -8 y -10 (Goltsev et al., 1997). Si bien ésta constituye la estructura básica de
la isoforma FLIPS, en el caso de FLIPL encontramos también un dominio pseudocaspasa
inactivo que va a ser degradado a nivel del DISC como si de la auténtica caspasa -8/-10
se tratara, dando lugar a una fracción de 43 kDa que quedaría anclada al DISC
impidiendo el reclutamiento de la auténtica caspasa al tiempo que se libera un
fragmento de 12 kDa homólogo al de la caspasa iniciadora, evitando el inicio de la
cascada de señales apoptóticas (Krueger et al., 2001; Scaffidi et al., 1999).
Figura 8. Estructura de las isoformas de c-FLIP y de v-FLIP en comparación con procaspasa -8
34
2. TRAIL Y SUS RECEPTORES
2.1 TRAIL
TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) es una proteína transmembrana
tipo II perteneciente a la superfamilia de TNF (Wiley et al., 1995). Con 32 kDa de peso
molecular, está formada por una fracción intracelular seguida de un dominio
extracelular que presenta un 28% de homología con el de CD95L (Wiley et al., 1995).
Este dominio extracelular puede ser liberado al medio, pudiendo así aparecer este
ligando de muerte en forma soluble (Mariani and Krammer, 1998a). De igual forma, se
ha descrito que linfocitos T activados pueden liberar al medio TRAIL como una
proteína completa mediante vesículas (Monleon et al., 2001). Al igual que el resto de
ligandos de muerte, TRAIL se une a sus receptores específicos en forma de
homotrímero, cuya estabilidad y actividad biológica requieren de la presencia de un
átomo de Zinc unido al residuo Cys230 localizado a nivel de los CRDs (Bodmer et al.,
2000), regiones extracelulares ricos en cisternas que se asocian los ligandos de muerte
por medio de puentes disulfuro formando multímeros funcionales (Banner et al., 1993).
2.2 Receptores de TRAIL
TRAIL pude unirse específicamente a cuatro tipo de receptores transmembrana
denominados TRAIL-R1 a -R4, cuyos genes codificantes se localizan en la región p2221 del cromosoma 8, lo que sugiere que evolucionaron de un precursor común (DegliEsposti, 1999), teoría avalada por la homología superior al 50% de las secuencias
nucleotídicas de los mismos. (Degli-Esposti et al., 1997a). TRAIL puede unirse también
a un receptor soluble denominado osteoprotegerina (OPG) con menor afinidad que al
resto de receptores(Truneh et al., 2000), y que parece estar implicado en la inhibición de
la osteoclastogénesis, así como en la resistencia a la apoptosis mediada por TRAIL en
ciertos tumores, como en cáncer de próstata, por secuestro del ligando de muerte antes
de su acción en la membrana de la célula tumoral (Holen et al., 2002).
35
Los receptores de TRAIL en membrana pueden ser clasificados en pro- y antiapoptóticos, en función de su capacidad para inducir la activación de la cascada
apoptótica.
Los receptores TRAIL-R1/DR4 (Pan et al., 1997b) y TRAIL-R2/DR5 (Walczak et
al., 1997) son denominados pro-apoptóticos pues presentan en su región intracelular los
dominio de muerte (DD) necesarios para transmitir la señal de apoptosis tras la unión
del ligando (Cha et al., 2000).
TRAIL
Figura 9. Esquema de la estructura de los receptores de TRAIL.
Los receptores TRAIL-R3/DcR1 (Degli-Esposti et al., 1997b) y TRAIL-R4/DcR2
(Degli-Esposti et al., 1997a) son conocidos como receptores anti-apoptóticos o
“señuelo” debido a su incapacidad para inducir apoptosis tras la unión del ligando.
TRAIL-R3 carece de dominio intracitoplasmático y transmembrana, anclándose
a la membrana a través de un lípido glicosil-fosfatidil-inositol (Degli-Esposti et
al., 1997b), y por lo tanto carece de DD.
TRAIL-R4, por el contrario, sí que presenta regiones citoplasmática y
transmembrana, pero posee un DD truncado que lo incapacita a la hora de
ensamblar la maquinaria necesaria para la activación del proceso apoptótico,
pero que le permite activar la ruta de supervivencia de NFκB tras la unión a
TRAIL (Degli-Esposti et al., 1997a), hecho que también se ha descrito tras la
unión del ligando de muerte a sus receptores pro-apoptóticos (Chaudhary et al.,
1997).
36
El perfil de expresión de receptores pro- y anti-apoptóticos en membrana puede
modular la susceptibilidad celular a la inducción de apoptosis vía TRAIL. Junto con la
capacidad antes mencionada de activación de la ruta de NFκB, los receptores antiapoptóticos se postularon en un primer momento como los responsables de la
resistencia a la muerte por el ligando, al secuestrarlo e impedir su unión a receptores
pro-apoptóticos (Pan et al., 1997a). Sin embargo, este mecanismo de resistencia no
aparece en todos los casos, como demuestran estudios más recientes donde se describen
tipos celulares resistentes a TRAIL que no expresan receptores anti-apoptóticos (Kim et
al., 2000).
Otro mecanismo de acción anti-apoptótica conferido a los receptores TRAIL-R3 y
-R4 consistiría en la formación de heterodímeros con el receptor pro-apoptótico TRAILR2 (Munoz-Pinedo et al., 2002), alterando el balance de señalización.
2.3 Regulación de la expresión de TRAIL.
El gen codificante del ligando de muerte se encuentra localizado en el cromosoma 3,
se compone de aproximadamente unas 20 kb y consta de cinco exones de 222, 138, 42,
106 y 1245 pb, separados por cuatro intrones de 8.2, 3.2, 2.3 y 2.3 kb respectivamente
(Gong and Almasan, 2000; Wang et al., 2000a).
Figura 10. Gen de TRAIL. H. Sapiens cromosoma 3, clon hRPK.44_A_1 (Accesion No. AC007051)
(Gong, B. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 278, 745-752 (2000)
Su promotor carece de caja TATA o CAAT típicas, aunque contiene dos secuencias
Sp1 que parecen ser las reguladoras del inicio de transcripción. Además contiene en la
región proximal otros sitios de unión a factores reguladores de la transcripción como
secuencias AP-1 o GAS (Gong and Almasan, 2000; Wang et al., 2000a). Numerosos
trabajos han descrito la regulación de la expresión de TRAIL por interferones de tipo I
37
(IFN-α e IFN-β) o de tipo II (IFN-γ), tanto en células del sistema inmune (células T,
NK, monocitos y células dendríticas) (Griffith et al., 1999; Kayagaki et al., 1999; Smyth
et al., 2001) como en otros modelos de células normales y tumorales. Se ha propuesto la
existencia de dos sitios ISRE cercanos al sitio de inicio de transcripción como
responsables de la regulación de la expresión de TRAIL por interferón (Clarke et al.,
2004).
Figura 11. Secuencia del del promotor de TRAIL.
También se ha demostrado que la activación de células T con anticuerpos antiCD3/anti-CD28, fitohemaglutinina (PHA), ésteres de forbol/ionomicina y en general
cualquier estímulo que imite la activación del receptor de la célula T para el antígeno
(TCR), conduce a un rápido aumento en la expresión de TRAIL tanto a nivel de ARNm
38
como de proteína en la membrana celular, permaneciendo la célula T activada resistente
a la acción de dicho ligando (Jeremias et al., 1998). Esta inducción de TRAIL en
linfocitos T activados parece estar regulada por el factor de transcripción NF-κB
(Siegmund et al., 2001). De hecho se ha descrito la presencia de dos sitios de unión para
dicho factor, en la región proximal del promotor de TRAIL, necesarios para la
inducción de este ligando en respuesta a la activación de linfocitos T (Baetu et al.,
2001). Artículos recientes también han propuesto una posible regulación de la expresión
de TRAIL por NFAT, pero la contribución exacta de este factor de transcripción aún no
se ha caracterizado (Liu et al., 2006).
2.4 Papel fisiológico de TRAIL
Poco se conoce acerca del papel fisiológico de TRAIL in vivo, pero distintos estudios
parecen indicar su participación en diferenciación, en la hematopoyesis y el
mantenimiento de la homeostasis del sistema inmunitario y en la eliminación de
tumores.
TRAIL en diferenciación celular.- Osteoclastos y células intestinales.
La diferenciación de los osteoclastos hasta constituirse como una célula madura
parece estar relacionada con dos receptores considerados “decoy” de ligandos de
muerte. El primero de estos receptores es RANK, ya que la unión de este receptor a
su ligando, RANKL determina la activación y supervivencia de este tipo celular vía
NF-κB (Fuller et al., 1998; Jilka et al., 1999). El otro receptor implicado en la
diferenciación es OPG (osteoprotegerina), receptor soluble con capacidad de unión a
TRAIL (Emery, 1998), así como a RANKL (Lacey et al., 1998). Este hecho parece
indicar que TRAIL puede jugar un papel en el metabolismo óseo, sobre todo tras
estudios recientes que muestran como TRAIL puede inhibir la osteoclastogénesis in
vitro (Zauli et al., 2004).
Por otra parte, es conocida la actividad de TRAIL a nivel de la proliferación y
diferenciación del epitelio intestinal, ya que interviene en la regulación de la
inflamación a nivel del tracto digestivo y la progresión de ciertos tumores (Strater et
al., 2002). Durante el proceso de diferenciación celular desde las criptas a las
vellosidades intestinales, se observa un incremento en la expresión de TRAIL así
39
como de sus receptores, que no provocan toxicidad en este tipo celular pero puede
favorecer la renovación en caso de células infectadas o transformadas (Zauli and
Secchiero, 2006).
TRAIL en hematopoyesis.- Maduración y eritropoyesis.
Los distintos linajes celulares presentan diferencias en cuanto al sistema formado por
TRAIL sus receptores. Si bien los precursores CD34+ no presentan expresión alguna
del ligando ni sus receptores (Zauli and Secchiero, 2006), se ha descrito que, tanto en
monocitos como neutófilos, la maduración celular provoca la progresiva expresión de
distintos receptores de TRAIL que van a favorecer su delección tras la entrada en
senescencia (Lum et al., 2005; Renshaw et al., 2003). Por otro lado parece que el
ligando de muerte interviene en el proceso de eritropoyesis puesto que los eritroblastos
inmaduros presentan receptores pro-apoptóticos y son sensibles a TRAIL (Secchiero et
al., 2004).
TRAIL en la homeostasis del sistema inmunitario
Se ha descrito que TRAIL media la apoptosis de linfocitos CD8+ una vez realizada
su función (Zerafa et al., 2005), evitándose con ello la expansión de dichas células y el
desarrollo de problemas de autoinmunidad,
Estudios realizados en modelos murinos deficientes en TRAIL muestran que estos
ratones sufren defectos en la apoptosis de timocitos que acaban traduciéndose en una
mayor susceptibilidad a desarrollar enfermedades autoinmunes (Lamhamedi-Cherradi et
al., 2003).
TRAIL en supresión de tumores
TRAIL es expresado por distintas células del sistema inmunitario, como linfocitos
T, células NK, monocitos y células dendríticas (Griffith et al., 1999; Liu et al., 2001;
Mariani and Krammer, 1998a). La estimulación de dichas células a través de
interferones o del TCR, en el caso de los primeros, induce la expresión de este ligando y
así se favorece o se estimula su capacidad de inducción de apoptosis sobre células
tumorales (Takeda et al., 2002).
Pero lo más relevante de este ligando de muerte, y lo que lo diferencia de otros
ligandos de muerte de la familia de TNF, es su capacidad para inducir apoptosis de
manera selectiva en células tumorales y no en células normales (Wiley et al., 1995). Si
40
bien existe un gran número de tumores resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL
(Griffith and Lynch, 1998), su estudiada efectividad en la erradicación de tumores en
modelos murinos acompañada de la ausencia de citotoxicidad en humanos (Ashkenazi
et al., 1999) confieren a TRAIL propiedades como un prometedor agente terapéutico en
la lucha contra el cáncer.
3. TRAIL EN TERAPIA ANTITUMORAL
La capacidad de TRAIL para inducir apoptosis selectivamente en células
transformadas y la necesidad de terapias antitumorales menos agresivas que las
utilizadas actualmente, han propiciado el desarrollo de numerosos estudios dirigidos al
empleo de este ligando en la erradicación de tumores. En la actualidad, anticuerpos
frente a los receptores pro-apoptóticos TRAIL-R1 y -R2 se encuentran en ensayos
clínicos de fase I y de fase II tras comprobar su capacidad para inducir apoptosis en
líneas tumorales y tumores primarios in vitro (Georgakis et al., 2005; Vulfovich and
Saba, 2005). Este hecho es extensible al empleo del propio TRAIL recombinante, en
forma de homotrímero soluble unido a un átomo de Zinc, tras haberse establecido su
tolerancia por parte de algunas células no transformadas, como hepatocitos o células
neuronales previamente descritas como sensibles al ligando en ciertos estudios (Kelley
et al., 2001).
Dada la existencia de un gran número de modelos tumorales resistentes a TRAIL, la
mayor parte de los estudios se han centrado en el desarrollo de terapias combinadas con
agentes que rompan la resistencia a este ligando. Entre dichos agentes podemos
mencionar drogas genotóxicas, inhibidores de histona deacetilasas, inhibidores del
proteasoma, así como compuestos inhibidores de distintas rutas de supervivencia.
3.1 Regulación de la expresión de FLIP
Una de las piezas claves en la sensibilización de distintos tumores a la acción de
TRAIL radica en la regulación de la proteína FLIP. Competidor natural del
reclutamiento de caspasa-8 a nivel del DISC, FLIP se presenta como la barrera más
41
apical en la ruta de apoptosis mediada por TRAIL. Desde el descubrimiento de esta
proteína (Irmler et al., 1997), distintos agentes se han propuesto como moduladores de
la resistencia a TRAIL al provocar un descenso en los niveles de FLIP. Entre éstos,
destacamos:
Doxorubicina (DRX), antraciclina que inhibe a la enzima topoisomerasa II y
además actúa como agente intercalante de la doble cadena de ADN, impidiendo
de este modo la síntesis de ácidos nucleicos y con ello la progresión tumoral. Se
emplea en el tratamiento de leucemia linfática aguda, leucemia mieloide aguda,
linfoma de Hodgkin y carcinoma de mama entre otros. En algunos modelos,
como en cáncer de próstata, se ha demostrado una sensibilización a TRAIL por
doxorubicina mediada por el descenso en los niveles de FLIP (Kelly et al.,
2002).
Cicloheximida (CHX), inhibidor de la síntesis proteica en organismos
eucariotas producido por la bacteria Streptomyces griseus. Actúa interfiriendo
en la actividad peptidil transferasa del ribosoma 60S, bloqueando la elongación
de la traducción. Su capacidad para sensibilizar a la muerte por apoptosis
mediante regulación de FLIP se ha demostrado en distintos tipos de cáncer
como el carcinoma renal (Brooks and Sayers, 2005) y CLL (Kang et al., 2003).
Actinomicina D, antibiótico polipeptídico aislado de las bacterias de suelo del
género Streptomyces que inhibe el proceso de transcripción. También en ciertos
modelos, como leucemia linfática crónica B, se ha descrito la sensibilización a
TRAIL por este compuesto a través de la regulación de FLIP (Olsson et al.,
2001).
Otros agentes que comienzan a ser empleados en la sensibilización de tumores a
TRAIL por inducir una reducción en los niveles de FLIP, entre otros factores antiapoptóticos, son los denominados inhibidores de histona deacetilasa (HDACi)
(Hernandez et al., 2001), cuyo mecanismo de acción aún no completamente
caracterizado será explicado en capítulos posteriores.
La expresión de FLIP se encuentra regulada a través de distintas vías de
supervivencia celular como son la vía de la proteina quinasa II dependiente de
calcio/calmodulina (CaMKII), la vía de las proteinas quinasas activadas por mitógenos
(MAPK), la vía de la fosfatidil-inositol 3’ quinasa (PI3K), o a través del factor de
42
transcripción NF-κB. El empleo de inhibidores específicos de estas rutas provoca el
descenso de los niveles de FLIP y así la sensibilización a TRAIL en distintos modelos
tumorales (Xiao et al., 2005).
3.2 Ruta de MAPK
Las proteinas quinasas activadas por mitógenos transmiten señales implicadas tanto
en proliferación celular como en apoptosis a través de la fosforilación de sustratos como
fosfolipasas, otras quinasas, factores de transcripción o proteínas del citoesqueleto.
Existen tres subfamilias de MAPK, de las cuales sólo dos se encuentran bien
caracterizadas:
ERK1 y ERK2
Quinasas activadas por factores de crecimiento o a través de la proteina quinasa C
(PKC), intervienen en mitosis, meiosis, diferenciación, angiogénesis y apoptosis, así
como en la activación de factores de transcripción relacionados con la supervivencia
celular como NF-κB (Hagemann and Blank, 2001; Johnson and Lapadat, 2002; Lee and
McCubrey, 2002). La actividad ERK1/2 se encuentra aumentada en ciertos tumores,
convirtiéndose en diana de drogas inhibidoras que presentan escasa o nula toxicidad en
células no transformadas, como el PD184352 o PD98059, actualmente en ensayos
clínicos (Sebolt-Leopold, 2000); o la bisindolilmaleimida, inhibidor más apical de la
ruta a nivel de PKC. En ambos casos se ha demostrado la capacidad de estos agentes de
sensibilizar a TRAIL en distintos modelos tumorales (Dai et al., 2003; Ohtsuka and
Zhou, 2002) (Sarker et al., 2001)
JNK y p38
La quinasa c-Jun NH2-terminal en asociación con p38, activadas al igual que
ERK1/2 por quinasas MKK de la ruta de las MAPK, están por el contrario relacionadas
con la inducción de apoptosis a través de la activación de miembros pro-apoptóticos de
la familia de Bcl-2 como Bax o Bim, de la inhibición de miembros anti-apoptóticos
como Bcl-2 o Bcl-XL, así como a través de la proteína supresora de tumores p53
(Corazza et al., 2006; Lee et al., 2005; Shimada et al., 2003)
43
Esta ruta puede ser activada por estímulos pro-apoptóticos como el propio TRAIL,
que favorece la traslocación de c-Jun y Fos al núcleo y la formación de AP-1, factor de
transcripción que determina la síntesis de ligandos pro-apoptóticos como TNFα o FasL
(Corazza et al., 2006; Sah et al., 2003).
Por otro lado, estudios recientes muestran como la inhibición de JNK podría
favorecer la apoptosis debido a la potenciación de la actividad de p38 (Hsu et al., 2007),
quinasa para la que se ha descrito su implicación en la inducción de apoptosis (Amran et
al., 2007; Lim et al., 2006), de forma que inhibidores de la JNK como SP-600125
podrían sensibilizar a TRAIL.
Estímulo
Respuesta
biológica
Factores de Crecimiento
Crecimiento
Desarrollo
(FLIP)
Estrés, TNFα
Inflamación
Apoptosis
Figura 12. Ruta de las MAPK.
3.3 Ruta de PI3K
La ruta de supervivencia iniciada por PI3K, activada por la unión de estímulos de
supervivencia como EGF a sus receptores específicos (Poulaki et al., 2002) o bien
directamente por el protooncogen Ras (Rodriguez-Viciana et al., 1996), determina la
activación de la quinasa Akt que se encuentra incrementada en un elevado número de
tumores, inhibiendo la actividad de TRAIL (Lane et al., 2007; Oka et al., 2006).
44
Akt, regulada en condiciones no patológicas por la proteína tirosina fosfatasa
inhibidora de tumores PTEN (Li et al., 1997), bloquea señales intracelulares apoptóticas
por fosforilación de distintos sustratos:
•
BAD, que pierde así su capacidad de unión e inhibición de Bcl-XL .
•
Caspasa -9, inhibiendo su activación.
•
MDM2, favoreciendo su unión a p53 y así la degradación de esta proteína
supresora de tumores.
•
IKK, potenciando la ruta de supervivencia mediada por NF-κB.
El compuesto LY294002, que bloquea esta ruta de supervivencia inhibiendo de
forma específica a PI3K, se ha descrito como un agente sensibilizador de la apoptosis
mediada por TRAIL en diversos modelos como en células de endotelio vascular
(Alladina et al., 2005), al inducir un descenso en los niveles de FLIP.
Figura 13. Ruta de PI3K/Akt
45
3.4 Ruta de NF-κB
El papel de este factor de transcripción en el mantenimiento de la supervivencia
celular y desarrollo del cáncer es de una gran relevancia, como se puede deducir de su
implicación en las vías previamente citadas, activadas por distintos estímulos. Tanto la
vía de las MAPK como la de PI3K acaban confluyendo en la activación de NF-κB, que
a su vez regula la expresión de distintas proteínas relacionadas con la resistencia a la
apoptosis junto con FLIP, IAP1 e IAP2 (Wang et al., 1998a), XIAP (Stehlik et al.,
1998), Bcl-XL (Chen et al., 1998) o el receptor anti-apoptótico TRAIL-R3 (Bernard et
al., 2001).
Pero la acción de NF-κB, en el contexto de la regulación de la apoptosis mediada por
TRAIL, no se limita a la mediación de estímulos y vías de supervivencia sino que es
mucho más compleja ya que este factor de transcripción también puede intervenir
positivamente en la cascada apoptótica, como demuestra su capacidad para regular la
expresión de TRAIL y de sus receptores de muerte (Baetu et al., 2001). Además, el
propio TRAIL es capaz de inducir la activación de NF-κB. Si bien en un primer
momento se describió este efecto como consecuencia de la unión del ligando de muerte
al receptor anti-apoptótico TRAIL-R4 (Degli-Esposti et al., 1997a), poco después se
amplió esta actividad a los receptores pro-apoptóticos TRAIL-R1 y -R2 (Chaudhary et
al., 1997). En definitiva, el concepto de equilibrio con el que comienza este trabajo
vuelve a aparecer en forma de una complicada madeja de señales intracelulares, de
manera que los denominados dominios de muerte de los receptores de TRAIL parecen
mediar dos tipos de señales opuestas, pro-apoptóticas y de supervivencia.
La activación de NFκB por unión de TRAIL a sus distintos receptores requiere el
reclutamiento de la protein quinasa RIP a través del adaptador FADD (Lin et al., 2000;
Varfolomeev et al., 1996). RIP fosforila y activa a IKK, complejo IkB quinasa
compuesto por tres subunidades: IKK1/IKKα, IKK2/IKKβ, ambas subunidades
catalíticas con actividad quinasa, e IKKγ/NEMO, subunidad inhibitoria que es separada
del resto del complejo por la acción de RIP, liberando así a las subunidades con
actividad quinasa de IKK (Mercurio et al., 1997) (Karin and Delhase, 2000).
NFκB se describe como un grupo de factores de transcripción diméricos (Karin and
Lin, 2002) cuyo heterodímero activo más conocido es el compuesto por las subunidades
46
p65/p50. Asociados al inhibidor IκB, dichos heterodímeros se encuentran secuestrados
en el citoplasma (Huang and Miyamoto, 2001). La fosforilación de IκB por parte de
IKK activo determina la ubiquitinación del inhibidor, que es degradado a nivel del
proteasoma, liberándose NFκB que se trasloca al núcleo donde determina la trascripción
de genes relacionados con supervivencia y proliferación (Ehrhardt et al., 2003)
TRAIL
TRAIL-R1/2
PROTEASOMA
UBIQUITINACIÓN
SEÑAL DE
LOCALIZACIÓN
NUCLEAR
NUCLEO
Figura 14. Ruta de activación de NF-κB. Adaptada de Hoffmann A, et al. Science 2002
Una vez establecida la importancia de NF-κB y su estrecha relación con TRAIL,
distintos grupos han demostrado la sensibilización de tumores a este ligando mediante
terapias combinadas con inhibidores de distintos puntos de la ruta de NF-κB, como
MG132 y bortezomib, inhibidores del proteasoma que impiden la degradación de IκB
(Kyritsis et al., 2007; Li et al., 2007); BAY 11-7085, inhibidor de la fosforilación de
IκB (Huerta-Yepez et al., 2004); o SN50, inhibidor de la traslocación de NF-κB al
núcleo (Kasuga et al., 2004).
47
3.5 Regulación del ciclo celular
3.5.1 Proteínas reguladoras del ciclo celular (CDKs)
La correcta progresión del ciclo celular se encuentra regulada por la denominadas
quinasas dependientes de ciclinas (CDKs), cuya actividad está a su vez controlada por
fenómenos de fosforilación/defosforilacion y por la unión a las citadas proteínas ciclinas
en respuesta a la estimulación por diversos factores como pueden ser factores de
crecimiento. De forma general, la unión de las ciclina D a las CDK4 y 6 favorece la
progresión de la fase G1, mientras que el complejo CDK2-ciclina E permite la entrada
en fase S, CDK2-cliclina A en G2, CDK1-ciclina A en mitosis y el retorno a G0
requiere de CDK1-ciclina B (Collins and Garrett, 2005).
En células no transformadas, la progresión del ciclo de una fase a la siguiente pasa
por una serie de “puntos de control” donde se diagnostica la correcta ejecución del
proceso y se intentan subsanar las posibles anomalías. De no ser esto posible, la célula
es eliminada por apoptosis. Las células tumorales desarrollan mecanismos para evitar
estos puntos de control íntimamente ligados con las funciones de las CDKs, lo que ha
convertido a estas enzimas en dianas farmacológicas en la lucha contra el cáncer.
Entre los distintos inhibidores de las CDKs, la roscovitina se presenta como un
posible agente pro-apoptótico en combinación con TRAIL. Se ha demostrado su efecto
sensibilizador al ligando en ciertos modelos tumorales, mediado posiblemente por su
capacidad para regular los niveles de proteínas pro-apoptóticas como Bak o de factores
anti-apoptóticos como Mcl-1 y XIAP (Hahntow et al., 2004; Kim et al., 2004).
3.5.2 Organización del citoesqueleto.
El mantenimiento de la integridad del citoesqueleto se encuentra íntimamente ligado
a la correcta progresión del ciclo celular. Los microtúbulos que componen el
citoesqueleto tienen su origen en polímeros dinámicos que intervienen en la movilidad
de la célula, el tráfico intracelular, así como en el crecimiento y la división celular.
La organización del citoesqueleto puede verse alterada por distintos agentes como el
nocodazol, inhibidor de la polimerización de microtúbulos, o el paclitaxel o taxol,
48
inhibidor de la despolimerizacion, produciéndose en ambos casos una parada de ciclo en
fase G2/M y la inducción de apoptosis en la célula (Wang et al., 2000b).
Esta inducción de la cascada apoptótica parece asociada a la capacidad de
regulación de distintas proteínas señalizadoras de la muerte celular por parte de estos
agentes inhibidores de la dinámica de microtúbulos. Se ha descrito el efecto de estos
agentes en la transcripción de proteínas pro-apoptóticas como TRAIL-R1 y -R2, Bax y
Bak, que ven incrementada su expresión (Shankar et al., 2005a), al tiempo que se
reducen los niveles de Bcl-XL, FLIP o XIAP (Liu and Stein, 1997; Park et al., 2004).
Por tanto, estos inhibidores también pueden ser útiles en estrategias de terapias
combinadas con TRAIL que potencien la acción de este ligando sobre ciertos modelos
tumorales (Nimmanapalli et al., 2001).
4. EPIGENÉTICA
La epigenética se define como el conjunto de cambios heredables en la expresión de
los genes no asociados a modificaciones en la secuencia del ADN. La accesibilidad
transitoria de distintas secuencias de ácidos nucleicos, regulada en gran medida por
factores epigenéticos, determina la expresión de genes que codifican proteínas
imprescindibles en procesos como pluripotencialidad, diferenciación y maduración
celulares. Así mismo, los cambios epigenéticos modulan la capacidad transcripcional de
la célula durante procesos inherentes a la correcta progresión del ciclo celular como son
la mitosis, o en su caso la apoptosis (Prigent and Dimitrov, 2003). Por tanto,
disfunciones en esta forma de control de la información genética pueden desembocar en
distintas patologías. Así, existe una íntima relación entre epigenética y cáncer. Los
fenómenos de activación
de oncogenes y de inactivación de genes supresores de
tumores asociados a la aparición y el desarrollo de un tumor (Galm et al., 2006) son
fruto en muchas ocasiones de alteraciones en las modificaciones epigenéticas durante el
ciclo celular. Y es por ello que los factores implicados en dichas modificaciones
epigenéticas pueden ser dianas importantes en la lucha contra el cáncer.
49
Las dos principales mecanismos epigenéticos, junto con la impronta genética, son la
metilación del ADN y la modificación de histonas por metilación, acetilación o
fosforilación (Klose and Bird, 2006; Strahl and Allis, 2000).
4.1 Metilación del ADN
La modificación epigenética más extendida en humanos es la metilación de citosinas
que preceden a guanosinas en la secuencia del ADN (dinucleótidos CpG) (Galm et al.,
2006). Esta metilación tiene lugar por unión covalente de un grupo metilo al carbono 5′
del anillo de citosina resultando una 5-metilcitosina, proceso llevado a cabo por unas
enzimas denominadas ADN metiltransferasas (DNMTs). La metilación del ADN inhibe
la expresión génica bien directamente bloqueando la unión de factores de transcripción,
o provocando la unión de las denominadas “proteínas de unión a CpG metilado” (MBP)
que silencian la expresión de los genes por remodelación de la estructura de la
cromatina a la que se unen (Klose and Bird, 2006).
En el ADN de mamíferos encontramos 5-metilcitosinas en aproximadamente el 4%
del ADN genómico y esta metilación basal parece contribuir al mantenimiento de una
gran cantidad de ADN en un estado transcripcional inerte. Existen unos pequeños
tramos de ADN ricos en CpG (de unos 0.5Kb) llamados islas CpG, localizadas
próximas a la las regiones promotoras y que se encuentran normalmente no metiladas
para permitir la expresión génica.
Figura 15. Patrón de metilación de las islas CpG en células tumorales y normales.
50
En la célula transformada los patrones de metilación del ADN se encuentran
profundamente alterados, presentando un espectro de genes hipermetilados específico
para cada tejido y origen del tumor, por lo que pueden actuar como biomarcadores para
la detección del cáncer, así como para predecir la susceptibilidad y respuesta a la terapia
(Baylin and Ohm, 2006). Generalmente, son los promotores de distintos genes
relacionados con la regulación del ciclo celular y apoptosis los que se encuentran
hipermetilados en células tumorales (Widschwendter and Jones, 2002), mientras que el
resto del ADN se presenta hipometilado (Weber et al., 2005). Así, tanto en tumores
hematopoyéticos como sólidos se ha descrito el silenciamiento por hipermetilación del
ADN de genes que codifican moléculas de adhesión, proteínas que regulan la
proliferación, la diferenciación, la reparación del ADN, la muerte por apoptosis, la
angiogénesis, metástasis del tumor e inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas
como p15, p27 o p21 (Gomyo et al., 2004).
4.2 “Código de Histonas”
La condensación del genoma eucariótico en forma de cromatina requiere de la
organización del ADN en unidades denominadas nucleosomas (Khorasanizadeh, 2004),
en los que encontramos 146 pares de bases enrolladas sobre un núcleo proteico en forma
de octámero compuesto por dos copias de cada una de las subunidades histonas H3, H4,
H2A y H2B.
Figura 16. Representación esquemática de un nucleosoma. Adaptado de Ruijter A.J.M.,Biochem. J,
2003
51
Estas histonas presentan un núcleo central altamente conservado, de estructura
globular (Luger et al., 1997), mientras que las colas aminoterminales contienen
secuencias variables particularmente ricas en lisina y arginina. Dichas secuencias actúan
como diana de distintas enzimas responsables de modificaciones post-traduccionales
tales
como
metilación,
fosforilación,
ubiquitinación,
poli-ADP-ribosilación
y
acetilación, que van a influir en el grado de compactación de la cromatina (Spotswood
and Turner, 2002). Esto ha permitido acuñar el término “código de histonas” para hacer
referencia a las modificaciones en la expresión de distintos genes en función de su
accesibilidad determinada por alteraciones reversibles de las histonas.
4.2.1 Metilación de histonas
La metilación de histonas, si bien es un proceso que no altera la carga total de la
proteína, incrementa su carácter básico e hidrofobicidad al tiempo que modifica su
afinidad por moléculas aniónicas como el ADN (Baxter and Cooke, 1995), de forma
que el nucleosoma ve modificada su estructura y función (Rice and Allis, 2001).
Este proceso está mediado por las histona metiltransferasas (HMTs) (Kouzarides,
2002), con capacidad de metilar los residuos de lisina K4, K9, K27, K36 y K79 de la
histona H3 y K20 de la H4, o bien las argininas R2, R17 y R26 de la H3 y R3 de la H4.
Este hecho favorece la liberación de la estructura eucromática del ADN facilitándose la
transcripción por unión de la ARN polimerasa II a los residuos metilados K4, K36 y
K79 de la H3 (Gerber and Shilatifard, 2003).
4.2.2 Ubiquitinación de histonas
La ubiquitina es una proteína altamente conservada de 76 aminoácidos cuya unión a
otras proteínas determina la proteolisis de las mismas a nivel del proteasoma (Adams,
2004), aunque la ubiquitinación a nivel del residuo de lisina K123 de la histona H2B
parece no constituir una señal directa para su degradación, sino tan solo una señal
dentro del código de las histonas para la expresión genética (Osley, 2004), en tanto que
actúa como un elemento regulador de la metilación de los residuos K4 y K36 de la H3
(Krogan et al., 2003).
52
Figura 17. Efectos de la ubiquitinación (Ub) de H2B sobre la metilación (M) de H3. Adaptado de
Zhang Y.Genes & Dev. 2003
4.2.3 Fosforilación de histonas
En mamíferos, la fosforilación de histonas en respuesta a determinados estímulos
tiene lugar sobre todo en los residuos S10 y S28 de la histona H3 a través de la vía de
las MAPK, de Akt y de IKK-1 (Anest et al., 2003; Hazzalin et al., 1997; Salvador et al.,
2001). Se trata de un proceso dual pues está implicado en la relajación de la cromatina,
permitiendo la transcripción de genes como c-jun, c-fos y c-myc que regulan la síntesis
de proteínas necesarias durante la interfase (Prigent and Dimitrov, 2003); y al mismo
tiempo también se ha descrito su participación en la regulación del ciclo celular durante
los procesos de mitosis y meiosis (Gurley et al., 1998) aunque su papel durante la
condensación de la cromatina asociada a la división celular no se conoce con exactitud.
4.2.4 Poli-ADP-ribosilación de histonas
Al igual que muchas otras proteínas, las histonas pueden ser modificadas por unión
de sucesivos monómeros de ADP-ribosa (poli-ADP-ribosa o PAR) por las PAR
polimerasas (PARPs). La acción de PARP en la regulación de la transcripción radica en
su capacidad para alterar la estructura de la cromatina favoreciendo su condensación y
reprimiendo, por tanto, la transcripción (Huletsky et al., 1989), o bien permitiendo la
asociación de complejos que incluyen distintos factores de transcripción a nivel de
distintos promotores (Kraus et al., 2003).
53
4.3 Acetilación de histonas
La progresión del ciclo celular desde el punto de vista epigenético es fruto del
correcto equilibrio entre la acetilación y la deacetilación de histonas con una relevancia
de proporciones infinitamente mayores respecto al resto de modificaciones a las que
hemos hecho referencia. El proceso de acetilación es llevado a cabo por las histona
acetil transferasas (HAT), enzimas que actúan sobre el grupo amino de los residuos de
lisina de las histonas (Johnson and Turner, 1999) neutralizando su carga positiva y con
ello su capacidad de unión al ADN, mientras que el proceso contrario está mediado por
las histona deacetilasas (HDAC), que eliminan dichos grupos acetilo favoreciendo la
compactación de la cromatina. Así, una situación de hipoacetilación de las histonas
llevado a cabo por las HDAC se correspondería con la disminución en la accesibilidad
al ADN. Por el contrario, la hiperacetilación provocada por la acción de las HAT, o por
inhibición de las HDAC, se traduciría en un incremento de la transcripción (Maison et
al., 2002).
4.3.1 Histona acetil transferasas (HAT)
Se trata de complejos multiproteicos de elevado peso molecular en los que además
de la subunidad catalítica encontramos una subunidad encargada de controlar la
selectividad de sustrato del complejo (Carrozza et al., 2003). Esto se traduce en que, en
función de las proteínas que conformen la región reguladora de este complejo, las HATs
van a reclutarse en diferentes regiones de distintos promotores por interacción con
proteínas activadoras que determinarán la acetilación de las histonas circundantes.
En humanos, podemos clasificar las HATs en tres familias en función de su
homología de secuencia y la similitud en sus funciones biológicas (Roth et al., 2001).
Familia GNAT.- En esta familia distinguimos las HATs Gcn5 y ATF-2,
caracterizadas por presentar un dominio con un átomo de Bromo que le permite
interaccionar con grupos que presenten las lisinas acetiladas, actuando como complejos
co-activadores.
Familia MYST.- En la que encontramos las enzimas MOZ, que actúa
como coactivador, y Tip60, que interviene en procesos como la reparación del ADN y
54
apoptosis (Carapeti et al., 1999). Estructuralmente, se caracterizan por presentar un
dominio catalítico de unos 250 aminoácidos que incluye una región rica en cisteína, una
región de unión a Zinc y un grupo Cromo amino-terminal para el reconocimiento de
grupos lisina metilados (Utley and Cote, 2003).
Familia CBP/p300.- Conjunto de enzimas que comparten en su
estructura la presencia de un residuo catalítico típico de las HATs, un dominio de
Bromo y una región rica en cisteína que permite la interacción proteína-proteína
(Marmorstein and Roth, 2001), pudiendo actuar como modulador global de la
transcripción. Esta enzima interviene activamente en procesos tumorales, debido a su
capacidad de acetilación de la proteína supresora de tumores p53 (Liu et al., 1999).
4.3.2 Histona deacetilasas (HDAC)
Las HDAC son enzimas con capacidad catalítica para eliminar el grupo acetilo de
distintas proteínas, como p53, E2F o tubulina (Hubbert et al., 2002), pero
particularmente de las histonas (Gray and Ekstrom, 2001).
Las HDAC actúan formando un complejo con distintas proteínas encargadas del
reclutamiento y remodelación de la estructura de la cromatina. De forma general,
elevados niveles de acetilación de histonas se asocian a un incremento de la actividad
transcripcional, mientras que la hipoacetilación se asocia con la represión génica (Wade,
2001). La principal señal para la represión de la transcripción mediada por las HDAC se
localiza en el propio ADN, a través de los grupos metilo de las citosinas de las islas
CpG (Klose and Bird, 2006). A estas regiones, como hemos citado previamente, se
asocian las “proteínas de unión a CpG metilado” (MBP) que son las responsables
directas del anclaje de las HDAC al ADN.
Una vez ancladas al ADN, la eliminación del grupo acetilo de las histonas tiene lugar
por un sistema basado en la modificación de la carga de la proteína. El dominio
catalítico de las HDAC, de unos 390 aminoácidos, presenta dos residuos de histidina
adyacentes y separados unos 30 aminoácidos de dos residuos de tirosina, y un átomo de
Zinc que va a retirar el grupo acetilo de la histona por ruptura del enlace convalente
(Buggy et al., 2000; Finnin et al., 1999).
55
Figura 18. Compactación y relajación de la cromatina por acción de las HATs y las HDACs. Adaptado
de Hess-Stumpp et al, IJBCB, 2007
En la actualidad, se han descrito hasta 18 HDAC diferentes que pueden clasificarse
en tres familias, las HDAC “clásicas” de clase I y II, que difieren en su localización, y
las HDAC clase III que presentan un mecanismo de acción diferente al de las HDAC
clásicas.
HDAC clase I.- De amplia distribución en distintas líneas celulares y
tejidos y de localización estrictamente nuclear (Fischle et al., 2001), presentan un
mecanismo de acción típico mediado por el átomo de Zinc. A esta familia de proteínas
pertenecen las HDAC1, 2, 3 y 8.
HDAC1 y HDAC2. Con secuencias con un 82% de homología entre sí,
ambas enzimas presentan capacidad de asociación in vivo a diferentes complejos de
56
unión al ADN, entre los que distinguimos los denominados Co-REST, Sin3, y NuRD
(Zhang et al., 1999). En el caso de estos dos últimos, junto con las proteínas que le dan
nombre encontramos otros integrantes como RbAp46 o RbAp48, que se unen a la
histona H4 directamente. La actividad de estos complejos está regulada por
fosforilación, de forma que un estado de hiperfosforilación se asocia con un incremento
en la capacidad de deacetilación de la enzima al tiempo que disminuye la asociación al
ADN para evitar una actividad excesiva. (Heinzel et al., 1997; Taplick et al., 2001).
HDAC3. De idéntico dominio catalítico pero tan solo un 68% de
homología con las HDAC1 y HDAC2, la región C-terminal no conservada de la
HDAC3 es imprescindible para ambas actividades deacetilasa y represora de la
transcripción. Pero lo que la separa del resto de las HDAC es el complejo al que se une,
el cual le confiere individualidad y especificidad.
La actividad de HDAC3 requiere de las presencia de SMRT (silencig mediator for
retinoic acid and thyroid hormone receptors) o N-CoR (nuclear receptor co-repressor),
cuya unión a la enzima les permite actuar como co-represores de la transcripción. A
través de estos complejos, la HDAC3 puede asociarse a otras HDACs como son la
HDAC4, 5 y 7 (Fischle et al., 2001; Yang et al., 2002), aunque también se ha observado
su asociación a las HDAC9 y 7 a través de otras proteínas.
HDAC8. De estructura similar a la HDAC3, está compuesta por un
dominio catalítico asociado a una señal de localización nuclear (NLS), aunque se
desconoce el complejo regulador al que puede encontrarse asociado.
HDAC clase II.- De complejo catalítico similar al de HDACs de clase I,
difieren de éstas en cuanto a su localización, limitada a un menor número de tipos
celulares, pero donde encuentran expresión tanto nuclear como citosólica (Verdin et al.,
2003) (Fischle et al., 1999). A esta familia enzimática pertenecen las HDAC4, 5, 6, 7, 9
y 10.
HDAC4, HDAC5 y HDAC7. Comparten una estructura similar que
incluye el dominio catalítico próximo a la región C-terminal, mientras que hacia la
región N-terminal se localizan el NLS y los dominios de unión a CtBP (roteínas de
unión al extremo C-terminal) y MEF2 (myocite enhancer factor 2).
Estas HDACs se localizan fundamentalmente en células musculares, donde regulan
el papel de MEF2 durante la diferenciación, de forma que su asociación con las HDAC
57
se traduce en una incapacidad de unión al ADN y por tanto de actuar como factor de
transcripción, que es recuperada con la disociación del complejo tras la fosforilación de
HDAC por CaMK (McKinsey et al., 2000).
Las HDAC4, 5 y 7 presentan sitios de unión a SMRT y N-CoR, favoreciendo su
asociación a la HDAC3 y con ello el reclutamiento de esta enzima al ADN (Guenther et
al., 2000).
HDAC6. Esta HDAC presenta dos rasgos estructurales que la separa del
resto de enzimas de la familia. El primero de ellos es la presencia de dos dominios
catalíticos dispuestos en tándem (Marks et al., 2001) y el segundo, un dominio Cterminal que actúa como señal para la ubiquitinación y que le confiere una mayor
predisposición a la degradación. Estas peculiaridades estructurales parecen asociadas a
su función como tubulina deacetilasa regulando la movilidad celular dependiente de
microtúbulos (Hubbert et al., 2002). Este hecho determina la presencia de una secuencia
de localización citosólica (NES), aunque también se ha descrito su localización a nivel
nuclear, asociada a la HDAC11.
HDAC9. Aunque aparece como variante por procesamiento alternativo
del ARN y por tanto está emparentada con las HDAC4, 5 y 7, la HDAC 9 difiere del
resto de proteínas de la familia en la localización del dominio catalítico, que se
encuentra dispuesto en el extremo N-terminal. Debido a su analogía con las HDAC4, 5
y 7, presenta capacidad de unión y reclutamiento al ADN de la HDAC3, y también se ha
descrito su interacción con MEF2, de lo que se deduce su posible implicación en la
diferenciación del tejido muscular.
HDAC10. Su capacidad de unión a las HDAC1, 2, 3, 4, 5 y 7 parece
indicar que su papel es predominantemente el reclutamiento de otras HDACs al ADN,
en lugar de la deacetilación por sí misma, aunque la presencia de dos sitios de unión a
Rb sugieren la posibilidad de su intervención en la regulación del ciclo celular.
HDAC11.
La
clasificación
de
la
HDAC11
no
se
encuentra
completamente establecida. Si bien filogenéticamente parece situarse próxima a las
HDAC3 y 8, no se ha establecido ningún tipo de asociación a los complejos descritos
como Sin3 o SMRT, lo que parece indicar que presenta una función bioquímica
diferente al resto (Gao et al., 2002). Esto ha llevado a que sea clasificada como HDAC
clase IV.
58
Figura 19. Clasificación y realación filogenética de las HDACs. Adaptado de Hess-Stumpp et al,
IJBCB, 2007
HDAC clase III o Sirtuinas. Difieren de las HDAC de clase I y II en su
mecanismo de deacetilación de histonas, al emplear un grupo NAD+ como aceptor de
grupos acetilo (Landry et al., 2000), y por no ser susceptibles de inhibición por
compuestos como el TSA (Tricostatina A) (Frye, 1999).
En humanos estas HDAC reciben el nombre de SIRT1-7 y son responsables del
silenciamiento de los telómeros, jugando un importante papel en la formación de la
heterocromatina (Palladino et al., 1993).
59
4.4 Histona deacetilasas y cáncer
Las HDAC regulan la expresión y actividad de numerosas proteínas que juegan un
papel en el inicio y en la progresión del cáncer. De entre los procesos en los que
interviene destacamos los siguientes
4.4.1 HDAC y proliferación celular
La proteína p21, inhibidora de CDKs, se presenta como uno de las dianas de la
acción de HDACs con mayor relevancia para la progresión del ciclo celular. Su
expresión durante el desarrollo se asocia a una hiperacetilación de las histonas H3 y H4
a nivel del promotor (Richon et al., 2000), de forma que la acción de las HDACs, en
especial la HDAC1, determina un descenso en la expresión de este inhibidor de la
proliferación que puede desembocar en una división celular incontrolada, como se ha
observado en distintos modelos tumorales (Ocker and Schneider-Stock, 2007).
4.4.2 HDAC y diferenciación hematopoyética
La
progresión
desde
células
precursoras
pluripotenciales
hasta
células
hematopoyéticas maduras requiere de la interrelación de una compleja gama de
moléculas. El bloqueo o desregulación de alguno de los pasos de este proceso de
diferenciación puede determinar la proliferación de células leucémicas y aquí pueden
jugar un papel importante las HDAC. Un ejemplo son los casos de leucemia mieloide
aguda (AML) asociados a la formación de la proteína de fusión AML-ETO, como
consecuencia de la translocación cromosómica t(8;21). Esta proteína de fusión se une a
las HDAC1, 2, 3, 5, 6 y 9 con afinidad variable (Hiebert et al., 2003) y así se asocia al
ADN provocando un descenso, por deacetilación, en los niveles expresión de ciertos
genes como el c-FMS, factor de diferenciación fundamental para macrófagos (Follows
et al., 2003).
60
4.4.3 HDAC, angiogénesis y metástasis
Entres los genes implicados en la progresión tumoral que son regulados por
acetilación y deacetilación de histonas, encontramos algunos relacionados con el
proceso de angiogénesis y con el control de la adhesión, migración e invasión celular.
Se ha demostrado que la situación de hipoxia localizada en el centro del tumor
induce la expresión de HDAC1, y con ello, la represión de p53 así como la inducción
del factor inducible por hipoxia-1α (HIF-1α) y el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF). De este modo HDAC1 regula la angiogénesis (Kim et al., 2001).
Por otra parte, las HDACs clase I regulan directamente la expresión de la Ecadherina, proteína fundamental en el proceso de adhesión y cuya pérdida determina la
invasión epitelial, primera fase de la metástasis (Peinado et al., 2004).
De la misma forma, las HDACs se encuentran implicadas en la regulación de la
expresión del receptor de quimioquinas CXCR4 en leucemia linfática aguda (ALL),
que interviene en la migración de estas células transformadas hacia hígado, bazo,
cerebro y nódulos linfáticos (Crazzolara and Bernhard, 2005).
4.4.4 HDAC y factores de transcripción
Cada día son más las proteínas no histonas descritas que son susceptibles de
modificación por acetilación y deacetilación por las HATs y HDACs, respectivamente,
alterando su función, capacidad de interacción proteína-proteína, estabilidad y
localización (Glozak et al., 2005). Entre estas proteínas, la acetilación de distintos
factores de transcripción parece jugar un importante papel durante la oncogénesis.
En respuesta a diferentes tipos de daño en el ADN se produce la acetilación de p53
por el complejo p300/CBP, incrementándose así la capacidad de unión de este gen
supresor de tumores a secuencias específicas situadas en ciertos genes, y por tanto su
acción como factor de transcripción. La activación de p53 promueve la parada del ciclo
celular a través de p21, en el caso de daños provocados por agentes alquilantes, e induce
apoptosis por activación de Bax tras daños en la maquinaria de reparación de ácidos
nucleicos (Gu et al., 1997; Sakaguchi et al., 1998).
En linfoma folicular de células B, la traslocación t(14;18) determina la
sobreexpresión de Bcl-2 regulada por los factores de transcripción Sp1 y C/EBP . La
61
interacción de la HDAC2 con dichos factores de transcripción permite su deacetilación
y así se favorece su unión al promotor del gen anti-apoptótico (Duan et al., 2005).
Figura 23. Activación de la transcripción de genes antiapoptóticos por acetilación de NF-κB.
Adaptdo de Kagoshima et al, Biochemical Society 2003
NF-κB interviene en el desarrollo de una gran diversidad de procesos oncológicos en
humanos. La actividad y estabilidad de este factor de transcripción también se encuentra
regulada por procesos de acetilación y deacetilación a distintos niveles (Basseres and
Baldwin, 2006). Una vez activado, NF-κB se trasloca al núcleo donde la unidad p65 es
acetilada por p300/CBP en los residuos K218, K221 y K 310, favoreciendo su unión al
ADN y así la transcripción de diversos genes anti-apoptóticos, e impidiendo su
asociación con la proteína inhibidora IκB. Una vez cumplida su función, es deacetilado
por HDAC1, 2 y 3, facilitando el exporte nuclear.
Pero esta asociación acetilación-activación no es estricta en el caso de NF-κB, ya
que la acetilación de los residuos K122 y K123 produce el efecto contrario,
reduciéndose la afinidad del factor de transcripción por el ADN (Kiernan et al., 2003).
En estas condiciones, la inhibición de la actividad HDAC puede ser beneficiosa para
el tratamiento de tumores, siendo este hecho aún más evidente si tenemos en cuenta que
en cada uno de los procesos relacionados con la oncogénesis descritos anteriormente, la
actividad HDAC se traduce en la progresión del tumor. De ahí que la inhibición de estas
enzimas se presente como una diana potencial en la terapia antitumoral.
62
4.5 Inhibidores de histona deacetilasas (HDACi)
Se han descrito un gran número de inhibidores de la actividad enzimática de las
distintas HDACs (HDACi), tanto de origen natural como derivados sintéticos, que
inducen parada de ciclo celular, diferenciación o apoptosis en células tumorales en
cultivo y modelos animales (Johnstone, 2002).
Dichos inhibidores presentan diferentes tipos de estructuras por lo que podemos
distinguir los siguientes grupos:
Ácidos hidroxámicos
La tricostatina A o TSA fue el primer hidroxamato descrito con capacidad de
inhibición de una amplia gama de HDACs (Yoshida et al., 1990). Pero es el vorinostat o
SAHA, inhibidor de HDACs de clases I y II, el único ácido hidroxámico aprobado
actualmente por la “Food and Drug Administration” para ser utilizado en el tratamiento
del linfoma T cutáneo, habiendo superado los ensayos de fase II en los que ha
demostrado su seguridad y eficacia y presentando una respuesta positiva en el 25% de
los casos (Duvic and Vu, 2007).
Otros miembros de esta familia de estructura similar al Vorinostat y que se
encuentran en fase I de ensayos clínicos son el LBH-589 o panobinostat en el
tratamiento de diferentes tipos de leucemias (Giles et al., 2006), el ITF2357 para el
tratamiento del mieloma múltiple y leucemia mieloide aguda (Golay et al., 2007), y el
PXD-101 o bellinostat, que presenta una buena tolerancia y una eficacia antitumoral
considerable en pacientes con un avanzado estado de oncogénesis (Marson et al., 2007).
Péptidos cíclicos
A esta familia estructural pertenecen los HDACi apicidina y depsipéptido. Este
último se caracteriza por inhibir eficazmente a las HDAC1 y 2, al tiempo que presenta
un efecto muy leve sobre las HDAC4 y 6 (Santini et al., 2007). Actualmente se
encuentra en fase II de ensayos clínicos en pacientes con linfoma T cutáneo con un
porcentaje de respuesta positivo del 36%, así como para el tratamiento de linfomas T
63
periféricos y distintos tumores sólidos o hematológicos en combinación con otros
agentes antitumorales (Piekarz et al., 2007).
Benzamidas
A este grupo pertenecen compuestos como N-acetildinalina (CI-994), MGCD-0103
y MS-275, inhibidor específico de las HDACs de clase I ante todo de las HDAC 1 y 3
(Hu et al., 2003). Actualmente en fase I de ensayos clínicos, este compuesto de
actividad comparable al TSA ha demostrado actividad antitumoral en neonatos y
adultos con cáncer de mama y riñón.
Figura 24. Estructura de los distintos HDACi. Adaptado de Minucci and Pelicci, Nature Reviews, 2006
Ácidos alifáticos
El ácido valproico (VPA) y el butirato sódico (NaB) son los representantes más
destacados de esta familia estructural, habiéndose probado sus efectos terapéuticos en
64
síndromes mielodisplásicos (Kuendgen et al., 2004). En el caso del VPA, junto con su
capacidad de inhibición enzimática, se ha demostrado también su implicación en la
degradación de la HDAC2 (Kramer et al., 2003).
4.6 HDACi y TRAIL
Los HDACi, al promover la hiperacetilación de histonas, afectan a la expresión de un
20% de los genes conocidos (Glaser et al., 2003), entre ellos genes implicados en las
rutas de señalización de apoptosis. Diferentes autores han demostrado la inducción por
HDACi de un elevado número de genes pro-apoptóticos como caspasa-8, caspasa-3,
Bid, Bim, Bax o Bak en distintos modelos de células tumorales. También se ha
observado la represión en la expresión de otros tantos genes de carácter anti-apoptótico
como Bcl-2, Bcl-XL o XIAP en respuesta al tratamiento con HDACi (Lindemann et al.,
2004; Shankar et al., 2005b).
Figura 25. Efecto selectivo de los HDACi sobre células transformadas. Adaptado de Minucci and
Pelicci, Nature Reviews, 2006
65
Entre los factores pro-apoptóticos regulados por HDACi se encuentran el ligando de
muerte TRAIL y su receptor de muerte TRAIL-R2 (DR5). Mediante estudios con ARN
de interferencia se ha demostrado que la regulación de dichos genes es necesaria para la
inducción de apoptosis por HDACi en ciertos modelos de células leucémicas, como es
el caso de la leucemia mieloide, y que el efecto de estos inhibidores parece ser selectivo
sobre células tumorales y no sobre células normales (Nebbioso et al., 2005). Además, en
tumores hematológicos y ciertos tumores sólidos se ha descrito la sensibilización a
TRAIL mediante el uso de determinados HDACi a concentraciones no tóxicas (Zhang
et al., 2003). En algunos casos se ha observado que el tratamiento simultaneo, pero no
secuencial, de ambos agentes determina un cierto sinergismo en la inducción de
apoptosis, de lo que se deduce que ésta no se debe a la represión de proteínas antiapoptóticas mediada por los HDACi, sino que se requiere la coactivación de ambas
rutas apoptóticas, extrínseca por parte de TRAIL e intrínseca por acción de los HDACi
(Rosato et al., 2003).
66
II. OBJETIVOS
67
68
El ligando de muerte TRAIL, cuya expresión se incrementa en la superficie de
células T en respuesta a señales de activación, parece mediar en gran parte la actividad
citotóxica de estas células. Aunque se ha demostrado la regulación de la expresión de
TRAIL por Interferones o por activación de NF-κB no se sabe nada acerca de la
implicación de otros factores de la transcripción que podrían estar jugando un papel
adicional e importante en su regulación, como es el caso de NFAT, factor que interviene
en las señales de activación de los linfocitos T y para el cual se han encontrado varios
sitios de unión en el promotor de TRAIL.
La ausencia de toxicidad de TRAIL para la mayoría de células no transformadas es
el hecho más importante a tener en cuenta a la hora de considerarlo como un agente
antitumoral. También los linfocitos T activados que expresan TRAIL en membrana
parecen ser resistentes a la acción de este ligando, siendo éste un requisito esencial para
que TRAIL pueda funcionar como mediador de la respuesta antitumoral de los propios
linfocitos T. Sin embargo, el mecanismo implicado en la resistencia de células normales
a TRAIL no está completamente caracterizado. En la actualidad se están empleando
distintos agentes en terapias combinadas con TRAIL a fin de mejorar la sensibilidad de
ciertos modelos tumorales a este ligando de muerte. Pero los efectos que dichos agentes
pueden tener sobre la resistencia de células normales no se conocen y en la mayoría de
las ocasiones no han sido analizados. Existe por tanto la necesidad de realizar un estudio
paralelo y comparativo sobre la capacidad de numerosos agentes para potenciar la
apoptosis en células normales y en células tumorales, estudio que nos dará a conocer la
inocuidad o los efectos adversos de estos agentes al mismo tiempo que nos ayudará a
caracterizar los mecanismos de resistencia a TRAIL específicos de las células no
transformadas.
Los inhibidores de HDAC (HDACi) constituyen un nuevo grupo de fármacos que
han demostrado una gran efectividad en la inhibición de la proliferación y supervivencia
de células tumorales. Estos efectos antitumorales parecen deberse principalmente a su
capacidad para regular genes relacionados con el ciclo celular y apoptosis. Al igual que
en el caso de TRAIL, las células no transformadas presentan una alta tolerancia a estos
inhibidores aunque su mecanismo de acción selectivo sobre células tumorales no se
conoce con precisión. Es por ello que, la posibilidad de una terapia combinada con
HDACi a dosis apropiadas y TRAIL puede constituir una estrategia muy útil en el
tratamiento de tumores, especialmente de aquellos más resistentes a TRAIL. Los
69
estudios realizados hasta el momento con HDACi se centran en los efectos concretos de
uno o un par de estos inhibidores sobre un determinado modelo tumoral. Pero el
desarrollo de todo el potencial de esta terapia requiere aún de un estudio comparativo de
la efectividad de HDACi pertenecientes a distintas familias estructurales sobre células
tumorales y células normales, así como de un análisis de los genes diana específicos de
cada uno de estos compuestos, teniendo en cuenta la posible diversidad en su
mecanismo de acción.
OBJETIVOS
En base a los antecedentes y planteamientos expuestos nos propusimos los siguientes
objetivos para la realización de esta tesis doctoral:
1.- Estudio de la regulación de la expresión de TRAIL en linfocitos T en respuesta a
la activación. Implicación del factor de transcripción NFAT.
2.- Caracterización de los mecanismos implicados en la resistencia a TRAIL de
linfocitos T primarios tanto en estado de reposo como activados.
3.- Análisis comparativo de la regulación de la respuesta a TRAIL en células T
primarias y en células leucémicas T.
4.- Estudio de la modulación por inhibidores de HDAC de la apoptosis mediada por
TRAIL en células T leucémicas.
70
III. MATERIALES Y MÉTODOS
71
72
1.- Cultivos celulares
Las muestras de sangre utilizadas procedentes de donantes sanos fueron recogidas en
tubos con citrato. Las células mononucleares se obtuvieron por centrifugación en
gradiente de Ficoll- Histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), eliminando los
monocitos del cultivo por adhesión a frascos de plástico durante 1 hora a 37 ºC. Los
linfocitos T de sangre periférica fueron aislados por selección negativa mediante un
sistema de unión indirecta a partículas magnéticas formado por un grupo de anticuerpos
frente a CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123 y CD235a asociados a biotina
(Human Pan T Cells Isolation Kit II, Miltenyi Bistec, GmbH). La pureza de los
linfocitos T fue superior al 95% de células CD3 positivas tras el análisis por citometría
de flujo con un anticuerpo marcado de forma directa (OKT3-FITC).
Las células T en reposo se resuspendieron en medio RPMI 1640 (Cambrex, Bio
Sciece, Bélgica) enriquecido con suero bovino fetal (GIBKO, California, USA) al 10%,
L-glutamina 1 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Cambrex)
(medio completo), y se mantuvieron en un incubador a 37 ºC y 5% de CO2.
La activación de linfocitos T se realizó mediante cultivo a la concentración de 2x106
células/ml en presencia de 5 μg/ml PHA (fitohemoglutinina-M, Roche, Indianápolis,
USA) y 1 μg/ml anti-CD28 durante 20 horas. Tras lavar con PBS, los linfocitos se
cultivaron en medio completo suplementado con 25 U/ml de IL-2 durante 5 días.
La separación de las subpoblaciones de linfocitos T activados se realizó por un
sistema de partículas magnéticas asociadas a un anticuerpo frente al CD8 (Human CD8
MicroBeads, Miltenyi Bistec, GmbH) según el protocolo desarrollado por el fabricante.
Las líneas de células T leucémicas Jurkat, CEM-6, MOLT-4 y HPB-ALL , así como
las líneas tumorales de cáncer de mama SKBr3 y BT474 y la de cáncer de cervix Hela,
se mantuvieron en medio completo RPMI 1640 y en un incubador de idénticas
características que los linfocitos T primarios.
Las muestras de sangre de pacientes con linfoma o con leucemia de células T fueron
proporcionadas por el Hospital Virgen de Las Nieves de Granada, y los linfocitos de
sangre periférica fueron obtenidos por centrifugación en gradiente de Ficoll- Histopaque
73
(Sigma-Aldrich) y resuspendidas en medio RPMI 1640 completo, para ser tratadas y
analizadas de forma inmediata.
2.- Reactivos y Anticuerpos
TRAIL humano recombinante, obtenido como se ha descrito previamente
(MacFarlane et al., 1997), fue donado amablemente por el Dr. Abelardo López Rivas
(CABIMER, Sevilla). PMA, ionomicina, PHA, doxorubicina, LY 294002, nocodazol,
ácido valproico (VPA), tricostatina A (TSA), butirato sódico (NaB), MS-275, BAY 117085, sulfosalazina y anticuerpos anti-tubulina y anti-actina se obtuvieron de SigmaAldrich (St. Louis, MO). Vorinostat (SAHA), apicidina y bisindolilmaleimida (BIS) de
Calbiochem (La Jolla, CA). Velcade (bortezomib) de Janssen-Cilag SA (Madrid,
España). IFN-α de PeproTech EC Ltd. (London, UK). PD 98059 de New England
Biolabs (Beverly, MA). El inhibidor de caspasas Z-VAD de Bachem (Bubendorf,
Suiza). Partenolide, CAPE, anticuerpo monoclonal anti-cFLIP NF6 y anticuerpos frente
a los receptores de TRAIL y frente a TRAIL (2E5) humanos fueron de Alexis
Biochemicals (San Diego, CA). Anticuerpos monoclonales frente a CD28 y fretne a la
subunidad p50 de NF-κB fueron adquiridos de eBioscience (San Diego, CA);
anticuerpo monoclonal anti-caspasa-8 de Cell Diagnostica (Münster, Alemania);
anticuerpo monoclonal anti-FADD de Transducction Laboratorios (Lexington, KY);
anticuerpos monoclonales anti-PARP, anti-XIAP, anti-c-IAP2 y anti-Bax de BD
Biosciences (San Jose, CA). Anticuerpo monoclonal anti-p65 de Santa Cruz
Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Anticuerpo monoclonal anti-caspasa-9 y los
inhibidores de caspasas Z-IETD-FMK y Z-LEHD-FMK de R&D Systems
(Minneapolis, MN). Anticuerpo monoclonal anti-Bcl-2 de Dako (Glostrup, Denmark).
Anticuerpo policlonal de conejo anti-caspasa-3 de Stressgen (Ann Arbor, MI).
Anticuerpo policlonal de conejo anti-histona H4 acetilada de Upstate Biotechnology
(Lake Placid, NY). Anticuerpo monoclonal anti-Bid de Cell Signaling Technology
(Boston, USA). Anticuerpo monoclonal anti-citocromo C de ZYMED Laboratories
(filial de Invitrogen, Carlsbad, CA).
74
3.- Determinación de células apoptóticas
Las células apoptóticas hipodiploides fueron detectadas por citometría de flujo de
acuerdo con el protocolo publicado (Gong, 1994). De forma breve, las células se
lavaron con buffer salino (PBS), se resuspendieron en 100 μl del mismo y se fijaron
durante 5 minutos en 900 μl de una solución de etanol al 70 % frío. Después de lavar el
exceso de etanol, se resuspendieron en 250 μl de PBS, se añadió 250 μl de una solución
de extracción de ADN (0.2 M NaHPO4, 0.1 M ácido cítrico pH 7.8) y se incubaron 10
minutos a 37 ºC. Finalmente, para la tinción del ADN se incubaron en 200 μl de PBS
conteniendo ARNasa a 100 μg/ml y ioduro de propidio a 40 μg/ml, durante 30 minutos
a 37 ºC en oscuridad. El análisis del pico sub-G1 del ciclo celular se realizó midiendo la
fluorescencia del ADN en el detector FL2 o en FL3 del citómetro de flujo (FACScan,
Becton Dickinson) utilizando el programa Cell Quest (BD Biosciences).
Otro método empleado para la cuantificación de la muerte por apoptosis fue la
detección del fosfolípido fosfatidilserina en la cara externa de la membrana celular
mediante la proteína Anexina-V-FLUOS (Roche), que se une al fosfolípido en presencia
de Ca++. Las células se suspendieron en un tampón de incubación compuesto por Hepes
NaOH 10 mM pH 7.4, NaCl 140 mM y CaCl2 5 mM al que se añadió Anexina-VFLUOS a la concentración indicada por el fabricante durante 15 minutos a temperatura
ambiente y en oscuridad. La externalización de la fosfatidilserina se detectó en la región
de emisión correspondiente a FL1 del citómetro de flujo.
4.- Análisis por citofluorometría de TRAIL y sus receptores
Para la detección del ligando de muerte y sus receptores en superficie, las células
control y tratadas se lavaron y posteriormente resuspendieron en PBS, donde se
incubaron con el anticuerpo primario monoclonal correspondiente (5 μg/ml) a 4 ºC
durante 30 minutos. Tras lavar con PBS para eliminar los restos del anticuerpo primario
que no se hayan unido al receptor, las células se incubaron con un anticuerpo de cabra
frente a ratón, conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Caltag laboratories,
Invitrogen) durante 30 minutos a 4º C. Tras esta segunda incubación, las células se
75
lavaron de nuevo, se resuspendieron en PBS y se analizaron en el detector FL1 del
citómetro FACScan.
5.- Análisis por citofluorometría del nivel de acetilación de histonas
Las pruebas para determinar los niveles de acetilación de histonas se llevaron a cabo
en células Jurkat y CEM-6 según el protocolo descrito por Ronzoni y colaboradores
(Ronzoni et al., 2005). Las células se incubaron a la concentración de 106 /ml durante 4
ó 24 horas con los distintos HDACi, se recogieron, se lavaron con PBS frío y se fijaron
en 500 μl de una solución al 1% de formaldehído en PBS durante 20 minutos a 4 ºC.
Tras la fijación, se lavaron con 1 ml de PBS conteniendo albúmina sérica (Sigma) al 1%
y se permeabilizaron por incubación en 100 μl de PBS con Tritón X-100 al 0.1%
durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron de nuevo con
BSA 1% en PBS, se realizó un bloqueo mediante incubación con 250 μl de suero de
cabra (Sigma) al 10% en PBS durante 30 minutos a 4º C, se centrifugaron y se
incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo policlonal de conejo
anti-H4-Ac a una concentración de 0.1 μg/ml en 100 μl de PBS-BSA 1%. El exceso de
anticuerpo primario se eliminó mediante lavado con PBS-BSA 1% y el marcaje con el
anticuerpo de cabra frente a conejo marcado con FITC se realizó por incubación con
dicho anticuerpo a una concentración de 1:500 en 100 μl de PBS-BSA 1% durante 1
hora a temperatura ambiente en oscuridad. Tras lavar las muestras con 1 ml de PBSBSA 1%, se resuspendieron en 200 μl de PBS y los niveles de acetilación de histonas se
analizaron en la región de emisión correspondiente a FL1 en un citómetro FACScan.
6.- Inmunodetección de proteínas por Western Blot
Las células control y tratadas fueron lavadas con PBS y lisadas en soluciones de
distinta composición en función de la localización de la proteína a detectar.
Para la detección de proteínas citosólicas, las células (2-5x106 según el tipo) se
incubaron durante 30 minutos en hielo con 100 μl de buffer de lisis (150 mM NaCl, 50
76
mM Tris-ClH y NP-40 al 1%). Los sobrenadantes citosólicos se separaron por
centrifugación durante 10 minutos a 13000g y se les añadió tampón de carga.
Para el análisis de proteínas localizadas en el núcleo, como PARP o la histona H4, se
lisaron las membranas celulares mediante congelación y descongelación de las células
resuspendidas en PBS, se añadió tampón de carga y se procedió a la sonicación de la
muestra para romper el ADN.
La separación de fracción membranosa y citosólica para detectar la liberación de
citocromo c de la mitocondria y la translocación de Bax en líneas celulares, se logró
lisando las células en frío durante 5 minutos con 50 μl de buffer compuesto por KCl 80
mM, sacarosa 250 mM, digitonina 500 μg/ml, PMSF 0.1 mM, DTT 1 mM e inhibidores
de proteasas, en PBS y centrifugando 5 minutos a 13000g. Las proteínas del
sobrenadante (fracción citosólica) y las del pellet (fracción membranosa) se mezclaron
con tampón de carga y estas últimas fueron sonicadas para romper el ADN.
Para la detección de factores de transcripción importados al núcleo se llevó a cabo el
lisado de 5x106 células en 300 μl de un buffer hipotónico (10 mM de HEPES pH 7.6,
KCl 10 mM, EDTA 0.1mM, EGTA 0.1mM, DTT 1mM, PMSF 0.5 mM, Na2MoO4
10mM e inhibidores de proteasas) en presencia de NP-40 al 0.6%. Los núcleos de esta
manera obtenidos se incubaron en 50 μl de un buffer de elevado contenido salino (20
mM HEPES pH 7.6, KCl 0.4 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0.5
mM, Na2MoO4 10 mM e inhibidores de proteasas) durante 30 minutos en una
plataforma giratoria a 4 ºC. El lisado se centrifugó a 13000 g durante 10 minutos
separándose así las membranas de los extractos nucleares, solubles en el sobrenadante.
En todos los casos las proteínas se cuantificaron por el método Bradford (Sigma)
antes de añadir el tampón de carga, buffer Laemmli compuesto por Tris 2 M pH 6.8,
urea 6 M, B-mercaptoetanol 6%, azul de bromofenol 0.003% y SDS al 3%.
Las proteínas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida (Bio-Rad) al 7.5%, 10% ó
12%, en función del tamaño de la proteína a detectar, en el sistema Mini Protean (BioRad) durante 80 minutos a 140 voltios. Una vez separadas las proteínas por tamaño se
transfirieron desde el gel a una membrana de PVDF (Millipore) por transferencia
semiseca empleando el sistema Trans-Blot SD (Bio-Rad) durante 50 minutos a 50 mA.
La membrana se bloqueó con una solución de PBS / 0.1% Tween 20 (PBSt) con 5%
de leche en polvo durante 1 hora a temperatura ambiente, tras lo que se lavó con PBSt
77
antes de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4 ºC con el
anticuerpo frente a la proteína a detectar, diluido en PBSt con 1% de leche. Tras la
incubación, se lavó la membrana 5 minutos tres veces con PBSt y finalmente se incubó
durante otra hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (frente a Ig de
ratón o de conejo según el caso) marcado con peroxidasa de rábano (HRP), preparado
en solución de bloqueo. Tras otros tres lavados de 5 minutos con PBSt, la membrana se
reveló por quimioluminiscencia empleando el reactivo ECL (Amersham Biosciences),
quedando la señal recogida en placas fotográficas (AGFA).
7.- Retrotranscripción (RT) y PCR
Se extrajo ARN total empleando el reactivo Trizol (Invitrogen) y siguiendo el
protocolo recomendado. Brevemente, se resuspendieron las células controles y tratadas
en un volumen de 1 ml de Trizol por cada 5-10x106 células. Se añadió 200 μl de
cloroformo y tras mezclar ambas fases, se centrifugó a 12000 g durante 15 minutos a 4
ºC. Se recogió la fase acuosa y se mezcló con 500 μl de isopropanol, dejando incubar
durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de centrifugar otros 10 minutos a
12000 g. Se eliminó el sobrenadante y se lavó el pellet de ARN con 1 ml de etanol al
75%. Tras centrifugar a 7500 g durante 5 minutos se eliminó el sobrenadante y se dejó
secar el pellet antes de resuspenderlo en 20 μl de H2O-DEPC.
Tras la cuantificación del ARN total, se partió de 3 μg del mismo para sintetizar
ADNc empleando la transcripta inversa M-MLV (Invitrogen) y oligo(dT) como cebador
en un volumen final de 20 μl. El proceso de retrotranscripción se llevó a cabo a 37 ºC
durante 50 minutos tras los cuales se inactivó por incubación a 70 ºC durante 15
minutos.
Las reacciones de PCR se realizaron con 0.1-2 μl de ADNc, en función del gen a
estudiar, en un volumen final de 50 μl empleado los siguientes pares de cebadores (el
tamaño del fragmento amplificado viene dado entre paréntesis) a una concentración
final de 0.2 μM:
TRAIL (443 pb) sentido 5’- GATCAAGACCATAGTGACCAA-3’ y antisentido 5’TGGCATGATCTCACCACAC-3’
78
Bid (588 pb) sentido 5’- ATGGACTGTGAGGTCAACAACGG –3’ y antisentido 5’CACGTAGGTGCGTAGGTTCTGGTT A –3’
TRAIL-R1 (506 pb), sentido 5’-CTGAGCAACGCAGACTCGCTGTCCAC-3’, y
antisentido 5’- TCCAAGGACACGGCAGAGCCTGTGCCAT-3’
TRAIL-R2 (502 pb), sentido 5’- GCCTCATGGACAATGAGATAAAGGTGGCT-3’ y
antisentido 5’- CCAAATCTCAAAGTACGCACAAACGG-3’
TRAIL-R3
(612
pb),
sentido
5'-GAAGAATTTGGTGCCAATGCCACTG-3'
y
antisentido 5'-CTCTTGGACTTGGCTGGGAGATGTG-3'.
TRAIL-R4
(453
pb)
sentido
5'-CTTTTCCGGCGGCGTTCATGTCCTTC-3'
y
antisentido 5'-GTTTCTTCCAGGCTGCTTCCCTTTGTAG-3'
FLIPL (227 pb), sentido 5’-AATTCAAGGCTCAGAAGCGA-3’, y antisentido 5’GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3’
FLIPS (100 pb), sentido 5’-AATGTTCTCCAAGCAGCAATCC-3’, y antisentido 5’CCAAGAATTTTCAGATCAGGACAAT-3’
Bcl-2 (367 pb), sentido 5’-AGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGAC-3’, y antisentido
5’-AGATAGGCACCAGGGTGAGCAAGCT-3’
Bcl-x (257 pb), sentido 5’- CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC-3’, y antisentido 5’CTGCGATCCGACTCACCAATAC-3’
Mcl-1 (211 pb), sentido 5’- CTTAGTTGATATTTTGGGCTTGGG-3’, y antisentido 5’AGAAGTCAAAAAGTAGTCACTGGG-3’
XIAP ( 487 pb), sentido 5’-GGCCATCTGAGACACATGCAG-3’, y antisentido 5’GCATTCACTAGATCTGCAACC-3’
c-IAP1 (171 pb), sentido 5’- CCAGTTCTTTTCTACACTATAAT-3’, y antisentido 5’CTTAATCTGTTTATTTACAAGGG-3’
c-IAP2 (150 pb), sentido 5’- CAACATGGAGATTCGAAATCC-3’, y antisentido 5’CACATCACTCTTCTGTGAAGGG-3’
β-actina (661 pb), sentido 5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’ y
antisentido 5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’
79
Las condiciones de los ciclos para las PCRs fueron los siguientes:
TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2 y TRAIL-R3: 1 min a 95 °C, 1 min a 55 °C, y 1 min a
72 °C.
TRAIL-R4, Bcl-2 y β-actina: 1 min a 95 °C, 1 min a 60 °C, y 1 min a 72 °C
FLIPS y FLIPL: 40 seg a 95 °C, 40 seg a 60 °C, y 40 seg a 72 °C.
Bcl-x, Mcl-1, XIAP, cIAP1 y cIAP2 : 1 min a 95 ºC, 1 min a 57 °C y 1 min a 72 °C.
El número de ciclos osciló entre los 30-35 en función del gen. Los productos de PCR
migraron en geles de agarosa (Ecogen) al 1% en tampón TAE y 0,5 μg/ml de bromuro
de etidio.
La reacción de PCR a tiempo real se llevó a cabo en el termociclador iCycler iQ
detection system (Bio-Rad) empleando los reactivos iQ SYBR Green Supermix (BioRad), de acuerdo con las instrucciones facilitadas por el fabricante: 12.5 μl de reactivo
Supermix 2x, 0.5 μM de cada uno de los cebadores y 1 μl de ADNc en un volumen final
de 25 μl. Cada reacción se llevó a cabo por triplicado. El agente intercalante SYBR
Green se une al ADN de doble cadena inmediatamente después de su síntesis y emite
fluorescencia tras su estimulación (absorción a 497 nm y emisión a 520 nm). La emisión
es recogida por el sistema detector del equipo en cada uno de los ciclos de PCR, siendo
la fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN formado. El ciclo de la PCR en que
se comienza a detectar el incremento de la señal de denomina ciclo umbral o Ct
(threshold cycle) y es inversamente proporcional a la concentración inicial de ADN de
la muestra. Los valores de Ct de cada muestra se normalizaron con respecto a un gen de
referencia, en concreto el ARNr 18S. La cuantificación relativa de la expresión génica
se determinó usando el método comparativo descrito (Wang et al., 2002a) donde el
número de veces de inducción es igual a 2-ΔΔCt, siendo ΔΔCt la diferencia entre el ΔCt
de la muestra problema y el ΔCt de la muestra control (normalizados según la expresión
del gen ARNr 18S).
Para las reacciones de PCR a tiempo real se utilizaron los siguientes cebadores:
FLIPS (100 pb), sentido 5’-AATGTTCTCCAAGCAGCAATCC-3’, y antisentido 5’CCAAGAATTTTCAGATCAGGACAAT-3’
FLIPL (102 pb), sentido 5’-AATTCAAGGCTCAGAAGCGA-3’, y antisentido 5’GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3’
80
Caspasa-3 (73 pb) forward 5’-TTGAATTGATGCGTGATGTT-3’ y reverse 5’TGGCTCAGAAGCACACAAAC-3’
Caspasa-9 (64 pb) forward 5’-GCTTCTCCTCGCTGCATTT-3’ y reverse 5’AGCACCATTTTCTTGGCAGT-3’
18s (98 pb) sentido 5’- GATATGCTCATGTGGTGTTG-3’ y antisentido 5’AATCTTCTTCAGTCGCTCCA-3’
En todos los casos se llevaron a cabo 40 ciclos de PCR en las siguientes
condiciones: 30 seg a 95 °C, 30 seg a la Tª de hibridación y 45 seg a 72 °C. Las
temperaturas de hibridación fueron 60 ºC para FLIPs, 56 ºC para FLIPL y 63 ºC para
caspasa-3, caspasa-9.
8.- Microscopía de fluorescencia
La translocación al núcleo de la subunidad p65 del factor de transcripción NF-κB se
observó por microscopía de fluorescencia en linfocitos T activados procedentes de
donantes sanos. Para ello se esterilizaron cubreobjetos con etanol 70% y, una vez secos,
se dispusieron en placas de cultivo. Se añadió 2 ml de poli-L-lisina (Sigma) y se incubó
1 hora a 37 ºC. Una vez transcurrido este tiempo, se recogió el exceso de poli-L-lisina y
se lavó la placa con PBS. Se añadieron 5x106 células en 1 ml de medio completo y se
mantuvieron toda la noche para su adhesión al cubreobjetos. Tras el tratamiento en
presencia o en ausencia del inhibidor de NF-κB durante 1 hora, se retiró el medio y se
lavó la placa con PBS. Las células se fijaron en paraformaldehido al 4% durante 10
minutos a temperatura ambiente, retirando el exceso mediante lavado con PBS-Tween
0.1%. El marcaje de la proteína p65 se realizó incubando con una solución del
anticuerpo monoclonal 1:100 en PBS-BSA 1% durante toda la noche a 4 ºC y
manteniendo la placa húmeda (envuelta en papel empapado en agua). Posteriormente se
lavó la placa con PBS-Tween 0.1% tres veces durante 5 minutos antes de añadir el
anticuerpo secundario marcado con FITC a una concentración de 1:1000 durante 1 hora
a temperatura ambiente. Por último, los núcleos se marcaron con diclorhidrato 4,6Diamino-2-fenil indol (DAPI, Sigma) a una concentración de 2 μg/ml incubando 10
minutos a temperatura ambiente en oscuridad. El exceso se retiró por lavado con PBS-
81
Tween 0.1%. Las células teñidas fueron analizadas en un microscopio de fluorescencia
Leica TCS NT (Leica Microsystems, Alemania).
9.- Obtención y clonaje en el vector reportero de luciferasa (pXP2) de los fragmentos
del promotor de TRAIL
Los distintos fragmentos del promotor del gen de TRAIL, amablemente cedidos por
el Dr. Abelardo López Rivas (CABIMER, Sevilla), se obtuvieron por PCR en base a la
secuencia del promotor del gen humano de TRAIL publicada con número de acceso
AF178756 del Genbank. Los cebadores utilizados, así como el protocolo seguido para
llevar a cabo el clonaje de dichos fragmentes en el vector reportero de luciferasa pXP2,
aparecen descritos en la tesis de la Dr. Carmen Ruiz de Almodóvar Egea (Granada,
2004).
10.-Transfecciones transitorias
Las transfecciones transitorias se llevaron a cabo en células Jurkat empleando el
reactivo Lipofectamina (Invitrogen). Las distintas construcciones del promotor de
TRAIL incluidas en el vector pXP2 se mezclaron con Lipofectamina en una proporción
de 3 μl del reactivo por 0.5 μg de plásmido, diluidos ambos previamente en 50 μl de
medio OPTIMEM (GIBKO). Las diluciones del vector llevaban también 0.5 μg de un
plásmido de expresión de β-galactosidasa, que se cotransfecta para normalizar la
eficiencia de transfección. La mezcla de plásmidos y Lipofectamina se incubó durante
20 minutos a temperatura ambiente. Acto seguido, los 100 μl de OPTIMEM
conteniendo el plásmido asociado a Lipofectamina se añadieron a cada pocillo
conteniendo 5x105 células en 500 μl de medio RPMI y se llevó a cabo la incubación de
dichas células durante 24 horas a 37 ºC. Pasado este tiempo las células fueron tratadas o
no con los estímulos correspondientes durante 6 horas, se lisaron con 200 μl de tampón
de lisis suministrado en el kit de luciferasa (Luciferase Assay System, Promega) y se
midió la cantidad de proteínas de cada muestra mediante el método de Bradford.
Finalmente, la actividad luciferasa se midió en un luminómetro siguiendo el protocolo
82
indicado en dicho kit. La eficiencia de transfección se normalizó mediante la medida de
actividad β-galactosidasa. Para medir dicha actividad, se tomó la misma cantidad de
lisado total que se utilizó para medir actividad luciferasa, se mezcló con una solución de
fosfato sódico 0,1M con 0,88 mg de ONPG (Sigma) y 0,1 mM de MgCl2, y se incubó a
37 ºC hasta que la densidad óptica a 420 nm de la muestra se encontraba en el rango de
0.2 a 0.8. Se midió la densidad óptica y con el valor obtenido se normalizó la actividad
luciferasa previamente determinada.
De la misma manera se llevaron a cabo las transfecciones con el vector reportero de
NF-kB, pKBF-Luc cedido amablemente por el Dr. Juan Miguel Redondo (CNIC,
Madrid), así como la determinación de la actividad luciferasa en las células
transfectadas con el mismo.
83
84
IV. RESULTADOS
85
86
1.REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE TRAIL EN CÉLULAS T ACTIVADAS.
1.1 Activación del promotor de TRAIL en células T en respuesta al tratamiento
simultáneo con ionomicina y PMA
Con el objeto de estudiar la regulación de la expresión del ligando de muerte TRAIL
en linfocitos T en diferentes estados de activación, en primer lugar se analizó la
expresión de dicho ligando, a nivel de ARNm, en células T de sangre periférica en
reposo y a los 6 días de activación, como se describe en materiales y métodos. Los
resultados de la figura 1 demuestran que la expresión del ARNm de TRAIL en
linfocitos T activados es considerablemente superior a la observada en células T en
reposo.
R
A
TRAIL
β-actina
Figura 1. Expresión del ARNm de
TRAIL en células T activadas. La
expresión del ARNm de TRAIL se
analizó mediante RT-PCR en
linfocitos T en reposo (R) y a los 6
días de activación (A). Como
control de carga se muestra la
expresión de β-actina.
Mediante el uso de programas informáticos, como TRANSFAC, se han identificado
en el promotor de TRAIL distintos sitios de unión a factores de transcripción, como
GATA, C/EBP, GAS, ISRE, NF-κB o NFAT. Como ya se ha mencionado en la
introducción, se ha descrito la implicación de NF-κB en la regulación de la expresión de
TRAIL en células T en respuesta a la estimulación con agentes que imitan la activación
del TCR, posiblemente por unión de este factor a dos secuencias consenso localizadas
entre las posiciones -384 a -375 (sitio κB2) y -256 a –265 pb (sitio κB1) del promotor
de TRAIL, con respecto al sitio de inicio de transcripción (Baetu et al., 2001). Sin
embargo, no se sabe nada acerca de la implicación de otros factores de transcripción
que, como NF-κB, se activan en respuesta a la estimulación de la célula T.
Para conocer mejor los factores que regulan la expresión de TRAIL en células T
activadas, utilizamos distintas construcciones del promotor de este ligando que habían
sido obtenidas previamente por la doctora Ruiz de Almodóvar (datos no publicados)
mediante clonaje de diferentes fragmentos de 1295, 787 y 165 pb en el vector pXP2 que
carece de promotor mínimo y que contiene el gen de luciferasa, tal como se describe en
el apartado de materiales y métodos (figura 2A).
87
+1
A
p1295Luc
κB2
SP-1
κB2
p787Luc
Actividad luciferasa (RLUsx105)
Actividad luciferasa (RLUsx106)
C
+1
κB1
SP-1
p165Luc
B
Luc
κB1
Luc
+1
Luc
SP-1
6
5
2.7x
4
3
2
1.4x
1.5x
PMA
Io
1
0
Control
PMA+Io
2.5
4.2x
2
4.2x
4x
1.5
1
0.5
0
pXP2
+
-
+
p165Luc
-
+
p787Luc
-
+
PMA+Io
p1295Luc
Figura 2. El tratamiento simultáneo con ionomicina y PMA induce la actividad transcripcional del promotor
de TRAIL en células Jurkat. A) Esquema de los fragmentos de 165, 787 y 1295 pb del promotor de TRAIL que
tras ser obtenidos por PCR fueron clonados en el vector pXP2 reportero de luciferasa. Se indican los sitios de
unión a NF-κB descritos (κB1 y κB2) y los posibles sitios de unión a NFAT (el fragmento de 1295 pb presenta
12 sitios para NFAT, el de 787 pb presenta 10 sitios y el de 165 pb 3 sitios) B) Células Jurkat se transfectaron
con la construcción p787Luc del promotor de TRAIL y la actividad luciferasa de la misma se analizó a las 6
horas de tratamiento con PMA (100 nM) +/- ionomicina (1 μg/ml). C) La actividad luciferasa de los
fragmentos p1295Luc, p787Luc y p165Luc y del vector vacio pXP2 se analizó en células Jurkat transfectadas y
tratadas con PMA + ionomicina. Para normalizar la eficiencia de transfección se contransfectó en todos los
casos un vector de expresión de β-gal. Los resultados mostrados son representativos de al menos 3
experimentos independientes.
88
Se transfectaron transitoriamente células Jurkat con la construcción de 787 pb, que
contiene los dos sitios de unión a NF-kB mencionados así como posibles sitios de unión
al factor NFAT entre otros, y 24 horas después se activaron mediante tratamiento con
ionomicina y/o PMA durante 6 horas. La actividad transcripcional del fragmento del
promotor se cuantificó midiendo actividad luciferasa en lisados de las células
transfectadas. Como se observa en la figura 2B, dicho fragmento tiene actividad
transcripcional inducible en respuesta a la activación simultánea con ionomicina y el
éster de forbol, pero no con dichos agentes por separado, indicando la importancia de
los factores de transcripción regulados por ambos, NFAT y NF-kB respectivamente, en
la regulación del promotor de TRAIL.
A continuación se comparó la actividad transcripcional de los tres fragmentos, de
1295, 787 y 165 pb, basal y en respuesta al tratamiento con ionomicina y PMA. Como
control de la actividad luciferasa basal se analizó también la actividad del vector vacio
pXP2. Curiosamente, y a pesar de lo descrito en la literatura sobre la localización de los
sitios de unión a NF-κB, no se observaron diferencias ni en la actividad basal ni en la
inducible por el tratamiento con ionomicina y PMA entre los diferentes fragmentos
(figura 2C), lo que sugiere que el fragmento más pequeño de 165 pb contiene no solo
los elementos mínimos necesarios para controlar la expresión basal de este gen sino
posiblemente también los sitios consenso de unión y respuesta a los factores de
transcripción NFAT y NF-κB.
1.2 Regulación de la expresión y función de TRAIL por ciclosporina A en células T
activadas
La activación de la calcineurina, fosfatasa dependiente de Ca2+/calmodulina, es
necesaria para la activación del factor de transcripción NFAT tras la estimulación de la
célula T con agentes que imitan la activación del TCR. Para confirmar la implicación de
este factor de transcripción en la regulación de la expresión de TRAIL en células T en
respuesta a la activación utilizamos la droga inhibidora de calcineurina, ciclosporina A
(Cs A) (Handschumacher et al., 1984). El tratamiento de células T activadas con
ciclosporina A durante 8 horas produjo una disminución en los niveles de ARNm de
TRAIL (figura 3A).
89
A
Control
CsA
TRAIL
β-actina
B
% Células apoptóticas
100
HeLa
BT474
80
SKBr3
60
40
20
0
Control
TRAIL
1:2
1:5
+ T activadas
C
% Células apoptóticas
100
80
60
40
20
0
C
TRAIL
-
+
+T reposo
-
+
CsA
+T activadas
Figura 3. El tratamiento con ciclosporina A reduce la expresión de TRAIL y la actividad citotóxica de
células T activadas. A) Células T activadas fueron incubadas durante 8 horas en presencia o en ausencia
de 500ng/ml CsA y los niveles de ARNm de TRAIL se determinaron mediante RT-PCR. Como control de
carga se analizó la expresión de β-actina. B) Células Hela, SKBr3 y BT474 se co-cultivaron durante 24
horas con o sin células T activadas a las proporciones indicadas (célula tumoral:célula T) y se analizó el
porcentaje de células tumorales en el pico sub-G1 del ciclo celular. C) Células T en reposo y activadas,
pretratadas durante 24 horas con o sin 500ng/ml CsA, se co-incubaron con células Hela en una
proporción 1:5 (Hela: células T). Tras 24 horas de co-cultivo se determinó el porcentaje de células Hela
en apoptosis. Como control positivo de inducción de apoptosis, las células tumorales en B) y C) se trataron
con TRAIL (250ng/ml). Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
90
La expresión de TRAIL en linfocitos T activados puede facilitar o potenciar la
acción citotóxica de los mismos sobre células tumorales. Con objeto de conocer la
posible actividad citotóxica de nuestro modelo de células T activadas, realizamos cocultivos de dichas células T con diferentes tipos de células tumorales sensibles y
resistentes a TRAIL, a diferentes proporciones, y analizamos la inducción de apoptosis
en las células tumorales. Los resultados de la figura 3B indican que la inducción de
apoptosis en células Hela, sensibles a TRAIL, tras su co-cultivo con células T activadas
en una proporción 1:5 (Hela: células T) es similar a la observada en respuesta al
tratamiento con TRAIL recombinante. Sin embargo, las células T activadas no fueron
capaces de inducir apoptosis en dos líneas de cáncer de mama, SKBr3 y BT474,
resistentes a TRAIL. Sólo se observó un débil efecto en células SKBr3, similar con las
dos proporciones de célula diana: célula efectora y comparable al efecto detectado en
Hela a la proporción 1:2, por lo que pensamos que podría tratarse de un efecto tóxico
inespecífico derivado de la co-incubación. El pretratamiento de los linfocitos T
activados con ciclosporina A redujo parcialmente su capacidad de inducción de
apoptosis en células Hela (figura 3C) sugiriendo la importancia de NFAT en la
expresión del ligando de muerte TRAIL funcional en dichos linfocitos activados.
Observamos además que, a diferencia de ellos, los linfocitos T en reposo no eran
capaces de inducir apoptosis en células Hela (figura 3C).
2.
MECANISMOS
QUE
REGULAN
LA
RESISTENCIA
A
TRAIL
EN
LINFOCITOS T PRIMARIOS HUMANOS
2.1 Resistencia de linfocitos T primarios en reposo y activados a la inducción de
apoptosis por TRAIL
Diversos grupos han descrito la resistencia a la apoptosis mediada por TRAIL en
células normales y en diferentes subpoblaciones de células sanguíneas (Hasegawa et al.,
2004; Mirandola et al., 2004). Para una mejor caracterización de los efectos de TRAIL
sobre células T primarias, analizamos la inducción de apoptosis en linfocitos T
activados y en reposo, procedentes de 10 donantes sanos diferentes, en respuesta al
tratamiento con una dosis elevada de TRAIL recombinante (250 ng/ml). En todos
loscasos las células primarias demostraron ser resistentes a la apoptosis mediada por
91
TRAIL (figura 4A). Para asegurarnos de la resistencia de este tipo celular repetimos los
experimentos con tratamientos prolongados durante 48 horas y empleando dosis aún
más elevadas del ligando de muerte (500 ng/ml), obteniéndose idénticos resultados
(datos no mostrados). Como control positivo en todos estos experimentos se utilizaron
células T leucémicas Jurkat que son sensibles a TRAIL.
% Células apoptóticas
A
100
100
80
80
REPOSO-CONTROL
REPOSO-TRAIL
60
60
ACTIVADOS-CONTROL
ACTIVADOS-TRAIL
40
40
JURKAT-CONTROL
JURKAT-TRAIL
20
20
00
Reposo
0
B
Reposo
-
+
Activados
Activados
-
+
2
Jurkat
Jurkat
-
+
TRAIL
Caspasa-8
41-43 kDa
Figura 4. Los linfocitos T en reposo y activados son resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL. A)
Linfocitos T en reposo o activados, procedentes de 10 donantes sanos, se trataron durante 24 horas con
250 ng/ml TRAIL. El porcentaje de células apoptóticas se determinó mediante análisis del pico sub-G1
por citometría de flujo. B) La activación de caspasa-8 se analizó mediante Western Blot en linfocitos T en
reposo y activados tras 15 horas de tratamiento con 250 ng/ml TRAIL. En ambos casos, como control
positivo de células sensibles a la inducción de apoptosis se utilizaron células Jurkat tratadas con TRAIL
(100 ng/ml).
Estudiamos también la activación de la caspasa-8 apical, como primer
acontecimiento bioquímico que tiene lugar tras la unión de TRAIL a sus receptores en la
superficie celular, mediante el análisis del procesamiento de las dos isoformas de
procaspasa-8 (a y b) en los fragmentos proteolíticos intermedios de 43-41 kDa. Como se
observa en la figura 4B, encontramos un bloqueo de la ruta de inducción de apoptosis
por TRAIL a este nivel tan temprano, tanto en células T primarias en reposo.
92
2.2 Expresión de proteínas involucradas en la ruta de señalización de TRAIL en
linfocitos T en reposo y activados
Puesto que la apoptosis mediada por TRAIL requiere en primer lugar de la unión del
ligando a sus receptores de muerte TRAIL-R1 y -R2, y dado que se ha descrito la
implicación de los receptores señuelo TRAIL-R3 y –R4 en la resistencia de células
normales a TRAIL, analizamos el patrón de expresión de los receptores de TRAIL en la
membrana de linfocitos T en reposo y activados. Así, observamos que los niveles de
TRAIL-R3 y -R1 eran prácticamente nulos y los de TRAIL-R2 muy bajos en todas las
muestras de linfocitos analizadas, tanto en reposo como activados, encontrando
mínimas diferencias entre donantes.
A
TRAIL-R1
TRAIL-R2
TRAIL-R3
TRAIL-R4
Reposo
Activadas
Intensidad de Fluorescencia
Figura 5. Expresión de los receptores de TRAIL en células T en reposo y activadas. La expresión de los
receptores de TRAIL en membrana se determinó por citometría de flujo en células T en reposo y
activadas utilizando los anticuerpos apropiados (picos sombreados). La línea sólida corresponde a la
fluorescencia basal del anticuerpo secundario. Los resultados mostrados son representativos de al menos
3 donantes diferentes.
Por el contrario, en el caso de TRAIL-R4 observamos una alta expresión y,
curiosamente, detectamos dos subpoblaciones celulares caracterizadas por la diferente
intensidad de fluorescencia de los picos mostrados en el análisis por citometría de flujo
(figura 5). El pico de alta intensidad de fluorescencia parece corresponderse con la
subpoblación CD8+ (Hasegawa et al., 2004, Mirandola, 2004 #252) mientras el pico de
baja intensidad de fluorescencia, que presenta una cierta variabilidad entre donantes en
93
cuanto a intensidad se refiere, corresponde a la expresión de TRAIL-R4 en las células
CD4+. Encontramos además un cierto incremento en la intensidad de fluorescencia de
las dos subpoblaciones celulares en linfocitos T activados con respecto a los linfocitos
en reposo, así como un aumento del porcentaje de células con mayor expresión de
TRAIL-R4 (figura 5), posiblemente debido al incremento en la relación CD8+/CD4+
que conlleva la activación linfocitaria.
Analizamos a continuación los niveles de expresión de otras proteínas que, junto con
los receptores de muerte, están implicadas en la formación del DISC y por tanto en la
activación de la caspasa-8. Como se observa en la figura 6, tanto las células T activadas
como en reposo expresaban la proteína adaptadora FADD siendo los niveles de esta
proteína similares a los de células Jurkat sensibles a TRAIL. Sin embargo, en el caso de
la proteína inhibidora c-FLIP encontramos que los niveles de la isoforma larga (cFLIPL) eran mucho mayores en células T primarias, en reposo y activadas, que en
células Jurkat. También los niveles de la isoforma corta (c-FLIPS), aunque bajos en
células T primarias, eran superiores a los encontrados en esta línea de células T
sensibles a TRAIL (figura 6). Estos datos sobre la expresión de FLIP, junto con los
obtenidos tras el análisis de expresión de los receptores de TRAIL en membrana,
pueden explicar la resistencia de células T primarias a la apoptosis mediada por este
ligando de muerte.
Jurkat
Reposo
Activados
FADD
FLIPL
FLIPS
α-Tubulina
Figura 6. Expresión de proteínas
implicadas en la formación del
DISC en linfocitos T en reposo y
activados. Los niveles de FADD,
FLIPL y FLIPs se analizaron en
células T en reposo y activadas y en
células Jurkat mediante Western-blot.
Como control de carga se analizó la
expresión de α-tubulina. Los
resultados
mostrados
son
representativos de al menos 3
donantes diferentes.
Con excepción de TRAIL-R4, en los factores hasta aquí analizados no encontramos
diferencias significativas entre los niveles de expresión entre células T en reposo y
activadas, a pesar de que varios autores han propuesto una mayor sensibilidad a la
muerte por apoptosis en células T activadas (Green et al., 2003; Krammer et al., 2007).
Analizamos también la expresión de algunos miembros de la familia de Bcl-2,
implicados en la ruta mitocondrial de señalización de TRAIL, en células T en los
94
diferentes estadios de activación y observamos que los niveles de la propia proteína
anti-apoptótica Bcl-2 eran similares en células en reposo y activadas, mientras que otras
proteínas pro-apoptóticas pertenecientes a la misma familia variaban su expresión con la
activación (figura 7A).
A
Reposo
B
Activadas
Bax
Bid
Bid
Bcl-2
β-actina
XIAP
Reposo
Activadas
α-Tubulina
Figura 7. Expresión de factores intracelulares implicados en la ruta de señalización de TRAIL en
linfocitos T en reposo y activados. A) La expresión de Bax, Bid, Bcl-2 y XIAP se determinó por Western
Blot en células T en reposo y activadas. Como control de carga se analizó la expresión de α-tubulina.
Los resultados mostrados son representativos de al menos tres donantes diferentes. B) Los niveles de
ARNm de Bid se determinaron en células T en reposo y activadas mediante PCR semi-cuantitativa,
utilizando diferentes cantidades de ADNc (2, 1 y 0,5 μl). Como control de cantidad de ARNm se muestra
la expresión de β-actina.
En concreto, encontramos una reducción reproducible y muy significativa en la
expresión de Bid en células T activadas, y un cierto incremento en el contenido
intracelular de Bax en las células T activadas respecto al estado de reposo en la mayoría
de los casos analizados. En cuanto a los niveles de la proteína inhibidora de apoptosis
XIAP, no encontramos diferencias en la expresión en respuesta a la activación.
Curiosamente, cuando analizamos los niveles de expresión del ARNm de Bid mediante
PCR semi-cuantitativa observamos que eran similares en células T en reposo y
activadas, lo que sugiere la existencia de mecanismos post-transduccionales
responsables de la regulación de esta proteína en ambos tipos de células T (figura 7B).
95
2.3 Efecto de diferentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL en la resistencia de
linfocitos T primarios humanos
Se han descrito numerosos modelos de células tumorales resistentes a TRAIL en los
cuales dicha resistencia es debida, entre otras causas, a la baja expresión de receptores
pro-apoptóticos y a los elevados niveles de proteínas anti-apoptóticas intracelulares. Sin
embargo, la mayoría de estos tumores pueden sensibilizarse a TRAIL mediante el
empleo de diferentes estrategias terapéuticas como son las drogas quimioterapéuticas,
inhibidores de histona deacetilasa, inhibidores del proteasoma o inhibidores de rutas de
supervivencia (Inoue et al., 2004; Kandasamy and Srivastava, 2002; Sayers and
Murphy, 2006; Shankar and Srivastava, 2004; Singh et al., 2003). Decidimos estudiar el
efecto de algunos agentes, pertenecientes a los mencionados grupos farmacológicos,
sobre la resistencia de células T primarias a la apoptosis mediada por TRAIL.
Concretamente, analizamos el efecto del agente genotóxico doxorubicina, del inhibidor
de la polimerización de los microtúbulos de actina nocodazol, del inhibidor de la PKC
bisindolilmaleimida (BIS), del inhibidor de PI3K LY294002, del inhibidor de histona
deacetilasa ácido valproico (VPA) y del inhibidor del proteasoma velcade (bortezomib),
utilizando concentraciones de dichos agentes establecidas en base a publicaciones
previas y a su capacidad para sensibilizar a las líneas tumorales CEM-6, línea de células
leucémicas T que presentan una moderada sensibilidad a TRAIL, y SKBr3, línea de
células de cáncer de mama muy resistentes a este ligando de muerte.
En la figura 8 se observa cómo doxorubicina, LY294002 y VPA eran capaces de
potenciar la acción de TRAIL en células CEM-6 mientras que nocodazol y bortezomib
sensibilizaban claramente a las células SKBr3, a las concentraciones establecidas. Sin
embargo en ninguno de los casos encontramos sensibilización de linfocitos T primarios,
ni en reposo ni activados, a la apoptosis mediada por TRAIL. Es importante señalar que
tanto doxorubicina, como nocodazol, y en especial bortezomib presentaron una alta
toxicidad para los linfocitos T primarios activados. También el inhibidor de PKC, BIS,
presentó cierto efecto sobre estas células. Y el bortezomib resultó ser además
ligeramente tóxico para los linfocitos T en reposo (figura 8A, D, E, F). Por el contrario,
los inhibidores LY294002 y VPA mostraron una ausencia total de toxicidad para los
linfocitos T primarios, tanto en reposo como activados, lo que sugiere su posible
utilización como agentes antitumorales en combinación con TRAIL.
96
% Células Apoptóticas
A
100
100
80
80
Control
TRAIL
DXR
60
60
DXR + TRAIL
40
40
20
20
0
0
1
Reposo
B
100
2
Activados
3
CEM
% Células Apoptóticas
100
80
80
60
60
Control
TRAIL
LY
*
LY + TRAIL
40
40
20
20
0
0
Reposo
1
C
% Células Apoptóticas
100
100
100
80
80
80
60
60
60
Activados
2
CEM
3
Control
Control
TRAIL
TRAIL
VPA
VPA
VPA + TRAIL
VPA + TRAIL
40
40
40
20
20
20
0
00
1
Reposo
D
2
Activados
3
CEM
% Células Apoptóticas
100
100
80
80
60
60
Control
TRAIL
NZ
NZ + TRAIL
40
40
***
20
20
00
Reposo
1
Activados
2
SKBr3
3
97
E
% Células Apoptóticas
100
100
80
80
60
60
Control
TRAIL
BZ
**
BZ + TRAIL
40
40
20
20
0
0
1
Reposo
F
2
Activados
3
SKBr3
% Células Apoptóticas
100100
80 80
Control
60 60
TRAIL
BIS-I
40 40
BIS-I + TRAIL
20 20
00
Reposo
Activados
Figura 8. Resistencia de linfocitos T primarios a TRAIL tras el tratamiento con distintos agentes
sensibilizadores. Linfocitos T en reposo y activados fueron preincubados con (A) doxorubicina (DXR,
100 ng/ml ), (B) LY 294002 (10 μM), (E) bortezomib (BZ, 50 nM ) o (F) BIS (6 μM) durante 1 h; o con
(C) VPA (1 mM ) o (D) nocodazol (NZ, 400 ng/ml) durante 7h. Tras la preincubación, las células fueron
tratadas con 250 ng/ml de TRAIL durante 24 h. Células CEM (A-C) y SKBr3 (D, E) fueron preincubadas
en las mismas condiciones antes de ser tratadas con 50 ng/ml o 250 ng/ml de TRAIL, respectivamente,
durante 20 horas. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1
mediante citometría de flujo. Las barras de error muestran la SD de tres experimentos independientes.
La significación estadística se corresponde con *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001, según el test de
Student.
2.4 La inhibición de NF-κB sensibiliza a linfocitos T activados a la apoptosis mediada
por TRAIL
Junto a los agentes descritos en el apartado anterior analizamos también el efecto del
inhibidor de NF-κB, BAY 11-7085, sobre linfocitos T primarios y su resistencia a
TRAIL. En el caso de las células T en reposo, encontramos una gran variabilidad en la
respuesta a este inhibidor entre los diferentes donantes estudiados (figura 9A). En 9 de
las 10 muestras analizadas el inhibidor del factor de transcripción por sí solo presentaba
efectos citotóxicos de intensidad variable en función del donante. En cuanto al efecto
regulador de la apoptosis mediada por TRAIL, si bien en 4 de los 10 casos se apreciaba
una sensibilización significativa de los linfocitos T en reposo a este ligando de muerte,
98
en otros 5 casos el porcentaje de células apoptóticas era inferior en respuesta al
tratamiento combinado con BAY 11-7085 y TRAIL que tras el tratamiento solo con el
inhibidor. Como se observa en la figura 9B, el inhibidor de NF-κB también presentó
una toxicidad variable, en función del donante, para los linfocitos T activados. Sin
embargo, en este caso encontramos una sensibilización significativa en todas las
muestras analizadas, con excepción de una de ellas en el que el inhibidor solo provocó
un efecto tóxico muy elevado (93% de células en apoptosis).
AA
% Células apoptóticas
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
00
BB
Control
TRAIL
BAY
BAY+TRAIL
BAY
BAY+TRAIL
% Células apoptóticas
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
00
Control
TRAIL
Figura 9. Sensibilización de linfocitos T primarios a TRAIL por inhibición de NF-κB. Linfocitos T
en reposo (A) o activados (B) de 10 donantes diferentes fueron preincubados durante 1 hora con BAY
11-7085 (2.5 μM) y a continuación tratados con TRAIL (250 ng/ml) durante 24 horas. El porcentaje de
células apoptóticas se determinó mediante análisis del pico sub-G1 del ciclo celular.
Se llevó a cabo un estudio de dosis-respuesta con el inhibidor BAY 11-7085,
tratando de encontrar la dosis que con menor efecto tóxico indujera sensibilización a
TRAIL en células T activadas. Concentraciones inferiores a 2.5 μM, aunque
99
presentaban baja toxicidad, no sensibilizaban a TRAIL de forma estadísticamente
significativa por lo que dicha dosis se estableció como la óptima para continuar el
estudio del efecto de este inhibidor en linfocitos T activados (figura 10). Estos
resultados coinciden con los publicados por otros autores en los que se utilizan dosis
similares del inhibidor de NF-κB para inducir la sensibilización a TRAIL de distintas
líneas de células tumorales (Huerta-Yepez et al., 2004).
% Células Apoptóticas
100
**
**
CONTROL
80
TRAIL-250
60
40
20
0
Control
1
2,5
BAY 11-7085 (μM)
Figura 10. Efecto de distintas dosis de
BAY 11-7085 en la sensibilización de
linfocitos T activados a TRAIL.
Linfocitos T activados de distintos
donantes sanos fueron preincubados
con distintas dosis de BAY 11-7085
durante 1 hora antes del tratamiento
con TRAIL (250 ng/ml) durante 24
horas. El porcentaje de células
apoptóticas se determinó por citometría
de flujo. Las barras de error muestran
la
SD
de
tres
experimentos
independientes. Significación estadística
**p < 0.01, según el test de Student.
Simultáneamente al estudio de sensibilización a TRAIL en linfocitos T
comprobamos que el inhibidor BAY 11-7085 efectivamente bloqueaba la activación de
NF-κB. Se ha descrito que este compuesto actúa inhibiendo a la quinasa IKK y así la
fosforilación de IκB, necesaria para la activación y translocación al núcleo de NF-κB
(Bremner and Heinrich, 2002). Analizamos por microscopía de fluorescencia la
localización nuclear de la subunidad p65 de NF-κB en linfocitos T tratados o no con
BAY 11-7085 (figura 11A). Aún presentando estas células una morfología esférica
constituida por núcleo en su práctica totalidad, el bloqueo de la entrada de la subunidad
p65 es claro en células tratadas, donde la mayor parte de dicha subunidad se localiza en
las regiones perinucleares. Analizamos también la capacidad de BAY 11-7085 para
inhibir la función de NF-κB como factor de transcripción. Para ello, se transfectaron
células Jurkat con el vector pKBF-Luc, que contiene tres copias de la secuencia de
unión a NF-κB del promotor de H-2Kb placed upstream of a herpes simplex virus
thymidine kinase minimal promoter driving the luciferase reporter gene, y se trataron
con ionomicina y PMA para inducir la activación de NF-κB. Como se muestra en la
100
figura 11B, el pretratamiento con distintas concentraciones de BAY 11-7085 provocó
una inhibición, casi completa en el caso de la dosis más alta, de la actividad luciferasa
inducida en respuesta a la activación con ionomicina y PMA.
A
CONTROL
B
Actividad Luciferasa (RLUs)
2400000
2000000
+ BAY (1H.)
Control
Control
PIo
PMA+Io
Pio+BAY-1
PMA+Io+BAY-1mM
Pio+BAY2,5
PMA+Io+BAY-2,5mM
1600000
1200000
800000
400000
0
Figura 11. BAY 11-7085 inhibe la activación de NF-κB. A) LinfocitosT activados de donantes sanos se
incubaron 1 hora con o sin BAY 11-7085 (2.5 μM) para determinar, mediante microscopía de
fluorescencia, la localización de la subunidad p65 del factor de transcripción NF-κB (fluorescencia
verde). La localización nuclear se estableció por tinción con DAPI (azul). B) Se transfectaron células
Juktar con el vector NFκB-Luc. A las 24 horas se preincubaron con diferentes dosis de BAY 11-7085 (1 y
2.5 μM) durante 1 hora y a continuación se trataron con PMA (100 nM) + Ionomicina (1μg/ml) durante
4 horas para finalmente analizar la actividad luciferasa. Los datos mostrados son representativos de tres
experimentos independientes.
101
Una vez analizada la capacidad de BAY 11-7085 para inhibir la activación de NFκB, se examinaron los efectos de otros inhibidores de este factor de transcripción para
confirmar la implicación del mismo en el mecanismo de sensibilización de linfocitos T
a TRAIL. En concreto, utilizamos sulfosalazina, partenolide y el éster feniletílico del
ácido caféico (CAPE). Mientras que la sulfosalazina permitió la sensibilización de los
linfocitos T activados a TRAIL, los otros dos agentes, aún habiéndose descrito también
como inhibidores específicos de NF-κB (Bork et al., 1997; Natarajan et al., 1996; Wahl
et al., 1998), presentaron un efecto muy débil (partenolide) o ningún efecto (CAPE)
sobre la resistencia a TRAIL (figura 12A). Para comprobar que las concentraciones de
los agentes empleados en el estudio inhibían la activación de NF-κB estudiamos la
presencia de las subunidades p65 y p50 en el núcleo de células T activadas y tratadas
con los inhibidores, esta vez mediante Western-blot. Así observamos que, tanto BAY
11-7085 como sulfosalazina y parthenolide reducían significativamente los niveles de
expresión de ambas subunidades en el núcleo, en comparación con los niveles en células
control no tratadas. Sin embargo no encontramos ningún efecto del CAPE sobre la
expresión de NF-κB en el núcleo lo que explicaría la ausencia de sensibilización a
TRAIL en respuesta al tratamiento con dicho agente (figura 12B).
A
B
% Células apoptóticas
100
80
C
BAY
SS
PT
CAPE
p65
60
CONTROL
*
TRAIL
40
p50
PARP
20
*
0
Control
SS
PT
CAPE
Figura 12. Efecto de diferentes inhibidores de NF-κB sobre la resistencia de linfocitos T activados a
TRAIL. (A) Células T activadas fueron preincubadas 1 hora con 1.5 mM de sulfosalazina (SS), 2.5 μM
de partenolinde (PT) o 50 μg/ml de CAPE antes de ser tratadas 24 horas con TRAIL (250 ng/ml). El
porcentaje de células apoptóticas se determinó mediante análisis del pico sub-G1 por citometría de flujo.
Las barras de error muestran la SD de tres experimentos independientes.* p<0.05 según el test T de
Student. (B) La expresión de las subunidades de NF-κB p50 y p65 se determinó por Western Blot en los
extractos nucleares procedentes de células T activadas y tratadas durante 4 horas con los inhibidores
indicados en (A), o con BAY 11-7085 (2.5 μM). Como control de carga se utilizó la proteína nuclear
PARP.
102
Por otro lado, comprobamos que la inducción de apoptosis por TRAIL en células T
sensibilizadas por inhibición de NF-κB era un proceso dependiente de la activación de
caspasas. Se preincubaron células T activadas con el inhibidor general de caspasas ZVAD antes del tratamiento con BAY 11-7085 y TRAIL, y así observamos una
inhibición no solo del efecto sensibilizador del BAY 11-7085 sino también de su efecto
citotóxico (figura 13A). De la misma manera se encontró un bloqueo de los efectos del
inhibidor de NF-κB en células T en reposo (figura 13B). Solamente en aquellos casos
en que la toxicidad del BAY 11-7085 era extrema, el pretratamiento con ZVAD no
logró inhibir este efecto lo que sugiere que el inhibidor de NF-κB, por si solo, es capaz
de activar vías de señalización de muerte celular dependientes e independientes de
caspasas en linfocitos T (datos no mostrados). Observamos también la activación de
caspasa-8 en respuesta a TRAIL en células T activadas preincubadas con BAY 11-7085,
lo que confirma la activación de la ruta de señalización de TRAIL desde su extremo
más apical en linfocitos T sensibilizados por el inhibidor de NF-κB (figura 13C).
% Células Apoptóticas
AA
BB
100
100
8080
100
100
100
100
-
80
80
80
80
Z-VAD
6060
60
60
60
60
4040
40
40
40
40
20
20
20
20
20
20
0
0
1
Control
2
TRAIL
CC
3
BAY
-
000
0
4
BAY+TRAIL
+
-
+
+
+
-Z-VAD
Z-VAD
Z-VAD
Control
1
TRAIL
2
BAY
3
BAY+TRAIL
4
TRAIL
BAY 11-7085
Caspasa-8
41-43 kDa
α-Tubulina
Figura 13. TRAIL induce la activación de caspasas en linfocitos T primarios sensibilizados por
inhibición de NF-κB. Linfocitos T activados (A) o en reposo (B) fueron preincubados en presencia o en
ausencia de Z-VAD (50 μM) y/o BAY 11-7085 (2.5μM) durante 1 hora y a continuación tratados con o sin
TRAIL (250 ng/ml) durante 24 horas. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por citometría de
flujo. C) La activación de caspasa-8 se analizó mediante Western Blot en linfocitos T activados tratados
con TRAIL (250 ng/ml) durante 20 horas tras pretratamiento de 1 hora con BAY 11-7085 (2.5μM). Como
control de carga se analizó la expresión de α-tubulina. Los datos mostrados son resultados
representativos de tres experimentos independientes con diferentes donantes.
103
2.5 BAY 11-7085 regula la expresión de receptores de TRAIL y de genes antiapoptóticos en linfocitos T activados
El papel regulador del factor de transcripción NF-κB sobre la expresión de
receptores y proteínas de la ruta de señalización de TRAIL se encuentra ampliamente
descrito (Bernard et al., 2001; Micheau et al., 2001; Ravi et al., 2001). A fin de
comprender el mecanismo por el que la inhibición de este factor de transcripción induce
sensibilización a TRAIL en linfocitos T primarios, estudiamos la posible regulación de
diversos factores implicados en la apoptosis mediada por este ligando y utilizamos para
ello células T activadas como modelo celular, dado que la sensibilización en dichas
células era mucho más consistente y reproducible que en el caso de los linfocitos T en
reposo. Analizamos en primer lugar la expresión de los receptores TRAIL-R1, TRAILR2 y TRAIL-R4 en la superficie de células T activadas tras el tratamiento con BAY 117085. Como se observa en la figura 14A, no encontramos efecto alguno sobre la
expresión de los receptores pro-apoptóticos en membrana mientras que los niveles del
receptor anti-apoptótico TRAIL-R4 se veían reducidos sensiblemente tras el tratamiento
con el inhibidor en todos los casos estudiados, afectando dicha reducción de forma
similar a las subpoblaciones CD4+ y CD8+. A nivel de ARNm observamos una pérdida
en la expresión de todos los receptores, dependiente del tiempo de tratamiento con BAY
11-7085 (figura 14B).
B
A
TRAIL-R1
Tiempo (horas)
TRAIL-R1
TRAIL-R2
TRAIL-R2
TRAIL-R4
β-Actina
TRAIL-R4
104
0
6
9
C
% Células Apoptóticas
C
100
80
60
Control
TRAIL
BAY
BAY + TRAIL
40
20
0
Cels T Totales
CD4+
CD8+
Figura 14. Expresión de receptores de TRAIL en linfocitos T activados en respuesta a BAY 11-7085.
A) Linfocitos T activados fueron incubados en presencia (picos no sombreados) o ausencia (picos
sombreados) de BAY 11-7085 (2.5 μM) durante 15 horas y la expresión de los receptores TRAIL-R1, R2 y -R4 fue analizada por citometría de flujo. La línea discontinua muestra la florescencia basal del
anticuerpo secundario. B) Los niveles de ARNm de los receptores fueron analizados por RT-PCR en
linfocitos T activados tras el tratamiento con BAY 11-7085 (2.5 μM) a los tiempos indicados. Como
control de la cantidad de ARNm se analizó la expresión de β-actina. C) La población total de linfocitos
T activados de donantes sanos y las subpoblaciones separadas CD4+ y CD8+ se pretrataron 1 hora
con BAY 11-7085 (2.5 μM) antes de ser incubadas con TRAIL (250 ng/ml) durante 24 horas. El
porcentaje de células apoptóticas se determinó por citometría de flujo. Los resultados mostrados son
representativos de tres experimentos independientes utilizando células de distintos donantes.
La diferencia en la expresión de TRAIL-R4 entre las subpoblaciones CD4+ y CD8+
parece acentuarse aún más tras el tratamiento con el inhibidor de NF-κB, dado que en
este contexto el porcentaje de células CD4+ que expresan dicho receptor es muy bajo
(pico no sombreado de menor fluorescencia en el panel inferior de la figura 14A)
mientras que el 100% de las células CD8 siguen expresándolo, aunque con menor
intensidad. Estudiamos por ello la inducción de apoptosis por TRAIL en ambas
subpoblaciones linfocitarias tras el pretratamiento con BAY 11-7085 y observamos que
no existían diferencias significativas en la sensibilización de las dos subpoblaciones con
respecto a la población total (figura 14C). Esto sugiere que la pérdida de expresión de
este receptor, si bien puede jugar algún papel en la sensibilización a TRAIL de los
linfocitos T activados por inhibición de NF-κB, no debe ser la única causa de la misma.
Estudiamos entonces la expresión de distintas proteínas anti-apoptóticas como cFLIP, Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1, XIAP, c-IAP1 y c-IAP2 en linfocitos T activados en
respuesta al tratamiento con BAY 11-7085, no observando cambios en los niveles de
ARNm de c-FLIPL, Bcl-x y Mcl-1 tras 9 horas de tratamiento (figura 15A). Por el
105
contrario, el descenso en los niveles de ARNm de c-FLIPs, Bcl-2, XIAP, c-IAP1 y cIAP2 fue significativo y dependiente del tiempo, tras la exposición al inhibidor.
A
Tiempo (horas)
0
6
9
B
B
-
+
BAY / 24 horas
c-FLIPL
c-FLIPL
c-FLIPS
c-FLIPS
Bcl-2
c-IAP2
Bcl-x
XIAP
Mcl-1
Bcl-2
XIAP
α-Tubulina
c-IAP1
-
+
c-IAP2
Bcl-2
Incremento expresión (tanto por 1)
β-Actina
C
BAY / 30 horas
α-Tubulina
D
2
-
+
BAY / 20 horas
Bid
α-Tubulina
1
0.33
0
-
+
BAY / 6 horas
Figura 15. Expresión de factores intracelulares implicados en la ruta de señalización de TRAIL en
céluas T activadas en respuesta a BAY 11-7085. Linfocitos T activados fueron tratados con BAY 117085 (2.5 μM) durante los tiempos indicados. Los niveles de ARNm de los genes c-FLIP, Bcl-2, Bcl-x,
Mcl-1, XIAP, c-IAP1 y c-IAP2 se determinaron por RT-PCR (A). Los niveles de proteína de los genes
mencionados (B) y de Bid (D) se analizaron por Western-blot. Como control de cantidad de carga se
analizó la expresión de β-actina (A) o α-tubulina (B, D). C) Los niveles de ARNm de Bcl-2 se
determinaron mediante PCR a tiempo real, llevando a cabo los experimentos por triplicado y
normalizando los resultados con respecto a la expresión del ARNr 18S, para cada una de las muestras.
Las barras de error representan la SD del triplicado. En todas las figuras los datos mostrados son
representativos de al menos 3 experimentos independientes con células de diferentes donantes.
106
Determinamos también si los cambios observados a nivel de ARNm se
correspondían con un descenso de los niveles de proteína y encontramos una pérdida de
todas las analizadas tras 24 horas de tratamiento con el inhibidor, con la excepción de
Bcl-2 (figura 15B, panel superior). El hecho de que los niveles de Bcl-2 no varíen a este
tiempo puede deberse a que la vida media de esta proteína es muy larga (Reed, 1996).
Así, encontramos que efectivamente se producía una reducción en la expresión de Bcl-2
tras 30 horas de tratamiento con BAY 11-7085 (figura 15B, panel inferior).
Confirmamos también, mediante PCR a tiempo real, que la proteína Bcl-2 se regulaba a
nivel transcripcional por el inhibidor de NF-κB en células T activadas (figura 15C).
Además de todos los factores anti-apoptóticos mencionados, estudiamos la posible
regulación por BAY 11-7085 de la proteína pro-apoptótica Bid, dada la disminución de
los niveles de expresión de la misma en células T activadas con respecto a las células T
en reposo (figura 7). Sin embargo, como se observa en la figura 15D, no encontramos
ningún cambio en la expresión de Bid en las células T activadas tratadas con el
inhibidor de NF-κB. En conjunto, todos estos datos indican que la regulación de
diversas proteínas anti-apoptóticas, incluyendo entre ellas el receptor TRAIL-R4, puede
ser el mecanismo por el cual la inhibición de NF-κB sensibiliza a las células T activadas
a la apoptosis mediada por TRAIL.
3. REGULACIÓN DE LA SENSIBILIDAD A TRAIL EN CÉLULAS T
LEUCÉMICAS.
3.1 Efecto de diferentes agentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL en células
T leucémicas
Como ya se ha mencionado en el apartado anterior, numerosos agentes con
diferentes mecanismos de acción se están ensayando en estrategias de terapia
antitumoral combinada con TRAIL gracias a la capacidad de los mismos para romper la
resistencia a este ligando o para potenciar su acción a dosis mínimas. Paralelamente al
estudio descrito en el apartado anterior sobre la regulación de la resistencia a TRAIL de
linfocitos T primarios de donantes sanos, analizamos la posible sensibilización a TRAIL
en líneas de células T leucémicas, en concreto en las líneas celulares Jurkat, CEM-6 y
MOLT-4.
107
% Células Apoptoticas
A
100
80
Control
Roscovitina
TRAIL
Roscovitina + TRAIL
60
40
20
0
B
% Células Apoptoticas
JURKAT
1
C
100
80
TRAIL
Nocodazol + TRAIL
% Células Apoptoticas
CELs T ACTIVADAS
4
60
40
20
0
JURKAT
1
100
% Células Apoptoticas
Nocodazol
80
CEM-6
2
MOLT-4
3
Control
BAY
TRAIL
BAY + TRAIL
CELs T ACTIVADAS
4
60
40
20
0
1
100
80
CEM-6
2
Control
LY
TRAIL
LY + TRAIL
MOLT-4
3
60
40
20
0
JURKAT
1
108
MOLT-4
3
Control
JURKAT
D
CEM-6
2
CEM-6
2
MOLT-4
3
CELs T ACTIVADAS
4
E
% Células Apoptóticas
100
80
Control
VPA
TRAIL
VPA + TRAIL
60
40
20
0
1
JURKAT
2
CEM-6
3
MOLT-4
Figura 16. Inducción de apoptosis por agentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL en células T
leucémicas. Las líneas leucémicas T Jurkat, CEM-6 y MOLT-4 fueron pretratadas con (A) roscovitina
20 μM, (B) nocodazol 400 ng/ml o (E) VPA 1 mM durante 7 horas; o con (C) BAY 11-7085 2.5μM o (D)
LY 294002 10μM durante 1 hora. Tras la preincubación, las células fueron tratadas con 100 ng/ml de
TRAIL durante 20 h. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1
mediante citometría de flujo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. En A,B y
C se muestra el resultado de un tratamiento idéntico, pero con 250 ng/ml TRAIL, en linfocitos T activados
como control del efecto citotóxico de la droga (A,B) o de sensibilización a TRAIL (C).
En la figura 16 se muestra la actividad de diferentes agentes, utilizados a
concentraciones seleccionadas en base a publicaciones previas, sobre dichas líneas.
Tanto la roscovitina, inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas, como el nocodazol
eran capaces de inducir muerte celular en las tres líneas, de forma similar a la observada
en células T activadas (figura 16A, B). Y el tratamiento combinado con cualquiera de
estos agentes y TRAIL solo suponía, a lo sumo, una suma de los efectos de ambos por
separado. Curiosamente, cuando analizamos el efecto del inhibidor de NF-κB BAY 117085 encontramos que, a diferencia de la sensibilización que producía en linfocitos T
primarios, en líneas leucémicas T no potenciaba la inducción de apoptosis por TRAIL,
aunque sí presentaba un efecto citotóxico importante en las mismas (figura 16C).
Estudiamos también el efecto de bortezomib, doxorubicina, BIS, PD 98059
(inhibidor de MEK) e IFN-α. De todos ellos, únicamente la doxorubicina presentaba un
cierto efecto potenciador de la apoptosis en las tres líneas celulares, especialmente en
células CEM-6 (figura 8A), mientras que el resto no producían ningún cambio en la
viabilidad celular ni en la respuesta a TRAIL, a excepción del bortezomib que resultó
ser ligeramente citotóxico (tabla I).
109
JURKAT
CEM-6
MOLT-4
BAY 117085 (2.5 mM)
+/-
+/-
+/-
NOCODAZOL (400 ng/ml)
+/-
+/-
+ /-
ROSCOVITINA (20 mM)
+/-
+ /-
+ /-
BORTEZOMIB (50 nM)
(+) / -
(+) / -
(+) / -
DOXO (100 ng/ml)
- / (+)
-/+
(+) /(+)
BIS (6 mM)
-/-
-/-
-/-
PD 98059 (50 mM)
-/-
-/-
-/-
IFN-a (3 ng/ml)
-/-
-/-
-/-
LY 294002 (10 mM)
(+) / +
(+) / +
(+) / +
VPA (1 mM)
-/+
-/+
-/+
Tabla I. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad y la sensibilización a TRAIL de células T
leucémicas. Células Jurkat, CEM-6 y MOLT-4 se preincubaron con los agentes indicados durante 1
hora, excepto con nocodazol, roscovitina y VPA en que la preincubación fue de 7 horas y con IFN-α en
que fue de 20 horas. Tras el pretratamiento se incubaron con o sin TRAIL (100 ng/ml) y se determinó la
inducción de apoptosis por citometría de flujo. Se indica: citotoxicidad / sensibilización a TRAIL.
Los resultados previos obtenidos con linfocitos T primarios sugerían la posible
utilización del inhibidor de PI3K, LY294002, así como del inhibidor de HDAC, VPA,
en el tratamiento de tumores dada la baja toxicidad de ambos compuestos para dichas
células. Además habíamos visto que los dos potenciaban la apoptosis mediada por
TRAIL en células CEM-6 (figura 8B, C). Los mismos resultados fueron obtenidos
cuando analizamos su efecto en células Jurkat y MOLT-4.
Especialmente llamativo fue el efecto del VPA, tanto por su escasa acción citotóxica
como por su mayor capacidad para potenciar la acción de TRAIL en las tres líneas
celulares estudiadas (figura 16D,E). Este efecto potenciador del VPA se observó incluso
reduciendo el tiempo de preincubación con el mismo a 4 horas y utilizando dosis bajas
de TRAIL del orden de 10 a 50 ng/ml (figura 17).
110
% Células Apoptoticas
100
80
JURKAT control
60
CEM control
JURKAT + VPA
CEM + VPA
40
MOLT control
20
MOLT + VPA
0
0
10
20
30
40
50
ng/ml TRAIL
Figura 17. Efecto potenciador de VPA de la apoptosis mediada por TRAIL en células T leucémicas.
Células leucémicas T Jurkat, CEM-6 y MOLT-4 fueron pretratadas o no durante 4 horas con VPA
1mM y a continuación incubadas con 10, 20 ó 50 ng/ml de TRAIL durante 20 horas. El porcentaje de
células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1 mediante citometría de flujo. Los datos
son representativos de tres experimentos independientes.
3.2 Regulación por VPA y LY 294002 de factores implicados en la ruta de
señalización de TRAIL en líneas leucémicas T
A fin de caracterizar el posible efecto de los inhibidores de HDAC y de PI3K sobre
la expresión de proteínas intracelulares pertenecientes a la vía de señalización de
TRAIL en células T leucémicas, estudiamos los niveles de ARNm de Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, c-IAP2 y XIAP tras 15 horas de tratamiento con dichos inhibidores (figura 18A).
En ninguna de las tres líneas leucémicas T empleadas en el estudio encontramos
diferencias entre las células tratadas y los controles no tratados. Sólo se muestran los
resultados de células Jurkat como modelo representativo. En paralelo se analizó la
expresión de dichas proteínas en células T activadas como modelo celular en el que el
tratamiento con VPA y LY 294002 no regula la sensibilidad a TRAIL.
A
Jurkat
C
VPA
T activadas
LY
C
VPA
LY
Bcl-2
Bcl-x
c-IAP1
c-IAP2
XIAP
β-Actina
111
B
JHM1
C
VPA
CEM
LY
C
VPA
T Activadas
MOLT
LY
C
C
VPA LY
VPA
LY
FLIPL
FLIPS
β -Actina
CC
T activadas
Jurkat
2
2
1
1
0,31
0,35
VPA
LY
0
0
C
C
VPA
LY
Figura 18. Expresión de factores anti-apoptóticos en líneas leucémicas T y células T activadas en
respuesta al tratamiento con VPA y LY 294002. Células T activadas, células Jurkat (A, B, C), CEM-6 y
MOLT-4 (B) fueron tratadas con LY 294002 10μM o VPA 1 mM durante 15 horas. Los niveles de ARNm
de Bcl-2, Bcl-x, c-IAP1, c-IAP2, XIAP (A) y FLIP (B) se determinaron mediante RT-PCR, empleándose
el producto de PCR de la β-actina como control de carga. En (C) los niveles de ARNm de FLIPs se
analizaron mediante PCR a tiempo real llevando a cabo los experimentos por triplicado y normalizando
los resultados con respecto a la expresión del ARNr 18S, para cada una de las muestras. Las barras de
error representan la SD del triplicado. Los resultados mostrados en los 3 paneles son representativos de
tres donantes diferentes en el caso de linfocitos T activados, y de tres experimentos independientes en el
caso de las líneas celulares.
Sin embargo, cuando analizamos los niveles de FLIP sí observamos un descenso
claro en los niveles del ARNm de FLIPs en las tres líneas leucémicas, Jurkat, CEM-6 y
MOLT-4, en respuesta al tratamiento con ambos inhibidores, pero no en las células T no
transformadas (figura 18B). En los niveles de FLIPL, por el contrario, no se observó
variación alguna ni en células T normales ni en leucémicas. La regulación selectiva de
la expresión de FLIPs por VPA y LY 294002 en células T leucémicas se confirmó
analizando los niveles de ARNm por PCR a tiempo real en células Jurkat y en células T
activadas (figura 18C).
Se ha descrito la regulación de la expresión del receptor TRAIL-R2 por inhibidores
de HDAC en otros modelos tumorales (Insinga et al., 2005; VanOosten et al., 2005).
112
Por ello, analizamos también la capacidad del VPA para incrementar los niveles de
expresión en membrana de este receptor en las diferentes líneas leucémicas T. Como se
observa en la figura 19, el tratamiento con VPA produjo un cierto aumento en los
niveles de TRAIL-R2 en células Jurkat y CEM-6, pero muy débil en células MOLT-4.
Jurkat
CEM-6
MOLT-4
Intensidad de Fluorescencia
Figura 19. Expresión de TRAIL-R2 en membrana en células T leucémicas en respuesta al
tratamiento con VPA. Células Jurkat, CEM-6 y MOLT-4 fueron incuabadas con (picos no
sombreados) o sin (picos sombreados) VPA 1 mM durante 24 horas. La expresión del receptor
TRAIL-R2 en membrana se analizó mediante citometría de flujo. La línea discontinua muestra la
fluorescencia basal del anticuerpo secundario.
3.3 Potenciación por HDACi de la apoptosis mediada por TRAIL en líneas
leucémicas T sensibles
La ausencia de toxicidad del VPA en linfocitos T primarios, así como su gran
capacidad para potenciar la inducción de apoptosis por TRAIL en líneas de células T
leucémicas, sitúan a este compuesto, de entre todos los analizados en nuestro estudio,
como el mejor candidato para ser utilizado en terapias combinadas con TRAIL.
Decidimos entonces estudiar el efecto de distintos inhibidores de HDAC, pertenecientes
a diferentes familias estructurales, en la sensibilidad a TRAIL de células T primarias y
de células leucémicas T, para de este modo establecer posibles diferencias en los
mecanismos de acción de los mismos y conocer cual de ellos es el más efectivo y
selectivo en el tratamiento de leucemias de células T. En concreto, trabajamos con los
siguientes HDACi: tricostatina A (TSA) y vorinostat (SAHA), pertenecientes a la
familia de los hidroxamatos; VPA y butirato sódico (NaB), representativos del grupo de
ácidos alifáticos; MS-275, perteneciente a la familia de las benzamidas; y apicidina
como inhibidor del grupo de péptidos cíclicos.
113
En primer lugar tratamos células Jurkat y linfocitos T activados procedentes de
donantes sanos con distintas concentraciones de cada uno de los inhibidores de HDAC,
para comparar la posible acción citotóxica sobre ambos tipos celulares y establecer el
límite de tolerancia de las células no transformadas. La selección de las concentraciones
se realizó en base a las utilizadas por otros autores en diferentes modelos de células
tumorales.
A
% Células apoptóticas
100
80
60
40
20
0
C
2
TSA
TSA
1
3
VPA
VPA
4
SAHA
SAHA
5
MS-275
MS-275
6NaB
NaB
7
Apicidina
Apicidina
5
MS-275
6
NaB
7
Apicidina
B
% Células apoptóticas
100
80
60
40
20
0
C
1
2
TSA
3
VPA
4
SAHA
Figura 20. Inducción de apoptosis por diferentes HDACi en células Jurkat y linfocitos T activados.
Linfocitos T activados (A) y células Jurkat (B) fueron incubadas durante 24 horas en presencia de
HDACi a distintas concentraciones: TSA 10, 30, 50, 75 y 100 ng/ml; VPA 0.5, 0.75, 1, 2.5 y 5 mM;
SAHA 0.1, 0.3, 0.5, 1 y 2 μM; MS-275 0.5, 0.75, 1, 2.5 y 5 μM; NaB 0.1, 0.3, 0.5, 1 y 5 mM; y apicidina
10, 25, 50, 100 y 250 nM. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1
del ciclo celular. Los datos son representativos de al menos tres donantes independientes en el caso de
linfocitos T y de 3 experimentos independientes en el caso de células Jurkat.
114
Las células T activadas resultaron ser resistentes a todas las dosis de los distintos
HDACi, con excepción de los hidroxamatos (SAHA y especialmente TSA, figura 20A).
El mismo patrón de resistencia se observó en células T no estimuladas (datos no
mostrados). Por el contrario, las células Jurkat resultaron mucho más sensibles a la
inducción de apoptosis por estos inhibidores (figura 20B). Las líneas T leucémicas
CEM-6 y MOLT-4 mostraron una sensibilidad similar a la de células Jurkat (datos no
mostrados).
A partir de estos resultados seleccionamos una dosis de cada uno de los HDACi no
tóxica para los linfocitos T primarios y además subletal para las líneas de células T
leucémicas, de modo que se pudiese claramente diferenciar el posible efecto
potenciador de la apoptosis mediada por TRAIL. Así establecimos las siguientes dosis:
10 ng/ml de TSA, 1 mM de VPA, 0.5 μM de SAHA, 1 μM de MS-275, 0.5 mM de
NaB y 50 nM de apicidina. Para comprobar que las dosis elegidas de estos inhibidores
efectivamente producían un efecto sobre la acetilación de histonas, estudiamos por
citometría de flujo los niveles de la histona H4 acetilada. Observamos en células Jurkat
un nivel máximo de acetilación a las 4 horas de tratamiento con los HDACi mientras
que a las 24 horas el nivel de acetilación basal se recuperaba (figura 21). Resultados
similares se obtuvieron en células CEM-6 por lo que se estableció el tiempo de 4 horas
Intensidad de fluorescencia
como el óptimo de pretratamiento con los HDACi.
60
Negativo
Control
TSA
VPA
40
SAHA
MS-275
30
NaB
Apicidina
50
20
10
0
4 1 horas
24 2horas
Figura 21. HDACi incrementan el nivel de acetilación de histonas en células Jurkat. Células Jurkat
fueron tratadas con los distintos HDACi a concentraciones subletales (TSA 10 ng/ml, VPA 1mM, SAHA
0.5 μM , MS-275 1μM, NaB 0.5 mM y apicidina 50 nM) durante 4 y 24 horas. Los niveles de acetilación
se analizaron por citometría de flujo como se describe en Materiales y Métodos. Los datos mostrados son
representativos de tres experimentos independientes.
115
Una vez establecidas las dosis y tiempos de tratamiento con los inhibidores
comenzamos a analizar el efecto sobre la apoptosis mediada por TRAIL en células
Jurkat, CEM-6 y MOLT-4. Los HDACi de las distintas familias estructurales
potenciaban de forma similar en las tres líneas celulares la inducción de apoptosis por
TRAIL, con excepción de la apicidina que a la concentración empleada incrementaba la
sensibilidad a TRAIL tan solo en células Jurkat, pero no en las líneas CEM-6 y MOLT4 (figura 22A, B, C). De forma paralela, se analizó la posible sensibilización a la
apoptosis mediada por TRAIL en linfocitos T activados de donantes sanos, no
encontrándose efecto alguno en ninguno de los casos analizados (figura 22D).
% Células apoptóticas
100
Jurkat
80
+ TRAIL
60
60
40
40
20
20
C
TSA
100
SAHA MS-275 NaB Apicidina
MOLT-4
-
80
VPA
60
0
+ TRAIL
C
TSA
40
40
20
20
C
TSA
VPA
SAHA MS-275 NaB Apicidina
0
SAHA MS-275 NaB Apicidina
Linfocitos T activados
+ TRAIL
60
0
VPA
100
80
+ TRAIL
CEM-6
-
80
0
% Células apoptóticas
100
C
TSA
VPA
SAHA MS-275 NaB Apicidina
Figura 22. HDACi potencian la apoptosis mediada por TRAIL en líneas leucémicas T sensibles,
pero no sensibilizan linfocitos T activados. Células Jurkat, CEM-6, MOLT-4 y linfocitos T activados
fueron pretratadas durante 4 horas con los distintos HDACi a las siguientes concentraciones: TSA 10
ng/ml, VPA 1mM, SAHA 0.5 mM , MS-275 1mM, NaB 0.5 mM y apicidina 50 nM y posteriormente se
incubaron con TRAIL (100 ng/ml en líneas y 250 ng/ml en primarias) durante 20 horas. El porcentaje
de células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1 mediante citometría de flujo. Las
barras de error representan la SD de al menos 3 experimentos independientes.
116
Estudiamos también el efecto de HDACi a las concentraciones establecidas sobre
otra línea de células T leucémicas, HPB-ALL, que se caracteriza por presentar una alta
resistencia a TRAIL, a diferencia de las tres líneas anteriores que se consideran
sensibles a este ligando. En este caso, a pesar de utilizar una dosis más alta de TRAIL,
no encontramos ningún efecto de sensibilización (figura 23A). Tampoco observamos
sensibilización a la apoptosis mediada por TRAIL en linfocitos primarios de sangre
periférica de pacientes con linfoma T cutáneo, leucemia T aguda, leucemia T precursora
y leucemia T crónica (figura 23B-E). Estos resultados sugieren que los HDACi son
capaces de potenciar o facilitar la inducción de apoptosis en células T leucémcias
sensibles a TRAIL pero no en aquellas que son resistentes a este ligando.
% Células apoptóticas
% Células apoptóticas
100
80
-
60
+ TRAIL
-
60
+ TRAIL
40
20
20
0
100
80
C
TSA
VPA
0
SAHA MS-275 NaB Apicidina
60
60
40
40
20
20
C
TSA
VPA
NaB
Apicidina
HPB-ALL
-
80
MS-275
+ TRAIL
60
40
20
0
C
TSA
VPA
SAHA
TSA
MS-275 NaB Apicidina
0
VPA
SAHA MS-275 NaB Apicidina
Leucemia T Crónica
-
80
+ TRAIL
0
C
100
Leucemia T Precursora
-
Leucemia T Aguda
80
40
100
% Células apoptóticas
100
Linfoma T Cutáneo
+ TRAIL
C
TSA
VPA
SAHA MS-275 NaB Apicidina
Figura 23. HDACi no facilitan la apoptosis
mediada por TRAIL en distintos modelos de
leucemias T resistentes. La línea celular
HPB-ALL y las células primarias de pacientes
con linfoma T cutáneo, leucemia T aguda,
leucemia T precursora y leucemia T crónica
fueron pretratadas durante 4 horas con los
distintos HDACi (TSA 10 ng/ml, VPA 1mM,
SAHA 0.5 μM , MS-275 1μM, NaB 0.5 mM y
apicidina 50 nM) y posteriormente se
incubaron con TRAIL (250 ng/ml) durante 24
horas. El porcentaje de células apoptóticas se
determinó por análisis del pico sub-G1
mediante citometría de flujo.
117
3.4 HDACi potencian la activación de caspasas y las señales mitocondriales mediadas
por TRAIL en líneas leucémicas T
Una vez demostrada la potenciación del proceso apoptótico mediante la combinación
de los HDACi y TRAIL en células Jurkat, CEM-6 y MOLT-4, analizamos a qué nivel
de la ruta de señalización de TRAIL tiene lugar dicha potenciación. En primer lugar
determinamos la activación de caspasas-8, -9 y –3 en respuesta a TRAIL en células
Jurkat preincubadas o no con los diferentes HDACi. Como se demuestra en la figura 24,
todos los inhibidores, en mayor o menor medida, aumentaron la activación de todas las
caspasas. Resultados similares se obtuvieron en células CEM y MOLT-4, excepto con
la apicidina (datos no mostrados).
HDACi
TRAIL
TSA VPA SAHA MS
_____ _____ _____ _____
-
+
- +
-
+
-
+
-
+
NaB Apicidina
______ ______
-
+
-
+
-
+
Caspasa-8
43/41 kDa
Caspasa-9
37-35 kDa
Caspasa-3
20/17 kDa
Figura 24. HDACi potencian la activación de caspasas -8, -9 y -3 en respuesta a TRAIL en células
Jurkat. Células Jurkat fueron pretratadas durante 4 horas con los distintos HDACi a las
concentraciones subletales anteriormente descritas y a continuación fueron tratadas con TRAIL (100
ng/ml) durante 20 horas. La fragmentación de caspasas se determinó por Western Blot.
Para determinar si el efecto fundamental de los HDACi sobre la ruta de TRAIL tiene
lugar en las etapas iniciales en las que se activa la caspasa-8 o en una fase posterior, a
nivel de las señales mitocondriales y la activación de caspasa-9, se comparó el efecto de
inhibidores específicos de ambas caspasas sobre la inducción de apoptosis por HDACi
118
y TRAIL con el del inhibidor general de caspasas Z-VAD. Encontramos que tanto el
inhibidor de caspasa-8, Z-IETD, como el de caspasa-9, Z-LEHD, producían un bloqueo
similar al del Z-VAD de la apoptosis mediada por TRAIL en células Jurkat pretratadas
con HDACi (figura 25). Estos datos sugieren que ambas caspasas son necesarias para la
potenciación de la apoptosis por HDACi.
% Células apoptóticas
100
80
60
HDACi
-
HDACi+TRAIL
TRAIL
ZVAD50uM
+HDACi
Z-VAD
ZVAD50uM
+HDACi+T
Z-VAD + TRAIL
Z-IETD
inhCASP8-50uM
+HDACi
Z-IETD + TRAIL
inhCASP8-50uM
+HDACi+T
Ac-LEHD
inhCASP9-50uM
+HDACi
Ac-LEHD + TRAIL
inhCASP9-50uM
+HDACi+T
40
20
0
Control
TSA
VPA
SAHA
MS-275
NaB
Apicidina
Figura 25. La inhibición de caspasas bloquea la apoptosis inducida por el tratamiento combinado
de HDACi y TRAIL. Células Jurkat se pretrataron durante 4 horas con las concentraciones subletales
de los distintos HDACi en presencia o ausencia de los inhibidores de caspasas Z-VAD, Z-IETD o ZLEHD (20 μM). Posteriormente se trataron con TRAIL (100 ng/ml) durante 20 horas y el porcentaje
de células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1 mediante citometría de flujo.
Analizamos entonces el efecto de los inhibidores de caspasas en la activación de las
mismas en células Jurkat preincubadas con un HDACi, en este caso MS-275, y tratadas
con TRAIL (figura 26). Observamos, como era de esperar, que el inhibidor de la
caspasa-8 no solo bloqueaba la activación de esta caspasa sino también la de la –9 y la 3 y la degradación de un sustrato de esta última, PARP. Pero también el inhibidor de
caspasa-9 evitaba la activación de caspasa-8, de caspasa-3 y la degradación de PARP
tanto en células tratadas con TRAIL como en los tratamientos combinados de HDACi y
TRAIL. Los mismos resultados se obtuvieron con otros inhibidores de HDACi. Estos
datos parecen indicar que el incremento en la activación de la caspasa-8 podría deberse
en gran parte a una potenciación en la activación de la caspasa-9 que, vía caspasa-3 por
119
retroalimentación, activaría a la caspasa-8. La dosis de inhibidores de caspasas utilizada
en estos experimentos (20 μM) es la mínima concentración descrita con capacidad para
inhibir de forma específica la activación de caspasas. A pesar de ello, no podemos
desechar la posibilidad de una acción inespecífica generalizada de los inhibidores
empleados.
MS-275
TRAIL
Z-IETD-FMK
Ac-LEHD-CMK
-
+
-
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
Caspasa 8
43/41 kDa
β-Actina
Caspasa 9
37-35 kDa
PARP
85 kDa
β-Actina
Caspasa 3
20/17 kDa
β-Actina
Figura 26. Efecto de los inhibidores de caspasas -8 y -9 en la activación de caspasas en respuesta al
tratamiento combinado con HDACi y TRAIL. Células Jurkat fueron pretratadas durante 4 horas con
MS-275 (1 μM) en presencia o ausencia de Z-IETD o Z-LEHD (20 μM) y posteriormente se trataron
con TRAIL (100 ng/ml) durante 20 horas. La fragmentación de caspasas se determinó por Western
Blot.
Estudiamos también la posible potenciación por HDACi de señales mitocondriales
descritas como necesarias para la inducción de apoptosis por TRAIL en la gran mayoría
de las células tumorales. En concreto, analizamos la translocación de Bax a la
mitocondria así como la salida de citocromo c al citosol, eventos que tienen lugar como
consecuencia de la activación de la caspasa-8 apical. En la figura 27 podemos observar
120
que el pretratamiento de células Jurkat con VPA (como modelo de HDACi) potenciaba
la translocación de Bax y especialmente la liberación de citocromo c en respuesta a
TRAIL. Estos datos confirman la acción de los inhibidores de HDAC sobre las señales
iniciales de la ruta de inducción de apoptosis por este ligando.
VPA
-
-
+
+
-
-
+
+
TRAIL
-
+
-
+
-
+
-
+
Bax
Bax
Citocromo C
Citocromo c
Bcl-2
β-Actina
PELLET
CITOSOL
Figura 27. VPA potencia la salida de citocromo c y el reclutamiento de Bax a la mitocondria en
respuesta a TRAIL. Células Jurkat fueron pretratadas con VPA 1mM durante 4 horas y a
continuación se incubaron con TRAIL 100 ng/ml durante 20 horas. Se prepararon extractos
citosólicos y membranosos (pellet) y se detectaron las proteínas citocromo c y Bax por Western Blot.
La expresión de β-actina y Bcl-2 se analizó como control de carga de los extractos citosólicos y de
membrana, respectivamente.
3.5 Regulación por HDACi de proteínas involucradas en la ruta de señalización de
TRAIL en células T leucémicas
Los estudios preliminares con VPA habían demostrado la regulación de la
expresión del receptor TRAIL-R2 en líneas de células T leucémicas, especialmente en
células Jurkat y CEM-6 (figura 19). Analizamos si este fenómeno se reproducía en
respuesta al tratamiento con todos los HDACi a las concentraciones previamente
seleccionadas como subletales que potencian la apoptosis mediada por TRAIL. En la
figura 28A se observa que, con excepción del TSA, efectivamente todos ellos inducían
un cierto incremento en la expresión de este receptor pro-apoptótico en células Jurkat,
siendo dicho incremento de menor magnitud en el caso de la apicidina. En células
CEM-6 también se observó la regulación de la expresión de TRAIL-R2, aunque de
manera más débil que en Jurkat, con todos los HDACi excepto con TSA y apicidina
(figura 28B). Estudiamos además si estos inhibidores afectaban a la expresión del
receptor TRAIL-R1, pero en este caso no encontramos ningún tipo de regulación
consistente de manera que la expresión de este receptor en la membrana de células
121
Jurkat y CEM-6 es prácticamente nula en todos los casos figura, tanto en células control
como tratadas (28C, D).
A
TSA
MS-275
BIntensidad de Fluorescencia
TSA
MS-275
Intensidad de Fluorescencia
C
TSA
MS-275
Intensidad de Fluorescencia
122
VPA
NaB
VPA
NaB
VPA
NaB
SAHA
Apicidina
SAHA
Apicidina
SAHA
Apicidina
D
TSA
MS-275
VPA
NaB
SAHA
Apicidina
Intensidad de Fluorescencia
Figura 28. HDACi incrementan la expresión de TRAIL-R2 pero no de TRAIL-R1 en células T
leucémicas. Las líneas leucémicas Jurkat (A y C) y CEM-6 (B y D) fueron tratadas durante 20 horas
con las concentraciones subletales de los distintos HDACi. La expresión de los receptores TRAIL-R2
(A, B) y –R1 (C, D) se determinó por citometría de flujo. Los picos sombreados corresponden a la
expresión del receptor en las células sin tratar mientras que los no sombreados corresponden a la
expresión en células tratadas. La fluorescencia basal del anticuerpo secundario se representa con la
línea discontinua. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
Al igual que ocurre con el receptor TRAIL-R2, la literatura describe el incremento
de TRAIL tras el tratamiento con HDACi en otros modelos tumorales (Insinga et al.,
2005; Nebbioso et al., 2005), siendo ésta una de las posibles causas del efecto citotóxico
de los inhibidores por sí mismos. Las concentraciones subletales de HDACi utilizadas
para potenciar la inducción de apoptosis por TRAIL en nuestro modelo celular son
similares a las usadas por dichos autores. Analizamos por tanto si a dichas
concentraciones tenía lugar algún tipo de regulación en la expresión de este ligando de
muerte, obteniendo un resultado negativo con todos los HDACi (figura 29A). Sin
embargo encontramos que, concentraciones más elevadas de algunos de estos
inhibidores, que sí resultaban tóxicas para nuestras células (figura 20B), eran capaces de
inducir la expresión de TRAIL (figura 29B). En concreto observamos una clara
regulación de la expresión de este ligando en respuesta al tratamiento con TSA, VPA y
NaB, que podría explicar en parte la inducción de apoptosis por los mismos a dichas
concentraciones.
123
A
TSA
NaB
VPA
MS-275
Apicidina
B
TSA
NaB
VPA
MS-275
Apicidina
Intensidad de Fluorescencia
Figura 29. Regulación de la expresión de TRAIL por HDACi en células T leucémicas. Células Jurkat
fueron tratadas durante 20 horas con (A) concentraciones subletales de los distintos HDACi o (B)
concentraciones elevadas de los mismos (TSA 50ng/ml, VPA 2.5mM, MS-275 2.5μM, NaB 5mM y
apicidina 0.25 μM) y la expresión de TRAIL se determinó por citometría de flujo. El pico discontinuo
corresponde a la fluorescencia basal del anticuerpo secundario, el pico sombreado refleja la expresión
de TRAIL en las células sin tratar mientras que le pico no sombreado corresponde a la expresión del
ligando tras el tratamiento con los distintos HDACi. Los resultados son representativos de dos
experimentos independientes y similares a los obtenidos en la línea CEM-6.
Siguiendo la misma línea de trabajo basada en la comparación de la actividad de los
distintos HDACi tratamos de caracterizar el efecto de los mismos, incluyendo el VPA
ya estudiado previamente, sobre proteínas intracelulares pertenecientes a la vía de
señalización de TRAIL. Los efectos del NaB en algunos casos no fueron analizados por
124
ser un inhibidor de la misma familia estructural que el VPA, ácidos alifáticos, y haber
demostrado las mismas acciones que éste en todas las determinaciones hasta aquí
realizadas. Esto no ocurre sin embargo con TSA y SAHA, pertenecientes ambos a la
familia de los ácidos hidroxámicos, por lo que continuamos el análisis de los dos
inhibidores. Estudiamos los niveles de expresión del ARNm de FLIP, Bcl-XL, Mcl-1, cIAP1 y c-IAP2 en células Jurkat y en CEM-6 en respuesta al tratamiento con los
diferentes inhibidores de HDAC a las concentraciones subletales. Tanto en células
CEM-6 como en Jurkat, de las que se muestran los resultados obtenidos como
representación de las líneas leucémicas, no encontramos diferencias entre células
tratadas y controles en los niveles de ARNm de ninguno de los factores analizados, con
excepción de FLIPs cuyos niveles se reducían especialmente tras el tratamiento con
VPA, SAHA y MS-275, y ligeramente en respuesta al TSA (figura 30A). Estos datos
coinciden con los ya obtenidos al analizar los efectos del VPA de manera individual
(figura 18).
Comprobamos los posibles cambios a nivel de proteína de FLIP y de otros factores
como Bcl-2 y XIAP en células Jurkat. En el caso de estos dos últimos no encontramos
regulación en respuesta a ninguno de los HDACi (figura 30B). Sin embargo, sí
observamos una reducción más o menos pronunciada en los niveles de FLIPL, lo que
sugiere una posible regulación postransduccional de esta proteína No pudimos analizar
la expresión de FLIPs a nivel de proteína, posiblemente por no alcanzar dicha expresión
los umbrales de detección del método y/o el anticuerpo empleado. Analizamos en
paralelo los niveles de estas proteínas en linfocitos T activados de donantes sanos, como
ya hicimos previamente con los de ARNm en respuesta a VPA (figura 18), para
establecer una relación
entre las posibles variaciones de las mismas y el efecto
potenciador de la apoptosis mediada por TRAIL. Como era de esperar, no observamos
ningún cambio en los niveles de las proteínas estudiadas, ni siquiera en los de FLIPL
(figura 30B). Tanto en linfocitos T activados como en células Jurkat comprobamos que
los tratamientos con HDACi habían resultado efectivos mediante determinación de la
acetilación de la histona H4 a las 4 horas de tratamiento (figura 30B). Resultados
similares a los de células Jurkat, incluyendo la regulación postransduccional de FLIPL,
se obtuvieron en células CEM-6 y MOLT-4 (figura 30C y datos no mostrados).
125
A
FLIPL
FLIPs
β-Actina
Bcl-x
Mcl-1
c-IAP1
c-IAP2
β-Actina
B
Jurkat
C
TSA
VPA
SAHA
Linfocitos T activados
MS
C
TSA
VPA
SAHA
MS
H4-Ac
FLIPL
XIAP
Bcl-2
β-Actina
MOLT-4
CEM-6
C
C
TSA
VPA
SAHA
MS
C
TSA
VPA
SAHA
MS
FLIPL
β-Actina
Figura 30. Expresión de factores antiapoptóticos en líneas leucémicas T en respuesta al
tratamiento con HDACi. A) Células Jurkat fueron tratadas con concentraciones subletales de los
diferentes HDACi durante 15 horas. Los niveles de ARNm se determinaron mediante RT-PCR. B)
Células Jurkat y linfocitos T activados se incubaron durante 4 horas (para detectar acetilación de
histona H4) o 24 horas (para analizar el resto de proteínas) con concentraciones subletales de
diferentes HDACi. C) Células CEM-6 y MOLT-4 se incubaron 24 horas como en (B). Los niveles de
las proteínas indicadas en B y C se analizaron mediante Western-blot. En todos los casos se muestra
la expresión de β-actina como control de carga. Los resultados son representativos de tres
experimentos independientes.
126
Dado que no podíamos observar los niveles de FLIPs a nivel de proteína,
confirmamos la regulación de la expresión de este factor anti-apoptótico a nivel de
ARNm mediante PCR a tiempo real. Como se observa en la figura 31 encontramos una
reducción significativa en la expresión de este gen en células Jurkat en respuesta al
tratamiento con VPA, SAHA, MS-275 y NaB (datos no mostrados) pero no con TSA y
apicidina. Analizamos también por esta técnica los niveles de ARNm de FLIPL pero en
este caso, aunque se apreciaban ciertas variaciones, no eran significativas lo que
corroboraba los resultados previamente obtenidos mediante PCR no cuantitativa.
FLIPs
Incremento expresión (tanto por 1)
FLIPL
4
2
1,74
3
0,87
1,41
0,87
1
2
0,38
0,41
0,81
0,71
1,15
0,29
1
0
C
TSA
VPA
SAHA
MS Apicidina
0
C
TSA
VPA
SAHA MS Apicidina
Figura 31. El tratamiento con determinados HDACi reduce la expresión del ARNm de FLIPs en
células T leucémicas. Células Jurkat fueron tratadas con concentraciones subletales de los diferentes
HDACi durante 15 horas. Los niveles de ARNm de FLIPs y FLIPL se determinaron mediante PCR a
tiempo real, llevando a cabo los experimentos por triplicado y normalizando los resultados con
respecto a la expresión del ARNr 18S, para cada una de las muestras. Las barras de error
representan la SD del triplicado.
En los estudiados realizados sobre la activación de caspasas, especialmente en
células Jurkat y CEM-6, en ocasiones encontrábamos un cierto incremento en la
expresión de caspasa-3 y de caspasa-9 en respuesta al tratamiento con algunos de los
inhibidores de HDAC. Otros autores han descrito la regulación de caspasas por HDACi
en diferentes modelos tumorales. Analizamos más en detalle esta posible regulación de
la expresión de caspasa-3 y -9 en células Jurkat, ya que también podría contribuir al
efecto potenciador de la inducción de apoptosis por TRAIL. Los resultados de la figura
127
32 indican que, efectivamente, a nivel de proteína los HDACi parecen regular la
expresión de ambas caspasas. Sin embargo dicha regulación no es significativa cuando
se analizan los niveles de ARNm mediante PCR a tiempo real, con excepción de la
inducción de caspasa-3 por VPA. Es posible que en este caso esté ocurriendo también
algún tipo de regulación postransduccional, como con FLIPL.
A
C
TSA VPA SAHA MS
Caspasa-3
Caspasa-9
β-Actina
Incremento expresión (tanto por 1)
B
Caspasa-3
8
Caspasa-9
4
1,74
4,29
1,41
3
6
4
0,93
2
2,14
0,71
0,71
1,52
1,32
2
1
0,71
0
0
C
TSA
VPA
SAHA
MS Apicidina
C
TSA
VPA
SAHA
MS Apicidina
Figura 32. Regulación de la expresión de caspasas por HDACi en células Jurkat. Células Jurkat
fueron tratadas con dosis subletales de HDACi durante 24 (A) o 15 (B) horas. En (A) los niveles de
caspasa-3 y -9 se analizaron a nivel de proteína por Western Blot determinándose la expresión de βactina como control de carga. En (B) se analizaron los niveles de ARNm de ambas caspasas por PCR
a tiempo real, llevando a cabo los experimentos por triplicado y normalizando los resultados con
respecto a la expresión del ARNr 18S, para cada una de las muestras. Las barras de error representan
la SD del triplicado. Los resultados mostrados son representativos de al menos dos experimentos
independientes.
En resumen, todos estos datos sugieren que, al menos en el caso del VPA, SAHA,
NaB y MS-275, los HDACi pueden potenciar la apoptosis mediada por TRAIL en
células T leucémicas desde sus estadios iniciales, de forma que el incremento
previamente observado en la activación de la caspasa -8 se podría correlacionar con el
128
aumento en la expresión del receptor TRAIL-R2 y la pérdida de FLIP. Pero no podemos
descartar la posible regulación de otros factores anti- o pro-apoptóticos, como las
caspasas, que contribuyan a potenciar las señales mitocondriales y la activación de
caspasa-9.
129
130
V. DISCUSIÓN
131
132
1. REGULACIÓN DEL PROMOTOR DE TRAIL
La importancia de TRAIL como agente terapéutico frente al cáncer radica en su
conocida implicación inmunológica frente al desarrollo de tumores, además de en su
acción selectiva sobre células tumorales y no sobre células normales. La expresión de
TRAIL en superficie se incrementa en células T y en otras células del sistema inmune
en respuesta a señales de activación, mediando en gran parte la actividad citotóxica de
estas células (Kemp et al., 2005; Takeda et al., 2002). La descripción de los elementos
reguladores de la expresión de TRAIL es fundamental para poder controlar su expresión
en dichas células, de manera que TRAIL puede ser una herramienta terapéutica muy útil
en el tratamiento del cáncer no solo administrándolo de manera exógena sino también
potenciando su expresión endógena en células con capacidad citotóxica.
Los trabajos iniciales sobre el promotor de TRAIL describieron la presencia de
numerosos sitios de unión a factores de trascripción, entre ellos NFAT, y demostraron
su regulación por interferón (Gong and Almasan, 2000; Wang et al., 2000a). En células
T se ha descrito la implicación de NF-κB en la regulación de la expresión de TRAIL
tras el tratamiento con agentes que imitan la estimulación del TCR - PMA/ionomicina,
PHA, anticuerpos frente a CD3 y CD28 – y se ha caracterizado un sitio de unión a este
factor de transcripción en la región -265 a -256 del promotor de TRAIL (Baetu et al.,
2001). Sin embargo, el mayor incremento en la expresión de TRAIL en respuesta a
tratamientos combinados con PMA/ionomicina que en tratamientos sólo con PMA
parece indicar una cooperación de NF-κB con NFAT en la regulación del promotor.
Nuestro trabajo ha tratado de establecer el posible papel de NFAT en la regulación de
TRAIL en respuesta a la activación de la célula T, al igual que se ha descrito su
implicación en la regulación de la expresión de otros ligandos de muerte como son
TNF-α y CD95L (McCaffrey et al., 1994; Rengarajan et al., 2000). En nuestro modelo
de células Jurkat hemos demostrado que efectivamente el tratamiento con PMA solo no
es suficiente para inducir la expresión del promotor de TRAIL, como tampoco lo es el
tratamiento solo con ionomicina, lo que confirma la importancia tanto de NF-κB como
de NFAT en la regulación de TRAIL en células T en respuesta a la activación. Por otro
lado, el descenso observado en los niveles de expresión de TRAIL en células T
activadas en respuesta al tratamiento con el inhibidor de NFAT, ciclosporina A, también
confirma la implicación de este factor de transcripción en la regulación del ligando de
133
muerte y coincide con los resultados obtenidos previamente en células T de ratón, en las
que se observó una reducción en los niveles de TRAIL en membrana tras el tratamiento
con dicho inhibidor (Mariani and Krammer, 1998b). Además, por primera vez, nuestros
resultados demuestran que el tratamiento con ciclosporina A determina no sólo el
descenso en los niveles de ARNm de TRAIL en células T activadas, sino también el
descenso en la acción citotóxica de las mismas sobre células tumorales sensibles a
TRAIL, indicando la importancia de NFAT en la regulación de la expresión del ligando
de muerte con capacidad para funcionar como tal en la membrana de la célula T. Es
importante mencionar que las células Hela, utilizadas como modelo de línea tumoral en
estos experimentos, son resistentes a CD95L (Ref. Muñoz-Pinedo, JBC, 2003) por lo
que podemos descartar que el efecto citotóxico regulable por ciclosporina observado sea
debido a la expresión de este ligando en los linfocitos T activados. En resultados
preliminares no mostrados hemos encontrado que dicho efecto citotóxico es similar en
linfocitos T CD4+ y T CD8+ activados purificados, e incluso ligeramente superior en
los primeros, lo que está de acuerdo con datos previamente publicados describiendo la
actividad antitumoral de células T CD4+ citotóxicas mediada por TRAIL (Dorothee et
al., 2002).
Los resultados obtenidos tras el estudio de la actividad de los distintos fragmentos
del
promotor
de
TRAIL
demuestran
que
el
tratamiento
simultáneo
con
PMA/ionomicina determina la activación del promotor en una magnitud similar
utilizando los fragmentos de 165, 787 y 1295 pb, de lo que se deduce la importancia de
la región de 165 pb más próxima al sitio de inicio de transcripción en su regulación,
aunque esta región no contiene el sitio para NF-κB descrito por Baetu y colaboradores.
En este sentido, nuestros resultados coinciden los de un trabajo reciente sobre la
inhibición de NF-κB mediante el tratamiento con prostaglandinas y su implicación en la
expresión de TRAIL en células T (Fionda et al., 2007), donde observan una inducción
con PMA/ionomicina similar en fragmentos de 300 y 165 pb del promotor. De hecho, se
ha descrito recientemente un sitio de unión para NF-κB entre los nucleótidos -75 a -65
que no había sido señalado previamente debido a que este sitio se solapa con el sitio
SP1 encontrado en el análisis inicial de la secuencia del promotor (Matsuda et al.,
2005). La unión de NF-kB a este sitio podría explicar la estimulación por
PMA/ionomicina en nuestro fragmento de 165 pb del promotor de TRAIL. Por otro
lado, podemos decir que el sitio de unión a NFAT también se encuentra en esta región.
134
Según el estudio realizado con programas informáticos, en este fragmento de 165 pb
existen 3 secuencias consenso para NFAT. Sería interesante caracterizar en un futuro
cual o cuales de ellos son los responsables de la regulación de la expresión de TRAIL
por este factor de transcripción.
2. REGULACIÓN DE LA RESISTENCIA DE LINFOCITOS T PRIMARIOS A
TRAIL
La ausencia de toxicidad de TRAIL para la mayoría de células no transformadas es
el hecho más importante a tener en cuenta a la hora de considerarlo como un agente
antitumoral, si bien el mecanismo implicado en esta resistencia no está completamente
caracterizado. De ahí que en el presente trabajo hayamos tratado de analizar la respuesta
de linfocitos T en reposo y activados a TRAIL. Hemos encontrado que la ruta de
señalización de apoptosis se ve inhibida en el nivel más apical, esto es, no llega a
activarse la caspasa-8 en células T en ninguno de los dos estadios analizados: reposo y
activación. El análisis de la expresión de las proteínas más importantes que participan
en la formación del DISC indica que:
- La activación de células T no regula la expresión de los niveles de FADD,
caspasa-8, c-FLIP ni de los receptores de TRAIL, con la excepción de TRAIL-R4.
- Comparando con la línea de células T leucémicas sensibles a TRAIL, Jurkat, la
expresión de FADD y caspasa-8 en células T normales es similar mientras que los
niveles de c-FLIP son mucho mayores que en la línea celular. Recientemente se ha
descrito esta proteína inhibidora de la apoptosis como una de las claves de la resistencia
de células NK a la muerte por TRAIL (Mirandola et al., 2004). Es posible que en
linfocitos T juegue un papel similar.
- Los niveles de TRAIL-R1, -R2 y -R3 en membrana son muy bajos, mientras
que en el caso del receptor anti-apoptótico TRAIL-R4 podemos distinguir dos picos con
baja y alta intensidad de fluorescencia, respectivamente. Este patrón de expresión de
receptores pro- y anti-apoptóticos podría estar íntimamente ligado con la ausencia de
activación de caspasa-8 tras tratamiento con TRAIL y, por tanto, con la resistencia de
linfocitos T a la muerte mediada por TRAIL.
135
En relación con la expresión de los receptores de TRAIL, encontramos ciertas
discrepancias con los trabajos publicados por otros autores. Mientras que estudios
previos aseguran que células T en reposo no presentan una significativa expresión de
receptores con excepción de TRAIL-R4 en la subpoblación de células CD8+ (Mirandola
et al., 2004), nuestros datos obtenidos mediante análisis citofluorimétrico revelan la
existencia de un pico de baja intensidad de fluorescencia de TRAIL-R4, que se presenta
con una cierta variabilidad entre células T de distintos donantes y que debe
corresponderse con la subpoblación de linfocitos T CD4+. Por otra parte, dichos
trabajos afirman que la activación de la subpoblación CD8+ incrementa la expresión de
los receptores TRAIL-R1 y -R2 (Hasegawa et al., 2004) o de TRAIL-R2, -R3 y -R4
(Mirandola et al., 2004), mientras que en la subpoblación CD4+ la activación no
provoca cambio alguno en la expresión de receptores (Hasegawa et al., 2004). En
contraste con los estudios de Mirandola, realizados con poblaciones purificadas CD4+ y
CD8+, nosotros trabajamos con la población global de células T CD3+, es decir, en
condiciones similares a las fisiológicas donde la coexistencia de ambas subpoblaciones
durante el cultivo y la activación celular puede influir en su comportamiento y por tanto
en el patrón de expresión de receptores de las mismas. Las discrepancias encontradas
pueden deberse también a la forma de activación empleada.
La inhibición de NF-κB se ha propuesto recientemente como un mecanismo de
sensibilización de algunos tumores resistentes a TRAIL ya que este factor de
transcripción se encuentra activado de forma constitutiva modulando la expresión de
ciertas proteínas antiapoptóticas en algunos modelos tumorales (Huerta-Yepez et al.,
2004). En este trabajo se muestra como los inhibidores de NF-κB pueden igualmente
sensibilizar a los linfocitos T activados a la muerte por TRAIL. Este efecto se ha
observado especialmente con los inhibidores BAY 11-7085 y sulfosalazina. En el caso
de partenolide el efecto es demasiado bajo para ser significativo, a pesar de que inhibe
claramente la translocación de las subunidades p50 y p65 de NF-κB al núcleo, pudiendo
este hecho deberse a que este compuesto presenta otros efectos colaterales como es la
activación de la vía de JNK y la inhibición de STAT3 (Nakshatri et al., 2004; Sobota et
al., 2000) que pueden interferir con las señales derivadas de la inhibición de NF-κB.
Si bien es cierto que la expresión de los receptores pro-apoptóticos TRAIL-R1 y
-R2 en membrana es demasiado baja en células T activadas como para ser detectada
mediante análisis citofluorimétrico, y que el tratamiento con BAY 11-7085 induce una
136
reducción a nivel de ARNm de dichos receptores, hemos encontrado una clara
activación de caspasa-8 en respuesta a TRAIL en células pretratadas con el inhibidor de
NF-κB. Por tanto, los niveles de ambos receptores o de cualquiera de ellos en la
membrana de linfocitos T activados deben ser suficientes para transmitir la señal de
muerte tras la interacción con su ligando TRAIL. Además de la regulación de estos dos
receptores hemos demostrado un descenso claro en la expresión de TRAIL-R4, tanto a
nivel de ARNm como de proteína en membrana. Esta reducción debería tener más
relevancia en el caso de linfocitos T CD4+ ya que supone que el porcentaje de células
que expresan dicho receptor tras el pretramiento con BAY 11-7085 es muy bajo,
mientras que el 100% de células T CD8+ siguen siendo positivas para el mismo. A
pesar de ello, los resultados obtenidos con poblaciones de células T CD4+ y CD8+
aisladas demuestran que la sensibilización a TRAIL por el inhibidor de NF-κB es
similar en ambas subpoblaciones. Estos resultados pueden explicarse si tenemos en
cuenta el papel regulador propuesto recientemente para TRAIL-R4 (Clancy et al.,
2005). Estos autores demuestran que TRAIL-R4 puede asociarse con TRAIL-R2
formando un complejo inhibidor de muerte, de manera independiente de la presencia del
ligando, y que dicho complejo preformado parece controlar la sensibilidad de linfocitos
T CD8+ a la apoptosis mediada por TRAIL. De este modo, la reducción de los niveles
de expresión de TRAIL-R4 por inhibición de NF-κB en la población CD8+ puede
contribuir de manera significativa en su sensibilización a TRAIL. En cualquier caso, no
podemos descartar la existencia de otros mecanismos implicados en dicha
sensibilización. Además de los niveles de TRAIL-R4, el tratamiento con BAY 11-7085
disminuye la expresión de proteínas anti-apoptóticas previamente descritas como
regulables por NF-κB, tales como FLIPs, XIAP y c-IAP2. Aunque se desconoce la
contribución de cada uno de estos factores en la resistencia a la muerte mediada por
TRAIL de los linfocitos T activados, en conjunto, la regulación todos ellos puede
explicar la sensibilización a TRAIL de estas células en respuesta a la inhibición de NFκB. En el caso de Bcl-2, aunque se produce una reducción temprana en los niveles de
ARNm, nuestros datos sugieren que este factor anti-apoptótico no debe estar implicado
en el efecto del inhibidor de NF-κB ya que en los tiempos en que se detecta
sensibilización a TRAIL (24 horas) todavía no se observan cambios en los niveles de
proteína.
137
En relación con los linfocitos T en reposo, el comportamiento observado es distinto
al de las células T activadas de modo que la respuesta de estas células al tratamiento con
el inhibidor de NF-κB varía entre diferentes donantes. En estado de reposo, el nivel de
activación de este factor de transcripción es muy bajo, incrementándose posteriormente
en respuesta a señales activadoras. A este hecho debe unirse la presencia de complejos
homodiméricos de p50 en células en reposo que actúan como represores de la
transcripción, en contraposición con los heterodímeros de p50/p65 que se localizan en
células T activadas y que son activadores de la transcripción (Algarte et al., 1995). Estas
características del factor de transcripción NF-κB en células T en reposo, junto con las
propias particularidades de cada donante, pueden influir sobre los efectos del inhibidor
BAY 11-7085 en dichas células. Además, debemos tener en cuenta la capacidad de
TRAIL para activar NF-κB cuando se une a los receptores pro-apoptóticos y a TRAILR4 en determinados tipos celulares (Franco et al., 2001). Es posible que esto pueda estar
ocurriendo en las células T en reposo, lo que explicaría que TRAIL pueda contrarrestar
los efectos citotóxicos del propio inhibidor de NF-κB en estas células. Por otro lado está
descrito que, en general, los linfocitos T en reposo presentan una mayor resistencia a la
muerte por apoptosis que los linfocitos T activados (Wesselborg et al., 1993), por lo que
deben existir mecanismos diferentes en ambos estadios de activación que regulan la
inducción de apoptosis y que por tanto pueden afectar al umbral de sensibilización a
TRAIL. Diferentes autores han descrito diversos cambios en la expresión de factores
pro- y anti-apoptóticos como posible causa de las diferencias en la susceptibilidad a
apoptosis entre células T en reposo y activadas (Bosque et al., 2005; Broome et al.,
1995; Schmitz et al., 2003). Nuestro análisis comparativo entre ambos tipos de células
muestra una menor expresión de Bax en linfocitos T en reposo que podría explicar su
mayor resistencia a la muerte por apoptosis. Sin embargo, la expresión del receptor
señuelo TRAIL-R4 también es menor en estas células y los niveles de la proteína Bid
son significativamente mayores que en células T activadas, lo que en principio estaría
relacionado con una mayor sensibilidad a TRAIL. Sería interesante realizar un análisis
más exhaustivo de los mecanismos de resistencia a TRAIL y la posible activación de
NF-κB en respuesta a este ligando en células T en reposo. En relación con los bajos
niveles de Bid encontrados en linfocitos T activados, pensamos que deben ser
suficientes para permitir la sensibilización a TRAIL dado que no se incrementan en
respuesta al tratamiento con BAY 11-7085.
138
La activación de NF-κB es esencial en numerosos procesos fisiológicos y juega
un papel crucial en el desarrollo de la respuesta inmunitaria, por ejemplo en la
proliferación de linfocitos y en la producción de citoquinas, lo que sugiere que el uso de
inhibidores de NF-κB puede dar lugar a una gran variedad de efectos colaterales.
Nuestros resultados demuestran que dichos inhibidores no solo sensibilizan a linfocitos
T activados a la apoptosis mediada por TRAIL sino que también presentan una
toxicidad variable para las células T, tanto en reposo como activadas. Recientemente se
ha descrito la implicación de NF-κB en la resistencia de células uroteliales normales
humanas a TRAIL (Steele et al., 2006). En conjunto, estos datos sugieren que NF-κB
puede jugar algún papel en la resistencia de algunas células primarias a TRAIL y
cuestionan la posible utilización de inhibidores de NF-κB en terapia antitumoral.
Aunque los inhibidores del proteasoma bloquean la activación de NF-κB, no hemos
observado efectos en la resistencia de células T a la apoptosis mediada por TRAIL tras
el pretratamiento con bortezomib. Esto es debido posiblemente a que dichos inhibidores
presentan multitud de efectos biológicos de manera que el resultado neto de todos ellos
puede no ser apropiado para inducir la sensibilización de los linfocitos T a TRAIL. Sin
embargo, sí presentan una elevada toxicidad especialmente para los linfocitos T
activados. De forma similar, otros moduladores de la sensibilidad de células tumorales a
TRAIL, como la doxorubicina o el nocodazol, muestran una toxicidad moderada para
linfocitos T activados. Estos resultados ponen en duda la posible utilización de dichos
compuestos en terapias combinadas con TRAIL. Por el contrario, otros agentes como
los inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) se presentan como una prometedora
estrategia en la sensibilización de células tumorales a la apoptosis mediada por TRAIL
debido a su falta de toxicidad y a su incapacidad para sensibilizar a células T primarias.
También los inhibidores de la vía PI3K/Akt podrían ser útiles en el tratamiento de
tumores con una elevada actividad de esta ruta de supervivencia que produce un
bloqueo en la señalización de apoptosis en respuesta a TRAIL (Nam et al., 2003;
Nesterov et al., 2001).
139
3. POTENCIACIÓN POR INHIBIDORES DE HDAC DE LA APOPTOSIS
MEDIADA POR TRAIL EN CÉLULAS T LEUCÉMICAS
Como hemos indicado previamente, la importancia de TRAIL como agente
terapéutico frente al cáncer radica en su falta de toxicidad para la mayoría de las células
no transformadas. En linfocitos T de donantes sanos hemos observado que la ruta de
señalización de apoptosis mediada por TRAIL se ve inhibida desde su etapa más apical,
esto es, a nivel de la activación de la caspasa-8 iniciadora, posiblemente debido a que
los niveles de la proteína inhibidora de apoptosis c-FLIP son elevados y a que la
expresión de los receptores pro-apoptóticos es muy baja. En el presente trabajo
demostramos que inhibidores de HDAC pertenecientes a diferentes categorías
estructurales potencian la ruta de señalización de TRAIL en células T leucémicas sin
que se llegue a romper la resistencia apical presentada por los linfocitos T primarios.
Curiosamente la potenciación de la apoptosis por HDACi parece deberse en parte a la
regulación selectiva de la expresión del receptor TRAIL-R2 y de la proteína antiapoptótica FLIP en células T leucémicas, pero no en células T normales.
Entre los posibles agentes empleados en terapia antitumoral, los HDACi se han
perfilado en los últimos años como una estrategia interesante en la lucha contra el
cáncer en combinación con TRAIL. La mayor parte de los estudios se han centrado
hasta ahora en leucemia linfática crónica B (B-CLL), donde se ha observado que la
sensibilización a TRAIL por HDACi, como el TSA, está mediada por un aumento en la
formación del DISC asociado al receptor TRAIL-R1 (MacFarlane et al., 2005); y en
leucemia mieloide aguda (AML), donde se ha demostrado que el MS-275 incrementa la
expresión de TRAIL (Nebbioso et al., 2005). Algunos de los HDACi frecuentemente
utilizados, como el VPA o el MS-275 son específicos de HDAC tipo I (HDAC1,
HDAC2, HDAC3 y HDAC8) mientras que los hidroxamatos (TSA y SAHA) actúan de
forma no selectiva, tanto sobre las HDAC de tipo I como de tipo II (HDAC4, HDAC5,
HDAC6 y HDAC7). Se ha demostrado que ciertos tumores solamente son susceptibles a
la inducción de apoptosis por determinados HDACi, como es el caso de algunas
leucemias linfáticas agudas B y T en las que el MS-275 no es capaz de provocar la
muerte celular, mientras que sí lo hacen VPA y SAHA (Tsapis et al., 2007). También se
ha descrito que la inhibición de HDAC de clase I, pero no de clase II, es fundamental
para la sensibilización a TRAIL de células de B-CLL (Inoue et al., 2006a). Nuestros
140
resultados demuestran un comportamiento uniforme de distintos HDACi, con
independencia del tipo de HDAC sobre el que ejercen su acción inhibidora, en el
mantenimiento de la resistencia a TRAIL de linfocitos no transformados, así como en la
sensibilización a TRAIL de las diferentes líneas de leucemias T sensibles a este ligando.
La única excepción la constituye la apicidina, ya que en el caso de este HDACi
observamos una menor potenciación de la inducción de apoptosis por TRAIL en células
Jurkat, en comparación con el resto de los inhibidores, y prácticamente nula en el caso
de las líneas CEM-6 y MOLT-4, a pesar de que a las concentraciones empleadas se
detecta claramente el incremento en los niveles de acetilación de histonas en dichas
células. En realidad la apicidina, comparada con el resto de HDACi utilizados en este
trabajo, constituye una excepción en la mayoría de los aspectos analizados.
Diversos estudios han descrito el incremento de los niveles de TRAIL-R2 en
extractos citosólicos de diferentes tipos de células sensibles al ligando de muerte
TRAIL en respuesta al tratamiento con HDACi (Inoue et al., 2004; Nakata et al., 2004).
El estudio comparativo del efecto de HDACi pertenecientes a las distintas familias
estructurales en líneas de células T leucémicas nos ha permitido demostrar que la
mayoría de ellos inducen un incremento en los niveles del receptor TRAIL-R2 en
membrana, con excepción de la apidicina y del TSA. Además de los cambios en la
expresión de este receptor, se ha descrito la regulación de diversas proteínas pro- y antiapoptóticas por diferentes HDACi en diversos modelos de células tumorales (Rosato et
al., 2003; Sanda et al., 2007). Tras el análisis de la expresión de numerosos genes
implicados en la ruta de señalización de TRAIL, nuestros resultados han demostrado
que la mayoría de los HDACi analizados, de nuevo con la excepción de TSA y
apicidina, provocan un descenso en los niveles de ARNm de FLIPs en las distintas
líneas leucémicas T sensibles a TRAIL. Aunque los niveles de esta proteína son bajos
en las líneas leucémicas, con respecto a la expresión en linfocitos T de donantes sanos,
es posible que juegue un papel importante en la sensibilización a TRAIL. Además
hemos observado una pérdida en la expresión de la proteína FLIPL que parece tener
lugar a nivel postransduccional, ya que no va a acompañada de una regulación de los
niveles de ARNm. Por tanto, la regulación de FLIP, junto con el incremento en los
niveles de TRAIL-R2, pueden explicar la mayor activación de la caspasa-8 iniciadora
en los tratamientos combinados de HDACi y TRAIL. Es importante señalar que
recientemente se ha publicado un trabajo donde se demuestra que la potenciación de la
141
ruta de TRAIL por HDACi no depende del incremento en la expresión de receptor
TRAIL-R2 en diferentes modelos tumorales (Inoue et al., 2006b).
En general, nuestros datos indican que no todos los HDACi parecen compartir
un mismo mecanismo de acción ni presentar similares efectos sobre las líneas T
leucémicas. La escasa o nula capacidad de la apicidina para potenciar la acción de
TRAIL en las distintas líneas leucémicas T correlaciona con su baja o nula capacidad
para regular los niveles tanto del receptor TRAIL-R2 como de la proteína FLIPs.
Recientemente se ha descrito que la apicidina inhibe selectivamente a las HDAC2 y
HDAC3 (Khan et al., 2008), lo que sugiere que ambas HDAC pueden no estar
implicadas en la regulación de FLIPs y TRAIL-R2 en células T leucémicas y que solo
en células Jurkat podrían jugar algún papel en la regulación de la sensibilidad a TRAIL,
por un mecanismo independiente de la modulación de estos genes. El caso del TSA es
más controvertido ya que, si bien hemos mostrado su incapacidad para modular la
expresión del receptor TRAIL-R2 y de FLIPs a la concentración seleccionada, también
es cierto que este HDACi sí potencia la inducción de apoptosis por TRAIL en las tres
líneas leucémicas sensibles. Por el contrario el SAHA, perteneciente a la misma familia
y con igual espectro de acción que el TSA (inhibición de HDAC tipos I y II), presenta
ambos efectos de incremento del receptor y potenciación de la apoptosis. Es posible que
la actividad del TSA sea menor que la del SAHA sobre determinadas HDAC cuya
inhibición es necesaria para regular la expresión del receptor de TRAIL y de FLIPs. En
cualquier caso, estos datos sugieren que la causa de la potenciación de la apoptosis
mediada por TRAIL no debe ser la regulación de uno o dos genes solamente, hecho que
además viene apoyado por el amplio espectro de la acción reguladora de los HDACi.
Uno de los múltiples factores que pueden contribuir a la acción de HDACi es
NF-κB. Algunos estudios han demostrado que TSA inhibe la activación de este factor
de transcripción favoreciendo la entrada en apoptosis de la célula tumoral (Hu and
Colburn, 2005; Yao et al., 2006) mientras que en otros se ha descrito la activación de
NF-κB por distintos HDACi, como TSA, SAHA y apicidina (Ashburner et al., 2001;
Domingo-Domenech et al., 2007; Kim et al., 2006). Si esta última hipótesis es correcta,
la capacidad de activación de NF-κB por parte de los distintos HDACi en nuestro
modelo de células T leucémicas puede ser diferente, de forma que el efecto proapoptótico de los inhibidores puede estar compensado en mayor o menor medida por la
activación de la vía de supervivencia de NF-κB(Mayo et al., 2003). Además se sabe que
142
TRAIL-R2 y FLIP pueden ser regulados por NF-κB por lo que los niveles de estas
proteínas en respuesta al tratamiento con HDACi se verían afectados de forma diferente
dependiendo del grado de activación de este factor de transcripción. Por otra parte,
aunque se ha descrito la inducción de apoptosis en linfomas T cutáneos por el
tratamiento con elevadas dosis de SAHA (Duvic and Vu, 2007), a las dosis subletales
utilizadas en nuestro trabajo de este y de otros HDACi no hemos encontrado
sensibilización a TRAIL de células primarias procedentes de pacientes con linfoma T
cutáneo o con diferentes tipos de leucemias T. La baja toxicidad de los HDACi y la
ausencia de sensibilización a TRAIL en células T leucémicas primarias así como en
células T normales también podrían venir determinadas por una mayor activación de
NF-κB en estas células.
La diferencia en el mecanismo de acción de los HDACi parece ir ligada no solo
a su estructura y a su actividad sobre HDAC concretas, sino que también varía en
función del modelo tumoral empleado. Así, estudios realizados por varios autores sobre
el efecto del ácido hidroxámico SAHA indican que este inhibidor puede regular la
expresión de genes diferentes en distintos tipos de células tumorales. Por ejemplo, en
células de hepatoma induce un aumento en la expresión de Bim y de Bcl-xs, mientras
que en células de cáncer de mama puede modular la expresión Bim, Bak, XIAP,
survivina y Bcl-2, y en células de mieloma múltiple es capaz de inducir la expresión de
otras proteínas pro-apoptóticas como Bax, Noxa y Puma (además de Bim y Bak)
(Emanuele et al., 2007; Fandy et al., 2005). En nuestro modelo de células T leucémcias
no hemos observado regulación de ninguna de las proteínas analizadas de la familia de
Bcl-2 ni de los IAPs en respuesta al tratamiento con SAHA ni con ningún otro HDACi.
En relación con esta ausencia de regulación de proteínas de la familia de Bcl-2, no
debemos olvidar que las líneas tumorales analizadas necesitan activar la ruta
mitocondrial a través de Bid para completar la señalización de muerte celular en
respuesta a TRAIL. Un estudio reciente demuestra cómo la sobreexpresión de Bcl-2 o
de Bcl-xL pueden bloquear la inducción de apoptosis por combinación de ciertos
HDACi y TRAIL en células Jurkat, poniendo de manifiesto la relevancia de esta ruta
mitocondrial (Shankar et al., 2005b). De hecho, según algunos trabajos, la mitocondria
es la vía fundamental afectada por los HDACi en ciertos modelos tumorales como la
línea de leucemia mieloide sensible a TRAIL U937, ya que la potenciación de la
apoptosis no está asociada a un incremento de receptores de muerte ni a un descenso en
143
los niveles de FLIP (Rosato et al., 2003). En el trabajo de Shankar y colaboradores (Ref.
Shankar) el tratamiento con HDACi a concentraciones ligeramente superiores a las de
nuestro estudio provoca en células U937 el descenso de XIAP, c-IAP, Mcl-1, Bcl-2 y
Bcl-xL. En nuestro caso, a pesar de no haber observado regulación de las proteínas
analizadas relacionadas con la ruta mitocondrial no podemos descartar un posible efecto
a nivel de esta ruta, por regulación de otros factores pro- o anti-apoptóticos distintos a
los hasta ahora analizados, en la acción de los HDACi en células T leucémicas,
especialmente en el caso del TSA que solo es capaz de regular los niveles de FLIPL pero
no de TRAIL-R4 ni FLIPs.
Ciertos estudios han demostrado también la regulación de la expresión de
caspasas-3 y -9 en células tratadas con diversos inhibidores de HDAC (Shankar et al.,
2005b; Wallace et al., 2006). Nuestro estudio comparativo de los niveles de ARNm de
ambas caspasas por PCR a tiempo real ha demostrado que tan sólo se produce un
incremento en los mismos tras el tratamiento con VPA, pero no con el resto de
inhibidores, lo que vuelve a confirmar la acción diferencial sobre distintos genes de los
distintos HDACi en nuestro modelo celular. Sin embargo a nivel de proteína sí hemos
observado un cierto incremento en la expresión de ambas caspasas en respuesta al
tratamiento con todos los HDACi analizados. Esta regulación podría jugar un papel
importante en la potenciación de la apoptosis mediada por TRAIL y, sobretodo, en la
inducida por TSA. La regulación a nivel de proteína, y no de ARNm, de caspasas puede
explicarse debido a la capacidad de los HDAC para modificar distintas proteínas no
histonas, algunas de las cuales presentan distintos efectos a nivel postraduccional. Uno
de estos efectos está relacionado con la estabilidad de las proteínas. Se ha descrito que
tanto la acetilación como la ubiquitinación pueden tener lugar en el mismo residuo de
lisina, existiendo una regulación cruzada de ambas modificaciones (Caron et al., 2005).
La competencia entre ambos procesos influye en la estabilidad de la proteína ya que las
HDACs pueden disminuir la vida media mediante cambios conformacionales que
provocan la exposición de los residuos de lisina para su ubiquitinación (Giandomenico
et al., 2003). De esta forma los distintos HDACi, al permitir la acetilación de los
residuos de lisina, pueden estar impidiendo la degradación de las caspasas-3 y -9 a nivel
del proteasoma, provocando una mayor actividad de las mismas a pesar de no existir
modulación a nivel del promotor. En el caso de FLIPL hemos observado una regulación
contraria a la de caspasas, es decir, una pérdida de expresión a nivel de proteína, pero no
144
es de extrañar si tenemos en cuenta que las HDACs pueden tener muchos otros efectos
por ejemplo en la interacción o en la localización de proteínas, cuyas consecuencias
pueden ser muy variadas.
Por otro lado, los resultados obtenidos con los inhibidores de caspasas parecen
demostrar la importancia de la vía mitocondrial en la potenciación de la apoptosis. Dado
que el inhibidor de caspasa-9 bloquea de manera muy significativa la activación de
caspasa-8 en respuesta al tratamiento con HDACi y TRAIL, debemos entender que
estos facilitan la activación de caspasa-9 de forma independiente de la activación de la
caspasa-8 apical y que en gran medida esta última se activa como consecuencia de la
activación de la caspasa-9 y de caspasas efectoras (ruta de amplificación de la señal de
muerte celular) (Slee et al., 1999). Un estudio reciente muestra cómo la potenciación de
la apoptosis por combinación de TSA y TRAIL en células de cáncer torácico se bloquea
mediante la inhibición de la caspasa-9 (Reddy et al., 2007). Sin embargo, no debemos
olvidar la posible acción inespecífica de los inhibidores de caspasas a las
concentraciones utilizadas por lo que sería interesante realizar un estudio más
exhaustivo de la acción de los HDACi en células sin caspasa-8. Por tanto, ensayos con
ARNi de esta caspasa podrían ser muy útiles para conocer la verdadera implicación de
la caspasas-8 y –9 en la potenciación de la apoptosis por dichos inhibidores. Además, el
análisis de la posible potenciación de la formación del DISC podría ayudar a establecer
la relevancia de dichas caspasas.
Por otra parte, futuros estudios deberían incluir la regulación de la expresión y
función por HDACi de otras proteínas que favorecen la activación de caspasa-9, como
son Smac/DIABLO y Apaf-1, a la vista de los datos obtenidos por otros autores
mediante ensayos de micro-array (Peart et al., 2005). También se ha descrito que, junto
con inducción de apoptosis por regulación de la expresión de TRAIL en células
leucémicas, los HDACi a concentraciones elevadas pueden provocar la muerte celular
mediante producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Ruefli et al., 2001). Sería
interesante analizar si el tratamiento con HDACi a las concentraciones empleadas para
la sensibilización de leucemias T a TRAIL provoca igualmente un incremento en la
producción de ROS que favorece la acción de este ligando de muerte.
145
146
VI. CONCLUSIONES
147
148
1.- El factor de transcripción NFAT está implicado en la regulación de la expresión
del ligando de muerte TRAIL funcional en células T activadas, encontrándose el sitio de
unión a este factor en la región de 165 pb del promotor proximal al sitio de inicio de
transcripción.
2.- Los linfocitos T en reposo y activados presentan una resistencia similar a la
apoptosis mediada por TRAIL. Entre los posibles mecanismos que controlan dicha
resistencia encontramos la expresión de las proteínas anti-apoptóticas TRAIL-R4 y
FLIP así como la baja expresión en membrana de los receptores pro-apoptóticos
TRAIL-R1 y –R2.
3.- Inhibidores de la activación del factor de transcripción NF-κB, como el compuesto
BAY 11-7085, sensibilizan a los linfocitos T activados a la apoptosis mediada por
TRAIL mediante la regulación de la expresión de diversos factores anti-apoptóticos
implicados en la ruta de señalización de TRAIL.
4.- Inhibidores de HDAC pertenecientes a diferentes grupos estructurales, con
excepción del péptido cíclico apicidina, potencian la apoptosis mediada por TRAIL en
diferentes líneas leucémicas T sensibles a este ligando, pero no en células T leucémicas
resistentes ni en linfocitos T primarios.
5.- Los inhibidores de HDAC potencian todas las señales implicadas en la ruta de
apoptosis mediada por TRAIL en líneas de células T leucémicas: activación de
caspasas-8 y –9, eventos mitocondriales y activación de caspasas efectoras como la
caspasa-3.
6.- Los inhibidores de HDAC SAHA, VPA, MS-275 y butirato sódico, incrementan
la expresión del receptor pro-apoptótico TRAIL-R2 y reducen la expresión de FLIP en
células T leucémicas.
149
150
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Jorge Carlos Morales, Marı́a José Ruiz-Magaña, Carmen Ruiz-Ruiz ∗
Departamento de Bioquı́mica y Biologı́a Molecular 3 e Inmunologı́a, Facultad de Medicina,
Universidad de Granada, Avda. de Madrid 11, 18012 Granada, Spain
Received 17 October 2006; received in revised form 13 December 2006; accepted 14 December 2006
Available online 25 January 2007
Abstract
Several combined strategies have been recently proposed to overcome the resistance to tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing
ligand (TRAIL) showed by some tumor cells, thus improving the use of this death ligand in antitumor therapy. However, the molecular mechanisms
of the tumor selective activity of TRAIL are not completely understood and hence the effects of the combined therapy on normal cells are
unknown. Here, we have studied the resistance of primary T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis. No significant differences were found
in the expression of proteins involved in TRAIL-mediated apoptosis between resting and activated T cells. The low expression of death receptors
TRAIL-R1/-R2 as well as the high levels of the antiapoptotic proteins TRAIL-R4 and cellular Fas-associated death domain-like IL-1␤-converting
enzyme-inhibitory protein (c-FLIP) may explain the lack of caspase-8 activation observed upon TRAIL treatment in both cell types. We have also
analyzed the effect of different sensitizing agents such as genotoxic drugs, phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) inhibitors, proteasome inhibitors,
microtubule depolymerizing agents, histone deacetilase inhibitors (HDACi), and NF-␬B inhibitors. Although some of them induced T cell death,
only NF-␬B inhibitors sensitized activated T cells to TRAIL-induced apoptosis, maybe through the regulation of the antiapoptotic proteins TRAILR4, c-FLIPS and members of the inhibitors of apoptosis proteins (IAP) family. These results question the safety of the combined treatments with
TRAIL and NF-␬B inhibitors against tumors.
© 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Apoptosis; TRAIL; T lymphocytes; Antitumor therapy
1. Introduction
TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/APO-2L)
and CD95 ligand (CD95L or FasL/APO-1L) are type II transmembrane proteins that belong to the tumour necrosis factor
(TNF) superfamily. They are potent inducers of apoptosis upon
binding to their respective death domain-containing receptors,
also known as death receptors (Suda et al., 1993; Wiley et al.,
1995). Cytoplasmic death domains serve to recruit intracellular
adapter molecules such as Fas-associated death domain protein
(FADD) that in turn engage procaspase-8, thereby forming the
death-inducing signalling complex (DISC). Caspase-8 is activated in the DISC allowing the initiation of a cascade of events
that leads to apoptotic cell death (Chinnaiyan et al., 1995; Sprick
et al., 2000). Such direct connection to the cell’s death machin-
∗
Corresponding author. Tel.: +34 958 24 35 22; fax: +34 958 24 90 15.
E-mail address: mcarmenr@ugr.es (C. Ruiz-Ruiz).
0161-5890/$ – see front matter © 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.molimm.2006.12.015
ery suggests a therapeutic potential for CD95L and TRAIL in
cancer treatment. Concerning CD95L, although it can efficiently
induce apoptosis in a variety of tumour cells, its administration
may not be a useful strategy as it is associated with severe liver
toxicity (Ogasawara et al., 1993). In contrast, TRAIL has no systemic toxicity in preclinical studies with mice and non-human
primates when administered at doses that inhibit the growth of
breast and colon cancer xenografts (Walczak et al., 1999).
TRAIL can bind to four specific type I membrane receptors.
TRAIL-R1/DR4 and TRAIL-R2/DR5 are death receptors, as
they contain the intracellular death domain essential for transmitting the apoptotic signals (MacFarlane et al., 1997; Pan et
al., 1997b; Walczak et al., 1997). TRAIL-R3/DcR1 and TRAILR4/DcR2 are known as antiapoptotic or decoy receptors because
they do not contain an intact death domain. They act as nonfunctional binding partners for TRAIL, thereby attenuating its
apoptotic activity (Degli-Esposti et al., 1997; MacFarlane et
al., 1997; Pan et al., 1997a). TRAIL receptors appear to be
ubiquitously expressed with transcripts detected in most human
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tissues as well as in tumor cell lines of different lineages. Moreover, unlike CD95L, TRAIL is expressed constitutively and it
is widely distributed in normal organs and tissues (Wiley et al.,
1995), which is in relation with its lack of toxicity to normal
cells. Even though a recombinant form of human TRAIL has
been shown to cause apoptosis in human hepatocytes (Jo et al.,
2000), more recent data have demonstrated that different recombinant versions of TRAIL vary considerably in toxicity towards
normal human cells, but all of them maintain their antitumor
properties (Lawrence et al., 2001).
To date, the mechanisms of TRAIL resistance in normal cells
and some tumor cells are not completely understood. As regulation of TRAIL-mediated apoptosis is exerted at several stages
along the signalling pathway, resistance can occur by different
means. Initially, the degree of TRAIL sensitivity or resistance
was proposed to be dependent on the levels of expression, localization and function of death and decoy receptors (Sheridan et
al., 1997; Zhang et al., 2000). However, a correlation between
cell survival and the expression of decoy or death receptors has
not been conclusively demonstrated. On the other hand, several intracellular molecules can block the apoptotic effect of
TRAIL. The cellular Fas-associated death domain-like IL-1␤converting enzyme-inhibitory protein (c-FLIP) modulates the
apoptotic pathway right at the beginning because it competes
with caspase-8 for binding to FADD (MacFarlane et al., 2002;
Siegmund et al., 2002). Bcl-2 and Bcl-XL impede the activation
of the mitochondrial pathway thereby blocking the release of
cytochrome c from mitochondria to cytosol (Ruiz de Almodovar
et al., 2001). The inhibitors of apoptotic proteins XIAP, c-IAP1
and c-IAP2 act by inhibiting active caspases (Cummins et al.,
2004; Li et al., 2004). The antiapoptotic signals induced by NF␬B (Ravi et al., 2001), protein kinase B (PKB)/Akt (Whang et
al., 2004), protein kinase C (PKC) or mitogen-activated protein
kinase (MAPK) (Ortiz-Ferron et al., 2006; Sarker et al., 2001)
have also been involved in the resistance to TRAIL-induced
apoptosis of different types of cells.
Despite the controversial results about the physiological role
of TRAIL in vivo, several studies point to a role for TRAIL in
the suppression of autoimmune diseases and the immune surveillance of developing and metastatic tumors (Cretney et al., 2006).
In this respect, it has been reported that TRAIL is implicated in
the antitumor cytotoxicity of dendritic cells, monocytes, NK
cells and even B cells (Fanger et al., 1999; Griffith et al., 1999;
Kemp et al., 2004; Takeda et al., 2001). Moreover, TRAIL is
induced on the surface of human T lymphocytes upon activation through the T cell antigen receptor (TCR) or treatment with
type I interferons, mediating an important part of the cytotoxic
activity of T cells (Dorothee et al., 2002; Kayagaki et al., 1999).
The resistance of immune cells to TRAIL-induced apoptosis is
essential for them to act as mediators of antitumoral response. In
this work, we have investigated the mechanisms of TRAIL resistance in resting and activated primary human T lymphocytes.
We have analyzed the expression of several proteins involved
in the TRAIL signalling pathway, such as TRAIL receptors and
components of the DISC, in both cell types. Furthermore, we
have studied their susceptibility to TRAIL upon combination
with agents that regulate TRAIL sensitivity in tumor cells. Our
results show that NF-␬B inhibitors are able to sensitize primary
activated T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis and regulate the expression of several antiapoptotic proteins in these
cells.
2. Materials and methods
2.1. Reagents and antibodies
Human recombinant TRAIL was prepared as described
previously (MacFarlane et al., 1997). Phytohemagglutinin,
doxorubicin, LY294002, nocodazole, valproic acid, BAY 117085, sulfasalazine and mouse anti-␣-tubulin mAb were from
Sigma–Aldrich (St. Louis, MO). Velcade (bortezomib) was from
Janssen-Cilag SA (Madrid, Spain). Z-VAD-FMK was provided
by Bachem (Bubendorf, Switzerland). Parthenolide, CAPE,
anti-cFLIP monoclonal antibody NF6 and mouse anti-human
TRAIL receptor antibodies for flow cytometry studies were
purchased from Alexis Biochemicals (San Diego, CA). Mouse
anti-human CD28 and polyclonal anti-human NF-␬B p50 antibodies were from eBioscience (San Diego, CA). Anti-human
caspase-8 monoclonal antibody was purchased from Cell Diagnostica (Münster, Germany). Mouse anti-FADD was obtained
from Transduction Laboratories (Lexington, KY). Monoclonal
antibodies against poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), XIAP
and c-IAP2 were obtained from BD Biosciences (San Jose, CA).
Mouse anti-p65 was obtained from Santa Cruz Biotechnology
Inc. (Santa Cruz, CA). Monoclonal antibody anti-Bcl-2 was
from Dako (Glostrup, Denmark).
2.2. Cells and cell culture
Blood samples were obtained from healthy donors by
informed consent and collected into citrate tubes. Peripheral
blood mononuclear cells (PBMC) were prepared by Ficoll–
Histopaque density gradient centrifugation (Sigma–Aldrich)
and adherent monocytes were depleted by culture on plastic
dishes for 1 h at 37 ◦ C. Peripheral blood T lymphocytes were
then isolated by negative selection with an indirect magnetic
labelling system consisting of a cocktail of biotin-conjugated
antibodies against CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123,
and CD235a (Human Pan T Cells Isolation Kit II, Miltenyi
Biotec, GmbH). Purity of T cells was >95% CD3+ as determined by flow cytometry. Purified resting T lymphocytes were
resuspended in RPMI 1640 medium (BioWhittaker Inc.) containing 10% fetal bovine serum, 1 mM l-glutamine, 100 U/ml
penicillin and 100 ␮g/ml streptomycin and incubated as indicated at 37 ◦ C in a humidified 5% CO2 , 95% air incubator. For
activation, resting T cells were cultured at 2 × 106 cells/ml with
5 ␮g/ml PHA and 1 ␮g/ml anti-CD28 for 20 h. After washing,
cells were incubated in complete medium supplemented with
25 U/ml IL-2 for an additional 5 days.
The human cell lines Jurkat, CEM and SKBR3 were all maintained in culture in RPMI 1640 medium with 10% fetal bovine
serum, l-glutamine, penicillin and streptomycin at 37 ◦ C in a
humidified 5% CO2 , 95% air incubator.
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2.3. Determination of apoptotic cells
Hypodiploid apoptotic cells were detected by flow cytometry
according to published procedures (Gong et al., 1994). Briefly,
cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS), fixed
in cold 70% ethanol, and then stained with propidium iodide
while treating with RNase. Quantitative analysis of sub-G1 cells
was carried out in a FACScan cytometer using the Cell Quest
software (BD Biosciences).
2.4. Cytofluorometric analysis of TRAIL receptors
To detect TRAIL receptors at the cell surface, control or
treated cells were incubated with primary antibodies (5 ␮g/ml)
at 4 ◦ C for 30 min. After washing with PBS to remove unbound
primary antibody, cells were incubated with goat anti-mouse
fluorescein isothiocyanate-conjugated antibody (Caltag Laboratories) for 30 min at 4 ◦ C. Cells were then washed again,
resuspended in PBS and analyzed in a FACScan flow cytometer.
2.5. Immunoblot detection of proteins
For detection of cytosolic proteins, cells were lysed in icecold lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris–Cl, 1% NP-40) for
30 min. Proteins of cytosolic supernatants were resolved on 10%
SDS-PAGE gels and detected as reported previously (Ruiz-Ruiz
and Lopez-Rivas, 1999).
For nuclear proteins extractions, cells were lysed with
300 ␮l of hypotonic buffer (10 mM HEPES, pH 7.6, 10 mM
KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.5 mM
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 10 mM Na2 MoO4 , and
protease inhibitors) containing 0.6% of Nonidet P-40. Nuclei
were then centrifuged and incubated in 50 ␮l of high saltcontaining buffer (20 mM HEPES, pH 7.6, 0.4 M KCl, 1 mM
EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 10 mM
Na2 MoO4 , and protease inhibitors) for 30 min on a rocking platform at 4 ◦ C. Nuclei were centrifuged at 13,000 × g for 10 min,
to get the supernatants containing the nuclear extracts. Proteins
were then separated through 10% SDS-PAGE gel and detected
as described (Ruiz-Ruiz and Lopez-Rivas, 1999).
2.6. Reverse transcription (RT)-PCR
Total RNA was extracted from T lymphocytes with Trizol
Reagent (Invitrogen) as recommended by the supplier. cDNAs
were synthesized from 3 ␮g of total RNA by using M-MLV
reverse transcriptase (Invitrogen) and oligo(dT) primer in a
total volume of 20 ␮l. Reverse transcription was performed at
37◦ for 50 min followed by 15 min at 70◦ for inactivation. PCR
reactions were performed with 0, 1–2 ␮l cDNA (depending on
the gene) in a 50-␮l volume and using the following primer pairs
(fragments size indicated in brackets): TRAIL-R1 (506 bp),
forward 5 -CTGAGCAACGCAGACTCGCTGTCCAC-3 and
reverse 5 -TCCAAGGACACGGCAGAGCCTGTGCCAT-3 ;
TRAIL-R2 (502 bp), forward 5 -GCCTCATGGACAATGAGATAAAGGTGGCT-3 and reverse 5 -CCAAATCTCAAAGTACGCACAAACGG-3 ; TRAIL-R3 (612 bp), forward 5 -GA-
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AGAATTTGGTGCCAATGCCACTG-3 and reverse 5 -CTCTTGGACTTGGCTGGGAGATGTG-3 ; TRAIL-R4 (453 bp),
forward 5 -CTTTTCCGGCGGCGTTCATGTCCTTC-3 and
reverse
5 -GTTTCTTCCAGGCTGCTTCCCTTTGTAG-3 ;
c-FLIPL (227 bp), forward 5 -AATTCAAGGCTCAGAAGCGA-3 and reverse 5 -GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3 ; cFLIPS (100 bp), forward 5 -AATGTTCTCCAAGCAGCAATCC-3 and reverse 5 -CCAAGAATTTTCAGATCAGGACAAT3 ; Bcl-2 (367 bp), forward 5 -AGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGAC-3 and reverse 5 -AGATAGGCACCAGGGTGAGCAAGCT-3 ; Bcl-x (257 bp), forward 5 -CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC-3 and reverse 5 -CTGCGATCCGACTCACCAATAC-3 ; Mcl-1 (211 bp), forward 5 -CTTAGTTGATATTTTGGGCTTGGG-3 and reverse 5 -AGAAGTCAAAAAGTAGTCACTGGG-3 ; XIAP (858 bp), forward 5 -GGCCATCTGAGACACATGCAG-3 and reverse 5 -GCATTCACTAGATCTGCAACC-3 ; c-IAP1 (171 bp), forward 5 -CCAGTTCTTTTCTACACTATAAT-3 and reverse 5 -CTTAATCTGTTTATTTACAAGGG-3 ; c-IAP2 (150 bp), forward 5 -CAACATGGAGATTCGAAATCC-3 and reverse 5 -CACATCACTCTTCTGTGAAGGG-3 ; ␤-actin (661 bp), forward 5 -TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3 and reverse
5 -CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3 . PCR
cycle conditions were as follows: 1 min at 95 ◦ C, 1 min at 55 ◦ C
and 1 min at 72 ◦ C for TRAIL-R1, TRAIL-R2 and TRAIL-R3;
1 min at 95 ◦ C, 1 min at 60 ◦ C, and 1 min at 72 ◦ C for TRAILR4, Bcl-2 and ␤-actin; 40 seg at 95 ◦ C, 40 seg at 60 ◦ C, and 40
seg at 72 ◦ C for c-FLIPS and c-FLIPL ; 1 min at 95 ◦ C, 1 min
at 57 ◦ C, and 1 min at 72 ◦ C for Bcl-x, Mcl-1, XIAP, c-IAP1
and c-IAP2. The number of cycles varied between 30 and 35,
depending on the gene analyzed. The products were resolved
on a 1% agarose gel and visualized with ethidium bromide.
3. Results
3.1. Resistance of resting and activated primary human T
lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis
The resistance of different peripheral blood cell subpopulations to TRAIL-mediated cytotoxicity has recently been reported
(Hasegawa et al., 2004; Mirandola et al., 2004). To further characterize the effect of TRAIL on primary human T lymphocytes
we first analyzed the induction of apoptosis on resting and activated T cells from 10 different healthy donors after treatment for
24 h with 250 ng/ml recombinant TRAIL. As shown in Fig. 1A,
all of the resting and activated primary T cell samples were
resistant to TRAIL-induced apoptosis as assessed by sub-G1
DNA content. Moreover, we did not observe any effect on primary T cell viability after incubation either for 2 days or with
higher doses of TRAIL (data not shown). In this set of experiments, we used TRAIL-sensitive Jurkat cells as a positive control
(Fig. 1). We also examined the activation of apical caspase-8
as it is the first biochemical event that occurs upon ligation of
TRAIL receptors at the cell surface. To this end, we analyzed
the processing of the procaspase into the 43–41 kDa intermediate proteolytic fragments corresponding to the cleavage of
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Fig. 1. Primary T cells are resistant to TRAIL-induced apoptosis. (A) Resting and activated T cells from 10 different healthy donors were treated for 24 h with
250 ng/ml recombinant TRAIL. Apoptosis was assessed by analysis of the percentage of cells with sub-G1 content. (B) Resting and activated T lymphocytes were
incubated for 15 h with 250 ng/ml TRAIL and caspase-8 activation was determined by Western blot as described in Section 2. As a positive control, apoptosis (A)
and caspase-8 activation (B) were determined in Jurkat T cells after treatment with 100 ng/ml TRAIL. (C) Cell surface TRAIL receptors expression was analyzed by
flow cytometry in resting and activated T lymphocytes (shaded peaks). Solid lines represent background fluorescence with secondary antibody alone. (D) Expression
of FADD and c-FLIP was determined by Western blot in Jurkat, resting and activated T cells. ␣-Tubulin was used as a control of loaded protein. In B–D, results
shown are representative of at least three different donors.
procaspase-8a and -8b. Data presented in Fig. 1B shows that
TRAIL was not able to induce activation of caspase-8 in either
resting or activated primary T lymphocytes, which indicates an
apical block of the TRAIL signalling pathway in both types of
cells.
These results led us to examine the expression of proteins
known to participate in the formation of the DISC and thus
in the activation of caspase-8. Firstly, we analyzed the surface expression of TRAIL receptors in resting and activated
T lymphocytes. In agreement with previous data (Hasegawa et
al., 2004), we observed that the expression of death receptors
TRAIL-R1 and -R2, as well as decoy receptor TRAIL-R3, was
barely detectable in all analyzed resting T cells, with very weak
differences among donors. In contrast, when we examined the
expression of TRAIL-R4, two subsets of cells with different fluorescence intensities were detected (Fig. 1C). The highly positive
TRAIL-R4 peak seems to correspond to the CD8+ T cell subpopulation (Hasegawa et al., 2004; Mirandola et al., 2004) while
the less fluorescent peak, which varies from very low to moderate intensity among different donors, corresponds to CD4+ T
cells. T cell activation did not change significantly the expression of TRAIL receptors except for TRAIL-R4 (Fig. 1C). For
this receptor, we found a slight enhancement in the fluorescence
intensity of the two subpopulations, as well as an increase in the
percentage of TRAIL-R4 highly positive cells, which is likely
due to the observed increment of the CD8+ /CD4+ ratio within
the population of activated T cells compared to the resting one
(data not shown). Regarding the expression of intracellular proteins involved in the activation of caspase-8, we observed that
the levels of FADD in resting and activated T cells were similar
to that found in the TRAIL-sensitive Jurkat cell line (Fig. 1D).
However, it is also known that human T lymphocytes express
the inhibitory protein c-FLIP (Bosque et al., 2005; Schmitz et
al., 2003). When we compared the expression of this protein
between Jurkat and primary T cells we detected a much higher
level of the long isoform, c-FLIPL , in both resting and activated T
lymphocytes than in Jurkat cells. The expression of the c-FLIPS
isoform was low in primary T cells but barely perceptible in
Jurkat cells (Fig. 1D). Taken together, these results suggest that
several factors may be responsible for the resistance of resting
and activated T lymphocytes to TRAIL-induced apoptosis.
3.2. Effect of different modulators of TRAIL sensitivity on
the resistance of human primary T lymphocytes
Deregulated expression of TRAIL receptors and intracellular
antiapoptotic proteins seem to cause resistance to TRAILinduced apoptosis in several types of tumor cells, which reduces
the effectiveness of TRAIL in cancer therapy. However, most of
these TRAIL-resistant cancer cells can be sensitized by several
therapeutic approaches such as conventional chemotherapeutic drugs, histone deacetylase inhibitors (HDACi), inhibitors of
survival pathways or proteasome inhibitors (Inoue et al., 2004;
Kandasamy and Srivastava, 2002; Sayers and Murphy, 2006;
Shankar and Srivastava, 2004; Singh et al., 2003). We analyzed the effect of some agents belonging to these functional
groups on the resistance of primary T lymphocytes to TRAILmediated apoptosis. As shown in Fig. 2, we specifically tested the
genotoxic drug doxorubicin, the PI3K inhibitor LY294002, the
HDACi valproic acid (VPA), the microtubule depolymerizing
agent nocodazole and the proteasome inhibitor Velcade (bortezomib). Working concentrations of these agents were chosen
according to previous reports and on the basis of experiments
with the T-lymphoblastic leukemic CEM cell line and the breast
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Fig. 2. Primary T lymphocytes remain resistant to TRAIL upon treatment with different sensitizing agents. Resting and activated T lymphocytes were preincubated
with (A) 100 ng/ml doxorubicin (DXR), (B) 10 ␮M LY 294002 or (E) 50 nM bortezomib (BZ) for 1 h, or with (C) 1mM valproic acid (VPA) or (D) 400 ng/ml
nocodazole (NZ) for 7 h. After preincubation, cells were treated with or without 250 ng/ml recombinant TRAIL for 24 h. CEM (A–C) and SKBr3 (D and E) cells
were preincubated in the same conditions before treatment with 50 and 250 ng/ml recombinant TRAIL, respectively, for 20 h. The percentage of sub-G1 apoptotic
cells was determined by flow cytometry. Error bars show S.D. from three independent experiments. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001 by unpaired Student’s t-test
(two-tailed).
cancer SKBr3 cell line, which show a moderate sensitivity and
a high resistance to TRAIL, respectively. Pretreatment with
either doxorubicin, LY294002 or VPA increased the susceptibility of CEM cells to TRAIL while bortezomib and nocodazole
clearly sensitized TRAIL-resistant SKBr3 cells. However, we
did not find TRAIL sensitization in either resting or activated
T cells in response to pretreatment with any of the indicated
agents. Interestingly, doxorubicin, nocodazole and bortezomib
showed a remarkable toxicity against activated T cells, whereas
only bortezomib was slightly toxic to resting ones (Fig. 2A,
D and E).
3.3. NF-κB inhibitors sensitize human activated T
lymphocytes to TRAIL-induced apoptosis
In addition to the above agents, we also analyzed the effect
of the NF-␬B inhibitor BAY 11-7085. Data presented in Fig. 3A
indicates that the response of resting T lymphocytes to this
inhibitor varies among different donors. BAY 11-7085 alone was
toxic to varying degrees to 9/10 samples. Surprisingly, while
it caused a significant sensitization to TRAIL-induced apoptosis in 4/10 samples, in five different ones the percentage of
apoptotic cells decreased following treatment with both BAY
11-7085 and TRAIL compared to cells treated with the NF␬B inhibitor alone. In the case of activated T lymphocytes, a
variable toxicity was also found in response to BAY 11-7085
alone (Fig. 3B). However, we observed that preincubation with
the NF-␬B inhibitor induced a different but substantial sensitization to TRAIL-mediated apoptosis in all donors analyzed,
except for one in which the inhibitor alone showed an extreme
toxicity.
To further establish that the death process promoted by the
NF-␬B inhibitor was apoptosis, resting and activated T lymphocytes from donors previously proved to be sensitized to
TRAIL (Fig. 3A and B, respectively) were preincubated with the
general caspase inhibitor Z-VAD-FMK before treatment with
BAY 11-7085 and TRAIL. Representative samples in Fig. 3C
and D show that not only TRAIL-mediated cell death but also
the cytotoxic effect of BAY 11-7085 were almost completely
inhibited by Z-VAD. It is worth mentioning that Z-VAD was
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Fig. 3. BAY 11-7085 sensitizes activated T lymphocytes to TRAIL-induced apoptosis. Resting (A and C) and activated (B and D) T lymphocytes from 10 different
healthy donors (A and B) and one representative donor (C and D) were preincubated for 1 h with 2.5 ␮M BAY 11-7085 and then treated with or without 250 ng/ml
TRAIL for 24 h. In C and D, preincubation was carried out in the presence or in the absence of 50 ␮M Z-VAD. Apoptosis was determined by flow cytometry. Results
in C and D are representative of three different experiments. (E) Activation of caspase-8 was determined by Western blot in activated T lymphocytes incubated
with or without 250 ng/ml TRAIL for 20 h after pretreatment for 1 h with 2.5 ␮M BAY 11-7085. ␣-Tubulin was used as a control of loaded protein. Data shown are
representative of three different experiments.
not able to inhibit cell death in the samples in which BAY
11-7085 alone was extremely toxic (data not shown). This suggests that BAY 11-7085 may activate both caspase-dependent
and caspase-independent cell death signalling pathways in T
lymphocytes. On the other hand, we observed the processing
of apical procaspase-8 in response to TRAIL in activated T
lymphocytes preincubated with BAY 11-7085 (Fig. 3E), which
confirm the induction of the TRAIL signalling pathway in T
cells sensitized by treatment with the NF-␬B inhibitor.
To determine the specific involvement of NF-␬B in the mechanism of BAY 11-7085-induced sensitization, we examined
the effects of different NF-␬B inhibitors on the resistance of
activated T cells to TRAIL-mediated cell death. Sulfasalazine,
parthenolide and caffeic acid phenetyl ester (CAPE) have all
been reported to be specific NF-␬B inhibitors (Bork et al.,
1997; Natarajan et al., 1996; Wahl et al., 1998). We observed
that activated T lymphocytes were significantly sensitized to
TRAIL-induced apoptosis upon pretreatment with sulfasalazine.
However, parthenolide and CAPE showed a very week and no
effect, respectively, on the resistance to TRAIL (Fig. 4A). We
next confirmed that all these compounds effectively inhibited
NF-␬B at the concentrations used in this study. To this end, we
analyzed the presence of the p65 (RelA) and the p50 (NF-␬B1)
subunits of NF-␬B in nuclear extracts of activated T lymphocytes
following treatment with the NF-␬B inhibitors. Western blot
analysis showed that BAY 11-7085, sulfasalazine and parthenolide significantly reduced the levels of p65 and p50 in the nucleus
of activated T cells, while CAPE only had a slight effect on the
nuclear translocation of the NF-␬B subunits (Fig. 4B), which
may explain the lack of sensitization to TRAIL-induced apoptosis showed by this agent.
3.4. BAY 11-7085 regulates the expression of TRAIL
receptors and antiapoptotic genes in activated T
lymphocytes
The transcription factor NF-␬B has been reported to regulate
the expression of some TRAIL receptors as well as that of
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may be due to the long half-life of the protein (Reed, 1996). Altogether, regulation of these antiapoptotic proteins and changes in
the expression of TRAIL-R4, may account for the sensitization
of T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis observed in
response to NF-␬B inhibition.
4. Discussion
Fig. 4. Effect of different NF-␬B inhibitors on the resistance of activated T cells
to TRAIL. (A) Activated T cells were preincubated for 1 h with 1.5 mM sulfasalazine (SS), 2.5 ␮M parthenolide (PT) or 50 ␮g/ml CAPE, before treatment
with 250 ng/ml TRAIL for 24 h. Sub-G1 apoptotic cells were analyzed by flow
cytometry. Error bars show S.D. from three independent experiments. * p < 0.05
by unpaired Student’s t-test (two-tailed). (B) Expression of the p50 and p65 subunits of NF-␬B was determined by Western blot in nuclear extracts of activated
T cells after treatment for 4 h with the indicated inhibitors. PARP was used as
control of loaded protein. Results shown are representative of three independent
experiments.
several antiapoptotic proteins involved in TRAIL signalling
apoptotic pathway (Micheau et al., 2001; Ravi et al., 2001;
Stehlik et al., 1998; Wang et al., 1998). In order to understand
the mechanism for NF-␬B inhibition-induced sensitization of
human primary T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis,
we first analyzed the expression of TRAIL-R1, -R2 and -R4
on the surface of activated T lymphocytes upon treatment
with BAY 11-7085. As shown in Fig. 5A, we did not observe
any change in the expression of death receptors, although the
surface level of the antiapoptotic receptor TRAIL-R4 was
reduced in response to the NF-␬B inhibitor in all samples
analyzed. Moreover, when we determined the expression of
TRAIL receptors at the mRNA level we observed a clear
time-dependent down-regulation of all of them after treatment
with BAY 11-7085 (Fig. 5B). TRAIL-R3 expression was
undetectable at the mRNA level (data not shown).
We then examined the effects of BAY 11-7085 on the expression of different antiapoptotic genes, namely c-FLIP, Bcl-2,
Bcl-x, Mcl-1, XIAP, c-IAP1 and c-IAP2, in activated T lymphocytes. We found no marked changes in the mRNA levels
of c-FLIPL , Bcl-x and Mcl-1 for up to 9 h following treatment
with BAY 11-7085 (Fig. 5C). In contrast, a significant and timedependent decrease in the mRNA expression of c-FLIPS , Bcl-2,
XIAP, c-IAP1 and c-IAP2 was observed in T cells exposed to
the NF-␬B inhibitor (Fig. 5C). We further analyzed whether the
decrease of these antiapoptotic genes was paralleled by changes
in the levels of the corresponding proteins. Results in Fig. 5D
indicate that all the proteins analyzed, with the exception of
Bcl-2, were down-regulated after 24 h of treatment with BAY
11-7085. The absence of down-regulation of Bcl-2 at this time
The significance of TRAIL as an anti-cancer therapeutic
agent is supported by its known involvement in immune
surveillance against tumors. Surface expression of TRAIL is
upregulated in virtually all cell types of the immune system in
response to activation signals, mediating to a great degree the
cytotoxic activity of these cells (Fanger et al., 1999; Griffith
et al., 1999; Kayagaki et al., 1999; Kemp et al., 2004, 2005;
Takeda et al., 2001). The lack of toxicity to most normal cells
is an important feature for TRAIL to act as an anti-tumor agent
although the molecular mechanisms of TRAIL resistance in
normal cells are not completely understood. Here, we have
analyzed the response of resting and activated T lymphocytes
to TRAIL. We have shown for the first time that the TRAIL
signalling pathway is inhibited at the most apical level in both,
resting and activated T cells, as no caspase-8 activation was
observed in response to TRAIL. The analysis of the expression
of the most important proteins involved in the formation of the
DISC indicate that: (1) long-term T cell activation (day 6) does
not modulate the expression levels of FADD, caspase-8, c-FLIP
and TRAIL receptors, with the exception of TRAIL-R4; (2)
when comparison with the TRAIL sensitive Jurkat cells, the
expression of the antiapoptotic protein c-FLIP is much higher in
T lymphocytes than in this cell line; (3) the levels of expression
of TRAIL-R1, -R2 and -R3 receptors on the surface of T cells
are barely detectable while the expression of TRAIL-R4 shows
two peaks with low and high fluorescence intensity, respectively. From these data we can infer that several factors may be
responsible for the lack of caspase-8 activation upon treatment
with TRAIL and hence for the resistance of resting and
activated T lymphocytes to TRAIL-induced apoptosis. It has
been recently described that c-FLIP is involved the resistance of
NK cells to TRAIL-induced apoptosis (Mirandola et al., 2004).
Our results about the expression of c-FLIP, in agreement with
previous reports (Bosque et al., 2005; Mirandola et al., 2004;
Schmitz et al., 2003), suggest that this inhibitory protein could
also play a role in the resistance of T lymphocytes.
Regarding the expression of TRAIL receptors, there are some
discrepancies between authors. Previous studies have reported
that resting T cells do not show significant expression of TRAIL
receptors, with the exception of TRAIL-R4 on the CD8+ subpopulation (Hasegawa et al., 2004; Mirandola et al., 2004). However,
we have observed that the intensity of the TRAIL-R4 less fluorescence peak, which seems to correspond to the CD4+ cells,
may vary among donors. On the other hand, those reports show
that activation of CD8+ T cells up-regulate the expression of
either TRAIL-R1 and -R2 (Hasegawa et al., 2004) or TRAILR2, -R3 and -R4 (Mirandola et al., 2004) while no changes are
detected in the expression of TRAIL receptors upon activation
of CD4+ T cells (Hasegawa et al., 2004). In contrast to Miran-
2594
J.C. Morales et al. / Molecular Immunology 44 (2007) 2587–2597
Fig. 5. Expression of TRAIL receptors and antiapoptotic genes in activated T lymphocytes in response to BAY 11-7085. (A) Activated T cells were incubated with
(unshaded peaks) or without (shaded peaks) 2.5 ␮M BAY for 15 h and cell surface TRAIL-R1, -R2 and -R4 receptors expression was assessed by flow cytometry.
Dashed lines show background fluorescence with secondary antibody. mRNA levels of TRAIL-R1, -R2, -R4 (B), c-FLIPL , c-FLIPS , Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1, XIAP,
c-IAP1 and c-IAP2 (C) were determined in activated T cells after treatment with 2.5 ␮M BAY for 6 and 9 h by RT-PCR as described under Section 2. ␤-Actin was
used as control of RNA input. (D) Expression of c-FLIPL , c-FLIPS , Bcl-2, XIAP and c-IAP2 was analyzed by Western blot in activated T lymphocytes treated with
or without 2.5 ␮M BAY for 24 h. ␣-Tubulin was used as control of loaded protein. Data shown are representative of at least three independent experiments with
different donors.
dola et al., we have worked with the whole population of CD3+
T lymphocytes as CD4+ and CD8+ T cells subpopulations coexist and may influence each other in physiological conditions.
Moreover, not only CD8+ cytotoxic T cells but also CD4+ T
cells seem to be involved in antitumor immune response via
TRAIL (Dorothee et al., 2002; Kayagaki et al., 1999). Contra-
dictory data concerning the expression of TRAIL receptors in
activated T lymphocytes may also be due to differences in the
way of T cell activation. Independently of the reported profile of
TRAIL receptors expression, it is important to emphasize that
all studies agree in the resistance of activated T lymphocytes to
TRAIL-induced apoptosis.
J.C. Morales et al. / Molecular Immunology 44 (2007) 2587–2597
NF-␬B inhibition has been recently proposed as a mechanism
for sensitization of some tumor resistant cells to TRAIL-induced
apoptosis since this transcription factor is constitutively active
in certain tumors modulating the expression of several antiapoptotic proteins (Huerta-Yepez et al., 2004; Karacay et al., 2004;
Kasuga et al., 2004). Our findings reveal that several inhibitors
of NF-␬B are also able to sensitize activated T lymphocytes to
TRAIL-mediated apoptosis. Specifically, we have observed a
clear sensitization to TRAIL with the NF-␬B inhibitors BAY
11-7085 and sulfasalazine while the effect of parthenolide is too
low to be significant. As all these agents were able to inhibit the
translocation of p65 and p50 subunits to the nucleus, we speculate that the weak sensitization observed with parthenolide may
be due to the additional activities that have been reported for
this compound, such as JNK activation and STAT3 inhibition
(Nakshatri et al., 2004; Sobota et al., 2000), which can interfere
in some way with the signals derived from NF-␬B inhibition.
Interestingly, BAY 11-7085 reduces the mRNA expression of
TRAIL-R1 and TRAIL-R2 receptors in activated T lymphocytes, although we could not estimate this decrease at the level of
surface protein expression. Despite that the levels of death receptors are too low to be detected by FACS analysis, we have clearly
observed activation of the initiator caspase-8 in response to
TRAIL upon pretreatment of T lymphocytes with BAY 11-7085.
Thus, the above data suggest that TRAIL-R1, TRAIL-R2 or both
receptors must be present on the surface of activated T lymphocytes and are able to transmit the apoptotic signals. In addition,
we have demonstrated for the first time that NF-␬B inhibition not
only down-regulates the expression of TRAIL-R4 at the mRNA
level but also modestly reduces TRAIL-R4 expression at the cell
surface. TRAIL-R4 has been recently proposed to be a regulatory rather than a decoy receptor as it associates with TRAILR2 forming a ligand-independent, death-inhibitory complex
(Clancy et al., 2005). Moreover, authors demonstrate that this
complex regulates the sensitivity of CD8+ T cells to TRAILinduced apoptosis. Therefore, down-regulation of TRAIL-R4
by NF-␬B inhibition may be involved in the sensitization of
activated T lymphocytes to TRAIL. We have further observed
that BAY 11-7085 down-regulates the expression levels of some
antiapoptotic proteins known to be transcriptionally modulated
by NF-␬B, such as c-FLIPS , XIAP and c-IAP2. Although the
contribution of each factor in mediating TRAIL resistance of
activated T lymphocytes is unknown, the overall results provide
a mechanism for the sensitization of activated T lymphocytes
to TRAIL-mediated apoptosis by NF-␬B inhibition. Regarding
Bcl-2, even though there is a clear decrease of mRNA levels,
our findings suggest that this antiapoptotic factor must not be
involved in the effect of the NF-␬B inhibitor as the protein
levels do not change at the time we observe sensitization of T
lymphocytes.
Our data indicate that the response of resting T lymphocytes
to TRAIL-induced apoptosis upon NF-␬B inhibition vary among
different donors. While NF-␬B is actively involved in T cell proliferation and activation, only low levels of constitutive NF-␬B
binding activity are usually found in resting T cells. Moreover,
homodimeric complexes of the NF-␬B p50 subunit, which generally function as transcriptional repressors, have been reported
2595
to bind to the DNA in the nuclei of resting T cells, in sharp
contrast with the transcriptionally active p65/p50 heterodimers
found in activated T lymphocytes (Algarte et al., 1995; Kang et
al., 1992). These special features of NF-␬B activity in resting T
lymphocytes, together with individual singularities, may influence the effect of BAY 11-7085. Furthermore, TRAIL has been
reported to activate NF-␬B through TRAIL-R1 and TRAILR2 in many cell types (Franco et al., 2001; Hao et al., 2003;
Schneider et al., 1997). Our striking findings about the blockade
of cell death observed in some resting T cells upon treatment with
both, BAY 11-7085 and TRAIL, might be due to the activation of
NF-␬B by TRAIL, which could counteract the cytotoxic effect
of the NF-␬B inhibitor. It would be interesting to determine
whether NF-␬B activation is the predominant effect of TRAIL
receptors engagement in resting T lymphocytes. On the other
hand, although we have detected similar levels of pro- and antiapoptotic genes in resting and activated T lymphocytes (Fig. 1
and data not shown) it is known that only the last ones are able
to undergo activation-induced cell death (AICD) (Wesselborg
et al., 1993) indicating that different mechanisms of apoptosis
resistance work in both types of cells, which may also influence
the sensitization to TRAIL.
Although proteasome inhibitors block NF-␬B activation, we
have not observed any effect of either bortezomib or MG132 on
the resistance of T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis
(Fig. 2E and data not shown). This is not surprising as the biological effects of proteasome inhibitors are multiple and the final
result of all of them may be not suitable for the sensitization
of T cells to TRAIL. In spite of that, our results indicate that
bortezomib is highly toxic especially for activated T lymphocytes. Similarly, other modulators of TRAIL sensitivity in tumor
cells, such as doxorubicin and nocodazole, show a moderate
toxicity against activated T cells. In contrast, and in agreement
with previous reports, our findings suggest that HDAC inhibitors
may be a valuable therapeutic strategy to sensitize tumor cells
to TRAIL-induced apoptosis as they seem to be non-toxic and
they do not regulate TRAIL resistance in primary T cells (Inoue
et al., 2004). PI3K/Akt inhibitors may also be useful in the
treatment of tumors with high level of activity of this survival
pathway that seems to block the apoptotic signals derived from
TRAIL receptors engagement (Nam et al., 2003; Nesterov et al.,
2001).
NF-␬B activation is essential to numerous physiological processes and plays a crucial role in the immune response, e.g. in
lymphocyte proliferation and cytokine production, which suggests that general NF-␬B inhibitors will probably produce a
myriad of side-effects. In the present study, we have demonstrated that NF-␬B inhibitors not only sensitize primary activated
T lymphocytes to TRAIL-induced apoptosis but also show a
variable toxicity to resting and activated T cells. It is worth mentioning a recent report describing that the mechanism of TRAIL
resistance in normal human urothelial cells is mainly dependent
on the NF-␬B pathway (Steele et al., 2006). Together with these
data, our results suggest a likely role for NF-␬B in the resistance of some normal cells types to TRAIL-induced apoptosis
and challenge the use of NF-␬B inhibitors as a useful approach
in antitumor therapy.
2596
J.C. Morales et al. / Molecular Immunology 44 (2007) 2587–2597
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Ministerio de
Educación y Ciencia SAF2003-02486 (to C.R.-R.). J.C.M. was
supported by a fellowship from the Ministerio de Educación y
Ciencia. We would like to thank Dr. Abelardo López-Rivas and
Dr. F. Javier Oliver for invaluable advice and for the generous
donation of reagents.
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