PCR a tiempo real
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PCR A TIEMPO REAL María Maiques R4-Bioquímica Clínica 25-Abril-07 VEAMOS… Herramientas para detectar mutaciones Moléculas fluorescentes y tecnología FRET PCR a tiempo real: equipos y métodos de detección Interpretación de resultados Utilidades de PCR a tiempo real Ventajas y aplicaciones Conclusiones S Secuenciación Hib rida ció n SONDAS ESPECÍFICAS en e r G YBR COMPONENTES DE LA REACCIÓN SONDAS SYBRGreen ESPECÍFICAS FLUORESCENCIA *FLUORESCENCIA E Estado de Máxima Excitación Estados Intermedios CALOR Estado Fundamental Tiempo E = h/λ “Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)” FRET es un proceso por el cual un fluoróforo (DONADOR) en estado excitado, transfiere su energía a una molécula próxima (ACEPTOR) E3= h/λ3 E1= h/λ1 E1 > E2 > E3 λ1 < λ2 < λ3 E2= h/λ2 FRET se produce sólo si las dos moléculas (DONADOR Y ACEPTOR) están suficientemente juntas, disminuyendo su eficacia al aumentar la distancia entre ellas MÉTODOS DETECCIÓN: sybr-green SYBR Green I ELONGACIÓN • Unión inespecífica al DNAds • Requiere empleo curvas de melting • Emite señal intensa que aumenta proporcionalmente al producto acumulado ANÁLISIS DE RESULTADOS Umbral de detección Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o RNA de partida S Secuenciación Hib rida ció n SONDAS ESPECÍFICAS en e r G YBR COMPONENTES DE LA REACCIÓN Sondas específicas MÉTODOS DETECCIÓN: sondas FRET Fluorescein LC Red ANNEALING • Hibridación de sondas específicas, marcadas con 2 fluorocromos (donador y aceptor) • Su aproximación disminuye la fluorescencia emitida x el donador (FRET) MÉTODOS DETECCIÓN: sondas de hidrólisis (TAQMAN®) • Sondas específicas con un fluorocromo en cada extremo (Reporter y Quencher) • Apantallamiento cuando la sonda está intacta ELONGACIÓN INSTRUMENTACIÓN ANÁLISIS DE RESULTADOS Umbral de detección Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o RNA de partida S Secuenciación Hib rida ció n SONDAS ESPECÍFICAS en e r G YBR DISCRIMINACIÓN ALÉLICA Alelo normal o wild-type Alelo mutante DISCRIMINACIÓN ALÉLICA WILD-TYPE HETEROCIGOTO HOMOCIGOTO UTILIDADES DE LA PCRtr Í Detección de mutaciones, discriminación alélica Í Cuantificación - absoluta (patrón de diluciones estándar) - relativa (respecto a un control) Í Caracterización de productos de PCR UTILIDADES DE LA PCRtr Í Detección de mutaciones, discriminación alélica Í Cuantificación GENES DE REFERENCIA - absoluta (patrón de diluciones estándar) - relativa (respecto a un control) Í Caracterización de productos de PCR UTILIDADES DE LA PCRtr Gene Genomic structure / pseudogenes Regulation e.g. ß-actin ↑: hormones of tyroid gland ↑: stomach tumor 5.8S,18S, 28S RNA ß2-microglobulin multigene family; > 20 genes; 1 active locus 20 pseudogenes multigene family; pseudogenes multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse mostly pseudogenes pseudogenes no pseudogenes G6PDH no pseudogenes γ-actin GAPDH E S U G N PI ↑: lung, pancreatic, colon cancer ↑: insulin, EGF E E K ↑: Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors ↑: kidney, stomach tumor ↑: hormones, oxidant stress, growth factors O H Í Detección de mutaciones, discriminación alélica S E N GE PBGD aldolase HPRT U3, U8, ... ornithin decarboxylase ... no pseudogenes pseudogenes pseudogenes Pseudogenes ↑: tumors Cuantificación absoluta UTILIDADES DE LA PCRtr Í Detección de mutaciones, discriminación alélica Í Cuantificación - absoluta (patrón de diluciones estándar) - relativa (respecto a un control) Í Caracterización de productos de PCR Cuantificación relativa Ge n Re fe re ncia Gen Diana y = -1,0365x + 28,82 R = 0,9936 6 6 4 4 Log ng RNA 2 20 0 30 0 Ct 10 Log ng RNA 2 0 0 y = -0,7147x + 27,213 2 R = 0,9852 8 2 Ct 8 20 40 MUESTRAS Ct GD Ct GR ng GD ng GR GD/GR Ratio Cerebro 28.36 15.22 0.84 589 1.43* 10-3 1 Músculo 32.33 15.74 0.13 302 4.17*10-4 0.29 Hígado 20.71 15.12 33.11 661 5.01*10-2 35.08 Riñón 24.58 15.15 5.13 646 7.94 * 10-3 5.56 UTILIDADES DE LA PCRtr Í Detección de mutaciones, discriminación alélica Í Cuantificación - absoluta (patrón de diluciones estándar) - relativa (respecto a un control) Í Caracterización de productos de PCR Caracterización de productos de PCR Cada producto de PCR se caracteriza por su Tm (Tª a la que el 50% del DNA está en forma de cadena sencilla) Diferentes DNA tienen distintas Tm y productos no específicos Amplificación como dímeros DNA-primers también. Detección con SYBRGREEN La Tm varía con: La Tm depende de: ↓ GC 41 °C ↑ GC 50 pb 10 °C 10,000 pb Identificación del productode sales, MgCl , Sybr-green Concentración 2 Grado de homología entre la sonda y el DNA VENTAJAS DE LA PCRrt Amplificación específica Automatización y disminución del tiempo de análisis Reacción monitorizada a tiempo real No procesamiento post-PCR: no contaminación Ciclos de amplificación rápidos (<2h) Detección de cambios en la señal <2x Más específico, sensible y reproducible Coste similar a PCR convencional APLICACIONES DE LA PCRrt Determinación agentes patógenos Expresión génica en tejido en diferentes estadios de la enfermedad o tras tratamiento Deleción o amplificación de genes Discriminación alélica Diagnóstico clínico de tumores o respuesta a tto Genotipado, detección de SNPs, haplotipo Validación de resultados de experimentos con arrays Metilación de DNA y estudio de apoptosis Monitorización de patrones de expresión de citoquinas …CONCLUYENDO La baja probabilidad de contaminación, la exactitud de los resultados y la sencillez, rapidez y automatización del método, hacen de la PCRrt una técnica cada vez más utilizada en todos los laboratorios ¡MUCHAS GRACIAS!
