VI. Piruvato deshidrogenasa

VI. Piruvato deshidrogenasa
En los organismos aeróbicos el producto final de la glucólisis, el piruvato,
es finalmente degradado hasta CO2 y H2O. En las bacterias y las arkeas esto
ocurre en el mismo compartimento celular, mientras que en los eucariotes, el
piruvato debe entrar en la mitocondria para terminar de ser procesado.
La primer etapa en la degradación del piruvato implica su
descarboxilación oxidativa para rendir acetil-CoA, CO2 y un par de electrones
transportados como NADH. Esta reacción se lleva a cabo dentro del complejo
multienzimático de la Piruvato deshidrogenasa. Esta multi-enzima, cuyo
mecanismo de reacción se muestra más abajo, está formada por tres tipos
diferentes de enzimas. La primera (E1) es la piruvato descarboxilasa, que
contiene al pirofosfato de tiamina (TPP) como cofactor.
CH3
C
CoA
HS
S
O
CH3
CoA-SH
NADH
O
H
C
S
R2
C
E1-B-H
CH3
+
N R1
CH3
C
S
N
R2
+
C
E1-B : OH
O
CH3 C
C
C
R1
CH3
HS
S
E3-FAD
C O
O
+
E1-B :
O
C
HS
NAD+
S
R2
N
+
O
E3-FADH2
O
C
NH
NH
O
H
R1
E2 E2
E2
CH3
E2
NH
NH
C
O
CO2
O
S
OH
C
S
R2
S
H
OH
CH3 C-
CH3 C
C
..
N R1
CH3
S
R2
C
H
+
O
CH3 C
C
+
N R1
CH 3
S
R2
SH
S
N
+
R1
CH3
Al comienzo de este proceso el piruvato reacciona con el TPP generando
el derivado hidroxietil-TPP que se encuentra estabilizado por resonancia. La
segunda enzima (E2), la dihidrolipoil-transacetilasa, contiene una molécula de
ácido lipoico unida por un enlace amida a un resto lisina de la enzima. Esto
genera un gran brazo movil que puede interactuar con los tres sitios activos
alternativamente. Primero el ácido lipoico que contiene un enlace disulfuro se
reduce a ditiol, produciendo la oxidación del derivado hidroxietil-TPP a acetilTPP. Después, el ácido dihidrolipoico captura el grupo acetilo, liberando al TPP
unido a E1 que puede iniciar otro ciclo catalítico. E2, es capáz de transferir el
grupo acetilo desde el dihidrolipoico hasta la Coenzima A, liberando acetil-CoA
y el cofactor reducido. La oxidación del cofactor dihidrolipoico con la
+
recuperación del enlace disulfuro, requiere la intervención de la tercer enzima
(E3) que contiene una molécula de FAD íntimamente unida. Esta enzima, la
dihidrolipoil-deshidrogenasa, captura los electrones y protones del cofactor
dihidrolipoico y los transfiere finalmente a una molécula de NAD+ para generar
NADH y el cofactor de E2 en estado oxidado.
VII. Ciclo de Krebs
Las cuatro primeras reacciones del ciclo involucran un intermediario
fuertemente unido a la correspondiente enzima. Los tres primeros
intermediarios están señalados en la figura entre corchetes.
El ciclo de Krebs comienza con la reacción de condensación aldólica
entre el oxalacetato y el acetil-CoA.
En esta reacción el carbono metílico del acetil-CoA produce un ataque
nucleofílico sobre el átomo de carbono carbonílico (C2) del oxalacetato,
produciendo que uno de los enlaces de este carbono con oxígeno se desplace,
generando un oxhidrilo. Este tipo de reacciones de condensación son difíciles
de realizar y normalmente van acopladas a un proceso que libere energía. En
O
O
C
Acetil-CoA
S
CoA
C
HO C
O
O
C
C
O
C
SH
O
O
C
C
O
O
O
Citrato
Citril-CoA
CH2 O
C
HC
C
O
CH
O
C
H2O
CH2 O
O
C
CH2 O
H2O
O
O
C
H2O
CH2
HO C
O
O
CH2
C
CoA
O
CH2 O
C O
O
CoA
CH2
CH3
O
S
C
HO
O
O
C
O
CH
C
NAD+
O
NADH
+ H+
Cis-Aconitato
Isocitrato
Oxalacetato
Citrato-Sintasa
NADH
+ H+
Aconitasa
O
C
Malatodeshidrogenasa
NAD+
O
C
CH2 O
Isocitratodeshidrogenasa
HC
O
O
O
HC OH
CH2
C
O
Succinatodeshidrogenasa
O
Malato
Fumarasa
O
O
C
O
C
CH
H2O
CH
C
O
O
E-FADH2
O
Q
α-Cetoglutaratodeshidrogenasa
Succinil-CoA
tiokinasa
O
O
C
O
CH2
CH2
CH2
O
Succinato
Fumarato
C
O
C
C
O
Oxalosuccinato
CH2
C
E-FAD
O
ATP
O
C
O
CH2
CH2
O C
SH
C
CoA
NAD+
CoA
ADP CoA SH O
C
NADH
S
O
O
+ Pi
+ H+
CO2
Succinil-CoA
α-Cetoglutarato
QH2
este caso el proceso es la hidrólisis del enlace C-S de un tioéster en el
intermediario citril-CoA. El producto de esta reacción, el citrato, es un ácido
tricarboxílico ramificado y simétrico con respecto a dos de los sustituyentes del
CO2
C3. Uno de esos dos sustituyentes contiene el grupo carboximetilo proveniente
del acetilo del acetil-CoA. En la etapa siguiente se produce una isomerización
para convertir al citrato en isocitrato. A primera vista parecería que los dos
átomos de C hacia donde puede migrar el oxidrilo (el C2 o el C4) son
equivalentes. Sin embargo, la enzima que cataliza la reacción de isomerización
(aconitasa) es capaz de reconocer los dos grupos diferentes. Para que esto
suceda es necesario que el sitio activo de la enzima posea la asimetría que el
sustrato no posee. El mecanismo de esta reacción es simplemente una
deshidratación seguida de un hidratación. Los átomos que se pierden en la
deshidratación del citrato son el oxidrilo unido al C3 y un proton del metileno del
carbono que está en posición C4 en el dibujo. Este carbono correspondía al C
metilénico (C3) de la molécula del oxalacetato. La rehidratación puede suceder
en la misma posición mencionada, regenerando el citrato, o a la inversa (el
proton sobre el C3 y el oxidrilo sobre el C4), produciendo el isocitrato. El
producto de esta reacción es un ácido orgánico que tiene un oxidrilo unido a un
carbono α con respecto a un grupo carboxilo. Esta estrategia de generar un αhidroxiácido es muy común en el metabolismo debido a que estos pueden ser
oxidados muy fácilmente a α-cetoácidos y estos transaminados a αaminoácidos. El cis-aconitato, intermediario de esta reacción, muy rara vez
abandona el sitio activo de la enzima.
La siguiente reacción, catalizada por la isocitrato deshidrogenasa,
involucra dos etapas, la primera de oxidación y la segunda de descarboxilación
de la molécula de isocitrato. El producto de la primer etapa es un ácido
tricarboxílico muy inestable, el oxalosuccinato, que se descarboxila
rápidamente para producir un ácido dicarboxílico de 5 C, el α-cetoglutarato y
CO2. La descarboxilación se produce sobre el átomo de C carboxílico unido al
carbono ternario (C3) del isocitrato.
La siguiente reacción involucra la descarboxilación y la oxidación de un αcetoácido, el α-cetoglutarato. Esta reacción es totalmente análoga a la reacción
de la piruvato deshidrogenasa, y la enzima α-cetoglutarato deshidrogenasa
posee el mismo tipo de actividades enzimáticas y cofactores que ella.
Por lo mismo, los sustratos de esta reacción son el α-cetoácido, el NAD+ y
la coenzima A, mientras que los productos serán NADH, CO2 y el succinil-CoA.
Este último es el acil derivado de la CoA con el resto de los carbonos del αcetoácido utilizado como sustrato. Análogamente al caso anterior, el átomo de
C que lleva el grupo ceto del α-cetoácido es oxidado y termina involucrado en
un enlace tioéster con la CoA.
Al finalizar esta reacción ya se han eliminado dos moléculas de CO2 por
cada acetil-CoA procesado. Sin embargo, los carbonos que se eliminan como
CO2 no son los mismos que se incorporaron al ciclo como acetil-CoA (ver en la
figura las conversiones que sufren los C de color, verde por carboxilato y
morado por metilo, del acetil-CoA). Además, sólo aproximadamente la mitad de
la energía que se incorporó en la molécula de acetil-CoA se ha logrado extraer
hasta el momento. Las siguientes etapas, involucran la conversión del succinilCoA en oxalacetato, para regenerar el primer compuesto del ciclo, y la
recuperación del resto de la energía aportada por el acetil-CoA.
El enlaces tioéster del Succinil-CoA, como todos los tioesteres de ácidos
orgánicos, es un enlace de alta energía. Esta energía es utilizada, en la célula
para acoplar la reacción de eliminación del tioéster con la síntesis de ATP (o
GTP en mamíferos). La reacción involucra el intercambio de la Coenzima A por
fosfato inorgánico en el carboxilo del ácido, produciendo un acil-fosfato en el
sitio activo de la enzima succinil-CoA-tiokinasa. Este fosfato es generalmente
transferido a un aminoácido del sitio activo de la enzima y luego al ADP para
sintetizar ATP. Este proceso de síntesis de ATP es de fosforilación a nivel de
sustrato para diferenciarlo de la fosforilación oxidativa que se produce en la
membrana de la mitocondria o de la bacteria acoplada a la transferencia de
electrones al O2 (u otro aceptor final) en la cadena de transporte. De esta
manera la reacción de hidrólisis del succinil-CoA se encuentra acoplada a la
síntesis de ATP.
El producto de la reacción anterior, el succinato, es un ácido dicarboxílico
de cuatro carbonos con el resto de sus carbonos en el mayor estado posible de
hidrogenación (o de reducción). En las reacciones siguientes se debe convertir
uno de los metilenos del succinato en un carbonilo del oxalacetato. Este tipo de
reacciones de oxidación ocurren en otras rutas metabólicas y todas ellas se
realizan en varias etapas que siguen un patrón común de diseño metabólico. El
grupo que termina oxidándose a carbonilo es, en general, un oxidrilo. La
molécula que aporta el átomo de oxígeno necesario para estas oxidaciones, no
es el oxígeno molecular sino más bien, es la molécula de H2O. Además, es
relativamente sencillo incorporar una molécula de H2O a una molécula orgánica
por hidratación de un doble enlace como ya hemos visto que ocurre en el caso
de la aconitasa, o en el mecanismo de acción de la mayoría de las isomerasas.
Por todo ello, la primer etapa consiste en la generación de un doble
enlace entre los dos metilenos del succinato, mediante una reacción de
deshidrogenación. Este tipo de reacciones requieren de un oxidante fuerte para
su realización, por lo que en esta etapa no se utiliza el NAD+ 1como coenzima.
De hecho, la enzima que cataliza esta reacción, la succinato deshidrogenasa,
está firmemente unida al grupo prostético FADH2, que finalmente transfiere los
electrones a la coenzima Q para rendir QH2 2. Esta enzima es un componente
integral de la membrana (de la mitocondria en los eucariotes o de la plasmática
en otros microorganismos) que se encuentra intimamente asociada con otros
componentes de la cadena de transporte como veremos en el próximo teórico.
El fumarato, producto deshidrogenado de la succinato deshidrogenasa, es
hidratado por acción de la enzima fumarasa para rendir L-malato, el cual a su
vez es oxidado por la malato deshidrogenasa para obtener el oxalacetato. En
1
Tener en cuenta que si el NADH es un reductor más poderoso que el FADH2, el NAD+ deberá ser un
oxidante más debil que el FAD.
2
En muchos libros de texto se encontrarán con que el producto final de la succinato deshidrogenasa es el
FADH2, sin embargo, esta coenzima jamás se libera del sitio activo de la enzima y, para que la enzima
vuelva a su estado original y que pueda actuar en otra reacción de deshidrogenación, el FADH2 debe ser
reoxidado a FAD por la coenzima Q. Esta se convierte en QH2 que si se libera de la enzima. Tanto Q
como QH2 son formas de la coenzima Q solubles en la membrana donde está insertada la succinato
deshidrogenasa y pueden transferir su poder reductor a otros aceptores, no nesesariamente relacionados.
De esta manera, en la membrana plasmática, la coenzima Q cumple funciones análogas a las del NADH
en solución. Nosotros consideraremos a la coenzima Q como uno de los productos finales de esta
reacción, lo que para los cálculos estequiométricos es totalmente equivalente a la consideración del FAD
antes mencionada.
esta última reacción la coenzima interviniente es el NAD+, por lo que se obtiene
otro NADH.
Los intermediarios del ciclo de Krebs pueden ser utilizados como
precursores de otras sustancias. Por ejemplo, el oxalacetato es el precursor de
la síntesis de glúcidos y de los aminoácidos de la familia del aspartato, el αcetoglutarato lo es de los aminoácidos de la familia del glutamato y el succinilCoA es el precursor del hemo y sus derivados.
En resumen, por cada vuelta del ciclo se han utilizado un acetilo del acetilCoA, y se han liberado 2 CO2, 3 NADH, 1 QH2 y se ha sintetizado una molécula
de ATP (o GTP) por fosforilación a nivel de sustrato. Las coenzimas reducidas
serán canalizadas más adelante por la cadena de transporte de electrones
hasta un aceptor final. En los organismos aeróbicos reducirán el O2 a H2O.
VIII. Ciclo del glioxilato
A pesar de que a partir del oxalacetato se puede obtener glucosa, y que
mediante el funcionamiento del ciclo los carbonos del acetil-CoA quedan
incorporados en la molécula de oxalacetato, no es posible realizar la síntesis
neta de esta molécula a partir de acetil-CoA. Esto se debe a que cada dos
carbonos que se incorporan en el ciclo como acetil-CoA, otros dos se pierden
en forma de CO2 antes de su conversión en oxalacetato. Por lo mismo, si
quitamos una molécula de oxalacetato para canalizarla hacia la síntesis de
glúcidos, estaremos eliminando moléculas capaces de realizar el ciclo de
Krebs, o visto de una forma más intuitiva, disminuiremos el número total de
ciclos que están en funcionamiento en un momento dado en la célula. En
cambio, si es posible realizar la síntesis neta de oxalacetato (y por consiguiente
de glucosa) si agregamos alguno de los intermediarios del ciclo, como sucede
con las reacciones de recomposición del ciclo a partir de aminoácidos.
Los ácidos grasos forman la reserva energética más abundante para
muchos organismos y, en su degradación, rinden prácticamente en forma
cuantitativa acetil-CoA. Por lo mismo, aunque puede extraerse mucha energía
de ellos mediante la descarboxilación del acetil-CoA, es imposible para la
mayoría de los organismos utilizar los ácidos grasos para obtener azúcares.
Sin embargo, las plantas y algunos microorganismos si tienen esa
capacidad. Para ello, utilizan una serie de reacciones muy similar a las del ciclo
de Krebs en las que se rodean las reacciones de descarboxilación y por medio
de las cuales se produce la síntesis neta de un intermediario de ese ciclo.
Estas reacciones tienen un único intermediario diferente al ciclo de Krebs, el
compuesto de dos carbonos denominado ácido glioxílico, que es el que le da el
nombre al ciclo que se muestra en la figura.
En esta ruta el isocitrato es procesado por una enzima que cataliza su
escición en una molécula de cuatro C (el succinato) y en otra de dos C (el
glioxilato). Esta escición es una reacción de condensación/ruptura aldólica del
mismo tipo de la de la citrato sintasa y en ambas intervienen (o se producen)
una molécula de cuatro y otra de dos carbonos. Sin embargo, el enlace que se
rompe en esta reacción es diferente al que se había formado por la citrato
sintasa. Estos dos enlaces (el formado por la citrato sintasa y el desarmado en
la isocitrato liasa) son los únicos que pueden utilizarse en este tipo de ácidos
tricarboxílicos ramificados en el C3, para generar un compuesto C4 más uno
C2.
El glioxilato se condensa con el acetil CoA, para dar malato. La reacción,
O
O
C
Acetil-CoA
S
C
CoA
C
HO C
O
C
O
CH2
O
O
C
SH
CoA
HO C
H2O
O
C
C
C
O
O
NAD +
O
C
O
CoA
HC OH
CH2
C
O
C
C
H
O
C
SH
Malato Sintasa
S
Malato Sintasa
S
O
C
O
Isocitrato
O
Isocitrato
Liasa
O
C
O
Acetil-CoA
O
O
C
O
C
O
E-FADH2
CH2
C
E-FAD
QH2
catalizada por la malato sintasa, tiene el mismo mecanismo de reacción que la
de la citrato sintasa produciendo un intermediario de acil-CoA unido a la
enzima. La reacción neta puede ser calculada considerando las siguientes
hemi-rreacciones:
1.
oxalacetato + Acetil-CoA + H2O → isocitrato + CoA-SH
2.
isocitrato → glioxilato + succinato
3.
succinato + Q + H2O → malato + QH2
4.
glioxilato + Acetil-CoA + H2O → malato + CoA-SH
5.
malato + NAD+ → oxalacetato + NADH + H+
O
Succinato
Fumarato
Q
O
CH2
O
CH
C
O
Succinatodeshidrogenasa
CH
Fumarasa
H2O
CoA
C
O
O
O
C
CH
CH2
CH2
CoA
O
H
H
HC OH
Malil-CoA
Malato
O
Aconitasa
O
H2O
CH2 O
Cis-Aconitato
Glioxilato
Malatodeshidrogenasa
O
HC
O
O
NADH
+ H+
C
C
CH
Citrato
O
H2O
CH2 O
O
C
Citrato-Sintasa
Oxalacetato
O
C
H2O
CH2 O
O
Citril-CoA
O
O
O
CH2
C
CH2 O
C O
C
O
CoA
CH2
CH3
O
S
Como se producen dos moléculas de malato (reacciones 3 y 4) la
reacción 5 debe ser multiplicada por dos. Por ello, sin considerar las
coenzimas, si partimos de una molécula de oxalacetato al finalizar una vuelta al
ciclo, haremos reaccionar dos moléculas de acetil-CoA y obtendremos dos
moléculas de oxalacetato como productos finales. Simplificando, a partir de dos
acetil-CoA se obtendrá 1 molécula de oxalacetato en lugar de 4 CO2 que es el
producto del ciclo de Krebs.
La reacción global en cada caso y puestas en igualdad de condiciones,
será:
Krebs
2 acetil-CoA + 6NAD+ + 2Q + 2ADP + 2Pi + 4H2O → 4CO2 + 6NADH + 6H+ + 2QH2 + 2ATP + 2CoA-SH
Glioxilato
2 acetil-CoA + 2 NAD+ + Q + 3 H2O → oxalacetato + 2 NADH + 2 H+ + QH2 + CoA-SH
El oxalacetato generado por el ciclo del glioxilato en forma neta, puede
ser utilizado como precursor de glúcidos. Las semillas de las plantas, ricas en
reservas de ácidos grasos, tienen la capacidad, durante la germinación, de
realizar esta conversión, para lo que poseen las enzimas necesarias en una
organela especial, el glioxisoma. Este mecanismo no existe en la planta adulta.