Capítulo III: Determinación de la capacidad

Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
3.1.- Introducción
Se cree que los antioxidantes son esencialmente importantes por la capacidad que tienen
de proteger a las macromoléculas biológicas contra el daño oxidativo. Entre los más
conocidos figuran los tocoferoles, el ácido ascórbico, los flavonoides, antocioaninas,
carotenoides y ácidos fenólicos [1].
Uno de los procedimientos más aplicados por la comunidad científica para evaluar la
actividad antioxidante, es el método del DPPH. Este es un método espectrofotométrico
en el que se utiliza el radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, que tiene un
fuerte color violeta y una intensa banda de absorción a 515 nm. Cuando una solución de
DPPH se mezcla con una sustancia que puede donar átomos de hidrógeno, capaz de
estabilizarlo, el color violeta intenso decae a un color residual amarillo pálido del grupo
picril aún presente, con la consecuente disminución de la absorbancia [2].
Estudios recientes vinculados a la capacidad antirradicalaria de extractos simples de
hoja y madera de olivo señalan a los extractos de madera con acetato de etilo y etanol,
en ese orden, como los responsables de la mejor capacidad de captura del RL DPPH. En
tanto, para la hoja, el etanol fue el solvente que generó el extracto de mayor actividad
antioxidante [3].
La presente investigación pretende evaluar la actividad antirradicalaria de extractos de
hoja y madera de olivo de la variedad Arbequina, procedente del Valle Central de
Catamarca, a través del método basado en la determinación del porcentaje de inhibición
de radicales libres, usando como radical modelo el compuesto 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH).
3.2.- Objetivos del presente capítulo

Determinar la capacidad de captura de radicales libres de los extractos de hojas y
madera derivados de la poda de olivos de la variedad Arbequina, aplicando el
método del DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo).

Comparar la capacidad de captura de radicales libres de los extractos obtenidos
según el material vegetal, el solvente empleado y la concentración de los
extractos entre sí y con otros antioxidantes.
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3.3.- Materiales y métodos
3.3.1.- Preparación de las muestras
Método modificado de reducción del radical 2,2-difenil-1-picrihidracilo (DPPH), según
Brand-Willians W. et al (1995) [4].
Reactivos:
2,2-difenil-1-picrihidracilo (DPPH)
Metanol absoluto
Agua bidestilada
Solución de etanol acuoso al 50%
Acetato de etilo
Extractos hoja- etanol 50% (EHE)
Extractos hoja- acetato de etilo (EHAc)
Extractos madera- etanol 50% (EME)
Extracto madera- acetato de etilo (EMAc)
I. Preparación de solución stock de DPPH
Se pesan con precisión de 0,1 mg una masa de 0,05 g de DPPH en vaso de precipitado
previamente tarado. Se disuelve en metanol grado analítico, se trasvasa a matraz aforado
de 25 ml y se enrasa para conseguir una solución de 5,07 x 10-3 M. La solución se
almacena en recipiente ámbar, recubierto en papel aluminio a 0 ºC [5].
II. Preparación de solución estándar de DPPH
A partir de la solución stock de DPPH se prepara una solución de 7,4 x 10-5 M
[3]
en
metanol grado analítico. La solución se coloca en recipiente ámbar, recubierto en papel
aluminio a 0 ºC. La solución estándar de DPPH debe ser preparada en momentos
previos de su utilización y no ser sometida a un almacenamiento superior a las seis
horas, debido a que se produce una disminución en la absorbancia de la disolución,
hecho que esta relacionado con la reducción de las moléculas de radical libre [5].
III. Preparación de las disoluciones de extracto fenólico
Se preparan, por quintuplicado, soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto a partir
de los extractos de hoja y madera por separado.
Se obtienen las soluciones de 600 ppm en extracto, diluyendo y enrasando con etanol
acuoso al 50%. Para la preparación de las soluciones de 300 y 100 ppm en extracto se
diluye la solución de 600 ppm enrasando con etanol acuoso al 50%.
Para obtener las soluciones con acetato de etilo absoluto se sigue la misma metodología
enrasando con este solvente (Anexo 4; Fotos A.4.33 a A.4.36).
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3.3.2.- Determinación de la capacidad antirradicalaria
Para cada extracto de hoja y madera de olivo se sigue la metodología que se detalla a
continuación, siendo la misma una modificación del procedimiento descripto por von
Gadow et al., (1997) [6].
Se coloca en celda de vidrio la disolución estándar de DPPH y se mide inmediatamente
su absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 515 nm. Respetando una
relación extracto: DPPH 1,6:1, se miden 0,187 ml de la disolución de extracto
concentrado (soluciones de extracto a 100, 300 o 600 ppm según corresponda), se
coloca en vaso de precipitado de 50 ml y se adicionan sobre el mismo 4 ml de
disolución estándar de DPPH. Se homogeniza la mezcla y se coloca rápidamente en
celda de vidrio. Finalmente se sigue la cinética de reacción de la mezcla durante 30
minutos leyendo las absorbancias en un espectrofotómetro a 515 nm (Anexo 4; Fotos
A.4.37 a A.4.42).
Se calcula el porcentaje de inhibición de radicales libres (PI) de cada uno de lo extractos
según la siguiente expresión:
Cálculo: PI = [(At = 0 min - At =15 min) / At = 0 min] x 100
Donde: PI: Porcentaje de inhibición.
At = 0 min: Absorbacia inicial del DPPH.
At =15min: Absorbacia a los 15 minutos de producida la mezcla de extracto:DPPH.
3.4.- Resultados y discusión
3.4.1.- Comportamiento de los extractos de hojas
En la tabla 3.1 se exponen los resultados de los máximos, mínimos, medianas,
promedios, desviaciones estándar y los coeficientes de variación de cinco repeticiones
de los PI de radicales libres DPPH, de los dos extractos de hojas de olivo evaluados.
Concentración en extracto (ppm)
Medidas
descriptivas
100
300
600
Extractos
HE
HAc
HE
HAc
HE
HAc
92,34
51,84
94,19
95,03
93,42
95,12
Máximo
88,90
44,99
91,48
92,64
92,02
91,63
Mínimo
91,55
50,27
92,61
94,16
92,54
91,86
Mediana
91,21
49,00
92,70
93,96
92,68
92,82
Media
1,36
2,73
0,93
0,87
0,53
1,56
DE
1,49
5,57
1,00
0,93
0,57
1,68
CV %
Tabla 3.1. Medidas descriptivas de los PI de extractos etanólicos y con acetato de etilo de hojas de
olivo para 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH = 1,6:1; 15 min.).
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Cinco de las seis soluciones de extractos de hoja de olivo de la variedad Arbequina
analizadas (HE 100, 300 y 600 ppm y HAc 600 y 300 ppm), presentan un efecto
inhibitorio del RL DPPH superior al 90% (Tabla 3.1) y en consecuencia predicen una
elevada capacidad antioxidante. Comparados éstos con la capacidad de captura de
radicales libres DPPH de soluciones de 500 ppm de BHA que registra un PI medio de
83,6 % y de BHT que sólo alcanza a inhibir el 50,3% de los radicales libres a los quince
minutos de iniciado el ensayo [7], se pone en evidencia la alta capacidad de capturar RL
DPPH de los extractos de hoja en ambos solventes. El extracto con menor rendimiento
es HAc 100 ppm que a los quince minutos de iniciado el ensayo alcanza a inhibir el
50,27% de los radicales libres. Sin embargo, presenta mayor poder de inhibición que el
BHT a 250 ppm
[7]
, que manifiesta un PI de 28,6%. Por su parte, el extracto con la
mejor respuesta es HAc 300 ppm con un PI equivalente a 94,16%, seguido por los
extractos HE a la misma concentración, HE 600 ppm, HAc 600 ppm y HE 100 ppm.
Al comparar estadísticamente, mediante la prueba de Kruskal Wallis, las medianas de
los extractos con PI superiores al 90%, se revela que el extracto HE 100 ppm muestra
un PI de RL DPPH significativamente menor que el extracto HAc 300 ppm (p<0,0278)
(Tabla 3.2). Mientras que, entre el resto de los extractos, el análisis no acusa la
influencia del solvente ni las concentraciones ensayadas sobre el comportamiento
antirradicalario de los extractos de hoja de olivo (Anexo 3; Tabla A.3.13).
Evidentemente, a elevadas concentraciones en extracto, los compuestos obtenidos a
partir de los extractos etanólicos y con acetato de etilo de hojas de olivo, presentan
mayor actividad en la matriz metanólica de radicales libres DPPH y por tanto exhiben
mayor capacidad antioxidante.
Extractos
Medianas*
HE 100 ppm
91, 55 A
HE 300 ppm
92,61 AB
HE 600 ppm
92,54 AB
HAc 300 ppm
94,16 B
HAc 600 ppm
91,86 AB
* Letras distintas indican diferencias significativas al 5%
Tabla 3.2. Medianas de los PI de extractos etanólicos de hojas de olivo a 100, 300 y 600 ppm y
extractos con acetato de etilo de hojas de olivo a 300 y 600 ppm.
En el gráfico 3.1 se presentan los resultados de la mediana de cinco repeticiones de la
capacidad antioxidante, expresada como el PI calculado a los quince minutos de
producirse la mezcla extracto: DPPH, en una proporción 1,6:1, de los dos extractos de
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hojas de olivo a las tres concentraciones evaluadas (100, 300 y 600 ppm). En tanto que,
en el gráfico 3.2 se exponen los valores, pero en relación a los solventes empleados.
91,86%
Concentración/ ppm
600
92,54%
94,16%
300
92,61%
50,27%
100
HAc
91,55%
HE
PI
Gráfico 3.1. Actividad antioxidante de los extractos de hojas de olivo expresada en términos de
medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH= 1,6:1; 15 min.).
A 600 y 100 ppm son los extractos etanólicos los que muestran mayor capacidad de
capturar RL de DPPH. A 600 ppm el extracto HE presenta una actividad 0,73% superior
a HAc, mientras que a 100 ppm los extractos etanólicos superan a los extractos de
acetato de etilo en un 45,09%, comportamiento que puede explicarse, si se tiene en
cuenta que estos extractos presentan una proporción superior al 60% en ODF;
estructuras químicas relacionadas, según diferentes fuentes, con la bioactividad de los
compuestos fenólicos
[3]
[10]
. Esto coincide con lo reportado por Pérez Bonilla et al (2003)
, quienes concluyen que para las hojas de olivo, el etanol fue el solvente que generó el
extracto de mejor actividad antioxidante. A pesar de esto, a 300 ppm es el extracto con
acetato de etilo el que tiene el mejor PI, con una actividad antirradicalaria de un 1,65%
superior a la del EHE, destacándose por sobre los demás extractos, aunque la diferencia
con el extracto etanólico a igual concentración es despreciable (Tabla 3.2). Puede
notarse, de acuerdo a los porcentajes presentados, que al disminuir las concentraciones
en extracto las diferencias en la capacidad de capturar radicales libres por parte de los
extractos en los distintos solventes se va haciendo más evidente.
Se esperaría observar una actividad antioxidante relativa a las concentraciones de
ensayo, sin embargo, probablemente por causa de la abundante concentración fenólica
de los extractos no puede distinguirse tal comportamiento
[8; 9]
. Las disoluciones
etanólicas de 600, 300 y 100 ppm en extracto poseen una cantidad tan elevada de
fenoles que aún a 100 ppm, la capacidad inhibitoria del extracto es próxima a la de las
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concentraciones superiores. Mientras tanto, los extractos con acetato de etilo que
presentan una concentración de fenoles importante, pero significativamente inferior a la
de los etanólicos, ponen en evidencia recién a 100 ppm la incidencia de la disminución
de la concentración de los extractos sobre la capacidad inhibitoria de radicales libres
DPPH, ya que el PI disminuye respecto al PI del extracto a 600 ppm, en 1,87 veces.
En el gráfico 3.2, se observa claramente que los extractos etanólicos de hojas de olivo, a
las tres concentraciones evaluadas, manifiestan una respuesta prácticamente idéntica
frente al sistema de prueba radicalaria DPPH, registrándose PI próximos entre sí. Este
hecho confirma, además de lo argumentado anteriormente en cuanto a la concentración
de fenoles y a la influencia de mayor proporción de ortodifenoles de los extractos
etanólicos sobre la actividad antirradicalaria, un comportamiento ligado a la naturaleza
de los CF extraídos. Por su parte, los extractos con acetato de etilo, que presentan menor
contenido en fenoles que los extractos etanólico, exhiben un comportamiento
diferenciado. A 300 y 600 ppm los PI son próximos entre sí y a su vez el extracto HAc
300 ppm resulta ser el mejor de los extractos de hojas evaluados. Mientras que, a 100
ppm se observa una actividad antioxidante notablemente inferior a la de los extractos
más concentrados de acetato de etilo y a los extractos etanólicos (Gráfico 3.1). Es decir,
que en los extractos de acetato de etilo se encuentra el más activo y el menos eficaz de
todos los extractos foliares ensayados, dependiendo de la concentración en extracto
empleada.
91,86%
HAc
600 ppm
300 ppm
100 ppm
94,16%
Extractos
50,27%
92,54%
HE
92,61%
91,55%
PI
Gráfico 3.2. Actividad antioxidante de los extractos de hojas de olivo en función de los solventes de
extracción, expresada en términos de medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH= 1,6:1;
15 min.).
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Para ambos solventes, los mayores PI se registran a 300 ppm, lo que permite suponer
que para la relación estequiométrica extracto:DPPH utilizada esta concentración resulta
ser la más apropiada y permite que los antioxidantes presentes en los extractos
manifiestan de mejor forma su poder inhibitorio. A pesar de ello no se encuentran
diferencias con los extractos de 600 ppm.
Por lo expuesto, se puede señalar que las concentraciones en extracto aplicadas tienen
incidencia en la evaluación de la capacidad antioxidante, pero no sería este factor el
responsable absoluto de la actividad inhibitoria de los extractos. Los resultados
obtenidos evidencian además que la naturaleza química de tales extractos tiene una
marcada influencia en la actividad antiradicalaria, si se considera que los solventes
empleados, de polaridades distintas, extraen de acuerdo al fenómeno de partición,
compuestos activos con diferentes capacidades de inhibir la actividad radicalaria.
En los gráficos 3.3 y 3.4 se presentan la disminución de las medianas de la absorbancia
a través del tiempo de las mezclas de DPPH con los extractos en etanol: agua y en
acetato de etilo a 100, 300 y 600 ppm. Mientras que, en las tablas 3.3 y 3.4 se detallan
las lecturas de las mediciones de absorbancia (A) efectuadas cada 36 segundos durante
los treinta minutos que dura el ensayo y los valores de PI correspondientes a dichas A.
HE 600 ppm
0,90
HE 300 ppm
0,80
Absorbancia 515 nm
HE 100 ppm
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0
500
1000
1500
2000
Tiempo/s
Gráfico 3.3. Medianas de las absorbancias, en función del tiempo, de las mezclas extracto:DPPH =
1,6:1 de las soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto de hojas de olivo con etanol al 50%.
En el gráfico 3.3 puede notarse el comportamiento instantáneo del extracto etanólico de
600 ppm, que a los 5 segundos de iniciada la reacción pasa de tener una absorbancia de
0,727 a 0,080, inhibiendo casi un 90% (89,15%) del DPPH. Si bien la capacidad
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antioxidante de los extractos de 300 y 100 ppm, evaluada para el mismo tiempo, es
inferior a la del extracto de 600 ppm, éstos son excelentes inhibidores de RL DPPH.
Tabla 3.3. Absorbancia y PI de los tres extractos etanólicos de hojas de olivo a lo largo de 30’.
Mediana A
Mediana PI
Tiempo (segundos)
600 ppm 300 ppm 100 ppm 600 ppm 300 ppm 100 ppm
0
0,727
0,731
0,739
0,00
0,00
0,00
5
0,080
0,233
0,383
89,15
68,13
48,89
41
0,059
0,102
0,297
91,99
86,05
60,77
77
0,057
0,067
0,238
92,27
90,83
68,16
113
0,056
0,063
0,196
92,40
91,38
73,48
149
0,055
0,060
0,168
92,54
91,76
77,27
185
0,056
0,058
0,148
92,54
92,03
79,97
221
0,055
0,056
0,132
92,54
92,31
82,14
257
0,055
0,056
0,120
92,54
92,31
83,57
293
0,055
0,055
0,111
92,54
92,45
84,82
329
0,055
0,055
0,103
92,56
92,48
85,93
365
0,055
0,055
0,097
92,56
92,48
86,78
401
0,055
0,054
0,091
92,56
92,58
87,60
437
0,055
0,054
0,086
92,56
92,58
88,28
473
0,055
0,054
0,082
92,56
92,58
88,83
509
0,055
0,054
0,078
92,56
92,61
89,37
545
0,055
0,054
0,075
92,56
92,61
89,78
581
0,055
0,054
0,073
92,56
92,61
90,12
617
0,055
0,054
0,072
92,54
92,61
90,26
653
0,055
0,055
0,071
92,54
92,48
90,60
689
0,055
0,054
0,069
92,54
92,61
90,87
725
0,055
0,054
0,066
92,54
92,61
91,01
761
0,055
0,054
0,065
92,56
92,61
91,14
797
0,056
0,054
0,064
92,56
92,61
91,28
833
0,055
0,054
0,063
92,54
92,61
91,42
869
0,056
0,054
0,063
92,42
92,61
91,42
905
0,055
0,054
0,062
92,54
92,61
91,55
941
0,056
0,054
0,061
92,42
92,61
91,69
977
0,056
0,054
0,061
92,42
92,61
91,69
1013
0,056
0,054
0,060
92,42
92,61
91,83
1049
0,056
0,054
0,060
92,42
92,61
91,83
1085
0,056
0,054
0,060
92,42
92,58
91,83
1121
0,056
0,055
0,060
92,42
92,48
91,83
1157
0,056
0,054
0,059
92,42
92,61
91,96
1193
0,056
0,054
0,059
92,42
92,61
91,96
1229
0,056
0,054
0,059
92,42
92,61
91,96
1265
0,056
0,054
0,059
92,42
92,61
91,96
1301
0,056
0,055
0,059
92,42
92,48
91,96
1337
0,057
0,054
0,058
92,42
92,61
92,10
1373
0,057
0,056
0,058
92,42
92,34
92,10
1409
0,057
0,053
0,058
92,42
92,72
92,10
1445
0,056
0,054
0,058
92,40
92,61
92,10
1481
0,056
0,054
0,058
92,42
92,61
92,10
1517
0,056
0,054
0,058
92,42
92,61
92,10
1553
0,056
0,054
0,058
92,40
92,61
92,10
1589
0,056
0,055
0,058
92,42
92,48
92,10
1625
0,056
0,055
0,058
92,42
92,48
92,10
1661
0,056
0,055
0,058
92,42
92,48
92,10
1697
0,056
0,054
0,057
92,42
92,61
92,23
1733
0,056
0,054
0,057
92,42
92,61
92,23
1769
0,056
0,054
0,057
92,42
92,61
92,23
1805
0,056
0,054
0,057
92,42
92,61
92,23
75
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ISBN: 978-987-661-125-1
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
Los extractos HE 300 ppm, alcanzan un poder inhibitorio del DPPH próximo al 90%
(90,83%) a los 77 segundos (1,28 min) de iniciada la reacción extracto:DPPH, con una
absorbancia de 0,057, mientras que los extractos HE de 100 ppm consiguen un PI
similar (90,87%) a los 689 segundos (11,48 minutos), consiguiendo una absorbancia de
0,069. A los 1373 segundos (22,88 minutos) las tres curvas se ven prácticamente
solapadas y los extractos etanólicos inhiben al radical libre DPPH en un 92,42%,
92,34% y 92,10% respectivamente. El PI máximo de los extractos HE de 100 ppm se
alcanza a los 1697 segundos (28,28 minutos) con un valor equivalente a 92,23% y una
absorbancia de 0,057, valores que se mantienen constantes hasta la última medición
efectuada a los treinta minutos.
Por su parte, las pendientes de las curvas presentadas en el gráfico 3.4 muestran que los
extractos HAc de 300 y 600 ppm presentan una cinética de reacción semejante entre sí,
a diferencia de la solución de 100 ppm que exhibe una velocidad de reacción
sensiblemente más lenta.
Los extractos de 600 ppm presentan la mejor capacidad de captura del RL DPPH, al
principio de la reacción. A los 77 segundos la mezcla pasa de tener una absorbancia de
0,729 a 0,059, alcanzando en este momento un PI del 91,86%, valor que permanece casi
constante durante el transcurso de treinta minutos. Para este mismo lapso de tiempo la
solución de 300 ppm inhibe en un 84,39% al radical libre DPPH y la de 100 ppm sólo
alcanza a capturar el 40,13% de los radicales libres, pasando de tener una absorbancia
de 0,747 a 0,116 y 0,455 respectivamente.
HAc 600 ppm
0,90
HAc 300 ppm
0,80
Absorbancia 515 nm
HAc 100 ppm
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0
500
1000
1500
2000
Tiempo/s
Gráfico 3.4. Medianas de las absorbancias, en función del tiempo, de las mezclas extracto:DPPH =
1,6:1 de las soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto de hojas de olivo con acetato de etilo.
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
Tabla 3.4. Absorbancia y PI de los tres extractos con acetato de etilo de hojas de olivo
a lo largo de 30’.
Medianas A
Medianas PI
Tiempo (segundos)
600 ppm 300 ppm 100 ppm 600 ppm 300 ppm 100 ppm
0
0,729
0,747
0,747
0,00
0,00
0,00
5
0,218
0,358
0,520
70,10
51,88
29,59
41
0,078
0,210
0,466
89,30
71,77
37,77
77
0,059
0,116
0,455
91,86
84,39
40,13
113
0,059
0,087
0,448
91,86
87,98
41,05
149
0,059
0,065
0,443
91,86
91,37
41,71
185
0,059
0,056
0,439
91,86
92,56
42,24
221
0,059
0,050
0,435
91,86
93,28
42,76
257
0,059
0,047
0,431
91,86
93,68
43,29
293
0,059
0,047
0,426
91,86
93,76
43,95
329
0,059
0,046
0,422
91,86
93,89
44,47
365
0,059
0,046
0,418
91,86
93,89
45,00
401
0,060
0,046
0,415
91,72
93,89
45,39
437
0,060
0,046
0,411
91,72
93,89
45,92
473
0,060
0,046
0,407
91,85
93,89
46,33
509
0,060
0,045
0,404
91,72
94,02
46,74
545
0,060
0,045
0,400
91,72
94,02
47,01
581
0,059
0,045
0,396
91,86
94,02
47,42
617
0,059
0,046
0,393
91,86
93,89
47,69
653
0,059
0,046
0,390
91,86
93,89
48,10
689
0,059
0,045
0,386
91,86
94,02
48,37
725
0,059
0,045
0,382
91,86
94,02
48,64
761
0,059
0,045
0,379
91,86
94,02
49,05
797
0,059
0,045
0,376
91,86
94,02
49,32
833
0,059
0,044
0,373
91,86
94,16
49,59
869
0,059
0,044
0,370
91,86
94,16
50,00
905
0,059
0,044
0,369
91,86
94,16
50,27
941
0,059
0,044
0,368
91,86
94,16
50,54
977
0,059
0,044
0,366
91,86
94,16
50,81
1013
0,059
0,045
0,364
91,86
94,02
51,08
1049
0,059
0,045
0,363
91,86
94,02
51,21
1085
0,059
0,044
0,361
91,86
94,16
51,48
1121
0,059
0,045
0,360
91,86
94,02
51,61
1157
0,059
0,044
0,359
91,86
94,16
51,75
1193
0,059
0,045
0,357
91,86
94,02
52,02
1229
0,059
0,044
0,356
91,86
94,16
52,15
1265
0,058
0,044
0,355
92,00
94,16
52,28
1301
0,059
0,044
0,353
91,86
94,16
52,55
1337
0,059
0,044
0,352
91,86
94,16
52,69
1373
0,059
0,045
0,350
91,86
94,02
52,96
1409
0,059
0,045
0,349
91,86
94,02
53,09
1445
0,059
0,044
0,347
91,86
94,16
53,36
1481
0,059
0,044
0,346
91,86
94,16
53,49
1517
0,059
0,044
0,345
91,86
94,16
53,63
1553
0,059
0,044
0,343
91,86
94,16
53,90
1589
0,059
0,044
0,342
91,86
94,16
54,03
1625
0,059
0,044
0,341
91,86
94,16
54,17
1661
0,059
0,044
0,340
91,86
94,16
54,30
1697
0,059
0,043
0,339
91,86
94,29
54,44
1733
0,059
0,043
0,338
91,86
94,29
54,57
1769
0,059
0,043
0,336
91,86
94,29
54,84
1805
0,059
0,043
0,335
91,86
94,29
54,97
A pesar de la elevada capacidad antirradicalaria puesta de manifiesto por el extracto de
600 ppm, se observa que a los quince minutos de puestos en contacto los reactivos, la
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
solución de 300 ppm, con una velocided de reacción evidentemente mas lenta, iguala el
PI de este extracto e incluso lo supera, alcanzando un PI de 94,16%. A los 185 segundos
(3,08 minutos) cruza a la curva de 600 ppm y sigue disminuyendo su valor de
absorbancia, consiguiendo un PI máximo de 94,29% a los 1697 segundos (28,28
minutos), valor que permanece hasta el final.
En comparación con el resto de los extractos ensayados, los extractos de HAc 100 ppm
resultan ser los menos eficientes; sin embargo alcanzan una actividad inhibitoria
superior al 50%, con un valor de 54,97% y una absorbancia de 0,335 en la última
medición. A los treinta minutos del ensayo la curva no llega a estabilizarse, continúa la
disminución de la absorbancia. Probablemente, no se alcanza el equilibrio, se cree que
los extractos necesitarían más tiempo de reacción o que en la mezcla hay mayor
concentración de RL que de compuestos antioxidantes, es decir, que la relación
estequiométrica 1,6:1 para este extracto a esta concentración, no sería la adecuada para
reflejar la inhibición radicalaria por parte de los extractos probados.
En síntesis, los extractos evaluados de hoja de olivo, tanto etanólicos como en acetato
de etilo, muestran elevados PI del radical libre DPPH dejando prever la excelente
capacidad antioxidante de los mismos. En cuanto a las cinéticas de reacción de las
mezclas extracto: DPPH, éstas presentan velocidades moderadamente diferenciadas, en
función del solvente y las concentraciones ensayadas.
En función de lo expuesto, se puede concluir que los extractos de hojas de olivo de la
variedad Arbequina procedentes del Valle Central de la provincia de Catamarca
constituyen una importante fuente natural de polifenoles con una elevada actividad
antioxidante, medida como la capacidad de capturar radicales libres DPPH, para la
relación estequiométrica extracto:DPPH 1,6:1. Sin embargo, considerando que la
actividad antioxidante depende no sólo de la concentración y naturaleza de los
extractos, sino también de las características del sustrato sobre el que se aplican, en el
capítulo 4 se evalúa la bioactividad de estos extractos sobre un sistema de prueba
biológico real.
3.4.2. - Comportamiento de los extractos de madera
Los resultados de los máximos, mínimos, medianas, promedios, desviaciones estándar y
los coeficientes de variación, de cinco repeticiones de los porcentajes de inhibición (PI)
de radicales libres DPPH de los extracto de madera de olivo se exhiben en la tabla 3.5.
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
Concentración (ppm)
300
100
Medida
descriptiva
600
Extractos
ME
MAc
ME
MAc
ME
MAc
75,03
33,38
94,45
71,39
93,30
96,61
Máximo
49,54
27,76
91,48
53,89
91,79
91,21
Mínimo
58,77
27,73
92,37
64,44
92,52
95,14
Mediana
61,30
27,55
92,84
62,75
92,45
94,80
Media
1,62
4,09
0,57
7,19
0,52
2,16
DE
2,64
14,84
0,61
11,46
0,56
2,28
CV%
Tabla.3.5. Medidas descriptivas de los PI de extractos etanólicos y con acetato de etilo de madera de
olivo para 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH = 1,6:1; 15 min.).
Como se observa en la tabla 3.5 y el gráfico 3.5, las medianas de los PI calculados
oscilan entre un máximo de 95,14% (MAc 600 ppm) y un mínimo de 27,73% (MAc 100
ppm). A excepción del tratamiento MAc 100 ppm, todos los extractos de madera
presentan PI superiores al 50% a los quince minutos de producirse la mezcla extracto:
DPPH, valor registrado para el BHT a 500 ppm [7].
En el gráfico 3.5 se representan las medianas de los PI de las disoluciones de los
extractos de madera en etanol 50% y en acetato de etilo a 100, 300 y 600 ppm,
calculados a los quince minutos de producirse la mezcla de cada extracto con DPPH en
una proporción en peso de 1,6:1. En este gráfico se observa además, que a 600 ppm la
mayor capacidad de captura de RL la presenta el extracto en acetato de etilo, mientras
que para 300 y 100 ppm los extractos etanólicos muestran mejor actividad
antirradicalaria.
95,14%
Concentración/ ppm
600
92,52%
64,44%
300
100
92,37%
27,73%
MAc
58,77%
ME
PI
Gráfico 3.5. Actividad antioxidante de los extractos de madera de olivo expresada en términos de
medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH= 1,6:1; 15 min.).
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
De los seis extractos de madera de olivo de la variedad Arbequina analizados, los más
activos resultan ser MAc 600 ppm y ME 600 ppm en ese orden respectivamente,
coincidiendo con estudios recientes que reportaron excelente actividad antirradicalaria
de los extractos de madera de olivo en estos mismos solventes [3].
Por otra parte, se observa que, a 600 ppm existe menor diferencia en el comportamiento
de los extractos en etanol:acuoso 50% y en acetato de etilo, que en el resto de las
concentraciones ensayadas. Así, continuando con el mismo análisis, se verifica que a
600 ppm el extracto MAc tiene una actividad 2,75% superior a ME. Sin embargo, a 300
ppm el extracto ME tiene una actividad antirradicalaria un 30,23% por encima de MAc.
Al seguir disminuyendo la concentración de ambos extractos de madera, se observa que
el poder inhibitorio se reduce de manera acentuada, registrándose que, a 100 ppm, ME
presenta una capacidad de captura superior al extracto MAc en un 52,82%
100 ppm
300 ppm
MAc
27,73%
600 ppm
64,44%
Extractos
95,14%
ME
58,77%
92,37%
92,52%
PI
Gráfico 3.6. Actividad antioxidante de los extractos de madera de olivo en función de los solventes
de extracción, expresada en términos de medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH=
1,6:1; 15 min.).
En el gráfico 3.6 se muestran las medianas de los PI de los extractos de madera,
calculados a los quince minutos de iniciada la reacción en función del solvente de
extracción empleado. Se observa que, a contenidos elevados en CF, los compuestos
extraídos de la madera presentan mayor actividad antirradicalaria en el sustrato DPPHmetanol y por lo tanto, muestran mejores propiedades antioxidantes. Debido a que el
etanol 50% es el mejor de los solventes ensayados, en lo que se refiere a la capacidad
extractiva de CF en la madera (Ver sección 2.4.2), las actividades antirradicalarias de
las soluciones etanólicas de 600 y 300 ppm se ven solapadas por la alta cantidad de CF
antioxidantes presentes en las mismas. Es decir, en el solvente etanol-agua 50% la
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
incidencia de la concentración del extracto en la capacidad de captura del radical libre
no es muy marcada. Sólo el tratamiento ME 100 ppm exhibe una actividad
significativamente menor, sin embargo, está por encima del 50% de inhibición, valor
registrado para el BHT a 500 ppm [7].
Por su parte, los extractos en acetato de etilo presentan una relación directa entre la
concentración de los extractos y la capacidad de captura del radical libre DPPH. Así, el
mayor poder inhibitorio (95,14%) del RL es revelado por el extracto a 600 ppm. A 300
y 100 ppm los extractos exhiben una actividad antioxidante inferior (64,44% y 27,73%).
Observando los valores de las medianas expuestos en el gráfico anterior, se puede
corroborar que los tratamientos con acetato de etilo de 600 ppm y etanólicos de 300 y
600 ppm presentan PI superiores al 90%. Al realizar la prueba de Kruskal Wallis con
los PI de estos tratamientos, no se encuentran diferencias significativas al 5% (Tabla
3.6), permitiendo suponer que poseen capacidades de capturar el radical DPPH
semejantes (Anexo 3; Tabla. A.3.14)
Extractos
Medianas de PI*
95,14 A
MAc 600 ppm
92,37 A
ME 300 ppm
92,52 A
ME 600 ppm
* Letras distintas indican diferencias significativas al 5%
Tabla 3.6. Medianas de los PI de extractos etanólicos de madera de olivo a 300 y 600 ppm y del
extracto con acetato de etilo de madera de olivo a 600 ppm.
La acción inhibitoria de los extractos de madera a 600 ppm para ambos solventes,
coincide con los resultados expuestos por Pérez Bonilla et al. (2003)[3], ya que el
tratamiento que alcanza el PI más alto a los 15 minutos es el de MAc.
En los gráficos 3.7 y 3.8 se exponen los comportamientos de las medianas de las
absorbancias de las mezclas de los extractos de madera de olivo, a las tres
concentraciones ensayadas, con el RL DPPH en función del tiempo. Mientras que, en
las tablas 3.7 y 3.8 se detallan las lecturas de las mediciones de absorbancia (A)
efectuadas cada 36 segundos, durante los treinta minutos que dura el ensayo y los
valores de PI correspondientes a dichas A.
En el gráfico 3.7 se observa que los extractos de MAc, a tres concentraciones distintas,
presentan cinéticas de reacción diferentes frente al RL DPPH.
A los 41 segundos de iniciado el ensayo, el extracto MAc 600 ppm pasa de tener una
absorbancia de 0,728 a 0,317, alcanzado este tiempo el PI supera el 50% de captura de
RL con un 56,46% de efectividad. Este valor continúa disminuyendo y a los 905
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
segundos (15 minutos) registra una absorbancia de 0,035 y un PI de 95,14%, porcentaje
que no es superado por ninguno de los extractos con acetato de etilo en el periodo de los
30 minutos de reacción. Llegado los 1445 segundos la curva de la absorbancia cae hasta
un valor mínimo de 0,032 y luego comienza a establecerse el equilibrio de la reacción
hasta estabilizarse finalmente en 0,033 de absorbancia con un PI de 95,42%; esta
actividad permanece casi constante hasta completar los treinta minutos de medición.
MAc 600 ppm
0,90
MAc 300 ppm
0,80
Absorbancia 515 nm
MAc 100 ppm
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0
500
1000
1500
2000
Tiempo/s
Gráfico 3.7. Medianas de las absorbancias, en función del tiempo, de las mezclas extracto:DPPH =
1,6:1 de las soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto de madera de olivo con acetato de etilo.
Por su parte, MAc 300 ppm logra registrar un 51,23% de inhibición de RL a los 113
segundos, con una absorbancia de 0,358. A los 15 minutos este porcentaje aumenta a un
valor de 64,44%. No obstante, a comparación con MAc 600 ppm, la velocidad de
inhibición de RL de MAc 300 ppm es más lenta. Este hecho se pone de manifiesto en la
menor pendiente de la curva correspondiente. Al finalizar los 30 minutos de lectura, los
valores de absorbancia siguen disminuyendo y la actividad antioxidante de MAc 300
ppm continua revelándose sin alcanzar el equilibrio.
En el caso de MAc 100 ppm se observa que la estequiometría extracto:DPPH ensayada
(1,6:1) no es la apropiada para inhibir al RL. A los 545 segundos, con una absorbancia
de 0,560, este extracto alcanza un de PI 25,01%. Luego, a los 905 segundos, el PI
calculado muestra que se inhibe sólo un 27,73%. Las lecturas finales de absorbancias
revelan que la curva esta llegando a un equilibrio con porcentajes de captura del 31,73%
y 31,75%. Comparados los PI de este extracto, con los de los extractos de 600 y 300
ppm, la actividad antirradicalaria mostrada a 100 ppm es cuantitativamente inferior.
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
Tabla 3.7. Absorbancia y PI de los tres extractos con acetato de etilo de madera de olivo
a lo largo de 30’.
Mediana A
Mediana PI
Tiempo (segundos)
600 ppm 300 ppm 100 ppm 600 ppm 300 ppm 100 ppm
0
0,728
0,733
0,725
0,00
0,00
0,00
5
0,419
0,481
0,603
40,99
34,47
19,60
41
0,317
0,408
0,586
56,46
44,41
19,73
77
0,242
0,374
0,580
66,80
49,05
20,55
113
0,190
0,358
0,577
74,25
51,23
20,96
149
0,150
0,348
0,575
79,67
52,59
21,23
185
0,123
0,340
0,573
83,33
53,68
21,60
221
0,103
0,335
0,572
86,04
54,36
22,00
257
0,088
0,329
0,571
88,08
55,18
22,27
293
0,076
0,324
0,569
89,70
55,86
22,80
329
0,067
0,319
0,568
90,92
56,54
23,07
365
0,060
0,315
0,566
91,87
57,08
23,47
401
0,053
0,311
0,565
92,82
57,63
23,87
437
0,048
0,307
0,564
93,50
58,17
24,13
473
0,044
0,303
0,562
94,04
58,72
24,53
509
0,042
0,299
0,561
94,29
59,26
24,80
545
0,041
0,295
0,560
94,43
59,81
25,07
581
0,041
0,291
0,559
94,43
60,35
25,47
617
0,041
0,288
0,557
94,43
60,76
25,73
653
0,040
0,284
0,555
94,57
61,31
26,00
689
0,039
0,281
0,553
94,58
61,72
26,27
725
0,038
0,277
0,551
94,72
62,26
26,53
761
0,037
0,274
0,549
94,86
62,67
26,80
797
0,037
0,271
0,547
94,86
63,08
27,07
833
0,036
0,267
0,545
95,00
63,62
27,33
869
0,035
0,264
0,544
95,14
64,03
27,47
905
0,035
0,261
0,542
95,14
64,44
27,73
941
0,035
0,257
0,540
95,14
64,99
28,00
977
0,035
0,254
0,539
95,14
65,40
28,13
1013
0,035
0,251
0,537
95,14
65,80
28,40
1049
0,034
0,248
0,536
95,28
66,21
28,53
1085
0,034
0,245
0,534
95,28
66,62
28,80
1121
0,033
0,242
0,533
95,42
67,03
28,93
1157
0,033
0,240
0,531
95,42
67,30
29,20
1193
0,033
0,237
0,530
95,42
67,71
29,33
1229
0,033
0,234
0,529
95,42
68,12
29,47
1265
0,033
0,231
0,527
95,42
68,53
29,73
1301
0,033
0,228
0,526
95,42
68,94
29,87
1337
0,033
0,225
0,525
95,42
69,35
30,00
1373
0,033
0,223
0,524
95,42
69,62
30,13
1409
0,033
0,220
0,522
95,42
70,03
30,40
1445
0,032
0,218
0,521
95,56
70,30
30,53
1481
0,033
0,215
0,520
95,42
70,71
30,67
1517
0,032
0,213
0,519
95,56
70,98
30,80
1553
0,033
0,210
0,518
95,42
71,39
30,93
1589
0,033
0,208
0,517
95,42
71,66
31,07
1625
0,033
0,205
0,516
95,42
72,07
31,20
1661
0,033
0,203
0,515
95,42
72,34
31,33
1697
0,033
0,201
0,514
95,42
72,62
31,47
1733
0,033
0,198
0,513
95,42
73,02
31,60
1769
0,033
0,196
0,512
95,42
73,30
31,73
1805
0,033
0,194
0,511
95,42
73,57
31,75
83
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
A diferencia de los extractos con acetato de etilo, los extractos etanólicos a 600, 300
100 ppm ensayados resultan ser intensamente activos, alcanzando valores de PI
superiores al 50% a los 15 minutos de producirse la mezcla. Sin embargo, se observa
también una marcada diferencia en el comportamiento antirradicalario de la solución
más diluida del extracto.
ME 600 ppm
0,90
ME 300 ppm
Absorbancia 515 nm
0,80
ME 100 ppm
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0
500
1000
1500
2000
Tiempo/s
Gráfico 3.8. Medianas de las absorbancias, en función del tiempo, de las mezclas extracto:DPPH =
1,6:1 de las soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto de madera de olivo con etanol al 50%.
Se puede observar que a los 77 segundos de realizada la mezcla extracto: DPPH, con
una absorbancia registrada de 0,072, ME 600 ppm inhibe al RL en un 90,32%. La
reacción se encamina rápidamente al equilibrio hasta alanzarlo con una absorbancia de
0,055 y un PI de 95,52%, valores que permanecen constantes desde los 1373 segundos y
hasta finalizar los treinta minutos de lecturas.
ME 300 ppm, por su parte, exhibe también una excelente actividad atrapadora de RL,
pero a diferencia de ME 600 ppm, la rapidez de la reacción es menor. A los 257
segundos, es decir 3 minutos después que la solución de 600 ppm, ME 300 ppm captura
poco más del 90% de RL y recién a los 365 segundos la curva de absorbancia se solapa
con la curva de absorbancia del extracto de mayor concentración. Este solapamiento es
transitorio ya que ME 600 ppm logra disminuir aún más su absorbancia, y ME 300 ppm
se estabiliza en 0,057 de A y PI de 92,37%.
Finalmente, se evidencia que ME 100 ppm reacciona más lentamente que los extractos
más concentrados. A los treinta minutos del ensayo, la curva no llega a estabilizarse, no
alcanza el equilibrio y continúa la disminución de la absorbancia, necesitando en este
caso más tiempo de reacción.
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
Tabla 3.8. Absorbancia y PI de los tres extractos etanólicos de madera de olivo a lo largo de 30’.
Mediana A
Mediana PI
Tiempo (segundos)
600 ppm 300 ppm 100 ppm 600 ppm 300 ppm 100 ppm
0
0,735
0,750
0,747
0,00
0,00
0,00
5
0,214
0,329
0,523
70,40
56,71
30,66
41
0,107
0,237
0,480
85,20
68,82
36,45
77
0,072
0,174
0,448
90,32
77,11
40,66
113
0,064
0,135
0,426
91,42
82,24
43,16
149
0,060
0,108
0,409
91,84
85,66
45,25
185
0,058
0,089
0,397
92,12
88,13
46,85
221
0,057
0,076
0,387
92,38
89,87
48,19
257
0,057
0,069
0,379
92,39
90,75
49,26
293
0,057
0,063
0,373
92,53
91,68
50,07
329
0,057
0,058
0,366
92,53
92,17
51,00
365
0,057
0,057
0,361
92,53
92,17
51,67
401
0,057
0,057
0,356
92,53
92,17
52,34
437
0,057
0,057
0,352
92,53
92,17
52,88
473
0,057
0,057
0,347
92,65
92,17
53,55
509
0,057
0,057
0,343
92,65
92,17
54,08
545
0,057
0,056
0,339
92,53
92,31
54,62
581
0,057
0,057
0,336
92,53
92,17
55,02
617
0,057
0,057
0,332
92,53
92,17
55,56
653
0,057
0,057
0,329
92,52
92,24
55,96
689
0,057
0,057
0,326
92,53
92,24
56,36
725
0,057
0,057
0,322
92,52
92,24
56,89
761
0,057
0,057
0,319
92,52
92,24
57,30
797
0,057
0,056
0,316
92,39
92,37
57,70
833
0,057
0,056
0,313
92,39
92,37
58,10
869
0,057
0,057
0,311
92,53
92,37
58,37
905
0,057
0,057
0,308
92,52
92,37
58,77
941
0,057
0,056
0,305
92,52
92,37
59,17
977
0,057
0,056
0,303
92,52
92,37
59,44
1013
0,057
0,057
0,300
92,52
92,37
59,84
1049
0,057
0,057
0,298
92,52
92,37
60,11
1085
0,057
0,057
0,295
92,52
92,37
60,51
1121
0,057
0,057
0,293
92,52
92,37
60,78
1157
0,057
0,057
0,291
92,52
92,37
61,04
1193
0,057
0,057
0,288
92,52
92,37
61,45
1229
0,057
0,057
0,286
92,52
92,37
61,71
1265
0,057
0,057
0,284
92,52
92,37
61,98
1301
0,057
0,057
0,282
92,52
92,37
62,25
1337
0,056
0,057
0,279
92,52
92,37
62,65
1373
0,055
0,057
0,277
92,52
92,37
62,92
1409
0,055
0,057
0,275
92,52
92,37
63,19
1445
0,055
0,058
0,273
92,52
92,37
63,45
1481
0,055
0,057
0,271
92,52
92,37
63,72
1517
0,055
0,058
0,269
92,52
92,37
63,99
1553
0,055
0,057
0,267
92,52
92,50
64,26
1589
0,055
0,058
0,265
92,52
92,37
64,52
1625
0,055
0,057
0,263
92,52
92,37
64,79
1661
0,055
0,057
0,261
92,52
92,37
65,06
1697
0,055
0,057
0,260
92,52
92,37
65,19
1733
0,055
0,057
0,257
92,52
92,37
65,60
1769
0,055
0,057
0,256
92,52
92,37
65,73
1805
0,055
0,057
0,254
92,52
92,37
66,00
Antecedentes señalan que la bioactividad reportada en los extractos vegetales se debe no
sólo a los diferentes mecanismos ejercidos por los CF que posee (flavonoides, taninos,
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
quinonas), sino además al efecto sinérgico del conjunto de metabolitos secundarios que
pudiera contener la planta (alcaloides, terpenos) y a los cuales también se les reconoce
esta actividad [11].
A través del análisis efectuado acerca del poder inhibitorio de RL y la cinética de la
reacción de los extractos de madera de olivo en etanol:agua 50% y en acetato de etilo
sobre el radical DPPH, se confirma que la polaridad del solvente extractor juega un
papel relevante en la capacidad de captura del RL DPPH, comportamiento que está
vinculado a la naturaleza de los compuestos extraídos (Ver Anexo 2) y que podría
explicarse a través del aislamiento e identificación de los compuestos puros presentes en
los extractos y del estudio de su capacidad antioxidante, análisis que excede a los
objetivos de la presente tesis.
En síntesis, independientemente del solvente utilizado, el presente estudio muestra que
los extractos de madera de olivo, con elevado contenido en PFT, son excelentes
captadores de RL y podrían ser considerados una fuente potencial de antioxidantes. No
obstante, todas estas suposiciones debieran ser confirmadas a través de estudios
cualitativos y cinéticos más profundos y especialmente complementarse a través de la
aplicación de estos extractos en sistemas biológicos reales para evaluar la capacidad de
captura efectiva de RL.
En el capítulo 4 se evalúa la actividad antioxidante de los extractos en estudio aplicados
sobre aceite de oliva virgen.
3.4.3.- Análisis comparativo de los residuos de poda de olivo
De acuerdo a los análisis particulares para hoja (Sección 3.4.1) y madera (Sección 3.4.2)
de olivo se deduce que, a excepción del extracto MAc 100 ppm, todos los extractos
(tanto en etanol acuoso como en acetato de etilo) a las distintas concentraciones
ensayadas, muestran una excelente actividad antioxidante, con una capacidad de captura
del radical libre superior al 50 % a los quince minutos de producirse la mezcla extracto:
DPPH en una proporción 1,6:1.
Salvo el extracto MAc 300 ppm, los extractos de 600 y 300 ppm presentan las medianas
de los PI próximas entre sí y superiores al 91%. En cambio, el comportamiento de los
extractos a 100 ppm presentan una marcada diferencia en los PI que van desde el
91,55% (HE) al 27,73% (MAc) (Gráfico 3.9).
86
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
95,14%
92,52%
91,86%
92,54%
Concentración/ ppm
600
64,44%
92,37%
94,16%
92,61%
300
27,73%
MAc
58,77%
50,27%
100
ME
91,55%
HAc
HE
PI
Gráfico 3.9. Actividad antioxidante de los extractos a 600, 300 y 100 ppm de hoja y madera de olivo
expresada en términos de medianas de PI (Extracto:DPPH= 1,6:1; 15 min.).
Los extractos de hoja más activos son HAc y HE 300 ppm, en ese orden, y los de
madera más activos son MAc y ME 600 ppm. Los PI de estos cuatro extractos, no
muestran diferencias estadísticamente significativas entre sí (para un nivel del 5%)
(Tabla 3.9), de acuerdo a los indicado por las pruebas de Kruskal Wallis (Anexo 3;
Tablas A.3.15 a A.3.18).
Concentración
100
300
600
Extractos
Etanólicos
Medianas*
Extractos con
Acetato de Etilo
Medianas *
Hoja
91, 55 C
Hoja
50,27 AB
Madera
58,77 BC
Madera
27,73 A
Hoja
92,61 D
Hoja
94,16 D
Madera
92,37 D
Madera
64,44 C
Hoja
92,54 D
Hoja
91,86 D
Madera
92,52 D
Madera
95,14D
* Letras distintas indican diferencias significativas, por concentración, al 5%
Tabla 3.9. Medianas de los PI de los extractos de hoja y madera de olivo.
Comparando el PI del BHT con el de los extractos más activos de hoja y madera de
olivo, éstos últimos manifiestan mayor capacidad de captura del radical DPPH que el
alcanzado por el antioxidante sintético que tiene un porcentaje máximo de 78% a 1250
ppm, según Rosales Castro, et al (2006) [7].
El contenido de compuestos fenólicos de diferentes fuentes vegetales ha sido reportado
como el responsable de la activad antioxidante y correlacionado con ella
[8]
, por lo que
un contenido elevado de compuestos fenólicos podría sugerir en primera instancia una
buena capacidad antioxidante [9].
87
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
En la tabla 3.10 se presentan la concentración fenólica y ortodifenólica, el % de
ODF/PFT y el PI de cada una de las soluciones de los cuatro extractos ensayados.
Conforme a los datos de rendimiento extractivo obtenidos (Tabla 3.10), todos los
tratamientos exhiben un elevado contenido de fenoles, sin embargo, no todos muestran
una relación directa con la actividad antirradicalaria.
.
Extractos
Concentraciones en extracto
PFT
ODF
% ODF/ PFT
PI
600 ppm
16369,51 10440,65
92,54
300 ppm
8184,76
5220,33
63,78
92,61
HE
100 ppm
2728,25
1740,11
91,55
600 ppm
6337,71
3011,28
91,86
300 ppm
3168,85
1505,64
47,51
94,16
HAc
100 ppm
1056,28
501,88
50,27
600 ppm
11363,31 4388,31
92,52
300 ppm
5681,65
2194,16
38,62
92,37
ME
100 ppm
1893,88
731,39
58,77
600 ppm
3237,08
2078,28
95,14
300 ppm
1618,54
1039,14
64,20
64,44
MAc
100 ppm
539,51
346,38
27,73
Tabla 3.10. Contenido polifenólico de los extractos etanólicos y con acetato de etilo de hojas y
madera de olivo.
Los extractos etanólicos de hoja que son a nivel extractivo los más ricos en contenido
fenólico, muestran a las concentraciones de 600, 300 y 100 ppm PI similares entre sí,
dejando suponer esto, que la riqueza propia de los extractos no permite reflejar actividad
antirradicalaria proporcional al contenido fenólico. Tal vez a menores concentraciones
de extracto, se podría observar una disminución en el PI (con la relación estequiometría
extracto: DPPH 1,6:1 utilizada), tal y como se observa con los extractos etanólicos de
madera y de acetato de etilo de hoja, donde a 100 ppm se observa que el PI disminuye a
un 50%. En cuanto a los extractos de madera con acetato de etilo que son, en
comparación al resto de los extractos, los de menor concentración fenólica, se puede ver
la relación proporcional entre el contenido fenólico de los extractos y el PI (Tabla 3.10),
en coincidencia con lo reportado por Kim [8] y Cheung
[9]
.
En la tabla 3.10 se observa que en los extractos de madera a 600 ppm el acetato de etilo,
lejos de tener la mayor cantidad de polifenoles, genera el extracto con mayor capacidad
de captura de radicales libres, aunque la diferencia con el etanol acuoso no resulta
estadísticamente significativa (al nivel de 5%). No es casual que sea precisamente el
extracto MAc el que presenta la mayor proporción de ODF con respecto a los PFT.
Evidentemente la naturaleza de los principios activos de este extracto son los que
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
marcan su actividad antirradicalaria. Inclusive se podría pensar en un efecto de tipo
sinérgico entre los diferentes compuestos extraídos por el sistema madera-acetato de
etilo. Sin embargo, para las dos concentraciones más bajas ensayadas (300 y 100 ppm),
los extractos etanólicos, con mayor contenido fenólico, muestran una capacidad
antioxidante mayor que los de acetato de etilo. Estos resultados coinciden con los de
Pérez Bonilla et al., (2003)
[3]
, en lo referido a que el mejor rendimiento extractivo de
un solvente puede ó no coincidir con la mayor actividad antioxidante del extracto
obtenido. A 100 ppm, los extractos etanólicos de hoja, con mayor rendimiento fenólico,
presentan una capacidad de captura de radicales libres significativamente superior
(p<0,0007) a la de los extractos en acetato de etilo. Igual comportamiento se verifica a
600 ppm aunque la diferencia entre los PI de los extractos de ambos solventes no es
significativa (al nivel del 5%), coincidiendo también con lo reportado por Pérez Bonilla
(2003) [3]. En tanto, los extractos en acetato de etilo a 300 ppm, con menor contenido
fenólico que los extractos etanólicos de la misma concentración, presentan mayor
actividad antioxidante, pero la diferencia no es significativa, al nivel de significancia
considerado.
En función de los contenidos fenólicos de las soluciones de los extractos (Tabla 3.10) se
hubiera esperado la mayor capacidad antirradicalaria por parte de los extractos
etanólicos de hoja, ya que son los que presentan mayor concentración en fenoles a las
tres concentraciones evaluadas. A pesar de esto, es el extracto de madera con acetato de
etilo 600 ppm el que supera a todos los demás extractos, con un PI de 95,14%. Aún a
esta concentración el extracto HE no presenta la mejor capacidad antioxidante, ya que
es la concentración de 300 ppm la óptima para ese extracto. Esta observación corrobora
que uno de los factores más importantes que determina la actividad antioxidante de los
polifenoles es su grado de hidroxilación y la posición de los grupos oxhidrilos en la
molécula que puede afectar la solubilidad y los efectos estéricos, aumentando o
disminuyendo consecuentemente la actividad antioxidante [10]. Por esto y conforme a los
resultados obtenidos (Tabla 3.9 y Gráfico 3.9) se puede establecer, por la diferencia en
la actividad antioxidante de los extractos analizados y el comportamiento particular de
cada uno de ellos frente a las diferentes concentraciones, que la capacidad de captura de
RL de los CF no sólo depende de su contenido, sino también, del tipo de compuestos
presentes en los extractos, que pueden manifestar diferentes formas de sinergismo.
En el gráfico 3.10 se representa la disminución de la absorbancia a lo largo del tiempo
de las mezclas de los cuatro extractos más activos con DPPH, en proporción 1,6:1.
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Absorbancia 515 nm
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
HAc 600 ppm
HAc 300 ppm
MAc 600 ppm
ME 300 ppm
0,75
0,70
0,65
0,60
0,55
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0
500
1000
1500
2000
Tiempo/ s
Gráfico 3.10. Medianas de las absorbancia, en función del tiempo, de los cuatro extractos de
madera y hoja de olivo más activos (Extracto:DPPH = 1.6:1; 15 min.).
Analizando las pendientes de las curvas de absorbancia, se observa que al comienzo las
velocidades de reacción son distintas hasta alcanzar el equilibrio y que son los extractos
con acetato de etilo, tanto en hoja como en madera de olivo los que actúan mas
lentamente pero los que al cabo de quince minutos de ensayo registran PI más altos. Por
su parte, los extractos etanólicos exhiben reacciones prácticamente instantáneas.
En síntesis, los extractos etanólicos y en acetato de etilo de hoja y madera de olivo de la
variedad Arbequina del Valle Central de Catamarca, presentan una excelente capacidad
de captura del radical libre DPPH. Debería evaluarse su comportamiento antioxidante
sobre sustratos de diferentes características para corroborar su actividad efectiva y poder
realizar los ajustes necesarios para concretar la transferencia tecnológica al sector
industrial. En este sentido, en el capítulo siguiente se analiza el comportamiento de los
extractos en estudio sobre aceite de oliva sometido a condiciones forzadas de oxidación
con la finalidad de evaluar el efecto protector de los extractos procedentes de la poda de
olivo sobre una matriz lipídica.
Por otra parte, resultaría interesante la determinación y comparación de las estructuras
responsables de las velocidades de reacción y del grado de actividad antioxidante de los
extractos de hoja y madera de olivo de Arbequina del Valle Central de Catamarca, ya
que según lo observado en esta investigación y de acuerdo a los antecedentes
consultados, la actividad antioxidante de extractos de origen vegetal, depende de la
cantidad pero también de la naturaleza de los CF presente en ellos [12].
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Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
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