Caracterización morfológica de dos ectomicorrizas asociadas a
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Caracterización morfológica de dos ectomicorrizas asociadas a Coccoloba uvifera L. e identificación del micobionte con base en la región ITS del ADNr, en una población de la comunidad La Ribera, Tampico Alto, Veracruz DIRECTOR DE TESIS: DR. VICTOR M. BANDALA MUÑOZ 2012 ÍNDICE Resumen….…………………………………………………………………………. 2 Introducción…………………………………………………………………………. 3-5 Antecedentes………………………………………………………………………… 6-7 Objetivos………………………………………….…………………………………. 8 Hipótesis……………………………………………………………………………… 9 Micorrizas…………………………………………………………………………….. 10 - 14 Área de estudio……………………………………………………………………….. 15 Material y método…………………………………………………………………….. 16 - 19 Muestreo de ectomicorrizas (y esporocarpos)……………………………………..... 16 Limpieza y caracterización de ectomicorrizas……………………..……………….. 16 - 17 Obtención de secuencias de ADN………………………………………………….. 17 - 19 Análisis filogenético………………………………………………………………... 19 Resultados…………………………………………………………………………….. 20 - 25 Especies comparadas en cladograma…………………………………….……..…... 21 Descripción de las ectomicorrizas…………………………………………………... 22-25 Discusión……………………………………………………………………….…… 26 - 28 Conclusiones………………………………………………………………………… 29 Bibliografía………………………………………………………………………….. 30 - 35 1 RESUMEN La mayoría de los registros de especies de hongos ectomicorrizógenos (ECM) se han reconocido con base en la presencia de esporocarpos sobre el suelo, sin embargo, la diversidad hipógea representada por las ectomicorrizas está todavía poco estudiada. El presente trabajo hizo dos muestreos en diferentes épocas del año, tomando suelo bajo plantas de Coccoloba uvifera L. en la comunidad La Ribera, Tampico Alto. En las muestras de suelo se encontraron 12 morfotipos diferentes, de los cuales se hicieron las descripciones morfológicas y anatómicas usando los protocolos de Agerer y de Ludwin-Maximilians, además de documentarlo con fotografías. También se llevó a cabo la extracción de ADN y secuenciación de la región ITS del ADN ribosomal y sólo dos muestras pudieron ser exitosamente completadas las cuales al compararlas usando la herramienta BLAST con las de la base de GenBank y UNITE con 97% de similitud se relaciona una con Scleroderma bermudense y otra con 95% a una especie no identificada de Tomentella o de Thelephora. De ambas se presenta aquí la caracterización de sus ectomicorrizas y se discute entorno a su taxonomía. 2 INTRODUCCIÓN El término micorriza, acuñado por Albert Bernard Frank en 1885, define la relación de las raíces de una planta con uno o varios hongos, donde los dos obtienen beneficios, de modo que es una relación simbiótica. El principal beneficio para ambos simbiontes, es el intercambio de nutrientes: los hongos reciben carbono de las plantas hospederas y las plantas reciben fósforo y nitrógeno a través de las hifas asociadas (Trappe, 2005). Actualmente se reconocen siete tipos de asociaciones de micorrizas: arbuscular, ectomicorriza, ectendomicorriza, arbutoide, monotropoide, ericoide y orquidioide (Smith y Read, 1997) (ver abajo capítulo Micorrizas, págs. 10-14). Uno de los tipos de asociaciones micorrízicas, tema del presente trabajo, son las ectomicorrizas, término propuesto por Peyronel et al. (1969). En esta simbiosis el hongo forma un manto o vaina alrededor de las raíces, las hifas crecen entre los espacios intersticiales de las células corticales (sin penetrar en ellas) formando un sistema intercelular llamado red de Hartig; de tal forma que se pueden mencionar tres características principales: el manto fúngico, la red de Hartig, y el micelio externo vegetativo que emerge de las raíces (Trappe, 2005). A la fecha se ha estimado que existen más de 5000 especies de hongos ectomicorrizógenos, de los cuales alrededor del 90% son basidiomicetos (Malloch et al., 1980). Los hongos ectomicorrizógenos (ECM) constituyen un grupo funcional importante en los ecosistemas al influir en la adquisición de nutrientes, establecimiento de las plántulas y desarrollo y resistencia de los árboles contribuyendo con esto a la funcionalidad de los ecosistemas (Brundrett, 2009; Tedersoo et al., 2010b). Se tiene registrado que aproximadamente seis mil especies de plantas terrestres tienen una relación ectomicorrízica, donde se encuentran involucradas cerca de 20-25 mil especies de hongos (Brundrett, 2009; Rinaldi et al., 2008). En México se conocen diferentes taxones que forman parte del grupo de hongos ECM. La mayoría de los estudios ya sean taxonómicos o de tipo taxonómico-ecológico que han contribuído al conocimiento de los mismos en el país, están basados especialmente en la ocurrencia de esporocarpos, mayormente de sitios en zonas templadas. Los bosques de Quercus y coníferas son los mejores documentados aunque existen todavía sitios poco o nada explorados, y pocos son los trabajos donde se consideren fitobiontes específicos y sus ectomicorrizas bajo el suelo. Es conocida la relación ectomicorrízica de árboles de Coccoloba 3 P. Browne, un miembro de la familia Polygonaceae Juss. (Smith y Read, 1997). Las recopilaciones efectuadas por De Roman et al. (2005) y Wang y Qiu (2006) sobre estudios de ectomicorrizas a nivel mundial, revelan que se ha generado poca información sobre la diversidad de ectomicorrizógenos asociados a Coccoloba uvifera L. considerando tanto micorrizas (bajo el suelo) cómo esporocarpos (por arriba del suelo). Las plantas de esta especie en México, tienen importancia antropológica local (sus frutos son comestibles, su látex es usado para curtir y teñir pieles, maderable, medicinal, etc.) y están ligadas a las dunas de las playas del litoral de la vertiente Atlántica y esporádicamente en la costa del Pacífico, se distribuye en las costas de Campeche, Colima, Chiapas, Guerrero, Michoacán, Nayarit, Oaxaca, Quintara Roo, Sinaloa, Tabasco, Veracruz y Yucatán a una altura entre 0 a 500 msnm (Parrota, 1994; www.conabio.gob.mx). En la región de La Ribera, Tampico Alto, Veracruz, localizada en la costa norte del estado de Veracruz, se establecen manchones de Coccoloba uvifera que ocupan extensiones relativamente grandes como elementos dominates o co-dominates, y considerando su importancia local, la ecológica de los hongos ECM en esos ecosistemas, así como la poca información de las especies que conforman su cortejo simbiótico, fueron la base para ejecutar el presente trabajo con el objetivo de generar información en esta área de conocimiento. Es importante realizar investigación para documentar cuál es el componente de ectomicorrizógenos asociados y conocer las especies que podrían representar los posibles candidatos al plantear un manejo para su potencial propagación. Prácticamente se desconocen las especies de hongos ectmicorrizógenos que se asocian con C. uvifera en México, y aún menos se conocen como son sus micorrizas (De Román et al. 2005; Bandou et al. 2006). Por tal motivo el presente trabajo planteó contribuir al conocimiento de las micorrizas de C. uvifera además de su caracterización morfológica, utilizando la región ITS del ADN ribosomal. En esta región del ADN se encuentra entre las dos subunidades codificadoras para el ribosoma, que son la subunidad larga (LSU por sus siglas en inglés) y la subunidad pequeña (SSU). Asimismo la región ITS se divide en dos ya que en medio de ésta se encuentra la secuencia que codifica a la subunidad 5.8S, dando como resultado el siguiente orden: ITS1, 5.8S e ITS2, concretando así toda la región ITS. Dentro de la región ITS, se encuentran regiones altamente conservadas, ya que se trata de la región que compartimos todos los organismos para codificar los ribosomas, sin embargo, esta región y contiene mutaciones puntuales (Gardes & Bruns, 1993) que ayudan al reconocimiento de los taxones 4 (Baldwin et al., 1995) y que funciona como herramienta para la interpretación de las especies de hongos involucrados en la simbiosis (Baldwin et al., 1995; White et al. 1990; Gardes y Bruns 1993). Horton y Bruns (2001) proponen usar las secuencias de ITS como una herramienta efectiva con propósitos de identificación aunque también tiene sus limitaciones. Esta tesis no sólo hace una descripción taxonómica de las ectomicorrizas estudiadas sino que también hace uso de la biología molecular como herramienta para identificar las especies de hongos que se encuentran asociados a Coccoloba uvifera y dar soporte a los conceptos de las especies involucradas en la simbiosis. 5 ANTECEDENTES La revisión bibliográfica realizada indica que todavía se desconoce la diversidad de hongos ectomicorrizógenos asociados a árboles de Coccoloba y de México son escasos los registros. En la recopilación sobre ectomicorrizas de plantas efectuada por De Roman et al. (2005) con base en trabajos publicados entre 1961 a 2005, no registran contribuciones a nivel mundial sobre ectomicorrizas de Coccoloba. El atlas de ectomicorrizas de Agerer (1987-2002) no considera C. uvifera, aunque cabe mencionar que esta publicación especialmente informa sobre micorrizas de árboles de zonas templadas del hemisferio norte. Las plantas de Coccoloba uvifera están registradas como ectomicorrízicas en la recopilación de Wang y Qiu (2006), aunque sin mencionar las especies de hongos que participan en la simbiosis. Es importante destacar que muchos estudios sobre hongos ECM informan sobre la ocurrencia de esporocarpos por arriba del suelo, basados en su pertenencia a taxones que son conocidos que forman simbiosis con los fitobiontes. No obstante, cada vez más se genera información sobre la diversidad de hongos ECM con base en su presencia por debajo del suelo, para conocer y caracterizar las micorrizas que producen. Para el caso de C. uvifera y ejemplo de esto último, sólo se tiene el trabajo de Bandou et al. (2006) quienes aprovechando la relación simbiótica de Scleroderma bermudense Coker con dicha especie efectuaron pruebas de crecimiento en plántulas micorrizadas. Por el contrario, referente al registro de esporocarpos de hongos ECM pertenecientes a especies y géneros conocidos que forman micorrizas, se tienen registros de especies de Amanita, Boletus, Inocybe, Lactarius, Russula entre otros, como se muestra en la Tabla 1. Teóricamente todas las especies incluidas en dicha tabla, registradas con base en los esporocarpos bajo Coccoloba, forman ectomicorrizas con estas plantas, pero aun no se han investigado los morfotipos en las raíces para confirmar la interacción. Es interesante destacar que en Ecuador, Tedersoo et al. (2010a) hace el reconocimiento de ectomicorrizas asociadas a Coccoloba y con ayuda del espacio interno de transcripción (ITS, por sus siglas en inglés, Internal Transcribed Spacer), dichos autores identifican a una comunidad de hongos algo distinta en géneros a los arriba mencionados, solo Inocybe, Russula y Lactarius en coincidencia. Reportaron Inocybe sambucina (Fr.) Quél., Russula brevipes Peck, Lactarius glaucescens Crossl, L. edulis Verbeken & Buyck, Tomentella stuposa (Link) Stalpers, T. botryoides (Schwein.) Bourdot & Galzin, T. sublilacina (Ellis & 6 Holw.) Wakef, T. ellisii (Sacc.) Jülich & Stalpers Thelephora caryophyllea (Schaeff.) Pers., T. penicillata (Pers.) Fr. Clavulina cinerea (Bull.) J. Schröt., C. cristata (Holmsk.) J. Schröt, Sebacina incrustans (Pers.) Tul. & C. Tul. y Tremellodendron pallidum (Schwein.) Burt. Tabla 1. Especies de hongos ectomicorrizógenos asociados a Coccoloba y otras especies de plantas, registradas con base en la presencia de esporocarpos. Especies registradas en Especies registradas con Autor Procedencia asociaciones de Coccoloba y Coccoloba uvifera otras plantas Miller et al., Puerto Rico, Mona y Amanita cystdiosa Amanita antillana 2000 las Islas Guana O.K.Mill. & Lodge Dennis 2 Amanita arenicola O.K.Miller Boletus ruborculus T.J.Baroni 5 & Lodge Amanita microspora Lactarius caribaeus O.K.Miller Pegler 3 Lactarius coccolobae Lactarius ferrugineus O.K Millers & Lodge Pegler 4 Lactarius nebulosus Pegler Russula littoralis Pegler Guzmán Bahamas, Barbados, Scleroderma stellatum (1970) Florida, Puerto Rico Berk. y Malasia Scleroderma bermudense Coker Kreisel, 1971 Cuba Reid, 1997 Guzmán, 1983, 1986 Guzmán et al. 2004 Ortiz-Santana et al. 2007 Trinidad y Tobago México Pegler 1983 Cuba Belice y República Dominicana Boletus cubensis Berk. & Curtis Xerocomus olivaceus B. Ortiz & T.J. Baroni Inocybe littoralis Pegler Cantharellus cinnabarinus (Schwein.) Schwein Amanita aglutinata (Berk. & Curt.) Murr. Xerocomus hypoxanthus Singer Russula metechromatica Singer Boletus floridanus (Singer) Murrill 1 Xerocomus guadalupae (Singer & Fiard) Pegler 5 Amanita antillana 2,3,6 Amanita craseoderma Bas 3,6 Xerocomus cuneipes Pegler 5 Fistulinella gloeocarpa Pegler 2 Lactarius hygrophoroides Berk. & Curt. 3 Russula brevipes Peck 4 Russula martinica Pegler2,8,9,10 Russula cremeolilacina Pegler 2 Lactarius nebulosus Pegler2,3 Lactarius castaneibadius Pegler 2,9 Lactarius murinipes Pegler 5,7 Esporocarpos recolectados cerca de árboles de: 1: Coccoloba belizensis Standley, 2: Coccoloba diversifolia Jacq., 3: Coccoloba pubescens L., 4: Coccoloba swartzii Moisn., 5: Coccoloba sp., 6: Haematoxylum campechianum L., 7: Lonchocarpus sp., 8: Slonea dentata L., 9: Tabernaemontana citrifolia L., 10: Torrubia fragans (Dum.-Cours.) Standley. 7 OBJETIVOS Objetivo general Contribuir al conocimiento de las especies hongos ectomicorrizógenos asociados a Coccoloba uvifera de la comunidad La Ribera, Tampico Alto, Veracruz. Objetivos particulares Caracterizar los morfotipos de las ectomicorrizas de Coccoloba uvifera. Identificar el micobionte con base en la región ITS ribosomal y su comparación con las regiones codificadas disponibles en GenBank. 8 HIPÓTESIS Los árboles de Coccoloba uvifera se asocian simbióticamente con diferentes especies de hongos ectomicorrizógenos. La diversidad de especies de hongos ECM expresada con base en la presencia de esporocarpos, no necesariamente corresponde con las especies identificadas con base en los morfotipos de las ectomicorrizas. 9 MICORRIZAS Frank (1885) descubrió que determinados árboles adquieren nutrientes gracias a los micelios que se encontraban próximos en el suelo y que ese micelio además se encontraba envolviendo en forma de manto, parte de las raíces formando un órgano en donde los dos interactuantes obtenían nutrientes a su favor, por lo cual lo consideró como una interacción simbiótica. Acuñó el término micorriza para esta relación entre un hongo y las raíces de una planta. Más recientemente se han hecho estudios fisiológicos donde se descubre que las plantas son provistas de nitrógeno y fósforo, y que los hongos protegen a la planta de la desecación (Duchesne et al., 1989), de la contaminación de metales pesados (Leyval et al., 1997; Shaw et al., 1990), algunas especies de hongos ECM varían la tolerancia de las plantas ante condiciones adversas (Lanyon & Heald, 1982; Samson & Fortin, 1986) y favorecen el crecimiento en ambientes extremosos, como los suelos ácidos (Senior et al., 1993). También determinan la diversidad de plantas, su variabilidad y productividad en los ecosistemas (Koide & Dickie, 2002). Se considera a las asociaciones micorrízicas como cosmopolitas por su presencia en diversos hábitats naturales terrestres y generalistas por el amplio número de familias de plantas susceptibles de ser micorrizadas (Hernández-Cuevas, 2003). La presencia de los hongos micorrizógenos en las plantas es considerada un carácter ancestral, ya que las evidencias fósiles señalan que estos hongos fueron determinantes para que las plantas colonizaran el medio terrestre al ayudar a resolver dos problemas: la desecación y los sustratos escasos de nutrimentos. Los datos señalan la presencia de hifas y esporas fósiles en rocas del Ordovícico (hace 46 millones de años), muy semejantes a los ejemplares actuales del género Glomus que forman micorrizas arbusculares (Pirozynski & Malloch, 1975; Simon et al., 1993; Redecker et al., 2000). Smith y Read (1997) reconocen hasta siete diferentes tipos de micorrizas según su estructura, forma del manto, entretejido de hifas y células de la raíz, así como la formación de estructuras-accesorios. Un ejemplo de distintas micorrizas se muestran en el esquema de la Figura 1 y un resumen comparativo de las principales estructuras de cada tipo se presenta en la Tabla 2. A continuación se describen brevemente los siete tipos de micorrizas reconocidos por Smith y Read (1997): 10 Figura 1. Esquema de cinco diferentes tipos de micorrizas vistas en corte transversal. Modificada de Selosse & Le Tacon, 1998. 11 Arbuscular Este tipo de micorriza también se conoce como endomicorriza, donde el hongo coloniza la raíz y se introduce entre las células epidérmicas por medio del apresorio. En el interior de la corteza, la hifa ramificada penetra la pared de la célula cortical y se diferencia dentro de la célula vegetal para formar estructuras terminales altamente ramificadas conocidas como arbúsculos. Los arbúsculos son estructuras que no atraviesan las membranas celulares de la planta sino que la membrana invagina a los arbúsculos, formando un nuevo compartimiento denominado interface arbuscular. (Harrison, 1997). Esta interface es el sitio de intercambio de carbono y fosfato entre los simbiontes (Harrison, 1999). Ericoide Tipo de endomicorriza caracterizada porque el hongo penetra las células radicales, pero se distingue porque la planta involucrada es generalmente del orden Ericales, aunque también se ha observado en algunas briofitas (Andrade-Torres, 2010). Orquideoide Tipo de endomicorriza donde el hongo penetra las células radicales y forma estructuras llamadas ovillos. Además se distingue porque únicamente se presentan en las orquídeas. En este caso la planta es muy dependiente del hongo, ya que éste estimula la germinación de sus semillas y el crecimiento inicial de la plántula. En su fase de plántulas las orquídeas son aclorófilas y por tanto saprobias, por lo que dependen directamente de las aportaciones de compuestos de carbono y nutrimentos que proporciona el hongo. Para algunas especies de orquídeas esta dependencia se observa incluso en etapa adulta (Andrade-Torres, 2010). Ectomicorriza Se caracteriza por tener un manto compuesto de hifas que envuelve la parte apical de la raíz, haciendo ver a la raíz ensanchada con diferente ramificación, textura y/o color. El manto puede variar extensamente en grosor, color y textura dependiendo de la combinación particular del hongo-planta (Halling, 2001). Del manto a veces se desprenden algunas hifas emergentes que pueden llegar a formar una red, esto es micelio externo que incluye hifas absorbentes, cordones miceliales y rizomorfos (Brundrett et al., 1996), estos últimos presentan una parte interna parecida a tubos que se especializan en transportar nutrientes y agua desde largas distancias. El manto incrementa el área de la superficie 12 absorbente de la raíz y con frecuencia afecta la morfología de las raicillas (Halling, 2001). Otra característica muy importante es la red de Hartig, que son las hifas que se encuentran penetrando intercelularmente a la raíz y donde se lleva a cabo el intercambio de nutrientes. Ectendomicorriza Las ectendomicorrizas comparten características con las endo- y ectomicorrizas, ya que presentan manto externo y red de Hartig como las ectomicorrizas, pero también penetran las células corticales de la planta como en las endomicorrizas sólo que no existen vesículas ni arbúsculos. En algunos casos no se forma el manto, pero siempre la red de Hartig. (Peterson y Farquhar, 1994). Su distribución es restringida. Arbutoide Las micorrizas arbutoides tienen características compartidas con las ectendomicorrizas ya que se observa que simultáneamente el hongo penetra las células radicales de la planta y forma la red de Hartig. Generalmente los hongos que forman micorriza arbutoide son capaces de formar ectomicorriza si interactúan con plantas del género Pinus (Peterson y Farquhar, 1994). Monotropoide Es otro tipo de ectendomicorriza que se caracteriza por establecer relación con la familia Monotropaceae (conformada por 10 géneros), esta familia se caracteriza porque sus miembros son plantas aclorófilas por lo que dependen en gran medida del hongo asociado para obtener nutrimentos. Las semillas de las plantas del género Monotropa son pequeñas y presentan dificultades para germinar en ausencia de hongos asociados. Se ha observado que el hongo es capaz de colonizar las raíces de árboles cercanos (principalmente Pinus y Picea) y transportar nutrimentos desde el árbol a las plantas aclorófilas (Peterson y Farquhar, 1994). 13 Tabla 2. Tabla comparativa de características morfológicas de micorrizas (traducido de Smith & Read, 1997). Tipo micorriza de Hifas septadas Hifas aseptadas Colonización intracelular Manto fúngico Red de Hartig Aclorofilicamente Taxón del hongo ** Taxón de planta*** la + + - + - + - Micorriza Monotropoide + - + - + + - + + +/+ -(+) - Glomero Bryo Pterido Gymno Angio Micorriza Arbuscular - + - Micorriza Orquideoide + - + + + +/+ + + - - - - + - -* Basidio Asco (Glomero) Basidio Asco Basidio Basidio Asco Basidio Angio Gymno Angio Ericales Monotropoideae Ericales Bryo Orchidales Ectomicorriza Ectendomicorriza Micorriza Arbutoide Micorriza Ericoide *Todas las orquídeas son aclorofílicas en la etapa temprana de plántulas. La mayoría de las orquídeas son verdes cuando adultos. ** Los taxones fungícos son las abreviaciones de Glomeromycota, Ascomycota y Basidiomycota. *** Los taxones de las plantas son Bryophyta, Pteridophyta, Gymnospermae y Angiospermae . 14 ÁREA DE ESTUDIO Las colectas se realizaron en La Ribera, municipio Tampico Alto, Veracruz (Fig. 2). En la zona litoral de esta localidad se encuentra una población de Coccoloba uvifera que cubre una extensión moderadamente grande siendo un elemento dominante o co-dominante con C. humboldtii Meissn. en algunas zonas a lo largo de la playa de Tampico Alto, registrando coordenadas 22°06’36.28’’N 97°46’0.8.84’’O a una altitud de 1 m.s.n.m. El municipio limita al norte con Pueblo Viejo, al este con el Golfo de México, al sur con Ozulama y al oeste con Pánuco (http://www.altotampico.gob.mx). La Ribera Figura 2. Municipio de Tampico Alto y ubicación del sitio de muestreo. Escala 1: 250 000, modificado de http://mapserver.inegi.org.mx/mgn2k/ 15 MATERIAL Y MÉTODO Muestreo de ectomicorrizas Se efectuaron 2 visitas al área de estudio en octubre de 2010 y agosto de 2011, coincidiendo con la época de lluvias, llevando a cabo recorridos al azar a lo largo del bosque de Coccoloba uvifera (muestreo oportunista, O’ Dell et al., 2004). Con la ayuda de una navaja y/o una pala de jardín se extrajo 10-15 cm3 de suelo para la obtención de raíces con ectomicorrizas (Agerer, 1991). En total fueron tomadas 7 muestras de suelo para su limpieza, cada una se envolvió en papel aluminio para su protección y trasporte en una hielera con geles refrigerantes para mantenerlos frescos hasta su llegada al laboratorio. Limpieza y caracterización de ectomicorrizas Las muestras de suelo en el laboratorio se colocaron dentro de un cristalizador con agua, eliminando el exceso de tierra y separando las raíces. Se tomaron porciones de raíces colocándolas en cajas Petri con agua destilada, y con la ayuda de un microscopio estereoscópico se separaron las puntas ectomicorrizadas, es decir, con algún tipo de hinchamiento, cambio de coloración o un patrón de crecimiento definido reconocido como morfotipo (Agerer, 1991). Los morfotipos se agruparon de acuerdo al tipo de ramificación, coloración, textura, estructuras, etc. En una libreta de campo se registraron las características distintivas de acuerdo al protocolo de Agerer (1991) y la guía de Ludwin-Maximilians (20042011). Una porción de micorriza se conservó en alcohol al 70% para su posterior estudio microscópico, y otra se deshidrató en un deshidratador con flujo de aire a una temperatura promedio de 35-45°C durante 2 a 3 días. No se dejó pasar más de un día para su herborización, ya que esperar más tiempo para procesar la muestra puede afectar el análisis molecular. El estudio microscópico se realizó sobre preparaciones de diferentes cortes de las puntas micorrizadas y realizar la caracterización morfológica, toma de fotografías de hifas, manto, red de Hartig etc. (Agerer, 1991; Ludwin-Maximilians, 2004-2011). Los cortes longitudinales ayudaron a caracterizar la red de Hartig, el manto interno y externo, hifas emergentes del manto, presencia de cistidios y la penetración de las hifas en las capas de células de la raíz; de los cortes transversales se describe la apariencia del manto, los colores, 16 la red de Hartig, hifas emergentes, la forma de las hifas entre las células de la raíz, etc.; y el desprendimiento del manto donde se observa el manto interno y externo, de lo cual se anota la disposición de las hifas, la forma de las hifas terminales, cistidios y otros elementos. Obtención de secuencias de ADN La extracción de ADN de las ectomicorrizas se llevó a cabo usando el kit comercial DNAeasy de Quiagen (Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo que indica el kit. Después de la extracción se hicieron varios corrimientos por electroforesis en un gel de agarosa al 1% para observar el ADN, sin embargo en las ectomicorrizas puede haber tan pequeña cantidad de muestra que no siempre fue abundante la concentración de material genético, por lo que en tales casos se pasó directamente a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para la PCR se usaron primers específicos de la región ITS del ADN ribosomal, para reconocer al hongo que está participando en la interacción, en este caso, con las raíces de Coccoloba uvifera (Morris et al., 2009; Gao y Yang, 2010; Tedersoo et al., 2010a). Todas las PCR’s se llevaron a cabo en un termociclador BIORAD, con ciclos específicos de la región ITS, que se muestran en la tabla 3. Para la PCR se preparó para un volumen de 25 μl con concentraciones de 50mM MgCl2, 5mM de cada dNTP (Life Technologies, Eggestein, Germany), 10μM de cada primer (Biomers, Ulm, Germany), 0.1μl de Taq Polimerasa (Life Techhnologies) y 2.5 μl ADN de la extracción. Para obtener las secuencias se utilizaron los primers ITS1F-NL4, ITS1F-ITS4, ITS1-ITS4, ITS3-ITS4, todos tienen diferentes longitudes, aunque se dio preferencia a los fragmentos más largos, como ITS1F-NL4 e ITS1F-ITS4. En ocasiones la combinación de primers no lograban la amplificación del ADN de la muestra por lo que se usaban primers de fragmentos más cortos para completar toda la región ITS (ver Figura 3). Los primers que se usaron en esta tesis han sido citados específicamente para la región ITS en diversos organismos, tanto procariontes como eucariontes, pero los primers ITS1F e ITS4 son exclusivos de estudios de hongos, exceptuando a los Oomycetes (Manter & Vivanco, 2007). Se revisaron los productos de la PCR en un gel de agarosa al 1% con transiluminador de rayos UV, y a partir de la intensidad de la fluorescencia de la banda y la distancia que corrió, comparada con la escalera-control, se calcularon los nanogramos por microlitro que se usarían para la reacción de secuenciación. Las bandas que se obtuvieron en el gel, fueron cortadas y separadas en tubos etiquetados (en algunos casos se usó directamente el producto de PCR para la purificación), 17 éstas fueron purificadas usando el kit de purificación de ADN Wizard purification system (USB, USA). La purificación se hace para eliminar los restos de nucleótidos, MgCl2, etc. usados para la PCR. Tabla 3. Ciclos específicos del termociclador BIORAD, para la amplificación de la región ITS (Montoya et al., 2010) El ADN purificado se sometió a la reacción de secuencias con el kit de secuenciación Big Dye, en ciclos específicos en el termociclador, para las reacciones de secuencias estándar (Boreman & Hartin, 2000). De los productos de la purificación se hicieron varios lavados con alcohol (isopropanol al 80% y etanol al 75%) hasta deshidratar la muestra y dejarla totalmente seca. La lectura de las muestras se llevó a cabo en un secuenciador Automático ABI PRISM 310 de un capilar, con polímero de acrilamida POP4, Applied Biosystems. Las secuencias fueron estudiadas con ayuda de espectoferogramas del programa FinchTV 1.4.0 y editadas usando el programa Sequencher 4.1.4. Se compararon con las de mayor similitud en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al. 1997) y con ello reconocer el taxón en estudio. También se compararon con las depositadas en la base de datos UNITE (http://unite.ut.ee/) que es exclusiva de secuencias genómicas de hongos. De manera similar se obtuvo la región ITS1–ITS2 de la raíz involucrada en la micorriza para reconocer el fitobionte usando los primers ITS1 e ITS4. 18 Figura 3. Región ITS donde se señalan (en color gris) los primers que se utilizaron para la total amplificación de la región espaciadora interna (Figura tomada de Martin & Rygiewicz, 2005). SSU (por sus siglas en inglés Small SubUnit y que codifica para la región 18S) y LSU (Large SubUnit, que codifica para la región 25-28S). Análisis filogenético El análisis se realizó con las secuencias obtenidas y diversas secuencias tomadas de GenBank, de los géneros: Amanita, Boletellus, Boletus, Cantharellus, Clavaria, Cortinarius, Crepidotus, Galerina, Geastrum, Gomphidius, Gomphus, Hydnum, Inocybe, Lactarius, Lycoperdon, Phaeocollybia, Phellinus, Polyporus, Ramaria, Russula, Sebacina, Scleroderma y Thelephora, asegurando que se tratara de una secuencia codificadora de la región ITS, donde la mayoría abarcaba parcialmente a la SSU y LSU. Las secuencias se analizaron con el programa BioEdit Sequence Aligment Editor 7.0.5.3, se alinearon y se creó el árbol filogenético con el programa MEGA 5.02. Los parámetros usados para el árbol filogenético fueron con la herramienta “Prueba del árbol de máxima probabilidad” (Test Maximum Likelihood Tree), método Bootstrap replicado 1000 veces, modelo Tamura-Nei. 19 RESULTADOS En las siete muestras de suelo analizadas se reconocieron 12 diferentes morfotipos de ectomicorrizas sobre las raíces de Coccoloba uvifera. Todos los morfotipos encontrados se describieron adecuadamente pero sólo de dos de ellos se logró obtener completas sus secuencias y son los morfotipos que se consideraron para describirlos en este trabajo, y son presentados abajo. En la tabla 4 se resumen los resultados arrojados al efectuar la comparación de las secuencias obtenidas con las depositadas en GenBank y UNITE al utilizar la herramienta BLAST. Antes cabe mencionar, que en el recorrido efectuado en el bosque de Coccoloba se obtuvieron tres muestras de basidiomas pertenecientes a dos taxones del género Boletus los cuales no se lograron relacionar a una especie por la mala representación de los especímenes. Es importante destacarlo ya que de las muestras de suelo obtenidas alrededor de su estípite, ninguna correspondió con ese género. Como se muestra en la tabla 4 una de ellas registrada como DR6B, con 99% de similitud se puede interpretar como perteneciente a Scleroderma bermudense, mientras que otra DR1D con un porcentaje de similitud 95% se agrupa con una micorriza de un taxón no identificado pero relacionado con los teleforáceos. El resultado del análisis filogenético de las secuencias (Fig. 4) revela que la ectomicorriza DR1D podría representar una especie de Tomentella o de Thelephora y se soporta la interpretación de la ectomicorriza DR6B con Scleroderma bermudense. Tabla 4. En esta tabla se sintetizan los resultados moleculares obtenidos de la comparación de las secuencias de los morfotipos con las bibliotecas genómicas, agregando el porcentaje de similitud con secuencias de especies depositadas en GenBank y UNITE. ECM (No. de registro) Long. de secuencia (pb) DR1D 447 pb DR6B 20 471 pb Taxón Secuencia de ECM no cultivada IDEM IDEM Thelephora aislada Thelephora terrestris aislada Tomentella cf. sublilacina Scleroderma bermudense S. polyrhizum S. sinnamariense Número de acceso %> GenBank %> UNITE C. uvifera FN557578 95% 95% FN557577 FN557576 GU246993 95% 93% 91% 94% 93% - FJ809998 90% - AJ889982 90% - EU718118 99% - FM213349 93% HQ687222 87% 92% 90% Figura 4. Árbol filogenético realizado con la prueba Maximum Likelihood, método Bootstrap repeticiones de 1000 veces, modelo Tamurai-Nei. Las secuencias trabajadas se muestran encerradas en color rojo 21 DESCRIPCIÓN DE LAS ECTOMICORRIZAS Tomentella/Thelephora (DR1D) Fig. 5 Ectomicorriza de color negruzco la mayor parte, ápices ligeramente decolorados de color café parduzcas, textura carbonosa. El aspecto en conjunto de su ramificación es irregular pero se ramifica de forma pinada. Sus ápices están adelgazados, presenta hifas emergentes delgadas, poco frecuentes, laxas. Reacción negativa al KOH. Manto no traslúcido de 1520 µm y sus hifas tienen de ancho de 4-6 µm. Manto externo de un color café negruzco, pseudoparenquimatoso con células epidermoides a hifas dispuestas en forma perpendicular a la superficie del manto con algunas hifas emergentes cilíndricas de pared delgada, septadas con fíbulas, unas de estas hifas son hialinas mientras que otras presentan un color café. Las hifas miden de ancho 1-4 µm. Manto interno pseudoparenquimatoso de células epidermoides portando una red de hifas, estas hifas miden 6-12 x 8-10 µm. La red de Hartig penetra en la primera capa de células corticales en 2 capas sin llegar a la endodermis, con hifas redondas entre las células, es de tipo palmeada. 22 Figura 5. (A-C) Foto de ectomicorriza vista en microscopio estereoscópico. (D) Corte transversal donde se aprecia el manto y la red de Hartig de la ECM, (E) Corte longitudinal donde se hace un acercamiento al acomodo del manto, y la red de Hartig que es palmeada. (F) Células epidermoides del manto interno (G) Manto externo (H) Hifas emergentes del manto externo. Escalas: A= 2 mm, B= 1 mm, C= 0.5 mm, D= 25 μm, E-H 10 μm 23 Scleroderma bermudense Coker (DR6B) Fig. 6 Ectomicorriza de color blanquecina-blanca, con aspecto de ramificación piramidal pero se ramifica de forma dicotómica, de aspecto fibrilosa-adpresa, con rizomorfos cilíndricosredondeados y se unen en un punto, con puntas redondeadas. Manto opaco, con ramificaciones sinuosas, ligeramente tortuosas. Reacción negativa al KOH. El manto tiene un color blanco a hialino o traslúcido, conformado por 7 a 11 capas de hifas, con un ancho de 33-55 µm, y sus hifas miden de 3-8 µm de ancho. Manto externo plectenquimatoso con hifas dispuestas en una red medianamente laxa, producida por la ramificación múltiple de las hifas, de un color blanquecino a hialino. Presenta algunos cistidios ligeramente clavados y con fíbulas, abundantes. Las hifas miden de ancho de 3-6 µm. Manto interno pseudoparenquimatoso con células epidermoides, y con algunas zonas plectenquimatosas. La red de Hartig penetra hasta la segunda capa de células corticales, de manera periepidermal, de forma palmeada, con las hifas entre las células redondeadas. Rizomorfo tiene un color amarillento a hialino, con partes refringentes. Compuesto de hifas cilíndricas de pared delgada, septadas y con fíbulas, con hifas terminales redondeadas. Las hifas se encuentran dispuestas de forma erecta y alargadas muy compactas. Presenta abundantes cistidios ramificados muy agudos, y otros más escasos, clavados a ampliamente clavados, de pared gruesa, lo que da la apariencia de que haya hifas globosas que compongan al rizomorfo. Las hifas tienen un ancho de 2-5 µm. 24 Figura 6. (A-B) Fotos del microscopio estereoscópico donde se muestra ramificación, textura y color de la ECM. (C) Corte transversal, se observa el manto. (D) Red de Hartig en un corte longitudinal. (E) Manto interno. (F) Manto externo con un cistidio clavado. (G) Rizomorfo con dos tipos de cistidios. (H) Acercamiento de los cistidios ramificados. Escalas: A= 1 mm, B= 0.5 mm, C= 25 µm, D-F= 10 µm, G= 25 µm, H= 10 µm. 25 DISCUSIÓN Se habla de que la mayoría de las plantas vasculares han desarrollado una dependencia a los hongos micorrizógenos por todos los beneficios (enzimas, auxinas, vitaminas, citocininas y compuestos que incrementan el tamaño y longevidad de las raicillas, además de protección de patógenos), que obtienen de su interacción (Trappe & Fogel, 1977). Tomando en cuenta la diversidad de las plantas vasculares y que un solo individuo vegetal puede estar relacionado con varias especies de hongos micorrizógenos, se han realizado estimaciones como la de Brundret (2009) y Rinaldi et al. (2008) donde calculan que hay 20 a 25 mil especies de hongos ectomicorrizógenos, de lo cual apenas conocemos la punta del iceberg. La gran parte de los proyectos enfocados en conocer la diversidad de las ectomicorrizas en México han sido llevados a cabo en las partes de zonas templadas donde abundan los bosques de pino-encino, dejando rezagado el conocimiento de los hongos encontrados en zonas tropicales. Nuestros resultados contribuyen en ese sentido al conocimiento de los micobiontes asociados con Coccoloba uvifera como un primer intento por informar sobre su cortejo de ectomicorrizógenos. Al menos dos especies Scleroderma bermudense y un representante de Tomentella o Thelephora se encuentran en asociación micorrízica con plantas de Coccoloba uvifera en la región de La Ribera, Veracruz. El hábitat de esta planta son los litorales y presenta una amplia distribución en las costas del Pacífico, Golfo de México, Mar Caribe y Océano Atlántico. Es conveniente explicar que la diversidad hipógea y epígea de los macrohongos pueden no coincidir en términos de presencia debido a la propia biología de esos organismos. El estudio taxonómico de los hongos en general depende en gran parte de los esporocarpos que estos producen. Esto es un punto crucial en los estudios de diversidad fúngica, puesto que al tratarse de organismos con producción de cuerpos fructíferos efímeros, se puede o no encontrar en campo el cuerpo fructífero, además se depende del estado de madurez en el que se encuentren, puesto que adicionalmente se pretende lograr colectas de especímenes bien representados y en buen estado para su posterior estudio y preservación. Los micelios la mayoría del tiempo están presente bajo el suelo sin mostrar cuerpo fructífero y obedecen a cierta temperatura y humedad ambiental que se presenta mayormente en los meses de junio a septiembre (en México, variando por regiones) y es indispensable conocer la época del año en que cada especie fructifica. Smith & Read (2008) ya mencionaban que los esporocarpos no siempre están presentes mientras el hongo esté formando ectomicorriza. 26 Lo anterior nos habla de la dificultad que se tiene para obtener las ECM con su cuerpo fructífero, aunado a lo difícil que resulta trabajar con las secuencias de ADN particularmente de las ectomicorrizas, muy probablemente por la cantidad del tejido a tratar. En los datos de Tedersoo et al. (2010a) obtuvieron 105 secuencias exitosas de 111 ECM (94.6%), con la misma metodología usada en este trabajo pero diseñaron primers específicamente para el grupo Tomenteloide. Es importante tener en cuenta que puede llegar a haber casos donde la secuencia del hongo partícipe en la micorriza no se encuentre en GenBank y/o UNITE. Si se llegara a la determinación de la especie a partir de la fructificación y la comparación de secuencias entre la ectomicorriza y el esporocarpo teniendo toda la descripción junto con la de la ECM hay la posibilidad de registrar una nueva especie de modo que se enriquezca la biblioteca genómica del NCBI (National Center for Biotechnology Information) y el conocimiento de la biodiversidad. En los casos en que la secuencia no tiene un gran porcentaje de afinidad con los bancos genómicos, y no se tiene el cuerpo fructífero, la identificación se vuelve poco probable. Y exactamente fue esto lo que pasó con los otros 9 morfotipos (sin contar los del basidiomas de Boletus), no se obtuvo una amplificación completa o fragmentos de la región ITS suficientemente largos como para poder determinar con qué especie de hongo se estaba tratando. Además debe tenerse en cuenta que las secuencias encontradas en GenBank no necesariamente están correctas y que sería preferible trabajar con secuencias ya publicadas en revistas científicas. Con un porcentaje relativamente alto uno de los morfotipos estudiado, DR1D, se agrupó con el grupo de los teleforáceos. De las pruebas que se hicieron con el ADN de este morfotipo, se logró la amplificación de la región ITS consiguiendo una secuencia ya editada con 447 pares de bases. Al hacer uso del BLAST en GenBank y UNITE, la secuencia se identificó con un porcentaje alto (95%) con hongos ectomicorrizógenos no caracterizados y con un porcentaje igual o menor a 90% con los géneros Tomentella y Thelephora. Para justificar el parentesco entre los taxones se llevó a cabo el análisis filogenético, tomando secuencias disponibles en GenBank de diferentes especies de los géneros Tomentella y Thelephora. El árbol resultante muestra que el hongo en la ectomicorriza DR1D filogenéticamente se relaciona en el clado de los Thelephoraceae, conformado por miembros de Tomentella y Thelephora, sin embargo, con la secuencias disponibles, no hay claras evidencias para asignarlo a un género o a una especie. Los cuerpos fructíferos del grupo de los teleforáceos especialmente de Tomentella, 27 por su biología, son inconspicuos entre la hojarasca del suelo y poco probables de ser encontrados. Resulta atractivo que se trata de micobiontes muy abundantes y diversos tanto en comunidades de regiones árticas como tropicales (Dahlberg et al., 1997; Trowbridge & Jumpponen, 2004; Haug et al., 2005). En cuanto al morfotipo aquí estudiado presenta muchas de las características morfológicas y anatómicas típicas de una ECM perteneciente al género Tomentella (Jakues & Erös-Honti, 2008), como color, textura, hifas emergentes, manto, etc. lo que sugiere que la micorriza DR 1D pudiera pertenecer a este género Para el caso de la secuencia obtenida de la micorriza DR6B se ubica con un porcentaje de afinidad de un 99% con la secuencia correspondiente a Scleroderma bermudense (código EU718118 en GenBank). El análisis filogenético apoya la identidad con un 91% en las mil repeticiones del Bootsrap, este resultado junto con el porcentaje del BLAST con GenBank nos permite interpretar nuestro material como S. bermudense y reconocer su ectomicorriza asociada a Coccoloba uvifera. En los antecedentes ya se reportaba este hongo como posible asociado a C. uvifera ya que en Bahamas, Barbados, Florida, Puerto Rico, las Bermudas, Islas Vírgenes, Malasia y en el Caribe mexicano habían sido encontrados basidiomas cerca de C. uvifera, sin embargo esta es la primera vez que se describe su ectomicorriza. 28 CONCLUSIONES Se reconoció que Coccoloba uvifera se asocia a un hongo ectomicorrizógeno del grupo de los teleforáceos, pero con la información molecular no se logró identificar la especie, en parte por la falta del cuerpo fructífero y porque la secuencia comparada con las bases genómicas (GenBank y UNITE) no nos arrojan alguna similitud confiable (>97%), por lo que podría tratarse de una especie de Tomentella o Thelephora no secuenciada hasta el momento, un registro nuevo para C. uvifera o incluso una especie nueva. La tesis aporta la descripción de la ectomicorriza formada por Scleroderma bermudense asociada a Coccoloba uvifera, la relación simbiótica estaba especulada con base en la presencia de esporocarpos y aquí por vez primera se documenta su ectomicorriza. La especie de Scleroderma se registra por primera vez para el estado de Veracruz ya que en México se conocía de el Mar Caribe, Península de Yucatán y el estado de Guerrero (Guzmán et al., 2004). Tanto para esta especie como para la de teleforáceo se espera en el futuro obtener material fresco de los basidiomas. Los 10 morfotipos restantes que no se presentaron en esta tesis a pesar de ya tener su caracterización y fotografías, siguen siendo estudiados molecularmente con diferentes primers de la región ITS. Incluyendo los basidiomas del género Boletus y sus probables ectomicorrizas. Un último punto que debería ser considerado es que el tiempo destinado a la elaboración de tesis por parte del nuevo sistema educativo (MEIF) es corto y al tratarse de trabajos recepcionales sobre biología de organismos hay que recordar que éstos no están a disposición de los estudios ni de tiempos impuestos, que de haberlo es probable que se hubieran podido recuperar en campo fructificaciones y obtenido más resultados moleculares. 29 BIBLIOGRAFÍA Agerer, R. 1991. Characterization of ectomycorrhiza. Methods in Microbiology 23:25-73. Agerer, R. 1987-2002. Colour Atlas of Ectomycorrhizae. Department Biology I, Biodiversity Research. Universität München. Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ.1997. Gapped BLAST and PSI-Blast: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25:3389–3402 Andrade-Torres, A. 2010. Micorrizas: antigua interacción entre plantas y hongos. Ciencia 61 (4): 84-90. Baldwin, B.G., M.J. 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