ö £ o t o Ç C O iß< 7 k ì Ô=î c u Lil-J h W TES!) 1020127848 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE MEDICINA SUB-DIRECCION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO "ESTUDIO MORFOLOGICO DE LAS (ALTERACIONES PRODUCIDAS POR EL ETILMETANOSULFONATO, EN CELULAS ESPERMATOGENICAS DE RATON" TESIS: Que presenta la Dra. Guadalupe Gallegos de Lerma para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN MORFOLOGIA. a r -V .-lonterrey, N.LcV 20 de Junio de 1984. ï H T'a La presente i n v e s t i g a c i ó n fué r e a l i z a d a en el Departamento de P a t o l o g í a , y el Departamento de U l t r a e s t r u c t u r a de l a Facultad de Medicina, de l a U.A.N.L. con el apoyo económico del Fideico miso (CONACYT-Gobierno del Estado-U.A.N.L.), destinada a l a in. v e s t i g a c i ó n c i e n t í f i c a de l a Universidad Autónoma de Nuevo León. (Ref. 301.02/81/00073). Asesor: Q.F.B. Enrique Ramírez Bon Co-Asesor: Dr. Sergio de l a Garza Dedico este mi m e j o r y a la trabajo esfuerzo memoria y de superación a mi esposo: fng. a mi hi j o : Jorge de mi Sr. Fermín Alberto padre: Eleuterio Gallegos Lerma Salinas Romero Lerma Galleg Por e s t e medio más s i n c e r o y p r o f u n d o aquéllas personas, brindaron éste Dr. Sergio Bon, por durante Sepúlveda, por la tesis ha s i d o liosa colaboración nicos y secretarias motivo, tud. manifiesto así lectura Debo r e c o n o c e r ésta el Garza y Q . F . B . sus e n s e ñ a n z a s ; Enrique que l a solo de p e r s o n a l de é s t a a todos que me estimula- a mis como a l Dr. de - asesores: Ramírez Julio a éste - trabajo. presentación de gracias va- a la profesional, Facultad. ellos mi todas desarrollo crítica posible a y me y muy e s p e c i a l m e n t e de l a patente, compañeros, desinteresado adelante trabajo, hacer agradecimiento, maestros y su a p o y o ron a s e g u i r deseo téc- Por é s t e mi e t e r n a - gratis INDICE DE CAPITULOS CAPITULO PAGINA I . - INTRODUCCION 1 I I . - ANTECEDENTES: A . - LA ESPERMATOGENESIS EN EL RATON B.- ALTERACIONES PRODUCIDAS EN LA ESPERMATOGENESIS DEL RATON POR AGENTES FISICOS Y QUIMICOS I I I . - MATERIAL Y METODOS 4 41 52 I V . - RESULTADOS: A . - INDUCCION DE ALTERACIONES EN LA FORMA DEL ESPERMATOZOO DE DE RATON POR ETILMETANOSULFONATO (EMS) 56 B.- ALTERACIONES PRESENTADAS EN EL EPITELIO SEMINIFERO DE RATONES TRATADOS CON EMS 59 C-- ALTERACIONES ULTRAESTRUCTURALES EN LA ESPERMATOGENESIS DEL RATON INDUCIDAS POR EMS V . - DISCUSION V I . - RESUMEN Y CONCLUSIONES , 70. 87 94 V I I . - PERSPECTIVAS 97 V I I I . - BIBLIOGRAFIA 99 ABREVIATURAS A.- Espermatogenia A AN.- A n i l l o Nuclear an.- Anulo B.- Espermatogonia B C.- Centríolo ce.- Cuerpo cromatoide CF.- Canal f l a g e l a r CR.- Cuerpo r e s i d u a l Dia.Dipí.E.EN.ENR.F.FI.G.GA.- Y SIMBOLOS Espermatocito en d i a c i n e s i s Espermatocito en d i p l o t e n o Espermátides (Estadio 1 , 2 , . 1 6 ) Envoltura nuclear Envoltura nuclear redundante Flagelo Fosa de implantación Aparato de Golgi Granulo acrosómico I.- Espermatogonia L.- Espermatocito en leptoteno LB.M.M-I.mt.- intermedia Lámina basal Manchette Metafase del espermatocito p r i m a r i o Mi crotúbulos N.- Núcleo P-- Espermatocito en paquiteno PL.- Espermatocito en p r e l e p t o t e n o S.- Célula de S e r t o l i VA.- Vesícula acrosomal VS.- Vesícula Sexual Z.- Espermatocito en zigoteno I.- INTRODUCCION.La presente i n v e s t i g a c i ó n m o r f o l ó g i c a , se r e l a c i o n a con l a Patología experimental específicamente con el área de Carcinogénesis, campo que ha tenido gran auge en los ú l t i m o s años y se encamina hacia l a detección de agentes químicos ó f í s i c o s con acción carcinogénica para el hombre, e indaga sobre el mecanismo de acción de los carcinógenos. Son los datos epidemiológicos los que han señalado con mayor certeza a los agentes carcinogénicos para el hombre ( 23, 83 h s i n em- bargo se requiere un l a r g o tiempo para l a evaluación de los efectos en v a r i a s generaciones de i n d i v i d u o s , y solo pueden a p l i c a r s e a agentes a los que grandes poblaciones se encuentran expuestos ( 93 ) . Por este motivo, muchos investigadores (Ames 1973; Pur^ chase 1976; Ashby 1977; Soares 1979; Zeeland 1983 e n t r e o t r o s ) » se han dedica do a la búsqueda de modelos experimentales, que permitan la detección de agen tes de p o t e n c i a l acción carcinogénica para el hombre. La mayoría de e l l o s se r e a l i z a n en sistemas i n - v i t r o y en organismos situados a diversos n i v e l e s taxo nómicos, por l o que la p r i n c i p a l objeción que se puede poner a su v a l i d e z , es la d i f i c u l t a d de e x t r a p o l a c i ó n de sus resultados al hombre ( 22, 78 ) . Una c l a s i f i c a c i ó n de l o s p r i n c i p a l e s modelos experimenta les para l a detección de agentes carcinogénicos se presenta en l a F i g . l 14,22,45,49,89,93,102 ( 2,13, ). Entre las pruebas de carcinogénesis a c o r t o p l a z o , en - mamíferos " i n - v i v o " destaca el modelo propuesto por A.J. Wyrobeck (1975), en el que l a elevación del porcentaje de espermatozoides de forma anormal, es indi_ c a t i v a del daño al m a t e r i a l genético de las c é l u l a s espermatogénicas expuestas ( 10,57,97,98 ) . Esta prueba ha resultado ser de gran u t i l i d a d , ya que su bajo costo y corta duración permite su a p l i c a c i ó n a un gran número de agentes ( 98 ) . La prueba d e s c r i t a por Wyrobeck, se ha enfocado a l a de tección del aumento en el número de formas anormales de los espermatozoides; - sin p r o f u n d i z a r en los d e t a l l e s e s t r u c t u r a l e s de las c é l u l a s malformadas ni en los de las c é l u l a s predecesoras. En v i s t a de e s t o , se propone que los cambios inducidos en l a morfología de los espermatozoides del r a t ó n , a consecuencia de l a a d m i n i s t r a c i ó n de agentes mutagénicos y / ó c a r c i n o g é n i c o s , son antecedidos por cambios en l a espermatogénesis cuyo aspecto m o r f o l ó g i c o puede ser estudiado con microscopía de luz y e l e c t r ó n i c a . Ya que esos cambios no han sido suficien- temente a n a l i z a d o s , los o b j e t i v o s de ésta i n v e s t i g a c i ó n son: 1 . - D e s c r i b i r los cambios morfológicos producidos por un agente mutagénico; el e t i l - m e t a n o - s u l f o n a t o , sobre el e p i t e l i o seminífero en el t e s t í c u l o del ratón. 2 . - I d e n t i f i c a r los cambios u l t r a e s t r u c t u r a l e s que conducen a l a producción de espermatozoides de forma anormal. IQ O 3 o OI c 03 "i r+ r+ ID O -i.uaCUO 3 ÍDvO O» 3 —p. US ->•O» ÍD o 3 3 O O. O (/) O. fD • fD fD o -h to fD n [ o tO 3 to O 0» —Ol fD 3 w Q. <-+ —•' 3 O fD O o O O . ) Q.Ol-oO —.i fD O» C7 3 CU 3 n 3* QO -J. " fD 0\ r> 3 O CL 3 O) O o 31 cu O -5 3 n o» n -••O Cu 3 QJ1, c lo 1 3 tD W ((33 3 rtOJ C CL tuI 3—1.no (D 3 cu .I/i —13 fD l/i Q. n> Q. IT» Z fD fD O X TD TD —' fD toa> —1» 1 o> <s> « a n m co -D 3 c c • </> QJ o O fD cu a> QJ rt O CU n 3 -5 n- tO _J. "O -5 o z O 3" —.i «/I 3 O r+ « 3 o fD in O iD o cu to .• co co co "a fD • 3 m —j fD cu OC 3 1= ft) 3 o a o _i. O 3 —1 to O) — 3 i. <-1. -•• QJ (/i rt1 1 fD fß 1 i ZT O 3" o C C C c—1 = —i 3 QJ c+ Cur+ 3 -1. Z5 —i. O < O < l/l O to O 3 CL 3 Q. O ft) O fD -s "5 3 -h 3 3" CU CU fD O" —'TD -5 <T>a> ft) (/) O V cr —i• O —i. o; IO r+ 0+ O l/i o to 3 QJ 3 »i — —h fD -s "O O fD </> -5 S O tO to fD 3 O» fD "5 -5U a> C <-i- 3 O fD 3 3 fl> <-t </> fD <-+ TO o fD Q. 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Dados l o s o b j e t i v o s de ésta i n v e s t i g a c i ó n , es necesario presentar en éste c a p i t u l o , primeramente una d e s c r i p c i ó n de l a espermatogénesis en el r a t ó n , así como de las c a r a c t e r í s t i c a s morfológicas de las c é l u l a s espermatogénicas del Túbulo Seminífero en ésta especie. En segundo término se presentará, l o que en la b i b l i o g r a f í a se r e p o r t a acerca de las a l t e r a c i o n e s producidas a n i v e l del e p i t e l i o germinal masculino, en especial sobre las c é l u l a s espermatogénicas y los espermatozoides d e l r a t ó n , por diversos agentes químicos y f í s i c o s . A . - La Espermatogénesis en el Ratón. La espermatogénesis en los mamíferos, es un proceso continuo de diferencia_ ción c e l u l a r , que comprende t r e s eventos p r i n c i p a l e s : l a p r o l i f e r a c i ó n y renova_ ción de las espermatogonias, l a meiosis y la espermiogénesis, que conducen a l a formación de c é l u l a s altamente e s p e c i a l i z a d a s : los espermatozoides. Este proceso c o n s t i t u y e un sistema p a r t i c u l a r m e n t e f a v o r a b l e para el e s t u dio de los eventos de d i f e r e n c i a c i ó n c e l u l a r , por conducir a un solo t i p o de c£ l u l a , ser altamente s i n c r ó n i c o y l o c a l i z a r s e en un órgano e s p e c í f i c o , acompañan dose de notables cambios en l a e s t r u c t u r a y composición química de éstas c é l u l a s ( ? )• La espermatogénesis se l l e v a a cabo en el t e s t í c u l o , que en el ratón se lo c a l i z a en l a región i n g u i n a l ( 6 6 ) ; l a anatomía macroscópica y microscópica de - esta g l á n d u l a , así como su d e s a r r o l l o embrionario han sido ampliamente descri- tas en v a r i a s especies ( 5 , 5 8 , 6 6 ) , por este motivo nos enfocaremos a l a d e s c r i p ción del e p i t e l i o seminífero en el ratón haciendo é n f a s i s en l a ultraestructura de las c é l u l a s espermatogénicas. Por ú l t i m o citaremos brevemente l a s í n t e s i s de macromoléculas en la espermatogénesis, con l a f i n a l i d a d de e x p l i c a r n o s con bases moleculares, sus p r i n c i p a l e s eventos m o r f o l ó g i c o s . a ) . - Estructura del Tùbulo Seminifero. Los túbulos seminíferos constituyen l a p a r t e exócrina del t e s t í c u l o ( 5 ) ; cada t ù b u l o está rodeado por una làmina propia ó l i m i t a n t e , que a su vez consta de dos hojas, i n t e r n a y externa, con f i b r a s de colágena dispuestas paralelamente al eje del tùbulo e i n c l u i d a s en una substancia de moderada e l e c t r o d e n s i d a d . Am bas hojas encierran una capa de c é l u l a s aplanadas con grumos densos de heterocro matina y agregados perinucleares de organelos citoplásmicos ( 29 ) . Estas c é l u las se han d e s c r i t o como c é l u l a s mioides ó c o n t r á c t i l e s , por presentar c a r a c t e r í s t i c a s de c é l u l a s musculares l i s a s ( 5 ) . La población c e l u l a r del e p i t e l i o germinal del tùbulo s e m i n í f e r o , comprende dos líneas c e l u l a r e s : las células sustentaculares de S e r t o l i y las c é l u l a s espermatogénicas. La organización y e s t r u c t u r a del t ù b u l o puede ser apreciada en la F i g . 2 . La Célula de S e r t o l i es de forma p i r a m i d a l , y se extiende desde l a lámina propia hasta l a luz del tùbulo s e m i n í f e r o . Su parte p r i n c i p a l descansa sobre l a lámina propia y contiene al núcleo, c l a r o y de nucléolo muy c a r a c t e r í s t i c o . La porción intermedia de ésta c é l u l a emite proyecciones citoplásmicas l a t e r a l e s er^ t r e las cuales quedan colocadas las c é l u l a s espermatogénicas; finalmente sus proyecciones apicales encierran a los espermátides j u s t o antes de que salgan a l a luz del tubulo seminífero ( 5, 20 ) . La u l t r a e s t r u c t u r a de l a c é l u l a de S e r t o l i , se conoce bastante bien ( 5, 20, 28 ) y se i l u s t r a esquemáticamente en l a F i g . 2 . Los l í m i t e s entre dos c é l u las de S e r t o l i adyacentes pueden d i s t i n g u i r s e fácilmente por la presencia de e s p e c i a l i z a c i o n e s de unión, sobre todo en l a región basai. Se t r a t a de uniones estrechas modificadas, de gran r e s i s t e n c i a , que a l t e r n a n con uniones de nexo ( 28,29,32,67 ). En v i r t u d de l a presencia de t a l e s uniones estrechas, la c é l u l a de S e r t o l i cumple además de las funciones t r a d i c i o n a l m e n t e señaladas (soporte y n u t r i c i ó n de las c é l u l a s espermatogénicas), con el establecimiento de l a barrera hemato- Fig- o D oblacion c e l u l a r ' tubulo ernmar-ro. ' r p a n i z a c i o t . de los ' compartimentos vasal y yuxxalum-: .1. t e s t i c u l a r y con l a compartimentalización del túbulo s e m i n í f e r o , en v i s t a de que impiden l a llegada de muchas substancias provenientes de l a sangre a l a luz del túbulo y de que se establece un compartimiento basal e n t r e las u n i o nes ocluyentes de la c é l u l a de S e r t o l i y l a lámina p r o p i a , y un compartimien^ to luminal e n t r e las mismas uniones y l a luz del t ú b u l o ( 5,20,29,73 ). Las c é l u l a s que se s i t ú a n en el compartimiento basal: espermatogonias y espermatocitos p r e l e p t o t é n i c o s , tienen acceso a las substancias provenientes de l a sangre, por l a v í a del t e j i d o conectivo i n t e r s t i c i a l y l o s espacios in_ t e r c e l u l a r e s de l a t ú n i c a p r o p i a ; al parecer el proceso de renovación de célu^ las madres puede o c u r r i r independientemente de l a c é l u l a de S e r t o l i Cuando las c é l u l a s germinales del t e s t í c u l o i n i c i a n ( 16, 20 ) . la profase de la - primera d i v i s i ó n m e i ó t i c a , salen del compartimiento basal y entran al microam biente del compartimiento l u m i n a l , en donde no están expuestas directamente a las substancias provenientes del plasma sanguíneo ( 20,53,73 ) . Para alcanzar a las c é l u l a s germinales avanzadas t a l e s m a t e r i a l e s deben atravezar al cito- plasma de l a c é l u l a de S e r t o l i , en donde están sujetos a modificaciones ( 16 ) , y p a r t e del mismo quedará r e t e n i d o en los cuerpos densos m u l t i f o r m e s , del tipo de los lisosomas, para su u l t e r i o r degradación ( 73 ) . La profase m e i ó t i c a y las dos d i v i s i o n e s de maduración, son procesos úni_ eos en l a gónada, que pueden r e q u e r i r el ambiente especial p r o v i s t o por los complejos de unión de l a c é l u l a de S e r t o l i y l a barrera he;r,atotesticular ( 20 ) . Por o t r a p a r t e , l o s fenómenos de expansión y r e t r a c c i ó n con pérdida del citoplasma a p i c a l , y reabsorción de espermatozoides i n v o l u t i v o s y espermatogon lasen degeneración, son o t r a s modificaciones morfológicas que en las c é l u l a s de S e r t o l i acompañan a l a espermatogénesis ( 58 ) . b) El C i c l o del E p i t e l i o Seminífero. El l i n a j e del túbulo seminífero de los mamíferos, compuesto de espermatogonias, espermatocitos, espermátides y c é l u l a s de S e r t o l i , s u f r e una r í g i d a y M tí) "0 PI 00 w o c z o > 50 M O > >-î M O w w CO M <73 G Z O T) 50 — i i M 50 PI pi H > T) > > T3 > > -9 O O — i i H O > n o c 25 O > W H > TJ > IsD TJ M H > > O n c n M o c o Z -T3 50 co £> en c/) fi s? s > H O (73 O en co T3 TI 50 n M 3 > > 50 O O M H O m t/3 •n pi H M T) O f—I T3 O PI P >O M H w H ET) 50 S > O > > 03 M •P s» : M -0 03 T) 03 T) ai -0 •"d w T3 50 03 ! I > I < > : < > • M< < > M I1 f t " 50 -0 > IS 3 CO I 1—t > O H. -a tsi I S O I I MMÛ» TJ N < M ' M I t-H , X > , X > i X M > X M r e p e t i t i v a s e r i e de cambios, conocida como el C i c l o d e l E p i t e l i o Seminífero ( 7 ). Clermont (1969). Define al c i c l o del e p i t e l i o seminífero como "una s e r i e completa de asociaciones c e l u l a r e s sucesivas que aparecen en una área dada de un túbulo s e m i n í f e r o " . Las c é l u l a s espermatogénicas en d i f e r e n t e s etapas del d e s a r r o l l o no se encuentran d i s t r i b u i d a s al azar en el e p i t e l i o s e m i n í f e r o , sino que se presentan en una s e r i e de asociaciones ó combinaciones bien definí^ das y f á c i l m e n t e i d e n t i f i c a b l e s ( 5, 12 ) . En el r a t ó n , se han d e s c r i t o 12 asociaciones c e l u l a r e s d i s t i n t a s , corres^ pondientes cada una de e l l a s a las 12 etapas del c i c l o del e p i t e l i o seminífero { 68 ) , y el aspecto de túbulos seminíferos adyacentes.varía de acuerdo a d i f e r e n t e s asociaciones c e l u l a r e s . Estas asociaciones c e l u l a r e s se muestran en la F i g . 3, y fueron propuestas por primera vez por Oakberg (1955) quien hizo una i n t e r p r e t a c i ó n de l a espermatogénesis en el r a t ó n , basada en estudios de l a espermiogénesis, en t e s t í c u l o s i r a d i a d o s y con l a Técnica de S h i f f con A c i do Peryódico. Las f i g u r a s 5, 6 y 7 muestran asociaciones c e l u l a r e s d i f e r e n t e s , vistas en c o r t e s semifinos de túbulos seminíferos de r a t ó n . Un c i c l o del e p i t e l i o seminífero t i e n e una duración de 8.63 + 0.26 d í a s , y se requieren cuatro v u e l t a s al c i c l o para que una espermatogonia l l e g u e a ser espermatozoide que se l i b e r a en l a luz del túbulo s e m i n í f e r o ; la duración t o t a l de l a espermatogénesis es por l o tanto de 33.5 a 35.5 días ( 69 ) . Estu_ dios por captación de t i m i d i n a t r i t i a d a y r a d i o a u t o g r a f í a , p e r m i t i e r o n conocer la duración r e l a t i v a de cada etapa del c i c l o , basándose en observación de secciones transversas de túbulos s e m i n í f e r o s , en las que l a frecuencia de pre sentación de v a r i a s etapas, obtenidas del examen de un gran número de secciones es i n d i c a t i v o de su duración r e l a t i v a en porcentaje ( 12 ) . Sin embargo, ya que el c i c l o es un proceso c o n t i n u o , y sus etapas c o n s t i t u y e n t e s son p o r - r f1 m Cl TJ (0 g g çu\ rt Ha. A ta ro fO LÛ fO • rt w fD 3 P r+ 0 n H. r+ 0 CO a Q c 3 ûOJ ^ p. O pi o 0 p o p. & o p* 3 ro co H. en •+ 3 ÍÍ rt ft) ûj w ro « Mi o p w 0) TJ CD 3 CU rt 0 O p. rt O -o -3 M. 3 ai p. o o pTi H O H3 p. O 0 ro1 H M W 'O CD w w •o o ^ 3 Ol rt O 0 p. rt O T3 P» 3 & •3 p. O TJ CU •û C p. r+ (t>V 3 p. O O Û) rt 0 0 p. rt 0 "O >ï p. S ÛJ ^ p. O [SI p. oo o r+ a» 3 p. O O co -j -J en P m co ti <T> y (1) r+ 0 0 P« rt 0 -J P. g QJ p. ° ro 13 r+ 0 r+ rov 3 p. O O r; T? ro T Cu rt 0 era 0 s p. ai es M ro T 3 Cu r+ 0 O Prt 0 U P. 3 tu ••s p. o o 3 • r> V "î o 3 ai * 0 M 0 3 H0) p> 3 rt n CJ/ ro — f—i > M O û) 0 Od 0 3 h" eu l1 > 1 rt- I—i Ci fí> 3 ro Q. p. 01 O TJ 0 M O a c > o í—< o z IO co pk to P c M C > W en •"O w S > H O ÍD M Z w co M CO ITI Z en t" CO 1 pro i a 3 » TJ > r* o hH ro i ro t j O -4 TJ i z H co ro M ro 3 1i I-+ (D if s» •-3 o z o -p p t-* 1 ^ p en • co h-» a> 1 to co • p 1^ M en • CO rO ai • co !1 w • Í 01 ro CD • C» CO co • en a H» C »U ÍD m TJ ro T 3 ÖJ CU rf f-1 Oo N O p. TJ a» a •s (D ai <b a CD H -p -p p^ p CD en to CÌ to co to en ro « co to -J O" • 1 1 10 œ 1 ^ CO o co en en . 3 > X M S o /«s a. H» eu en r+ O tr c H O • >-h O >3 3 CU 3 tu a c "S eu a ro t-1 o s» 03 M Ci co en -J Etapa II del ciclo del epítalio seminífero: Se observan espermatocitos pa_ quiténicos, espermátides en fase de Golgi, y una generación más avanzada de espermátides alargados en maduración (estadio 13), incluidos en el ci_ topiasma de la célula de Sertoli. Se señala la lámina basal.C Objetivo 40X) F i g u r a Etapa VII del ciclo del epitelio semi nifero del ratón. Se observan la lámi na basal circundante, espermatogonias B, dos filas de espermatocitos paquiténicos y espermátides en fase de cas_ quete. (Objetivo 100X). F i g u r a No. 6 No. 5 Etapa IX. del ciclo del epitelio seminífero del ratón. Se observan e s — permatocitos leptoténicos, zigoténicos, paquiténicos y espermátides en elongación. Sobre la lámina basal se observan los núcleos de algunas célu las de Sertoli. (Qbjetívo 40X). F i g u r a No. 7 Esquema que representa los modelos de renovación de e tiernatogonias en el rarón; proyuest-as por Bustos Obregon, 19bS (a) y Vackins, 1971 (b), molificados de acuor v OackDerg, (Ver explicación en el texto). Los números ronaios indican etapas del ci_lo en que se den las células. F i e u r a las divi lío. 3 Espermatocitos (a) Espermatocitos (b) ratón prepuberal ( 4 ) . Las espermatogenias A, miden unas 12 mieras de diámet r o , presentan una cromatina nuclear homogénea y nucléolos m ú l t i p l e s y reticu^ lados cerca de l a envoltura n u c l e a r . El citoplasma es escaso, finamente grani¿ l a r , pobre en r e t í c u l o eridoplásmico y pequeñas mitocondrias ovoides ó e s f é r i cas v e s i c u l a r e s . Las espermatogenias B, son v i s t a s con más frecuencia y tienen un diámetro de 8 a 9 mieras. El núcleo presenta mayor cantidad de heterocromat i n a en masas c e n t r a l e s y un f i n o borde de heterocromatina alrededor de l a mem brana nuclear ( 29 ) ; el nucléolo simple y r e t i c u l a d o es v i s t o cerca del cent r o del núcleo ( 4 ) . El citoplasma y los organelos son s i m i l a r e s a l o s descri_ tos para las espermatogenias A ( 5 ) . A pesar de v a r i a s i n v e s t i g a c i o n e s la forma exacta de renovación de las es^ permatogonias A en roedores, aún no se d e f i n e b i e n , y prevalecen dos puntos de v i s t a d i f e r e n t e s . Uno propuesto por Clermont y Bustos Obregón (1968), sugiere la presencia de dos grandes categorías de espermatogenias A: las " c é l u l a s madres reserva" ó t i p o Aq y las " c é l u l a s madres en renovación" ó t i p o A^ a A^. El t i p o Aq corresponde a espermatogenias A aisladas ó por pares, de bajo í n d i ce m i t ó s i c o (0.19) que aunque se encuentran presentes en todas las etapas del c i c l o , solo esporádicamente contribuyen a la formación de nuevas espermatogen i a s . Los t i p o s A j a A^ son más numerosos, forman grupos l i n e a l e s a l o l a r g o de l a membrana l i m i t a n t e del t ú b u l o , y se d i v i d e n durante el c i c l o para aumer^ t a r su número y renovarse así mismas. Según este modelo l a s espermatogonias A e I provienen de l a s espermatogonias A^. El segundo modelo, propuesto por Huckins y Oakberg (1971) considera a las espermatogonias Aq, responsables de l a renovación y a los t i p o s A^ a A^, así como las espermatogonias I y B, c é l u l a s en d i f e r e n c i a c i ó n . Estos dos mo- delos de renovación se presentan en esquema de l a F i g . 8 , tomado de Bratmaska y Clermont (1983), cuyos r e c i e n t e s estudios concuerdan con el primero de los modelos que -bemos d e s c r i t o . < 1 11 - : x i (IX-Xi I - o t >v * M-l DIA F 13.9 . \».V ' 1 MORFOLOGIA DE ESPERMATOGONIAS Y ESPERMATOCITOS A pesar de que no puede hacerse una c l a r a d i s t i n c i ó n entre los d i f e r e n t e s t i p o s de espermatogonias A,basándose en l o s datos aportados por v a r i o s autores ( 4,36,70 ) se presentan esquemáticamente en l a F i g . 9. Las d i f e r e n c i a s morfológicas son mínimas y r e f e r e n t e s sobre todo a l a t i n c i ó n n u c l e a r , l a presencia y tamaño del núcleo, y l a cantidad y l o c a l i z a c i ó n de pequeñas masas de heterocromatina. La i d e n t i f i c a c i ó n del t i p o de espermatogonia A^ a A^ se hace sobre todo por l a etapa manos en l a Fig. del c i c l o en l a que se presentan (indicados con números r o 9). d) Meiosis: Morfología de l o s Espermatocitos. Como r e s u l t a d o de una s e r i e de d i v i s i o n e s m i t ó s i c a s y fenómenos de d i f e renciación c e l u l a r , las espermatogonias producen un s i n c i t i o de espermatocitos primarios ( 24 ) , los cuales entran j u n t o s a l a fase f i n a l de s í n t e s i s de DNA y después de un período de crecimiento c e l u l a r , i n i c i a n el proceso de meiosis ( 7 ). La meiosis es una forma de d i v i s i ó n c e l u l a r , cuyas f i n a l i d a d e s son: reducin a l a mitad e l número de cromosomas de una c é l u l a , es d e c i r p r o d u c i r l a - condición haploide en las c é l u l a s h i j a s , y p e r m i t i r el intercambio del m a t e r i a l genético ( 82 ) . Esto se logra a t r a v é s de dos d i v i s i o n e s : La meiosis I que culmina con l a formación de los Espermatocitos Secundarios, que entran r £ pidamente a l a Meiosis I I para formar espermátides ( 4,52,82 ). La profase de l a meiosis I , es marcadamente l a r g a , e i n c l u y e las etapas de Leptoteno, Zigoteno, Paquiteno, Diploteno y D i a c i n e s i s . Los p r i n c i p a l e s - eventos que acontecen en e l l a son el apareamiento de los cromosomas homólogos y e l intercambio de segmentos de sus cromátides ( 4,82 ) . La s i g u i e n t e d e s c r i p c i ó n morfológica de los espermatocitos está basada escencialmente en los t r a b a j o s de Gardner (1964) y Bel 1 vé (1977). Los esperma_ t o c i t o s primarios en etapa de preleptoteno y leptoteno están presentes en el ratón a los 10 días después del nacimiento; en ratones adultos son observables en las etapas I X , X y XI temprana del c i c l o del e p i t e l i o seminífero ( 4 ) . Los espermatocitos p r e l e p t o t é n i c o s son los mas pequeños de las c é l u l a s germi_ n a l e s , miden 7 . 5 a 8.2 mieras de diámetro y están separados de l a membrana basal por procesos c i t o p l á s m i c o s de l a c é l u l a de S e r t o l i . Areas l o c a l i z a d a s de heterocromatina se presentan esparcidas en el núcleo y ocasionalmente cer. ca de l a membrana nuclear. La cromatina r e s t a n t e está dispersa en forma homo génea pero es más densamente granular que en las espermatogenias t i p o B ( F i g . 9). Característicamente el preleptoteno contiene una cantidad l i m i t a d a de citoplasma. El Leptoteno se c a r a c t e r i z a por l a a p a r i c i ó n de f i n o s filamentos l o n g i t u d i n a l e s en el núcleo que representan el i n i c i o de l a formación de los cromosomas. En o t r a s áreas la cromatina de l o s espermatocitos l e p t o t é n i c o s es homogénea y g r a n u l a r y la cromatina condensada v i s t a en preleptoteno empieza a comprimirse sobre l a envoltura nuclear. Frecuentemente se observan fragmentos de nucleonema. Estas c é l u l a s tienen un diámetro de 8 a 10 mieras y son si_ milares en tamaño a las Espermatogonias B ( F i g s . 9 y 10). Los Espermatocitos primarios zigoténicos se observan por primera vez hac i a el día 12 después del nacimiento y una vez establecido el c i c l o de la espermatogénesis del ratón a d u l t o , se presentan en las etapas XI y X I I temprana ( 68 ) . Se c a r a c t e r i z a n morfológicamente por l a presencia de segmentos cortos de complejos sinaptonémicos. La condensación de los cromosomas X y Y forma l a "vesícula sexual" que también se i n i c i a en ésta etapa de l a profase m e i ó t i c a . Un nucléolo r e t i c u l a d o se observa situado tangencialmente ó en l a vecindad de la vesícula sexual. Estas c é l u l a s tienen un diámetro de 10 a 12 mieras y son por l o t a n t o mayores que los espermatocitos p r e l e p t o t é n i c o s . El citoplasma contiene cantidades c r e c i e n t e s de r e t í c u l o endoplásmico rugoso en p i l a s de c i s t e r n a s estrechas. Las mitocondrias se vuelven más alargadas con unas pocas c r e s t a s d i l a t a d a s ( F i g s . 9 y 11). La t r a n s i c i ó n de zigoteno a paquiteno es g r a d u a l ; los autosomas están ahora apareados por los Complejos Sinaptonémi- Microfotoprafía electrónica en la que se observan espermatocitos leptoténicos en el compartimiento yuxtaluminal del tiibulo seminífero, separadas de la lámina basal por el citoplasma de una célula de Sertoli. Complejos de unión entre las células de Sertoli — adyacentes, están señalados con flechas. (b, 6U0 X ) F i g u r a Espermatocito zigoténico de la profase meiótica T. La croiriatina empieza a condensarse; pequeñas porciones de ma terial electrodenso están en relación a la vesícula sexual. El citoplasma es muy abundante y contiene mitocon— drias vesiculosas y una gran cantidad de pequeñas vesículas membranosas. (5, 700 X) F i g u r a No. 11 No. 10 Espermatocito primario paquiténico. L1 nticleo presenta grumos más gruesos de heterocromatina y se observan los compiojos sinaptonémicos (fie— chas), así como la envoltura nuclear. En el citoplasma, que es menos abundante que en etapas anteriores, se observan nutocondrias y cisternas de retículo endoplásmico rugoso. (8, 70u X) F i g u r a Espermatocito primario diploténico. En el núcleo se observan segmentos de cronu-tina muy conúensada que corres— ponden a los cromosomas. La vesícula sexual está asociada a la envoltura nuclear, que en algunos sitios ha desaparecido (flechas). Aun se observa roatei ial nu:2eolar. L1 citoplasma es muy escaso, presenta mitocondrias y una red muy extensa de cisternas membranosas, que se continúa con la cisterna perinuclear. Se señalan la lámina basal y la célula de Sertoli. (9,000 X) F i E u r a No. 13 No. 12 En la Diacinesis el proceso de " t e r m i n a l i z a c i ó n , por el que los s i t i o s de unión e n t r e los cromosomas anteriormente apareados se desplazan a los extremos, es l o mas prominente, además de la desaparición de l a e n v o l t u r a nuclear. ( 82 ) En la Anafase I l o s centrómeros de cada par homólogo se desplazan hacia los polos opuestos del espermatocito, a r r a s t r a n d o con e l l o s ambos cromátides ( 82 ) . Espermatocitos en Diacinesis pueden ser v i s t o s en l a etapa X I I del del e p i t e l i o seminífero del r a t ó n , al igual que metafases de ciclo espermatocitos p r i m a r i o s , espermatocitos secundarios y metafases meióticas I I ( 68 ) F i g s . 9 , 14, 15. Los estudios u l t r a e s t r u c t u r a l e s , confirman l a escasez de Espermatocitos Secundarios; que tienden a ser más pequeños que los espermatocitos primarios t a r d í o s ; su núcleo es e s f é r i c o con agregados de substancia cromatínica c e n t r a j mente l o c a l i z a d o s . Las mitocondrias muestran s i m i l i t u d a las de los espermáti_ des; grandes magnificaciones muestran que las paredes engrosadas de las m i t o condrias es debida a crestas que se disponen paralelamente a l a membrana e x terna ( 29 ). En general e x i s t e poca información respecto a l a morfología del espermatocito secundario; en l a b i b l i o g r a f í a d i s p o n i b l e no se encontraron mas d e t a l l e s de su u l t r a e s t r u c t u r a . e) Espermiogénesis. La espermiogénesis, fase f i n a l de l a espermatogénesis, c o n s i s t e en una compleja transformación morfológica de l a c é l u l a s germinal haploide que culmi_ na con la s a l i d a de espermatozoides maduros a l a luz del túbulo s e m i n í f e r o . Aunque los fenómenos generales de l a espermiogénesis pueden seguirse con el microscopio ó p t i c o , l o s d e t a l l e s más f i n o s y exactos han sido estudiados con microscopía electrónica. Los cambios morfológicos que conducen a l a formación de espermatozoides Espermatocito primario en la etapa de la Diacinesis de la profase meiótica 1. Aún se observa la envoltura n u — olear, aunque el nucléolo y la vesícula sexual no se aprecian en ésta se cción. La condensación del material cromatínico es mayor. El escaso cito plasma presenta los organelos ya des critos. (6, 600 X) F i g u r a Espermatocito primario durante la metafase de la primera división robotica. Los cromosomas se encuentran alineados en el ecuador de la célula. (8, 900 X) F i g u r a No. 15 No. m quedan comprendidos en cuatro grandes fases ó etapas: l a Fase de G o l g i , l a Fa se de Casquete, l a Fase Acrosomal y l a Fase de Maduración ( 5 ) , que en el r a t ó n incluyen 16 estadios d i f e r e n t e s , d e s c r i t o s en base a cambios acrosomales y nu_ cleares ( 68 ) , observables en cortes de 5 mieras de g r o s o r , de t e j i d o testi- c u l a r f i j a d o en Zencker-Formol y teñidos con P A - S c h i f f . Estudios con microscopía e l e c t r ó n i c a , analizando los cambios u l t r a e s t r u c ^ t u r a l e s comprendidos en este proceso de d i f e r e n c i a c i ó n c e l u l a r han sido repo£ tados por diversos autores ( 13,15,25,30,41,43,80,85,86",100 y 101). A continuación presentamos una d e s c r i p c i ó n de los p r i n c i p a l e s eventos en cada etapa, que se i l u s t r a n esquemáticamente en l a Fig. 16. Fase de G o l g i . - Se i n i c i a con l a a p a r i c i ó n de espermátides redondos ó p i l i é d r i _ eos que r e s u l t a n de l a d i v i s i ó n de los espermatocitos secundarios, ( e s t a d i o 1 ) , los cuáles pueden ser i d e n t i f i c a d o s con c e r t e z a , cuando uno ó más gránulos pe_ queños se aprecian en el i n t e r i o r de l o s sáculos del Aparato de Golgi de p o s i ción yuxtanuclear (estadio 2 ) . Generalmente se t r a t a de dos ó t r e s gránulos lj_ mitados por una membrana de G o l g i ; éstos gránulos se t i ñ e n con el r e a c t i v o de S c h i f f y su contenido es r i c o en carbohidratos ( 5,30,68 ) . La f u s i ó n de los gránulos proacrosómicos en un gran gránulo adyacente a l núcleo, marca el inicio de l a etapa 3; el gránulo acrosómico queda contenido en una gran vesícula limi^ tada por una membrana que se adhiere a l a envoltura nuclear en el estadio 4 , Figs. 17 y 18. El punto de adherencia marca la f u t u r a punta a n t e r i o r del esper matozoíde. Durante l a Fase de Golgi el núcleo es e s f é r i c o , grande y c l a r o , con un carioplasma finamente p a r t i c u l a d o , de electrodensidad moderada; es común ver uno ó más grumos de heterocromatina ( 30 ) . La evolución del r e t í c u l o endoplás^ mico en la espermiogénesis fué d e s c r i t a por Clermont (1978); en l a F i g . 21 se i l u s t r a su d i s p o s i c i ó n en etapa de casquete; se ha propuesto que l a c o n t i n u i dad del r e t í c u l o endoplásmico a través de los puentes i n t e r c e l u l a r e s pueda con Pag. 2U Fig. 16. Espermiogénesis en el ratón. 2ri - — K%* 4 ' Lsperni.ítiae en fase de Golgi. El nucleo presenta una cromatina finamente gì anular, y aigunos grumos densos cen erales. El citoplasma es abundante, ** i • con numerosas mitocondrias vesiculosas de paredes engrosadas, t.1 aparato . GA r O- * '* k 2 Ml;-. ae Golgi y la vesícula acroscmica ob r o*-^' o & i servan en el polo anterior de la célu la. En una de las células se observa .. L> ? ' i" A ' a •o W ^ " 0 / v el granulo acrosómico y en otra el - _y cuerpo cromatoide. 3 V > "t ^ (3, 60u X) * ' ' 1 „o / - - rJ* Extremo anterior de un espfermaticre en fase de Golgi faumento de la region indicada en la Fig. anterior). Pequeñas vesículas se desprenden de la cara de maduración ael Golgi y se dirigen hacia la v.¿sí<;ula acrosomal, a la que se fusionan agregándole su conter>~"_!o. La envoltura nuclear aparece en grosada en el sitio donde la vesícula acrosomal se adhiere a ella, se señala con flechas. (7, 3CO X) F i f u r a No. 13 F i g u r a No. 17 t r i b u i r a l a s i n c r o n i z a c i ó n del proceso de d i f e r e n c i a c i ó n del espermátide. (94) Las mitocondrias tienden a l o c a l i z a r s e p e r i f é r i c a m e n t e ( 41 ) , y grandes magrii f i c a c i o n e s permiten observar d i l a t a d o s espacios i n t r a c r í s t i c o s , que a baja magnificación dan el aspecto de mitocondrias vacuoladas. En muchos casos las crestas se disponen paralelamente a l a s u p e r f i c i e m i t o c o n d r i a l ( 30 ) . En el citoplasma yuxtanuclear presenta además un corpúsculo densamente teñido y de forma i r r e g u l a r , que ha sido llamado cuerpo cromatoide ( 76 ) , F i g . 17. Fase de Casquete.- La membrana l i m i t a n t e de l a vesícula acrosómica aumenta su zona de adherencia a l a e n v o l t u r a n u c l e a r , formando un delgado p l i e g u e que se extiende sobre el polo del núcleo para r e c u b r i r todo su hemisferio a n t e r i o r - como un casquete c e f á l i c o membranoso ( e s t a d i o 5 ) . Mientras t a n t o el gránulo acrosómico permanece l o c a l i z a d o en el polo a n t e r i o r del núcleo ( 5 ) . El Apar a t o de Golgi es s u b s t i t u i d o completamente por v e s í c u l a s , las más grandes de las cuales se encuentran cerca de la vesícula acrosomal y se fusionan a e l l a ( 30 ) , F i g s . 19 y 20. En el citoplasma los c e n t r í o l o s se desplazan al polo abacrosomal del ni¿ c l e o , donde uno de e l l o s se dispone perpendicularmente a l a s u p e r f i c i e c e l u l a r y produce un f l a g e l o , el cual crece en una estrecha hendidura e x t r a c e l u l a r - que hay e n t r e e l espermátide redondo ó p o l i é d r i c o y l a c é l u l a de S e r t o l i adya^ cente ( 25 ) , F i g s . 21 y 22. El cuerpo cromatoide emigra ligeramente hacia el polo c e n t r i o l a r y las mitocondrias continúan en p o s i c i ó n p e r i f é r i c a . ( 13 ) La fase de casquete corresponde a los estadios 5, 6 y 7 de l a espermiogé nesis en e l ratón ( F i g . 3 ) . Fase Acrosomal.- Se i n i c i a en el estadio 8 de l a espermiogénesis del r a t ó n , cuando los espermátides jóvenes se o r i e n t a n a sí mismos con el sistema acrosó mico hacia l a membrana basal y la elongación del núcleo comienza ( 68 ) . Durante-esta fase se c o n s t i t u y e el acrosoma, e s t r u c t u r a l i m i t a d a por una membrana que ha sido comparada a un lisosoma, por su contenido r i c o en carbo- Espermátide en fase de casquete. La envoltura nuclear subyacente al cas^ quete membranoso está engrosada al igual que en la fosa de implanta ción. En éste sitio se observan el par de centriolos, el annulus (felcha) y el cuerpo cromatoide en reía ción con el flagelo en formación. El citoplasma es abundante y contiene las mitoeondrias ya descritas y gran cantidad de vesículas revestidas por una unidad de membrana, de contenido electrodenso. Se observa también el canal flagelar. (4,300 X). Figura 19 Es¡ermátide en fose de casquete. El núcleo muestra un agregado electroderi so de cromatina. En el extremo ante— rior del casquete se observa el granu lo acrosómico, cuyo material empieza a distribuirse en el interior de esta estructura. En el citoplasma vecino el aparato de Golf i se encuentra en pos i ción lateral al casquete. En el extre_ mo posterior del acrosoma, entre este y la envoltura nuclear, el citoplasma muestra mayor densidad. (6,600 X). Figura 20 Dibujo esquemático en el que se observa un e s p e r t ó t ¿ d e en f a s e de oae quete. El retículo endoplásBico se dispone en una red tridimensional de tubulos y esférulas conectadas entre si» carentes de rilx»so»as. Se extien de sobre la superficie convexa del Aparato de Golgi, y delinea i a membra na continuándose a las células veci ñas a través de los puentes interce lulares. (Clernont 1978). F i Dibujo esquemático de un e s p ^ á t i d e 60 ÍSSe de ^ s o ^ a l . Se ilustra la P a c i ó n del manchette en r e l a ci5n con el anillo nuclear. El citoplasma se des Plaza caudalmente, para circundar la P«rci6n próxima1 del flagelo, tnyendo el ^ b¿erto en „ ^ ^ en fIageiar . ^ consti ^ extremo posterior) ei anterior se invagina « f i e j a sobre el flagelo. (Clermont X9?8), , ^ ^ y ~ u r a No. 21 h i d r a t o s y enzimas h i d r o l í t i c a s ( 5 ) . El acrosoma presenta una subestructura ordenada y c a r a c t e r í s t i c a , al parecer debido a l a d i s t r i b u c i ó n e s p e c í f i c a por r e g i o n e s , de las enzimas que c o n t i e n e , en a r r e g l o s p a r a c r i s t a l i n o s ( 77 ) . Aunque se encuentra presente en todos l o s mamíferos, el acrosoma v a r í a de f o r . ma y tamaño según l a especie ( 5 ) . En e l r a t ó n l a Fase Acrosomal corresponde a l o s estadios 8 , 9 , 10 y 11 de l a espermiogénesis ( 68 )» y durante e l l a el sistema acrosomal se extiende para c u b r i r l a s u p e r f i c i e dorsal y a p i c a l del núcleo y su s u p e r f i c i e externa se a p l i c a estrechamente a l a membrana plasmática ( 30 ) , F i g s . 11 y 12. En el núcleo, l a cromatina se condensa formando grumos densamente empaquetados; por m o d i f i c a c i o n e s en su forma el núcleo empieza a aplanarse, y d¿ j a de ser redondo para volverse primero ovoide y luego estrecharse en su extremo a n t e r i o r alargándose y adquiriendo su extremo p o s t e r i o r una forma angj¿ lada ( 68 ) , F i g s . 23 y 24. Simultáneamente a los dos eventos a n t e r i o r e s , se presenta un alargamiento del espermátide. Cuando l a condensación de l a cromatina se i n i c i a aparecen numerosos microtúbulos que se asocian l a t e r a l m e n t e circundando al extreno cau da! del núcleo ( 25,43,62,80 ) , F i g . 22. Se t r a t a de un organelo el Manchette ó Vaina Caudal, cuya formación parece i n i c i a r s e en e l transitorio, espermáti- de redondo ó p o l i é d r i c o , el cual contiene muchos microtúbulos que predominan en el extremo caudal del núcleo y se extienden por todo el citoplasma (estadio 7 ) , Figs. 23 y 24, y en el que el margen p o s t e r i o r del casquete acrosomal está c u b i e r t o por una banda electrodensa aplanada: depósito de m a t e r i a l f i b r o s o electrodenso en su lado citoplásmico que circunda al núcleo y r e c i b e el nombre de a n i l l o nuclear ( 5,80 ) , F i g . 24. En r e l a c i ó n con ésta e s t r u c t u r a los e l e mentos microtubulares del manchette son rápidamente polimerizados y se extier^ den caudalmente hacia el citoplasma de la pieza del c u e l l o en formación. Ini- cialmente los^microtúbulos del manchette t i e n e n un t r a y e c t o o b l i c u o siguiendo el contorno del núcleo, desde e l a n i l l o nuclear a l a base del f l a g e l o , pero su Micrografía electrónica de un espermátide en fase acrosomal. El cito— plasma del polo anterior ha sido des plazado caudalmente, y la membrana acrosomal externa está adherida a la membrana citoplásmica. El núcleo es más alargado, y se observan masas de h<=M e-focrorratina en la periferia. (35, 000 X) Espermátide en faje acrosomal. La clon gación del nlucieo es más evidente, y ••u extremo t oteríor e > de forma c u a - drada. La 2romatina condensada en la periferia es nis abundante;en el extre mo caudal del r.úcleo se observa la fosa de implantación y lo¿ elementos pro pios del cuello en formación. En el citoplasma se ven claramente los micro_ tübulos dél manchctte de trayecto recto Se observan también el cuerpo cromatoide, una porción del canal flag lar y del flagelo. (C750 X) F i g u ra No. 24 tendencia a ser rectos parece m o d i f i c a r l a forma del extremo p o s t e r i o r d e l n£ cleo a l a de una pirámide de base truncada, extendiéndose paralelamente a l - e j e l o n g i t u d i n a l del espermátide en - elongación. Por su asociación l a t e r a l los microtúbulos forman una especie de c i l i n d r o alrededor del núcleo en su p£ l o caudal y l a base del f l a g e l o ( 5,SO ) . Los microtúbulos del Manchette, aumentan de l o n g i t u d y cuando el núcleo t i e n e forma e l i p s o i d e , se extienden a v a r i a s mieras de l a región del c u e l l o ( F i g s . 25 y 26). Un estudio m o r f o l ó g i c o y morfométrico, cuidadosamente r e a l i z a d o ha revelado las dimensiones de los microtúbulos del Manchette y su r e l a c i ó n con l a envoltura n u c l e a r , mediante "brazos" que se extienden hacia ésta ( 80 ) . Mientras ésto sucede y cuando el Acrosoma ha alcanzado su volúmen defini_ t i v o , e l Aparato de Golgi abandona su s u p e r f i c i e y se desplaza hacia l a región caudal de l a c é l u l a ; el desplazamiento del Golgi parece ser p a r t e del f l u j o - c i t o p l á s m i c o en sentido a n t e r o p o s t e r i o r . El cuerpo Cromatoide se s i t ú a en éste momento e n t r e el núcleo y el extremo proximal del f l a g e l o ( 76 ) , y a l parecer contribuye a l a formación del Anulo, e s t r u c t u r a que c o n t r i b u y e a l a formación de l a cola del espermatozoide como veremos después ( 5,13 ) , F i g s . 22 y 24. Fase de Maduración.- A d i f e r e n c i a del humano, durante ésta fase suceden p r o - fundas modificaciones en l a forma del acrosoma que son c a r a c t e r í s t i c a s en el r a t ó n ; comprendiendo los estadios 12 a 16 de l a espermiogénesis en ésta espec i e ( 68 ) . Así en el estadio 12, cuando el espermátide alcanza su tamaño máximo, el acrosoma presenta un extremo a n t e r i o r cuadrado ( F i g s . 7 y 2 4 ) , y apa rece como una e s t r u c t u r a en forma de cuña, subyacente al núcleo, que crece más en su extraño y forma un pico muy agudo ( F i g s . 29,30 y 31). El núcleo a su vez forma una expansión a n t e r i o r subyacente al acrosoma. En el e s t a d i o 13 se p r e senta un abrupto acortamiento de l a l o n g i t u d del espermátide de cerca del 20». Los ángulos caudales asumen l a forma del espermatozoide maduro, que se mantiene durante l d ^ estadios 14 y 15; el espermatozoide abandona el túbulo seminífe ro en el e s t a d i o 16 ( 67 ) , F i g . 31. Pag. 32 Fig. 25 Representación esquemática de un espermátide del estadio 14 mostrando la configuración del Retículo Endoplásmico Rugoso, (Clermont 1978). En A y B se muestra la conformación del Retículo Endoplásmico a nivel de la vaina caudal. En C y D se ilustra la configuración a nivel del flagelo, (descripción más detallada en el texto). Polo caudal de un espermátide en eloii gación. Se observa la fosa de implantación en la que los centríolos se disponen perpendicularmente uno al otro. Adyacente a ellos puede verse una masa de material electrodenso c£ rrespondiente al cuerpo cromatoide. Se observan también los microtúbulos del manchette. (39, 000 X) F i g u r a Esquema que muestra la formación del cuello y pieza intermedia del espermatozoide. Se observa el capitulum y una de las columnas estriadas de la pieza de conexión. El centríolo distal ha de_ saparecido y el proximal está dispuesto perpendicularmente al eje del flagelo. Las mitocondrias rodean la vaina fibro sa de la pieza intermedia. Puede verse también la envoltura nuclear redundante. (Bloom y Fawcett 1972). F i g u r a No. 27 No. 26 El manchette c i l i n d r i c o excluye las mitocondrias de l a región del aparato c e n t r i o l a r , base del f l a g e l o , y del citoplasma que rodea al canal f l a g e l a r ; - sin embargo en secciones t r a n s v e r s a s , caudales al núcleo, se observan túbulos de Retículo Endoplásmico Liso que corren p a r a l e l a s por dentro y por f u e r a de la vaina, conectadas por f i n a s anastomosis ( 13 ) , F i g . 25. La formación de l a cola del espermatozoide sucede durante l a fase Acrosomal t a r d í a y l a fase de Maduración. I n i c i a l m e n t e el f l a g e l o consta de un comp l e j o a x i l f i l a m e n t o s o ó axonema t í p i c o cuyos microtúbulos p e r i f é r i c o s se continúan con la pared del c e n t r í o l o p o s t e r i o r , mientras que el c e n t r í o l o ante- r i o r ocupa una hendidura poco profunda en el polo p o s t e r i o r del núcleo, llamada Fosa de Implantación ( F i g . 19). En ésta etapa los c e n t r í o l o s están rodeados de una e s t r u c t u r a anular f i b r o s a laxa que hacia l a membrana nuclear se r e l a c i o na con un pequeño a n i l l o f i b r o s o denso, el Anulo, presente en el s i t i o donde la membrana c i t o p l á s m i c a se r e f l e j a sobre el f l a g e l o y adherido tan fuertemente a e l l a como lo está el a n i l l o nuclear a l a membrana c e l u l a r suprayacente al - acrosoma ( 5,101 ) , Fig. 21 y 22. Ulteriormente se forman 9 columnas segmentadas f i b r o s a s , orientadas longi_ tudinalmente que se unen entre sí y a l a base del núcleo para formar l a pieza de conexión ( 101 ) , Figs. 26 y 27. En sentido d i s t a l las nueve columnas segmentadas se unen a nueve f i b r a s - densas l o n g i t u d i n a l e s que se d e s a r r o l l a n en l a p e r i f e r i a de los dobletes del axonema. C i e r t a c o n t r o v e r s i a e x i s t e con respecto al destino del c e n t r í o l o d i s t a l ; mientras que Zamboni (1971b)índica que p e r s i s t e en forma modificada, Fawc e t t (1978), señala que desaparece al igual que el a n i l l o l a x o , una vez que l a pieza de Conexión y las f i b r a s externas son formadas. Para Zamboni (1971^) el c e n t r í o l o próxima!, dispuesto perpendicularmente al f l a g e l o , podría actuar como un cuerpo basa! de o r i e n t a c i ó n ú n i c a , centro de la m o t i l i d a d especial del f l a g e l o del espermatozoide. Las f i b r a s densas externas comienzan a d e s a r r o l l a r s e al tiempo que el flu 3S Sección oblicua de un espermátide en elongación. El núcleo es muy largo y estrecho. En ésta sección ambos extre mos tienen forma aguda. La cromatina está más condensada en el centro del núcleo. El contenido acrosomal presen ta un aspecto estratificado. El citoplasma de la célula de Sertoli vecino al aerosoma muestra mayor electrodensidad que el resto de él. Los microtubulos del manchette aparecen en se^ cción transversa. (25, 000 X) F i g u r a No. 28 Sección longitudinal de un espermátide en elongación. Las características aerosomales y nucleares corresponden a las descritab un la I'ig. anterior. La sección permite apreciar el trayecto % recto de los microtübulos del manchette que se extienden desde el anillo nu-cledr, caudalmi-nte hasta más aJ la del cuello en formación. (25, 600 X) Espermátide en maduración. El núcleo 1 recenta forma alargada, la cromatina se ve muy condensada. El extremo ante_ rior del acrosoma presenta una proye£ ción aguda. Los grumos electrodensos del citoplasma de la célula de Sertoli aún se observan. El anillo nuclear ..c ho desplazado caudalmente al igual que los microtubulos del manchette que excluyen a lac rrdtocondrias de la región periflagelar. (15, 000 X) F i g u r a Espermátide en elongación. La condensación de la cr ^at'na na alean? in-> su grado máximo. El material a-ro^o.n^l e^ ' e- ios electro' erto en la vecindid del n'cleo. Los grunos densos del citoplas ma de xa cC ul . "c. bert<">li con mis ercasos. Se ..bot jwa también la pieza de conexión y 1er microtCbulos de la vaina caudal de disposición helicoidal. (30, 000 X) F i g u r a No. 31 No. 30 Espermátide en maduración. La orientación del corte permite observar la cabeza del espermátide y el acrosoma. Esté último se extiende casi desde el extremo caudal del núcleo por el dorso para formar una proyección ante— rior y aguda. En el extremo caudal se observa la implantación del flagelo. Las mitocondrias se disponen alrededor de éste. La mayor parte del cito plasma se localiza en la región caudal. (7, 000 X) F i g u r a No. 32 i' Espermátide que se encuentra en la últi v ' \ • 4, . 0 % J m 1<j f 1-. X fk • m fím ma etapa de maduración. El núcleo y el acrosoma tienen su aspecto definitivo; el cuello y la pieza principal están - i • - VBr también completamente desarrollados. % En la pieza intermedia, el filamento axial aparece rodeado per la vaina fibrosa y la vaina mitocondrial, limitada caudalmente por el anulo, que se encuera o tra en su posición definitiva. En secciones transversas se aprecian xa pieza principal y la terminal. Se señalan * (flechas) porciones de citoplasma resi- » dual . (3, 600 X) F i g u r a No. 33 A - j.o c í t o p l á s m i c o hace que el canal f l a g e l a r aumente de l o n g i t u d , mientras l a d i s t a n c i a e n t r e el a n i l l o nuclear y el anulo permanece constante ( 5 ) . f ) S í n t e s i s de Macromoléculas Durante l a Espermatogénesis. Muchos de l o s conocimientos sobre eventos macromoleculares se han d e r i v a do de estudios citoquímicos ( 7 ) . La Figura 34 reúne los datos sobre s í n t e s i s de macromoléculas en l a espermatogénesis, que a continuación describimos. 3 S í n t e s i s de DNA.- Estudios r a d i o a u t o g r a f i c o s usando t i m i d i n a H , en t e s t í c u l o s de ratón ( 64 ) , han d e t a l l a d o los eventos de s í n t e s i s de DNA, durante la espermatogénesis, indicando que dicha s í n t e s i s se l l e v a a cabo durante el recambio y p r o l i f e r a c i ó n de espermatogenias así como en espermatocitos prj_ marios, donde sucede j u s t o antes de ser v i s i b l e l a profase m e i ó t i c a . No hay, en cambio, s í n t e s i s de 'DNA en las etapas t a r d í a s de l a espermatogénesis. Igualmente ha sido determinado por Monesi (1962), e l tiempo de duración del período de s í n t e s i s de DNA en las c é l u l a s en que sucede: En espermatogenias A j a A^, que tienen un promedio de vida y de duración de la etapa presin_ t é t i c a muy semejante (de 27 a 30 h r s . y 10.5 h r s . respectivamente), el perío- do de s í n t e s i s de DNA y el p o s t d u p l i c a c i o n a l son muy v a r i a b l e s . En espermatogonias B l a s í n t e s i s de DNA es muy l a r g a , t i e n e una duración de 14.5 h r s . ; igual que en espermatogonias I donde es de 12.5 y en espermatogonias A^, en las que l a s í n t e s i s de DNA dura 13 h r s . ; en cambio es mucho más corta en espermatogonias Ag, ^ y en 9ue ciura de 7 a 8 hrs. El período p o s t d u p l i c a c i o n a l es por el c o n t r a r i o c o r t o en espermatogonias B (4.5 h r s . ) , más l a r g o en las I (11 h r s . ) , y mucho más l a r g o en A^, Ag y A^ (14 h r s . ) . S í n t e s i s de RNA y P r o t e í n a s . - Estudios r a d i o a u t o g r a f i c o s empleando u r i d i na H3 y aminoácidos marcados, en t e s t í c u l o de r a t ó n ( 65 ) , han proporcionado informaci-én sobre l a s í n t e s i s de RNA y proteínas en l a s c é l u l a s espermatogénicas y de S e r t o l i . Fig. 34 Síntesis de Macromoléculas en la espermatogénesis del ratón (citado por Bruce y Meistrich 1972). - 4— Espermatogenias A 0 ! DNA - 2- Espermatogenias I - 1- Espermatogonias B 0 - Preleptoneno DNA DNA 1 23" 4 - Zigoteno Sínt. alta de proteínas 5- Síntesis elevada de 67 fi u RNA Paquiteno - 9 10- Diploteno 11- Espermatocito See. 12- Proteínas Síntesis baja de RHA Citoplásmicas 1314 ' Espermátide 3 1516- Espermátide 8 17- Nucleoproteínas Ricas en Arginina ( Protaminas ) 181920- Espermátide 11 2122- Estructura Nuclear Resistente 2324- Espermátide 25 2526- Espermatozoide En espermatogenias l a tasa de s í n t e s i s de RNA y proteínas es mucho más a l t a en c é l u l a s que son inmaduras es d e c i r t i p o A que en las maduras, t i p o B, lo cual posiblemente está en r e l a c i ó n a su grado de d i f e r e n c i a c i ó n y condensa_ ción de cromatina. La s í n t e s i s de proteínas nucleares y citoplásmicas ocurre en todas las etapas del c i c l o y en la d i v i s i ó n c e l u l a r , mientras que l a s í n t e s i s de RNA se detiene en metafase y anafase. Durante l a M e i o s i s , l a s í n t e s i s de RNA en r e l a c i ó n con los autosomas cesa ó f a l l a para alcanzar n i v e l e s s i g n i f i c a t i v o s durante l a profase temprana ( l e p t o t e n o y zigoteno) así como en l a profase t a r d í a ( d i a c i n e ' s i s ) , alcanzando su pico máximo en Paquiteno mediano. En cambio, en r e l a c i ó n con l o s cromosomas sexuales que permanecen como un cuerpo h e t e r o p i c n ó t i c o , no se s i n t e t i z a - RNA y permanecen invariablemente s i n marcar a través de l a profase m e i ó t i c a . La s í n t e s i s de proteínas por el c o n t r a r i o , continúa durante los períodos de depresión de s í n t e s i s de RNA y está presente también en los cromosomas sexuales. Durante l a espermiogénesis, l a s í n t e s i s de RNA se detiene tempranamente. Aunque en espermátides redondos l a tasa de RNA s i n t e t i z a d o puede ser comparable con l a producida en los momentos más a c t i v o s de t r a n s c r i p c i ó n de la meios i s ( 92 ) . El RNA producido durante l a Meiosis desaparece del núcleo ya sea por r u ¿ t u r a ó t r a n s f e r e n c i a al citoplasma, y hacia l a espermiogénesis media ya no es p o s i b l e ver RNA en el núcleo. En el citoplasma puede verse RNA escaso, del que ha sido s i n t e t i z a d o en la profase m e i ó t i c a . La s í n t e s i s de proteínas que se ve en los espermátides de los estadios 9 al 15, es probablemente sostenida por el RNA producido en l a m e i o s i s . Esta s í n t e s i s r e s u l t a esencial para los marcados cambios morfológicos que tienen lugar durante esas etapas de l a espermiogénesis. Muchas de las proteínas r e queridas para el ensamblaje de l o s componentes de l a cola son s i n t e t i z a d o s - durante l a espermiogénesis, igualmente muchas enzimas que i n c l u y e n l a f o s f o - g l i c e r a t o c i n a s a e s p e c í f i c a de t e s t í c u l o , l a hexocinasa t i p o espermatozoide, l a hialuroriidasa y l a b e t a - g a l a c t o s i d a s a , aparecen por primera vez durante l a espermiogénesis ( 92 ) . Existen evidencias de que un RNAm de " l a r g a d u r a c i ó n " , es s i n t e t i z a d o en paquiteno y se conserva a través de l a espermiogénesis hasta sus etapas más t a r d í a s . Se ha especulado mucho sobre la p o s i b i l i d a d de que el cuerpo cromatoj_ de, que aparece en paquiteno y es prominente en espermiogénesis temprana ( 7 6 ) , s i r v a de s i t i o de almacenamiento para ese RN^ de larga duración. Estudios de marcación con u r i d i n a t r i t i a d a en espermátides tempranos, sugieren que el RNA^ s i n t e t i z a d o en espermatocitos paquiténicos y espermátides redondos, pudiera ser almacenado en el Cuerpo Cromatoide, aportando una fuente de RNAm para l a d i f e r e n c i a c i ó n c e l u l a r p o s t - m e i ó t i c a ( 76 ) . S í n t e s i s de Proteínas Nucleares. Cambios Cromatínicos en Espermiogénesis.El núcleo de los espermátides de l o s mamíferos, s u f r e profundos cambios morfol ó g i c o s , l o s cuales ya hemos d e s c r i t o , y además modificaciones bioquímicas que involucran a la cromatina, cambios que son claramente adjudicables al proceso de c i t o d i f e r e n c i a c i ó n , y que ocurren con un contenido constante de DNA y s i n actividad transcripcional ( c i t a d o por Redi 1983). La t r a n s i c i ó n e s t r u c t u r a l de la cromatina, a una e s t r u c t u r a altamente con_ densada, se acompaña de profundos cambios en l a composición de las proteínas básicas nucleares. Durante el proceso de maduración del espermatozoide, la f o £ mación de puentes d i s u l f u r o entre los grupos t i o l e s de Tas proteínas nucleares y l a e l i m i n a c i ó n de RNA del núcleo sucede concomitantemente ( 81 ) . A n i v e l t e s t i c u l a r , e s p a r t i c u l a r m e n t e notable l a s u b s t i t u c i ó n de histonas r i c a s en L i s i n a por histonas r i c a s en a r g i n i n a , con l a a p a r i c i ó n de proteínas nucleares básicas e s p e c í f i c a s de t e s t í c u l o ( 44 ) . Estas proteínas nucleares, las Protaminas, comienzan a s i n t e t i z a r s e en el e s t a d i o 12 de l a espermiogénes i s ; la s u b s t i t u c i ó n de histonas por protaminas, causa una condensación e x t r e ma del genoma paterno ( 7,61 ) . B.- Alteraciones Producidas en l a Espermatogénesis del Ratón por Agentes F í sicos y Químicos. Además de lo d e s c r i t o en la i n t r o d u c c i ó n , con respecto a la inducción de anomalías morfológicas de espermatozoides de r a t ó n , como prueba carcinogénica el conocimiento acerca de l a s e n s i b i l i d a d de las c é l u l a s espermatogénicas a la acción de agentes mutagénicos f í s i c o s y químicos, determina l a e x i s t e n c i a de una abundante l i t e r a t u r a acerca de éste tema. En esta sección se expondrán separadamente las a l t e r a c i o n e s producidas en espermatozoides y las producidas en c é l u l a s espermatogénicas; en éste ú l t i m o caso se d e s c r i b i r á n estudios de t i p o c i t o g e n é t i c o así como estudios morfológicos con microscopía de luz y e l e £ trónica. a ) . - A l t e r a c i o n e s en Espermatozoides. Desde hace tiempo se ha indicado que t a n t o en el ratón como en el hombre, c i e r t o porcentaje de espermatozoides muestra una morfología anormal. La f r e cuencia de anormalidades y el t i p o de e l l a s , puede v a r i a r en d i f e r e n t e s cepas, pero se mantiene constante para una cepa en p a r t i c u l a r . Se ha sugerido que los t i p o s y frecuencias están bajo c o n t r o l genético ( c i t a d o por Soares 1979). Bruce y c o i s . (1974), observaron que l a r a d i a c i ó n i o n i z a n t e , a dosis ba- j a s de 30 rads, aumenta l a frecuencia de espermatozoides morfológicamente anor males, que se extiende por v a r i a s semanas, y propusieron que el estudio de las anormalidades de los espermatozoides, podría ser usada como una prueba de muta genicidad en mamíferos. La inducción de a l t e r a c i o n e s morfológicas en espermatozoides de ratón ha sido reportada por muchos investigadores ( 8 , 9 , 9 0 , 9 5 , 9 7 , 9 8 , 1 0 3 ) , como prueba del p o t e n c i a l mutagénico de agentes químicos y r a d i a c i o n e s . Sin embargo, es 'conveniente considerar los reportes hechos de incrementos en espermatozoides anormales por h i p e r t e r m i a ( 58 ) y r e s t r i c c i o n e s d i e t a r i a s ( 46 ) . Agentes de conocida acción mutagénica, teratogénica y carcinogénica, pro ducen una elevación en el porcentaje de formas anormales de espermatozoides ( 9 7 ) , los cuales son presentados en la f i g u r a 35 . La inducción de m u t a c i o - nes por r a d i a c i ó n , que afectan l a morfología del espermatozoide, ha sido evj_ denciada recientemente por Hugenholtz (1983). La forma en que se inducen éstas anomalías aún no es c l a r a , se han a d j u dicado a aberraciones cromosomales, aunque l a búsqueda de translocaciones in- dican que ésto es poco probable ( 8 ) ; parece ser más f a c t i b l e que los cambios puedan deberse a a l t e r a c i o n e s en los genes responsables de la espermatogénesis ( 97 ) . También es f a c t i b l e que se induscan cambios en l a expresión génica du_ rante l a t r a n s c r i p c i ó n ó el translado de l a información genética. Sin embargo aún en ausencia de un c l a r o entendimiento del mecanismo de inducción de anomalías morfológicas de espermatozoides, ésta prueba ha r e s u l tado ser de gran v a l o r en l a búsqueda de agentes que pudieran ser de e f e c t o deletéreo para el hombre; ya que los gametos masculinos pueden ser examinados rápidamente, en forma r e p r o d u c i b l e y en gran número ( 97 ) . El tiempo de a p a r i c i ó n de las formas anormales de espermatozoides puede ser i n d i c a t i v a de l a etapa de l a espermatogénesis ó las c é l u l a s espermatogé-nicas que son afectadas por el agente administrado. El Thiram ( s u l f u r o de b i s d i m e t i l - t i o x i l - c a r b a m o i 1 ) , un agente f u n g i c i d a , produce elevaciones del porcen_ t a j e de espermatozoides anormales, 5 semanas después de l a a d m i n i s t r a c i ó n del t ó x i c o , indicando ésto que el daño ha o c u r r i d o en etapa p r e m i ó t i c a , es d e c i r en espermatogonias t a r d í a s ó espermatocitos tempranos ( 103 ) . Aunque se ha sugerido por o t r o s autores que muchos mutágenos probados dan lugar a incrementos de espermatozoides anormales a p a r t i r de espermatogonias t r a t a d a s , como es el caso de la Mitomicina C, ( 95 ) , las anormalidades en espermatozoides inducidas por agentes mutagénicos, son más relevantes 5 semanas después de l a exposición ( 97 ) . Por o t r a p a r t e l a exposición a mutágenos durante l a espermatogénesis t a r d í a (espermátide), no parece conducir a ningún incremento substancial en anomalías de espermatozoides ( 98 ) . Fig, No. 35 Agentes químicos que producen alteraciones morfológicas en espermatozoides de ratón, (citados por Wyrobeck 1975). Actividad Reportada: Agente Químico Mutagénica Teratogénica Carcinogénica Actioroicina D + + + Aminopterina + + Benzo + + (a) pireno Colchicina + + + Ciclofosfamida + + + Diclorvós + + + + Dietilestilbestrol Etilmetano Sulfonato + + + Griseofulvina + Hidroxiurea + + Inmurán + + 5-Iodo-de-oxiuridina + + Metil-colantreno + + + Metil-metano-sulfonato + + + Metepa + + + Mitomicina C + + + Myleran + + + Un aspecto más importante sobre l a inducción de anomalías morfológicas en espermatozoides de r a t ó n , es el hecho de que éstas anomalías pueden ser heredables, ya que l a progenie F 1 y ?2* de raton e s t r a t a d o s para i n d u c i r - es- permatozoides anormales, presentan incrementos de éstos ( 37,95 ) ; ésto con— f i r m a e l hecho de que las frecuencias aumentadas de espermatozoides aberrantes, es i n d i c a t i v a de mutagenesis ( 90 ) y que l a prueba puede ser de u t i l i d a d para l a i d e n t i f i c a c i ó n de compuestos que causen daño genético t r a n s m i s i b l e en mamíf e r o s ( 95 ) . A éste r e s p e c t o , estudios c i t o g e n é t i c o s i n d i c a n que l a forma del espermatozoide es altamente heredable; que l a f r a c c i ó n de espermatozoides anormales está controlada por una m u l t i t u d de f a c t o r e s autosómicos y que probablemente i n v o l u c r e a l o s cromosomas sexuales ( 98 ) . El estudio de las formas anormales de espermatozoides ha sido hecho en f r o t i s ó extensiones del contenido del epidídimo y conducto deferente de l o s ratones t r a t a d o s , teñidos con Eosina y examinados a 400 X ( 97 ) . La mayoría de las a l t e r a c i o n e s d e s c r i t a s por éste método corresponden a a l t e r a c i o n e s de la forma de l a cabeza del espermatozoide, e n t r e las que se describen formas s i n gancho, cabezas con forma de p l á t a n o , cabezas amorfas, formas plegadas y formas con doble f l a g e l o , las cuales se presentan en l a f i g u r a 3£. D e t a l l e s más f i n o s ó bien estudios u l t r a e s t r u c t u r a l e s de estas formas anómalas de e s permatozoides no han sido presentadas en l a literatura. Recientemente se ha propuesto o t r o método c u a n t i t a t i v o que determina l a producción de espermatozoides anormales para l a evaluación t ó x i c a de agentes contaminantes ( 11 ) basado en l a obtención de espermatozoides t e s t i c u l a r e s - por sonicación y para completar estudios h i s t o p a t o l ó g i c o s del t r a c t o reproduc t o r ; ésta t é c n i c a ha sido propuesta para d e t e c t a r efectos s u t i l e s t a l e s como oligospermia en ausencia de lesiones histopatológicas. E U e s t u d i o morfológico de los espermatozoides para l a evaluación del -- efecto genotóxico de agentes químicos, puede ser complementado con o t r o s da- tos f e n o t í p i c o s del espermatozoide como l o son la m o t i l i d a d , el número de espermatozoides producidos y l a a c t i v i d a d p r o t e o l í t i c a acrosomal ( 26,27 ) . Estos t r e s parámetros se ven afectados cuando e l t r a t a m i e n t o con agentes mutagé nicos (Mitomiciria C), es dado a n i v e l del espermatocitos p r e l e p t o t é n i c o s y es permatogonias. En cambio no se producen a consecuencia del t r a t a m i e n t o de espermátides y espermatozoides ( 27 ) . Se ha reportado disminución de l a m o t i l i dad de los espermatozoides a consecuencia de l a a d m i n i s t r a c i ó n también de tera_ tógenos ( 26 ) . b) A l t e r a c i o n e s en Células Espermatogénicas. La búsqueda de modelos experimentales apropiados en los que el p o t e n c i a l mutagénico de substancias químicas pueda ser medido, ha conducido a l a u t i l i z a ^ ción de las c é l u l a s gonadales de mamíferos. El estudio de los gametos se ha complementado con estudios c i t o g e n é t i c o s en las c é l u l a s espermatogénicas del e p i t e l i o germinal en r a t o n e s , donde los cambios cromosómicos pueden ser d e t e r minados directamente ( 79 ) . Los químicos y las radiaciones producen en general muerte de las c é l u l a s germinales, e s t e r i l i d a d temprana, mutaciones y r u p t u r a s cromosómicas { 72 ) . La importancia de a l t e r a c i o n e s cromosómicas en espermatogenias, ha sido reconocida en v i s t a de que las espermatogenias c o n s t i t u y e n l a población c e l u l a r permanente del t e s t í c u l o y e l daño genético inducido en ésta etapa, puede ser de gran s i g n i f i c a d o (19,59 y 88). Se ha reportado que l a a d m i n i s t r a c i ó n de Mitomicina C a dosis de 5 mg/Kg. de peso produce rupturas en la cromatina pericentromérica de espermatogonias en d i v i s i ó n , así como recambio de cromátides hermanas; igualmente C i c l o f o s f a mida, una droga a n t i n e o p l á s i c a , produce elevaciones del porcentaje de formas anormales de espermatozoides ( 97 ) , y ontogenéticamente se ha comprobado que produce rupturas cromosómicas en espermatogonias I y B, además de f a l t a de - disyunción en d i a c i n e s i s con a p a r i c i ó n de univalentes ( 1 , 7 4 , 7 9 ) . Un agente - - Pag. 46 a r i t i r i e o p l á s i c o , e l s u l f u r o de t r i s (2 m e t i l - 1 a z i r i d i l ) f o s f i n a ó THIOTEPA, - produce trarislocaciones en espermatocitos primarios. El daño genético y somático inducido por agentes químicos muestra especj_ f i c i d a d y es s e l e c t i v o para d i f e r e n t e s etapas de las c é l u l a s germinales masci¿ l i n a s ( 71 ) . En l a f i g u r a 37_ , se resumen l o s cambios inducidos por diversos agentes químicos, reportados en l a l i t e r a t u r a , y el t i p o de c é l u l a espermatogénica e s p e c í f i c a que a f e c t a n . Cabe destacar e n t r e e l l o s e l Etilmetanosulfona t o , por ser el agente químico que u t i l i z a m o s en nuestro e s t u d i o , el cual como se i n d i c a , produce mutaciones l e t a l e s dominantes en espermátides y espermatozoides así como mutaciones e s p e c í f i c a s de l o c u s , en estadios p o s t g o n i a l e s , y translocaciones en ésta misma etapa ( 57 ) . Cambios t e s t i c u l a r e s en ratones expuestos a r a d i a c i ó n i o n i z a n t e (1000 r a d s ) , y a agentes mutagénicos (Mitomicina C a dosis de 5 mg/Kg de peso), han sido reportados desde hace tiempo ( 31,53 ) . Ambos agentes tienen efectos si- m i l a r e s : disminución del peso t e s t i c u l a r , disminución de espermatogonias hasta un 10%, de 7 a 14 días después del t r a t a m i e n t o ; disminución de espermatocitos 14 a 28 días después y de espermátides a los 35 d í a s . Estos cambios son prodt¿ cidos por muerte de las espermatogonias, con desaparición de espermatocitos y espermátides, por f a l t a de s u b s t i t u c i ó n por parte de las espermatogonias en las que l a s í n t e s i s de DNA está deprimida. Como se ha podido observar en l o presentado hasta el momento, el aspecto morfológico de los daños inducidos por agentes f í s i c o s ó químicos en el e p i t e l i o seminífero y sobre las c é l u l a s espermatogénicas en p a r t i c u l a r , ha sido - t r a t a d o muy someramente en la b i b l i o g r a f í a d i s p o n i b l e al respecto, y de hecho, pocos estudios se han r e f e r i d o a los cambios e s t r u c t u r a l e s que suceden en l a espermatogénesis a consecuencia de agentes mutagénicos. Parvinen (1979a) r e p o r t a los efectos tempranos de l a Procarbazina, en - segmentos^de túbulos seminíferos dañados, analizados con microscopía de contras t e de f a s e . Las a l t e r a c i o n e s tempranas se v i e r o n en espermatocitos zigoténicos -o o n 0) cr o N} Tf 3 CO 2 0) 0» 3 i.. + — .V QJ 1 O o> I S o O DJ rt 0 "O C "5 P3 01 3 t—' tt) •s Qjv 3 << 3 Prt O 3 p. O p. 3 ai o s n H m TJ + i—i 3 en 3 3 cn > X p. a i o X p. c ^ f &tj + "H + .-s cr O cr i o cr n i i CÎ- a •—• '—* "i 0 co •ti n> co ri fD T O n •z c n 3 w O T -V o en -h tu 3 H" a 0) CL 3 et fD en ,o e pi g p. o o to e- 3 fl> C r+ r+ &i Q) O (t PW 0 3 a o « 3 + 0 1 a. £CD p. û) 3 P. O P« 3 ÎU 0 1 CL. \-< P. 09 CO «J oo n OJ T »-h tu >-h o n pv r+ 3 ÎU O n XJ a co O a> XJ 1 (ti eu < era ^ 3 eu a> Qj 3 rt — i * » rt O o CD OQ M CO O CJ p. C C Ol r-t PV M O 3 -3 /«S rc n o a* co CO o rj 3 OD tr T 171 to CD W <7< 1 ^ h(î ro ÜJ CO •S 3 V Cu GJ o r+ i-k (Dv O H" O s» n C ^ P- e rt CO Ûl O en œ CO T (> C" co o -J a> en T 3 m w Û> o ÍK, n M -o il» X) to 3 p. 0} -J n Oí £Uv ir m r-t p. -0 0) a CT> 3 !î> en T O (0 CD ca -4 c CO CO o -J eny — 6 3 ÛJ — i C ts 0 y , —•• • + + Cu ÖJ 0) n 3 M C T.3 f+ 0J o a p. (n o 3 C (t> O co o c co 0 1 ci- r. i G. + •f + •+ CL 01 1 p- 01 Cu a. + n > "S cr 0 n> 3 4 O 4 CO D Ov O 3 M. p. 0 O3 CU ft> w CO O C2 / 2 pk > 3 rt 3 ce O p. V) TJ M >-5 O CL Tu o ^ C > S o 3 OT rt ^ ft ^ 3» 3 n c. r-t r~ Ñ — C1 r- ' O ^ *— - w . • ^ • H H H ^ S 21 hH tn M as se M S S tn s z S HH M S en en H en G CO O 73 M > H T) > 2 M T 3 > > co 73 trJ < M > H G H H^ ÛJ 3 -3 rr p. o rt (0 TJ ÛJ H M S 73 > CO CO c1 IHi C o o— /<nS CD M. W 1 a. p. o r+ H*» >-• rf P0 X P. 1— 1 O Ol •J CT fiJ 3 O P. M CO c I-1 Hl C o Cb rt) rt •S H. W y^s fO 3 <> t rt HH 1 P» ÛJ N M. rs H* a p. H.1 "h 0 w Hi p. 3 Cu H H p. <> t rt p. (D 3 3 fD M Û> 3 p. 3 ai -a 0 •o p. 1—• 3 o rt ÛJ 3 O M C1 IHi O 3 Û) rt O S m rt p. M 3 ft> rt ÛJ 3 O M C M Hi O 3 ÛJ r+ 0 O >-i X V) p. O a tf o O a T3 m p. M rt 3 <t p. rt en ÛJ 3 ro 0 « 3 C ÍD H rt Hi p. 0 h- 3 1 m h^ rt o PU N P. P. CL p. h1 o en -n p» 3 ÛJ M rt p. M 3 prt T O Cfl o e ^ (t) ÛJ M rt P. M 3 <> t rt û> 3 0 M C1 lPi O 3 ÛJ rt O o l .a + o i -CL _- 3 Eu O Ov 3 T 7= CM. . y medios p a q u i t é n i c o s , especialmente en sus cromosomas. A dosis a l t a s l a Procarbazine produjo daño también en espermátides redondos» y r e t a r d o en l a es— permiación probablemente a consecuencia de acción p r i m a r i a a n i v e l de l a c é l j j l a de S e r t o l i . Un e s t u d i o sobre l a morfología t e s t i c u l a r en casos de a t r o f i a inducida por químicos no relacionados e n t r e s í (Acido f t á l i c o , Oxido de e t i l e n o , Hexafluoroacetona y a c r i l a m i d a ) , proporciona más d e t a l l e s sobre los cambios hist£ p a t o l ó g i c o s , señalando la a p a r i c i ó n de túbulos a t r o f í e o s , con disminución del diámetro y depleción del e p i t e l i o g e r m i n a l , donde los espermátides en maduración fueron los más dañados, y con l a a p a r i c i ó n de c é l u l a s gigantes m u l t i n u — cleadas ocasionalmente; en túbulos más severamente dañados los espermatozoides y espermátides desaparecieron, y el e p i t e l i o germinal comprendía sólo una capa delgada de espermatocitos y espermatogonias ó bien sólo una capa de espermatogenias y c é l u l a s de S e r t o l i ; éstas a l i g u a l que las c é l u l a s de Leydig, no mos_ t r a r o n a l t e r a c i o n e s . Túbulos menos dañados presentaron degeneración de espermátides en maduración y numerosos g l ó b u l o s e o s i n ó f i l o s que contienen espermát i d e s maduros p i c n ó t i c o s ; ya que las espermatogonias no presentaban cambios degenerativos n i n e c r ó t i c o s , la a t r o f i a t e s t i c u l a r producida por éstos agentes químicos se considera r e v e r s i b l e ( 33 ) . En nuestra búsqueda de a l t e r a c i o n e s u l t r a e s t r u c t u r a l e s en c é l u l a s espermatogénicas a consecuencia del t r a t a m i e n t o con agentes f í s i c o s ó químicos, so^ lamente encontramos las a l t e r a c i o n e s h i s t o l ó g i c a s y u l t r a e s t r u c t u r a l e s en t e ^ t í c u l o s de rata sometidos a i n h a l a c i ó n crónica de adelgazador de p i n t u r a s (60); dicho estudio señala la pérdida de peso t e s t i c u l a r y del t e j i d o adiposo vecino, disminución en l a cuenta de espermatozoides en suspension y en c o r t e s de t e s t í c u l o , r e t r a c c i ó n y vacuolización del citoplasma de las células espermatogéni— cas en el estudio con microscopía de luz y l a a p a r i c i ó n de granulos electroden sos, vacuolas abundantes e i r r e g u l a r e s de contenido electrodenso y mitocondrias dispersas, en espermatogonias, espermatocitos y espermátides, a n i v e l ultraes- tructura"). Igualmente con microscopía e l e c t r ó n i c a se observaron abundantes es permatides inmaduros y anormales de l o c a l i z a c i ó n anormal. Las anomalías encon tradas en los espermátides se l o c a l i z a r o n sobre todo a n i v e l del acrosoma. En c é l u l a s de S e r t o l i se observaron r e t r a c c i ó n y disminución del tamaño, aumento en el número de lisosomas, vacuolas de m a t e r i a l electrodenso y cuerpos m u l t i vesiculares. 1020127848 I I I . MATERIAL Y METODOS Se u t i l i z ó como m a t e r i a l b i o l ó g i c o , 24 ratones machos de genotipo híbrj_ do (C57 BL X C3H) F l , de 8 a 12 semanas de edad. La selección de ésta cepa de animales se basó en reportes previos de la l i t e r a t u r a , que la señalan como una de las mejores para éste t i p o de ensayos por presentar un porcentaje muy bajo de anomalías morfológicas de espermatozoides. Los ratones fueron ob tenidos de Charles R i v e r , Breeding Laboratories Inc. Para l a inducción de anomalías morfológicas en espermatozoides se e m pleó una agente mutagénico: El e t i l m e t a n o s u l f o n a t o (de Sigma Che. C o . ) , el cuál ha sido reportado j u n t o con el metiImetanosulfonato como químicos de una potente acción sobre laforma del espermatozoide ( 97 ) . Se l l e v a r o n a cabo dos experimentos s i m i l a r e s , en cada uno de los cuáles se formaron cuatro grupos de 3 ratones cada uno. El e t i l m e t a n o s u l f o n a t o se ad m i n i s t r ó por v í a i n t r a p e r i t o n e a l a dosis de 200 mg/Kg. de peso, d i a r i a m e n t e , durante 5 días consecutivos. Uno de l o s grupos fué usado como c o n t r o l , inyec^ tándosele únicamente el v e h í c u l o ; 0.3 mi. de agua t r i d e s t i l a d a . Después de l a a d m i n i s t r a c i ó n del e t i l m e t a n o s u l f o n a t o , l o s ratones se man t u v i e r o n en cuarto a temperatura de 25°C, con c i c l o s controlados de luz-obscu r i d a d , y alimentados con Purina Lab. Chow. Los ratones fueron s a c r i f i c a d o s por d i s l o c a c i ó n c e r v i c a l ; el primer grij po de ratones se s a c r i f i c ó 3 semanas después de l a ú l t i m a inyección de e t i l metanosulfoanto; el segundo grupo y el grupo c o n t r o l se s a c r i f i c a r o n a las 4 semanas y el t e r c e r grupo a las 5 semanas; de ésta forma se cubrió toda la duración del c i c l o del E p i t e l i o Seminífero, reportada por Oakberg (1957) como de 35 d í a s . Una vez s a c r i f i c a d o s los r a t o n e s , se disecaron; t e s t í c u l o s , epidídimos y conductos d e f e r e n t e s . Los epidídimos y conductos d e f e r e n t e s , de cada r a t ó n , se fragmentaron - con t i j e r a s y pinzas y se suspendieron en 0.6 mi. de s o l u c i ó n amortiguadora de f o s f a t o s , 0.2 m o l a r , de pH 7 . 3 . La suspensión se f i l t r ó dos veces, con r e j i l l a s de 200 mesh para e l i m i n a r fragmentos de t e j i d o s , y se h i c i e r o n con e l l a 10 f r o t í s ó extensiones, los cuáles se t r a t a r o n de la s i g u i e n t e manera: 1) Secado al a i r e por 12 horas. 2) F i j a c i ó n en una solución de: Metanol absoluto 85% Formaldehído 10% Acido a c é t i c o 5% durante una hora. 3) Lavado en agua (10 inmersiones). 4) Tinción con Eosina "Y" acuosa al 5%, por una hora. 5) Secado a temperatura ambiente por 24 horas. 6) Lavado en Etanol para r e t i r a r el exceso de c o l o r a n t e . 7) Secado al aire. Las l a m i n i l l a s se a n a l i z a r o n con microscopio de luz (Zeiss K7) a 600 X, y en cada una de e l l a s , se contaron 100 espermatozoides para establecer el -- porcentaje de anomalías m o r f o l ó g i c a s . De l o s t e s t í c u l o s disecados en cada r a t ó n , uno de e l l o s se f i j ó en L í q u i do de Zenker por 12 horas, después de i n c i d i r la albugínea; se lavó con agua c o r r i e n t e por 24 horas, y se deshidrató con cambios de alcohol en grados ascendentes, para i n c l u i r s e en p a r a f i n a por los métodos convencionales. Del o t r o t e s t í c u l o se obtuvieron fragmentos de 1 a 2 mm. de espesor, que se f i j a r o n de inmediato por el método recomendado por Hayat (1972), para el estudio u l t r a m i c r o s c o p i o de espermátides. Las soluciones empleadas y el método se d e t a l l a n a c o n t i n u a c i ó n : Solución A. Solución B. Glutaraldehído al 25% 25 mi. B u f f e r de c a c o d i l a t o s 0 . 1 M. pH 7.2 75 mi. Sacarosa 7.5 g r s . B u f f e r de c a c o d i l a t o s 0.1 M. pH 7.2 100 mi. Solución C. Dicromato de Potasio a l 5% 16 mi. Hidróxido de Potasio 2.5 N. 2 mi. Agua d e s t i l a d a 2 mi. B u f f e r de cacodilatos 0 . 1 M. pH 7.2 Solución D. Tetraóxido de Osmio B u f f e r de c a c o d i l a t o s 0 . 1 M. Sacarosa 20 mi. 1 grs. 100 mi. .4 M. METODO: 1.- F i j a r piezas pequeñas de t e s t í c u l o s en la s o l . A por 1 hora a 4°C. 2.- Lavar y guardar los especímenes en l a Sol. B por 30 h r s . a 4°C. 3.- Pasar a l a Solución C por 30 minutos a 4°C. 4.- Lavar en la solución B y p o s t - f i j a r en l a solución D por 80 minutos a 4°C. Una vez f i j a d o s los fragmentos de t e j i d o s , se lavaron con l a solución B, se deshidrataron e incluyeron en Epoxiresina LX112, por l a técnica habitual- ( 55 ). E1 t e j i d o t e s t i c u l a r i n c l u i d o en parafina se u t i l i z ó para estudio h i s t o l ó gico con microscopía de l u z , para l o cuál se obtuvieron secciones de 3 mieras de g r o s o r , que fueron tratadas con solución Yodo-yodurada de Lugol, para e v i t a r p r e c i p i t a d o s de c l o r u r o mercúrico componente del l í q u i d o de Zenker. Los c o r t e s se t i ñ e r o n por los métodos de Hematoxilina y Eosina, reacción de S c h i f f y método de Gomori para f i b r a s r e t i c u l a r e s ( 56 ) . El ú l t i m o de éstos métodos, se u t i l i z ó en v i s t a de que demuestra en forma rápida y exacta información sobre l a organización del túbulo seminífero y asociaciones c e l u l a r e s , c a r a c t e r í s t i c a s de cada etapa del c i c l o del e p i t e l i o semi_ nífero. Se estudiaron 3 l a m i n i l l a s con secciones seriadas del t e j i d o de cada r a t ó n , es d e c i r 9 l a m i n i l l a s por grupo y un t o t a l de 72 en los dos experimentos. Por o t r a parte del t e j i d o i n c l u i d o en LX112 se h i c i e r o n c o r t e s de .25 mieras de g r o s o r , que se t i ñ e r o n con Azul de T o l u i d i n a y cortes de 900 amstrongs obtenidos con c u c h i l l a de diamante, en e l ultramicrotomo S o r v a l l MT-1, que se t i ñ e r o n con c i t r a t o de plomo y acetato de u r a n i l o ( 35 ) . Los cortes del t e j i d o i n c l u i d o en P a r a f i n a , a s i como l o s de .25 mieras de grosor se estudiaron en Microscopio Zeiss K7. El estudio de Microscopía - E l e c t r ó n i c a se l l e v ó a cabo con microscopio e l e c t r ó n i c o de transmisión Zeiss EM 109; de l a s áreas más r e p r e s e n t a t i v a s se tomaron f o t o g r a f í a s con p e l í c u l a Agfa-Pan Profesional que se ampliaron e imprimieron en papel Kodabromide. F3. IV.- RESULTADOS. A . - Inducción de a l t e r a c i o n e s en l a forma del espermatozoide de ratón por E t i 1_ metanosulfonato. (EMS). En una etapa p r e l i m i n a r a nuestro e s t u d i o , se e s t a b l e c i e r o n los porcentaj e s de formas anormales de espermatozoides y el t i p o de anomalías para l a cepa de ratones u t i l i z a d a en éste estudio y las cepas p r o g e n i t o r a s . En l a cepa C57BL/6n se presentaron 10.65% de espermatozoides de forma - anormal; en C3H e l porcentaje fué de 11.6 y para l a cepa h í b r i d a (C57BL X C3H) Fj fué de 1.65. Esta notable disminución en el p o r c e n t a j e de espermatozoides de forma anormal, r e s u l t ó muy p r o p i c i a para l a detección del efecto del EMS a éste n i v e l . Las a l t e r a c i o n e s morfológicas encontradas se c l a s i f i c a r o n en cuatro g r u pos, que se i l u s t r a n en l a f i g u r a 38, y corresponden a defectos del gancho, formas f i l a m e n t o s a s , formas con doble cabeza ó doble cola y espermatozoides amorfos. Hubo d i f e r e n c i a s en cuanto al t i p o de a l t e r a c i ó n morfológica prevale c i e n t e , siendo para C57BL más frecuente el t i p o amorfo, para C3H l a forma fi- lamentosa y para el h í b r i d o (C57BL X C3H)F^, el t i p o amorfo y los defectos del gancho. Los porcentajes correspondientes se presentan en la f i g u r a 39. No se observaron efectos tóxicos en los ratones a consecuencia de l a admi_ n i s t r a c i ó n del EMS a las dosis indicadas, ya que s i g u i e r o n comiendo y bebiendo normalmente, aunque se v i ó disminución de l a a c t i v i d a d f í s i c a en los días s i guientes al t r a t a m i e n t o e i r r i t a c i ó n en el s i t i o de l a i n y e c c i ó n . No se regis_ t r ó muerte de los animales en ninguno de los experimentos. Se produjo en general una elevación en el p o r c e n t a j e de formas anormales en los ratones t r a t a d o s con el agente mutagénico, que no se observó en los ra tones del grupo c o n t r o l a los que solo se les a d m i n i s t r ó agua t n a e s t i l a d a . Se presentaron d i f e r e n c i a s en los incrementos detectados a 3,4 y 5 sema- Pag. 57 o Cn -J CD O f o 2 X H ?Ö O Cto f re O O cn cn -J -J CO W f f M i-i MX M X M O O CO SC 0 01 -4 CO f H X o co re o cn -o M C X > o t-to re O en -J CO t* I 25 O O co •n M Gì > •n m CO eo CO œ N5 CO ID Ol CO en C O «sj CTI en OD CTI CO C/l to NO O CO co en w •F tO cn cn CO cn IO CD co cn CO CO CO CO cn Z O o > a > CO M f w co W > a> l£> IO CTI ro <T> cû ro cn CT> en PO o S3 -J cn cn CT> Z O w s > c M CO M <J> cn cn cn cn o -J •F CO N> cn CD 35 o a M M a M ^ 3 Gì M > O o CO 25 H O o re co o to co -f cn O <û -O O cn •f so to cn <1 cn fO CO cn co o co a ro cn cn F cn CO cn • CT) to en • > CO fO cn 3 o SO O co CD M t> 3 CD 3 -3 O LO > CO F fO 03 O cn o cn cn W 1 i o 1 •~J 1, 1 1 1 1 1 H1 en en • «ft o > CO M TJ O 73 3 > CO c TI o w O f O 50 cn o 3 3 > CO n a» 133 . > ci CS3 > í i O i ! i i i' oa CD tM n iro Z O c o o M O 525 a tri > f H M g n M o 55 M co n s f> TI O 50 > O n w co n 50 3 > H O N O i-f O M CO o M TO > -3 O 22 •n o 70 177 3 CO • ñas del t r a t a m i e n t o , l o mismo que en el t i p o de a l t e r a c i o n e s más f r e c u e n t e s . La máxima elevación en el porcentaje de formas anormales se observó a las cu£ t r o semanas d e l t r a t a m i e n t o , encontrándose 12.35% de formas anormales de e s permatozoides y fueron más comunes las formas filamentosas y los espermatozoi_ des amorfos t a n t o a las 3 como a las 4 semanas, mientras que a las 5 se v i e - ron más los defectos del gancho. Los porcentajes correspondientes se presen-tan en l a f i g u r a 40, en e l que puede apreciarse que los resultados del segundo experimento son Consistentes con l o s del primero. La prueba e s t a d í s t i c a aplica^ da i n d i c a que e x i s t e un 95% de grado de c o n f i a b i l i d a d para los resultados de éste ensayo ( f i g u r a 40). B . - A l t e r a c i o n e s presentadas en el e p i t e l i o seminífero de ratones t r a t a d o s con EMS. El estudio m o r f o l ó g i c o de l a s a l t e r a c i o n e s producidas en el e p i t e l i o sem i n í f e r o de ratones t r a t a d o s con el agente mutagénico, fué r e a l i z a d o sobre to do en cortes h i s t o l ó g i c o s de 3 mieras de grosor en l o s que un gran nCrnero de túbulos seminíferos pudo ser estudiado comparativamente. Aunque los c o r t e s de .25 mieras de grosor del t e j i d o i n c l u i d o en resina LX112, ofrecen una mejor re s o l u c i ó n , su desventaja fué que sólo unos pocos túbulos pudieran a n a l i z a r s e com parativamente en un c o r t e ; s i n embargo fueron de u t i l i d a d para corroborar y d£ t a l l a r l o s hallazgos hechos en c o r t e s de 3 mieras, para l a l o c a l i z a c i ó n de espermátides anormales y en l a s e l e c c i ó n de áreas con daño mínimo para el estudio ultraestructural. OBSERVACIONES GENERALES.Aunque el tamaño y el peso t e s t i c u l a r no fueron precisados en éste e s t u d i o , no se apreciaron h i p o t r o f i a ó a t r o f i a t e s t i c u l a r en las secciones histo- l ó g i c a s . La albugínea apareció í n t e g r a , así como l o s tabiques de t e j i d o cone£ Fig. 40 Determinación estadística del grado de confiabilidad de los resultados. N = - — — L (donde) t = cte. = 1.96 X 2 P = % de formas normales Q = % de formas anormales L = % de significación (100% - % de Significación = Grado de Confiabilidad). De nuestros datos : (22) (P) (Q) N (4) (94.5) (6.2) N 25 N= 93.7 Fig. 41 Tiempo de sacrificio (número de células que deben contarse para obtener un gra_ do de confiabilidad de 95% en nuestros resultados). Porcentaje de tubulos alterados por el EMS % de tubulos con daño leve. % de Tubulos con daño moderado % de túbulos con daño severo Total de túbulos lesionados, 3 semanas 23 30 5 58% 4 semanas 32 40 9 81% 5 semanas 28 14 12 54% t-ivo i n t e r s t i c i a l , vasos sanguíneos y c é l u l a s de Leydig. Comparados con los c o n t r o l e s , los t ü b u l o s seminíferos mostraron mayor f r a g i l i d a d apareciendo con f r e c u e n c i a d i s t o r s i o n a d o s a causa del e f e c t o mecánico del procesamiento. El daño t u b u l a r f u é muy evidente aunque no u n i f o r m e , encontrándose túbulos de a p a r i e n c i a normal y o t r o s con d i f e r e n t e grado de l e s i ó n . Para f a c i l i t a r ésta d e s c r i p c i ó n los túbulos lesionados se c l a s i f i c a r o n de l a s i g u i e n t e manera: a) Lesión t u b u l a r l e v ? . - En túbulos con membrana basal í n t e g r a , y en los que f a l t a n c é l u l a s en pequeñas áreas y l a organización es de aspecto normal, así como l a t i n c i ó n general del t ú b u l o . b) Lesión t u b u l a r moderada.- Cuando l a membrana basal aparece i n t e g r a pero e l e p i t e l i o se ve afectado con disminución de l a c e l u l a r i d a d y pérdida del ordenamiento normal de las c é l u l a s ; l a t i n c i ó n general del túbulo se ve disminuida y l a f r a g i l i d a d del e p i t e l i o es mayor. ( F i g s . 43,45 y 46). c) Lesión t u b u l a r severa.- La membrana basal sigue siendo normal aunque por l a mayor f r a g i l i d a d de los túbulos con f r e c u e n c i a se observan rupturas en e l l a ; el túbulo se ve francamente a l t e r a d o , el e p i t e l i o se reduce a una ó dos capas de c é l u l a s ó bien f a l t a por completo, por l o que l a t i n c i ó n general es p á l i d a . ( F i g . 47). PORCENTAJE DE TUBULOS LESIONADOS. Un recuento de l o s túbulos dañados nos p e r m i t i ó determinar que el grado de l e s i ó n v a r i ó según e l d i f e r e n t e tiempo t r a n s c u r r i d o después de la administ r a c i ó n del EMS. A las t r e s semanas el 58% de los túbulos presentaron daño, l a mayor parte de e l l o s moderado a leve y sólo el 5% mostró daño marcado; a las cuatro semanas e l daño fué más extenso, e l 81% de los túbulos presentaron le- s i ó n , 40% daño moderado y 9% mostraron daño marcado; a las cinco semanas 44" de los túbulos presentaron l e s i ó n , 28% con daño leve y 12% con l e s i ó n marcada. Estos datos se presentaron en l a F i g . 41. Los cambios producidos a n i v e l de - cada t i p o c e l u l a r en el túbulo s e m i n í f e r o , se d e s c r i b i r á n a c o n t i n u a c i ó n , seña lando a l a vez las observaciones hechas con microscopía e l e c t r ó n i c a . ALTERACIONES EN ESPERMATOGENIAS. Los cambios producidos en espermatogonias fueron mínimos y éste parece ser el t i p o c e l u l a r menos afectado de las c é l u l a s espermatogénicas. a) Número.- Hubo disminución en el número de espermatogonias o s t e n s i b l e sobre todo en túbulos de daño moderado a severo en éstos ú l t i m o s algunas zonas aparecían desprovistas de espermatogonias ( F i g . 4 3 ) . En los ratones sacrificados a las t r e s semanas, l a disminución fué poco marcada y v i s i b l e en las primeras etapas del c i c l o del e p i t e l i o seminífero. A las cuatro semanas la f a l t a de permatogonias se observó por igual en las primeras y las últimas etapas del c i c l o , mientras que a las cinco semanas l a disminución de espermatogonias se notó más en las ú l t i m a s etapas del c i c l o del e p i t e l i o seminífero. b) M i t o s i s . - Salvo en las etapas IX a X I I , se vieron pocas espermatogonias en d i v i s i ó n . Sólo ocasionalmente se vieron c é l u l a s de éste t i p o en degeneración, y específicamente en túbulos con daño l e v e . c) L o c a l i z a c i ó n . - En éste aspecto no se observaron cambios, ya que las espermatogonias permanecieron siempre en el compartimiento basal del e p i t e l i o semj^ nífero. d) M o r f o l o g í a . - No se detectaron cambios morfológicos a n i v e l de microscopía de l u z y e l e c t r ó n i c a . CAMBIOS EN ESPERMATOCITOS. Este fué uno de los t i p o s c e l u l a r e s más dañados, encontrándose cambios sobre todo en espermatocitos paquitenicos medianos y t a r d í o s . No se observaron cambios en z i g o t e n o , y se v i e r o n pocos espermatocitos primarios en d i p l o t e n o y d i a c i n e s i s así como espermatocitos secundarios. Los cambios observados en es- X 64 Tübulos seminíferos normales del gru po control. El túbulo superior muestra una asociación celular correspon diente a la etapa III del ciclo del epitelio seminífero. La pared del tü bulo muestra espermatogenias B, célu las de Sertoli, espermatocitos paqui tónicos, espermátides redondos y espc-rma^ides 33. El túbulo inferior pre senta una asociación celular compatible con la etapa V del ciclo del epitelio seminífero. Objetivo 40 X. F i g u r a Dos tübulos seminíferos de las etapas III y IV que presentan lesiones de gra do moderado a consecuencia de la administración de EMS. En ambos túbulos se observa una notable disminución de la población celular a expensas de las cé lulas e=;permato--'nicas. La disminución es marcada en cuanto i espeimatogonius y espermatocitos primarios. El número de espermátidos tempranos es también mucho menor, (compárese con la fotografía anterior). Objetivo 40 X. No. 4 2 permatocitos paquiténicos fueron los s i g u i e n t e s : a) Número.- Se observó una disminución de éstas c é l u l a s en todas las etapas del c i c l o del e p i t e l i o s e m i n í f e r o , aún en túbulos con daño l e v e , donde f a l t a ban espermatocitos en pequeños segmentos, dejando huecos en l o s s i t i o s corres^ pondientes. Las áreas afectadas por éste cambio fueron mayores en túbulos de daño moderado, y en l o s de l e s i ó n severa, en los que l l e g a r o n a desaparecer por completo en grandes áreas. b) L o c a l i z a c i ó n . - En túbulos con l e s i ó n leve no se observaron cambios en el - acomodo normal de las c é l u l a s , que se presentaron acompañando a los defectos en el número de las c é l u l a s , encontrándose espermatocitos aún en l a luz del - túbulo s e m i n í f e r o . c) M o r f o l o g í a . - Se presentaron cambios nucleares y c i t o p l a s m á t i c o s que indican l e s i ó n c e l u l a r severa que culminó con muerte y desaparición de muchos espermatocitos. Estos cambios se observaron aún en túbulos con daño l e v e , y en todas las etapas del c i c l o del e p i t e l i o s e m i n í f e r o , y no se observaron d i f e r e n c i a s a i n t e r v a l o s d i s t i n t o s de exposición al EMS. Con microscopía de luz el citoplasma presentó un aspecto filamentoso y disgregado; que en secciones de .25 mieras fué más e v i d e n t e , apreciándose - además pérdida de las granulaciones propias del citoplasma así como desaparición de l a membrana nuclear y plasmática. (Fig. 47). En túbulos con daño leve éstos cambios fueron segmentarios observándose espermatocitos con d i v e r s o grado de l e s i ó n alternando con espermatocitos de aspecto normal. En túbulos con l e s i ó n moderada a marcada e l daño fué más extenso y l a t o t a l i d a d de los espermatocitos mostraron éstos cambios. Con microscopía e l e c t r ó n i c a se vieron espermatocitos con francos signos de muerte c e l u l a r : desaparición de organelos y membranas; o t r o s espermatocitos no mostraron ningún cambio u l t r a e s t r u c t u r a l . En el núcleo, coincidiendo con - éstos cambios c i t o p l á s m i c o s , se observó c a r i ó l i s i s ; apareciendo con microscopía de luz mal d e l i m i t a d o s . Se observó d i s o l u c i ó n de l a cromatina hasta desa- Tubulo seminífero normal, del grupo control, correspondiente a la etapa V ó VI de ciclo del epitelio semini fero. La pared del tùbulo aparece constituida por espermatogenias, es permatoeitos paquiténicos, espermáti des poligonales y una generación más avanzada de espermátides del estadio 15 de la espermiogénesis. Observese la gran cantidad de colas que ocupan la luz del tubulo seminífero.Objetivo 40 X. F i g u r a MicrofotografSa que muestra varios tu bulos seminíferos en los que el daño producido por el EMS es evidente. El tübulo señala ir (flecha), aparece sección longitudinal, lo que permite observar la extensión del daño. La minuciór. de Co[ ci n .togonias y osj e tocitos es muy nurcadi; pocas colas espermátides avanzados se ven en la de éste tübulo. (Compárese con la Fi anterior). Objetivo 25 X, F i r u r a No. U5 No. Ui4 parecer por completo. La desaparición de l a envoltura nuclear fué confirmada con microscopía e l e c t r ó n i c a . CAMBIOS ESPERMATIDES. Con microscopía de luz se detectaron f á c i l m e n t e cambios en espermátides tempranos y algunas formas anormales de espermátides avanzados pudieron obser varse en cortes de .25 mieras. a) Número.- Se observó claramente disminución en el número de espermátides en todas l a s etapas del c i c l o del e p i t e l i o seminífero poco notable en túbulos de daño l e v e , pero francamente evidente en túbulos de l e s i ó n moderada a severa, en algunos de l o s cuales los espermátides desaparecieron por completo. Los espermátides f a l t a n t e s correspondieron en su mayor p a r t e a la Fase de Golgi y de Casquete; l a f a l t a de éstas c é l u l a s dió un aspecto desorganizado al epite- l i o s e m i n í f e r o . Estos cambios numéricos fueron más evidentes a las 4 y 5 semanas después de la a d m i n i s t r a q i ó n del EMS, cuando se observó aún en túbulos con daño l e v e . b) L o c a l i z a c i ó n . - En túbulos de daño moderado l a f a l t a de espermatocitos oca^ sionó una separación aparente e n t r e l o s compartimientos basal y a d l u m i n a l ; se observaron espermátides tempranos en s i t i o s anormales, como l a l u z del túbij l o s e m i n í f e r o , y r a m i l l e t e s de espermátides se observaron desprendidos del e p i t e l i o . Estos cambios se presentaron siempre acompañando a l a disminución de l a población de espermátides y espermatocitos. c) M o r f o l o g í a . - En espermátide en Fase de Golgi y de Casquete (redondos y p¿ l i g o n a l e s ) , se observaron cambios concordantes con muerte de las c é l u l a s , se mejantes a los v i s t o s en espermatocitos p a q u i t é n i c o s : el citoplasma mostró un aspecto filamentoso y disgregado, con pérdida de los l í m i t e s c e l u l a r e s y de las granulaciones propias del citoplasma, como se pudo observar en cortes de .25 ffiieras ( F i g s . 45 y 46). Algunas c é l u l a s mostraron franca a c i d o f i l i a citoplásmica. - Microfotografía en la que se observan tübuJos seminíferos de las etapas IX y X'del ciclo del epitelio seminífero. A este aumento resulta evidente la — dislución y disgregación del citoplas rr.a de los espermatocítos primarios y la resistencia de los espermátides avanzados al efecto tóxico del EMS. Objetivo 40 X. F i g u r a Corte semifino del tejido testicular incluido en resina LXil. Se observan espermatogenias A y B sin alteraciones aparentes, ta porción bisal de la célu la de Sertoli no muestra alteraciones, pero su eitopl\sna medio y apicil ha desaparecido. Va-ios espermatocitos paquitcnicos iiuostr n disolución cito plásmica y v_arióii? is. Me. st obse. vai. •acuolizar ion ci op_a^rr i . i ni picioris nuclear. Objetivo lr>0 X. I' i " ii i a . i > No. 46 Cambios en l a morfología nuclear acompañaron a las a l t e r a c i o n e s citoplás^ micas en éstas c é l u l a s . Los f i n o s grumos de cromatina desaparecieron dando li¿ gar a l a r e t r a c c i ó n y condensación de l a cromatina ( p i c n o s i s n u c l e a r ) . Con f r e cuencia se observaron grupos de espermatocitos con éstos cambios, en l a l u z del túbulo s e m i n í f e r o . Conmicroscopía e l e c t r ó n i c a se pudieron comprobar los cambios n e c r ó t i c o s en las c é l u l a s lesionadas. Pocas c é l u l a s presentaron éstos cambios morfológicos en túbulos con daño l e v e , y fueron más d i f u s o s y marcados en túbulos con daño moderado-severo y sobre todo a las 4 y 5 semanas de l a a d m i n i s t r a c i ó n del EMS. No se observaron cambios morfológicos en espermátides en elongación y - avanzados, a n i v e l de microscopía de l u z . En algunos casos se observó p i c n o s i s , pero por las c a r a c t e r í s t i c a s normales de éstas c é l u l a s , éste cambio fué d i f í c i l de evaluar ( F i g . 46). En cortes semifinos se pudieron observar espermátides en maduración de forma anormal, frecuentes a las t r e s semanas del t r a t a m i e n t o . Estos túbulos fueron seleccionados para el e s t u d i o u l t r a e s t r u c t u r a l de espermátides avanzados con l a f i n a l i d a d de indagar los cambios conducentes a l a a p a r i c i ó n de espermátides de forma anormal. CAMBIOS EN LA CELULA DE SERTQLI Pocos cambios fueron v i s t o s en éstas c é l u l a s que e s t u v i e r o n presentes en todas las etapas del c i c l o del e p i t e l i o seminífero y a las 3, 4 y 5 semanas de l a a d m i n i s t r a c i ó n del EMS. No se apreciaron cambios en su número ni en su localización. No se observaron cambios morfológicos en su porción basa! donde el núcleo t í p i c o y el citoplasma p e r i n u c l e a r fueron de aspecto normal. En las porciones media y a p i c a l se observó pérdida del citoplasma en r e l a c i ó n con las c é l u l a s espermatogénicas en d i s o l u c i ó n ; ésto fué más notable en el citoplasma apical en r e l a c i ó n con grupos de espermátides que se vieron l i b r e s en l a luz del tú- bulo ( F i g . 4 7 ) . No se observaron cambios u l t r a e s t r u c t u r a l e s en éstas c é l u l a s en túbulos de aspecto normal, excepto l a presencia de m a t e r i a l electrodenso filamentoso y radiado en r e l a c i ó n al acrosoma de espermátides tardíos. Otros cambios.- Masas a c i d ó f i l a s conteniendo m ú l t i p l e s núcleos p i c n ó t i c o s se v i e r o n en l a luz del túbulo seminífero con daño moderado a marcado, y sobre todo a las 4 y 5 semanas de l a exposición al agente mutagénico. Estas masas se observaron en r e l a c i ó n con áreas donde se observaron espermátides que mos_ traban p i c n o s i s nuclear. C.- A l t e r a c i o n e s u l t r a e s t r u c t u r a l e s en l a espermatogénesis inducidas por EMS. Se hizo un a n á l i s i s con microscopía e l e c t r ó n i c a del t e j i d o t e s t i c u l a r - de los ratones t r a t a d o s con EMS, para indagar sobre los cambios morfológicos conducentes a l a a p a r i c i ó n de espermatozoides de forma anormal. Para éste e f e c t o , se seleccionaron por examen del t e j i d o con microscopio de l u z , en c o r t e s de .25 mieras, los túbulos en los que no había daño aparente y aquellos en los que fué p o s i b l e i d e n t i f i c a r espermátides avanzados de - forma anormal. En el examen con microscopio e l e c t r ó n i c o de los túbulos seleccionados, las c é l u l a s espermatogénicas que mostraron cambios morfológicos correspondieron a espermátides avanzados. No se detectaron cambios a n i v e l de espermatogonias, espermatocitos pri- marios y secundarios; tampoco hubo cambios morfológicos durante l a espermio-génesis temprana; las Fases de Golgi y de Casquete no presentaron a l t e r a c i o n e s al igual que en l a fase acrosoma! temprana no hubo d i f e r e n c i a s entre el tejido t u b u l a r de los animales de c o n t r o l y los t r a t a d o s . Los cambios morfológicos v i s t o s durante la espermiogénesis fueron refe- rentes a l a modelación del acrosoma, l a condensación de l a cromatina, l a mode l a c i ó n del núcleo; l a organización de los microtúbulos y l a implantación del f l a g e l o , también se observaron fenómenos de d u p l i c a c i ó n a diversos niveles. Microfotografía electrónica que muestra espermátides anormales del estadio 9. Al centro aparece uno en sección longitudinal; su núcleo es peque ño. A la izquierda, otro espermátide anormal presenta defecto en la elonga ción de la cabeza; el aerosoma se ve asociado a un material electrodenso de aspecto filamentoso y radiado. (7, 200 X) F i g u r a Espermátides anormales del estadio 9. El nucleo está aplanado en su polo an terior y el aerosoma se limita a este extremo sin desplazarse caudalmente. Los microtûbulos del manchette no pre sentan su organización típica. La posición de la fosa de implantación tam bien es anormal. (Conpárese con las Figs. 24, 25 y 26). (24, OfQ X). Fi g u r a No. 49 No.48 A continuación se d e s c r i b i r á n las formas de espermátides observados, en los túbulos seminíferos seleccionados para estudio ultraestructural. Espermátides de los estadios 9 y_ 10: Fueron i d e n t i f i c a d o s por el tipo de asociación del que forman p a r t e . En muchos de e l l o s el defecto p r i n c i p a l correspondió a l aplanamiento del polo a n t e r i o r del núcleo y a l a f a l t a de - elongación n u c l e a r , que normalmente se presenta en ésta etapa ( F i g s . 48,49 y 50). También se presentaron en éstos e s t a d i o s , a l t e r a c i o n e s acrosomales; en muchos casos el acrosoma se l i m i t ó a c u b r i r el extremo a n t e r i o r aplanado del núcleo ( F i g s . 49 y 5 0 ) , conservando su aspecto e s t r a t i f i c a d o normal. Con f r e cuencia se observó l a asociación del m a t e r i a l acrosomal a.gruesas estriacio- nes electrodensas de d i s p o s i c i ó n r a d i a d a , ( F i g s . 49 y 51), que parecen e s t a r l o c a l i z a d a s en el citoplasma de l a c é l u l a de S e r t o l i . En l a Fig._48.uno de los espermátides aparece en sección longitudinal; el núcleo es pequeño y l a condensación de l a cromatina es ligeramente mayor que en los espermátides de l a derecha, de aspecto normal. Tal vez debido a l plano de sección en l a región de l a cabeza no se observa acrosoma, y los m i crotúbulos presentan un t r a y e c t o o b l i c u o , aunque en el extremo caudal no p r ^ sentan e l a r r e g l o l o n g i t u d i n a l c a r a c t e r í s t i c o del Manchette. Se observa l a formación del c u e l l o y l a pieza intermedia del f l a g e l o , de aspecto normal. En el c u e l l o es p o s i b l e observar a los c e n t r í o l o s proximal y d i s t a l , a s i como el ánulo. El f l a g e l o se observa en gran parte de su l o n g i t u d , - inclu£ do en el canal f l a g e l a r . El citoplasma es muy abundante y presenta gran canti_ dad de mitocondrias vesiculosas típicas. A r r i b a y a la i z q u i e r d a en ésta misma f o t o g r a f í a se observa un espermá t i d e también anormal, en el que l a elongación del núcleo ha f a l l a d o y el acro^ soma l o c a l i z a d o al rostrum, se asocia a un m a t e r i a l filamentoso y e l e c t r o d e n so que se i r r a d i a hacia el citoplasma de l a c é l u l a de S e r t o l i del que parece formar p a r t e . En algunos espermátides como el que se muestra en l a f i g u r a 50, se o b - - Espermátide anormal del estadio 9. El extremo anterior de la cabeza apa rece aplanado en sentido perpendicular al eje del espermatozoide. El — alargamiento nuclear es defectuoso. La cromatina periférica se presenta en agregados irregulares. En algunos sitios la envoltura nuclear no se ob serva y los microtúbulos del manchette parecen ponerse en contacto direc tamente con la cromatina (flechas). (20, 800 X) Espermátide anormal del estadio 10. La' sección corresponde al polo caudal del núcleo, en el cual se observan dos escotaduras. r n una de ellas se obser van los centríolos y el flagelo, y <_o rresponde a la io^a de implantación que es más profunda y asimétrica. En la otra excavación >e observa una gran vesícula que ¡odt ía corresponder a la envoltura nuclear redundante (flechas). El resto de la célula no presenta alte raciones. (26, 000 X) F i g u r a No. 51 servó fragmentación de l a cromatina p e r i f é r i c a . En éste caso l a envoltura parece haber desaparecido en algunos tramos en l o s que la cromatina nuclear -- queda expuesta directamente a los microtúbulos del citoplasma. Otra observación hecha en éstos espermátides, es l a desorganización de l o s microtúbulos del manchette. En algunos casos, como en l a f i g u r a 49, most r a r o n un t r a y e c t o o b l i c u o anormal. En ésta misma m i c r o g r a f í a l a p o s i c i ó n de la fosa de implantación parece ser anormal. En muchos casos l a d i r e c c i ó n del plano de sección es d i f í c i l de e s t a - b l e c e r ; s i n embargo espermátides como l o s que se observan en las F i g s . 51 y 52, no se observaron en el grupo c o n t r o l . El grado de condensación cromatíni_ ca y el t i p o de asociación de l a que forman parte indican que corresponden al estadio 10 de l a espermiogénesis. En l a F i g . 51. no se observa el acrosoma, el núcleo t i e n d e a ser de forma e l í p t i c a , y presenta en uno de sus lados una doble excavación, separadas entre sí por una proyección estrecha. En una de las excavaciones se observan unas e s t r u c t u r a s que parecen corresponder a l par de c e n t r í o l o s y al f l a g e l o . En l a o t r a excavación se observa una formación v e s i c u l a r membranosa que contiene un m a t e r i a l de escasa e l e c t r o d e n s i d a d y que recuerda a l a e n v o l t u r a nuclear redundante (ver F i g . 2 7 ) . Los m i c r o t ú b u l o s apa recen en secciones o b l i c u a s y t r a n s v e r s a s ; el citoplasma vecino es muy abundante y presenta algunas mitocondrias v e s i c u l a r e s típicas. En l a F i g . 52, se presenta una espermátide que en ésta sección muestra una forma e l í p t i c a , en el que l a e n v o l t u r a nuclear no puede ser precisada. En uno de los extremos se observa un c e n t r í o l o en sección t r a n s v e r s a , que podría señalar el extremo caudal de la c é l u l a , sin embargo, los m i c r o t ú b u l o s del mar^ c h e t t e parecen tener una d i r e c c i ó n opuesta. El acrosoma y la fosa de implanta ción no se observan, l o que puede ser explicado quizá por e l plano de sección. Espermátides del estadio 12: Se observaron numerosas espermátides del estadío.42 con gran variedad de a l t e r a c i o n e s , como los que se muestran en la f i g u r a 53. En muchos de e l l o s se observó de nuevo f a l t a de elongación n u c l e a r , Espermátide anormal del estadio 10. El núcleo es pequeño y elíptico, pre_ senta disgregación de los agregados densos de cromatina periférica. La en_ voltura nuclear no se observa. Un cen tríolo aparece cortado transversalmen_ te en uno de los extremos del núcleo, pero los microtübulos que aparecen en sección oblicua, se dirigen hacia el extremo opuesto. (26, 000 X) F i g u r a Espermátidos del estadio 12 normales (N) y anormales (An), algunos de ellos se presentan a mayor aumento en las si guientes figuras. Una forma extremadamente ano "nriril se observa en la parte superior de J s » 1 I?0 i j tografia (flecha) ( 6 , 000 X) i i g u r a N . 53 No. 52 aunque l a condensación de la crcmatina fué de aspecto normal en algunos y en o t r o s fué defectuosa. Estas c é l u l a s mostraban también aplanamiento del extria mo a n t e r i o r (rostrum) de l a cabeza, como se observa en el espermátide de l a f i g u r a 54. El acrosoma permaneció cubriendo sólo el extremo a n t e r i o r aplanado del núcleo s i n extenderse caudalmente como sucede normalmente; ésta altera- ción se v i o asociada a una p o s i c i ó n muy a n t e r i o r por f a l t a de desplazamiento caudal, del a n i l l o n u c l e a r . En éstas formas de espermátides anormales, los microtúbulos del manchette parten en d i r e c c i ó n p o s t e r i o r desde el a n i l l o nuc l e a r pero su t r a y e c t o es o b l i c u o y no r e c t o ; además en e l extremo caudal de l a c é l u l a con frecuencia no es p o s i b l e observar l a fosa de i m p l a n t a c i ó n , aui^ que el f l a g e l o , aparece cortado t r a n s v e r s a m e n t e y a c i e r t a d i s t a n c i a de él - se observa un agregado de m a t e r i a l electrodenso que pudiera corresponder al cuerpo cromatoide. Otros espermátides del mismo estadio 12 presentaron cambios mucho más severos. El espermátide presentado en la f i g u r a 55, que corresponde a una amp l i f i c a c i ó n de l a zona indicada en l a f i g u r a 53, l a sección parece ser longj_ t u d i n a l , y el núcleo muestra una profunda escotadura que en su extraño caudal a l o j a a l o s elementos propios de l a fosa de i m p l a n t a c i ó n . Comparándolo con espermátides del e s t a d i o 12 normales, r e s u l t a evidente que l a condensación de la, cromatina es defectuosa, por l o que el núcleo aparece menos electrodenso. Los microtúbulos presentan un patrón desorganizado y t r a y e c t o o b l i c u o por l o que parecen tener una d i r e c c i ó n perpendicular al eje l o n g i t u d i n a l de la célula. Por el c o n t r a r i o en algunas o t r a s formas anormales de éste e s t a d i o l a cromatina presentó condensación extrema, asociada a o t r o s defectos como el ya mencionado aplanamiento a n t e r i o r de l a cabeza ( F i g . 5 6 ) ó bien deformidades graves como l a observada en el espermátide de l a f i g u r a 57, en el que de nue vo se observa el m a t e r i a l f i l a m e n t o s o electrodenso que en éste caso rodea ca s i por completo al espermátide, y parece l o c a l i z a r s e en el citoplasma vecino Espermátide anormal del estadio 12. Los defectos son múltiples; el núcleo es muy corto, el acrosoma se limita al extremo anterior del núcleo y su forma es irregular; el anillo nuclear permanece en posición muy anterior. Los microtúbulos presentan un trayec^ to oblicuo. No se observa la fosa de implantación; el cuerpo cromatoide se ve en el extremo caudal de la ce lula en relación a estructuras vesi_ culares. (13, 500 X) F i g u r ft No. 54 Espermátide anormal del estadio 12. El núcleo presen La una profunda escotadura, en cuyo extremo caudal se icen tilica la fo.;a -ir 'implantación, Je po sición anorrral. Ll citcplaoim es abun dante. (22, 800 X) F i g u r a No, 55 Erpermátide anormal del estadio 12. El núcleo es muy corto y la cromatina está muy condensada. El acrosoma cubre sólo el extremo anterior del núcleo y en sus extremos se asocia a material electrodenso y filamentoso irradiado hacia la célula de Sertoli. El anillo nuclear aparece en posición muy interior i .los microtúbulos presen tan ni inyecto .«normal. (.Ib, 000 X) F i g u r a Espermátide anormal del estadio 12. El extremo anterior ^e ^ef.ala con una i lecha, donde se otserva que ol aeroect-an apl.njdo;-. ^e son a y el nu apiec'a dt. r.jf-vo el mure, ial filatoso descrito anteriormente en relición con -1 j irosona. Una proyección lateral que pe.ttcu ucr. expender uni_ camente al material acrorcmal es SÍ mámente anor ul, (23, 000 A) F i P u I Í No. No. 56 Espermátides del estadio 13. Uno de ellos normal (N) y otro anormal (An). En este ultimo se observan alteracio nes ya descritas como lo son el apla namiento del polo anterior y la falta de desplazamiento del acrosoma y del anillo nuclear. Se observa también un estrechamiento del núcleo en su parte media. Los microtübulos del manchette presentan un trayecto oblicuo anormal (b, bOO X). Espermátide «anormal del estadio 1 3. El núcleo es muy lar?o; jn j eqaefio .».rag mentó r.uclear aparece separado de la — parte principal d«l núcleo. Material electrodenco del citoplasma de la có'u la de Sertoli so ve en relación con el extremo anterior del acrosoma (flecha). (17, 000 X) F i g u r a No. 59 •de l a c é l u l a de S e r t o l i . Espermátides del estadio 13: En muchas c é l u l a s de éste e s t a d i o , pudo observarse que el aplanamiento r o s t r a l d e s c r i t o en etapas a n t e r i o r e s persis- t e y el acrosoma sigue l i m i t a d o al extremo a n t e r i o r del núcleo; s i n embargo, la elongación del r e s t o del núcleo pudo l l e v a r s e acabo. Esto se observa en la f i g u r a 58 donde pueden compararse dos espermátides de éste e s t a d i o , uno de - a p a r i e n c i a normal y o t r o francamente anormal. El espermátide anormal presenta además, un estrechamiento ó escotadura l o n g i t u d i n a l hacia l a p a r t e media del núcleo, asociada a microtúbulos de d i r e c c i ó n anormal. En o t r a s formas del mi_s mo estadio ( F i g . 5 9 ) e l núcleo apareció d i v i d i d o en dos segmentos: un pequeño fragmento a n t e r i o r rodeado de m a t e r i a l acrosomal y un fragmento mayor alarga, do de posición caudal, separado del primero por un f i n o f i l a m e n t o constituido por el m a t e r i a l acrosomal y el escaso citoplasma p e r i n u c l e a r . Al parecer éstos espermátides alargados podrían ser precursores de las formas filamentosas de espermatozoides v i s t a s al microscopio de l u z . Otro t i p o de defecto acrosomal se observó en espermátides del estadio 13: una larga proyección del acrosoma con a p a r i c i ó n de una gran zona c e n t r a l vacía, l o cual se observa en la f i g u r a 60, y se ve asociada al materia? eTectrodenso; que forma grumos ó filamentos i r r a d i a d o s hacia l a c é l u l a de S e r t o l i . La pared de ésta proyección acrosomal es muy densa. Por su aspecto la proyección d e s c r i t a señala el extremo a n t e r i o r de la c é l u l a , y la posición de los espermátides vecinos indica que ésta c é l u l a está i n v e r t i d a . Espermátides de los estadios 14, 15 y 16: Aunque en l o s espermátides de éstos estadios ya no se observan m i c r o t ú b u l o s , las deformaciones acrosomales y nucleares s i g u i e r o n observándose. Algunos espermátides presentaron una cabeza c o r t a de polo a n t e r i o r aplanado, en los que el acrosoma se v i o también a l t e r a d o por su forma i r r e g u l a r y de l o c a l i z a c i ó n r o s t r a l . Estos cambios pue den vers« en uno de los espermátides de l a f i g u r a 61, el cual presenta además una gran vacuola i n t r a n u c l e a r que aunque pudiera r e s u l t a r de la sección en un Espermátides del estadio 12 ó 13. Uno de ellos es anormal (An), por pre sentar en uno de sus extremos una lar ga proyección acrosomal que además es vacuolada, y se ve también asociada j1 material electrodenso de la célula de Sertoli, descrito en otros defectos acrosomales. (10, 000 X) F i g u r a Espermátides estallo Ib, uno normal (N) y otro anormal (An). En éste último el núcleo es corto y aplaT¿ado en su ex tremo anterior. Se observa también una estructura vesicular de contenido amor fo, localizada er, el nú^le , que pudie ra corresponder a un sitio de flexión extrema que no observa en esperná- tides normales. El acrosoma está lini tado al extrema anterior del núcleo y es de forma a n o m a i . (6, 000 X) ¡ i » u v a N^.61 No. 60 s i t i o de f l e x i ó n nuclear extrema, en ésta especie no se observa normalmente. En o t r o s espermátides los defectos fueron menos marcados, localizándose sobre todo a n i v e l del acrosoma, e l cual presentó proyecciones anormales que casi siempre acompañaron a modificaciones leves en l a forma del núcleo; a l t e raciones de éste t i p o pueden observarse en l a f i g u r a 62, en la que uno de l o s espermátides muestra una excavación nuclear en el dorso y una implantación del f l a g e l o de s i t u a c i ó n anormal. Con frecuencia se observó también e l m a t e r i a l acrosoma? de aspecto est r a t i f i c a d o normal asociado a f i n a s proyecciones radiadas del citoplasma vecino de l a c é l u l a de S e r t o l i . Esto es evidente en los espermátides observados en l a f i g u r a 64. La f a l t a de formación del gancho ó cuerno a n t e r i o r , fué o t r o de los de f e c t o s mínimos observados en espermátides muy avanzados en su d e s a r r o l l o (es^ tadíos 15 y 16). Generalmente fué acompañado de defectos en l a modelación de l a forma del acrosoma,observándose en ocasiones proyecciones del m a t e r i a l - acrosomal de p o s i c i ó n anormal. En l a f i g u r a 63 se observa un espermátide del e s t a d i o 15 que muestra una prolongación v e n t r a l completamente anormal. En éstos espermátides con defectos acrosomales y nucleares mínimos l a formación del c u e l l o y pieza intermedia de la cola del espermatozoide, fueron aparentemente normales, como puede verse en l a f i g u r a 64. Pero los defectos graves del acrosoma y núcleo se acompañaron de defectos en l a implantación y d i r e c c i ó n del flagelo. Fenómenos de d u p l i c a c i ó n : Estos fueron observados en espermátides de d i f e r e n t e s estadios y fueron mucho más frecuentes que en los del grupo c o n t r o l donde no se observaron éste t i p o de fenómenos. En l a f i g u r a 65, se muestra una espermátide del estadio 9 que posee 2 núcleos, los cuales aparecen fusionados por su lado d o r s a l , mediante el mate r i a l acrosomal que se encuentran compartiendo. El extremo a n t e r i o r de ambos Espermátide anormal del estadio 15 (An), que presenta una flexión dorsal anormal (flecha). El acrosoma se aso cia al material electrodenso ya descrito. En el extremo caudal del níi-cleo la implantación del flagelo y dirección del mismo es anormal. (4, 600 X) F i g u r a Espermátide anormal del estadio 15 que presenta defectos acrosomales. La proyección dorsal está muy acentuada, y senta una proyección ventral que es c pletamente anormal (ílecha). Se obser van también microfilamentos del ei ma de la célula de Sertoli asociados a algunas de éstas malformaciones. Compá rese con la Fig. 32. (15, 000 X) No. 62 Espermâtide anormal del estadio 16 en sección longi Ludinal. El material aero somal estratificado se ve asociado a los filamentos electrodensos que se irradian al citoplasma de la célula de Sertoli, descrito para formas anormales dé estadios anteriores (flecha). El polo caudal del núcleo es muy pronunciado y la fosa de implantación es muy profunda. Se observa un puente ci toplâsmico entre el espermâtide des—-' crito y uno vecino. (11,200 X). F i g u r a No. 64 Lspermátide anormal del estadio 9, en el que se observan dos núcleos fusionados por uno de sus lados mediante el material acrosomal. El extremo a n t e rior del j.ücHo es a, loriado. La croma tina nuclear muestra c^reg^dos df-nsos en el intei ior y <-n la periferia. El extremo caudal de cada núcleo presenta una exi a>/ac "ón, y juntos constituyen la fosa de implantación; en el ci toplasma abundante se observan m i t o — condrias y estructuras vesiculares li mitadas por una unidad de membrana. ('1,C00 X). F i g u r a No 65 núcleos está aplanado y en uno de e l l o s e l acrosoma se l i m i t a al r o s t r o del núcleo. En el extremo caudal se observa una sola fosa de implantación que es compartida por los dos núcleos. En etapas más avanzadas se vieron espermátides del estadio 14 ó 15, con sideradas a s i según el grado de condensación de su cromatina, que presentaban también dos núcleos. En e l que se observa en la f i g u r a 66, los núcleos aparecen fusionados por uno de sus lados; asociados a la d u p l i c a c i ó n nuclear se observan en éste espermátide defectos de elongación y acrosomales. El m a t e r i a l acrosoma! es muy poco denso y en uno de e l l o s se puede observar una gran d i l a t a c i ó n del acrosoma, cuyo aspecto recuerda las primeras etapas de f o r m a ción acrosomal. En l a f i g u r a 67 se observa o t r a forma de espermátide anormal correspor^ d i e n t e al estadio 16. El espermátide es b i c é f a l o , y las dos cabezas aparecen fusionadas por su extremo caudal. El acrosoma no parece e s t a r bien d e s a r r o l l a do y el citoplasma p e r i n u c l e a r es muy abundante. La formación del f l a g e l o , - que aparece en sección t r a n s v e r s a , es también aparentemente defectuosa ya que carece de vaina m i t o c o n d r i a l ; la mayor parte del citoplasma ocupa la r e gión caudal y en él pueden i d e n t i f i c a r s e un grupo de m i c r o t ú b u l o s , algunas e s t r u c t u r a s v e s i c u l a r e s y un agregado de m a t e r i a l electrodenso, pero no se observan m i t o c o n d r i a s . Espermátide anormal en el que se ob servan dos masas nucleares que apare cen fusionadas lateralmente. El aero soma tiene aspecto vacuolar de conté nido flocular de poca electrodensidad y semeja la vesícula acrosomal de es tadíos tempranos del espermiogénesis. En el citoplasma vecino se observan microtübulos en corte transversal. (24, 700 X) F i g u r a Espermátides anormales del estadio 16 que presentan dos núcleos en un solo flagelo cortado transversalmente que carece de vaina fibrosa y mitocondrial El citoplasma es muy abundante. Los microtübulos del nanchette, el cuerpo cromatoide y algunas.estructuras membranosas vesiculares se localizan en el extremo caudal. (26, 000 X). F i p u r a No. 67 No. 66 V. D I S C U S I O N . La cepa h í b r i d a u t i l i z a d a en éste e s t u d i o r e s u l t ó de mucha u t i l i d a d por presentar un porcentaje sumamente bajo de espermatozoides de forma anormal. A s í , observamos el e f e c t o que l a cruza de las cepas endogámicas produce sobre e l p o r c e n t a j e de formas anormales; c o i n c i d i e n d o con l o d e s c r i t o por Kra zanowska (1968 y 1976) en sus estudios de h e t e r o s i s , y de acuerdo a l o propuesto por Wyrobeck (1979), el porcentaje de formas anormales de espermatozoides r e s u l t ó ser en éste experimento, menor que en los genotipos paternos. El e f e c t o del EMS, sobre l a espermatogénesis, fué f á c i l m e n t e detectado por l a s elevaciones producidas en e l número de espermatozoides anormales. A éste respecto las observaciones hechas en éste experimento concuerdan con lo reportado por Wyrobeck (1975); aunque las elevaciones en el porcentaje de formas anormales fueron en nuestro estudio menores (12%) que las reportadas por Wyrobeck, a dosis y tiempo de exposición comparable (más d e l 20%); la elevación máxima se produjo a las cuatro semanas. Por o t r a p a r t e , l o s t i p o s de a l t e r a c i o n e s morfológicas v i s t a s correspondieron en general a los descri_ tos por o t r o s autores ( 8,9 ) pero l a forma filamentosa d e s c r i t a en éste es. t u d i o no había sido reportada. El i n t e r v a l o entre e l tratamiento y e l tiempo de muestreo de los esper matozoides indican cuales etapas han sido afectadas con base a la vida media de las c é l u l a s espermatogénicas (12,69,98). Considerando l o a n t e r i o r , a las t r e s semanas de tratamiento estaremos observando los cambios producidos en espermátides tempranos; a l a s cuatro semanas se observará el efecto del tra- tamiento sobre espermatocitos y a las cinco semanas sobre espermatogonias. Las formas anormales de espermatozoides^inducidas a las cuatro semanas y los espermátides anormales observados a las t r e s semanas del tratamiento representarán por lo tanto a células que fueron expuestas al EMS en etapa de espermatocito p r i m a r i o . El mecanismo de producción de éstas anomalías aún se d i s c u t e . Se ha s.u g e r i d o que en general las etapas de espermatogenias t a r d í a s a espermatocitos tempranos son los estadios c e l u l a r e s más sensibles a l a acción de l o s agentes químicos, en l a producción de espermatozoides anormales ( 9 8 ) . Sin embargo el EMS t i e n e l a capacidad de atravezar l a barrera h e m a t o t e s t i c u l a r , por l o cual puede actuar sobre estadios postmeióticos (73,102). Se ha reportado que éste agente produce mutaciones l e t a l e s dominantes, aberraciones cromosomales y mu_ taciones de punto en c é l u l a s e s p e r m a t o g e n i a s , específicamente en espermátides y espermatozoides^Esto parece e s t a r relacionado con l a f a l t a de sistemas re- paradores del daño genético en éstos estadios ( 57 ) . En cuanto a las a l t e r a c i o n e s gruesas producidas por el EMS en el epite_ l i o seminífero del r a t ó n , el p r i n c i p a l cambio observado fué l a disminución de l a población c e l u l a r . A d i f e r e n c i a de l o reportado para la Mitomicina C y las radiaciones i o n i z a n t e s por Leonard y G u i l l i a v o d (1973), la disminución sucede a expensas de los espermatocitos y no de las espermatogonias. Aunque se observó disminución en el número de espermatogonias» éste cam bio fué d i s c r e t o y pudiera deberse a la f a l t a de m i t o s i s , ya que éste agente a f e c t a l a s í n t e s i s de DNA (102) y ya que no se apreciaron cambios i n d i c a t i v o s de muerte en éstas c é l u l a s . El e f e c t o c i t o t ó x i c o de l a Mitomicina C sobre las espermatogonias no fué v i s t o a consecuencia del EMS; los espermátides avanzados tampoco fueron susceptibles al efecto t ó x i c o de ésta droga. Resultaron ser más susceptibles a éste e f e c t o , los espermatocitos y espermátides tempranos, en l o s que se produjo l a muerte a l a dosis administrada de EMS. También se ha reportado muerte de espermatocitos y espermátides por 5 - f l u o r o u r a c i l o , tinum (63) y por hexafluoroacetona Cis-pla. (33). Los cambios observados más frecuentemente en las c é l u l a s afectadas por el EMS, fueron c a r i o l i s i s y c i t o l i s i s . La p i c n o s i s nuclear no parece ser un cambio indicador de muerte en los espermatocitos. Tampoco se observó la franca v a c u o l i z a c i ó n del citoplasma, d e s c r i t a para o t r o s agentes t ó x i c o s en éstas cé l u l a s ( 60 ) . Un aspecto morfológico importante que i n f l u y e sobre el e f e c t o de los agentes mutagénicos sobre las c é l u l a s espermatogénicas, es l a presencia de puentes i n t e r c e l u l a r e s e n t r e espermatogenias y espermatocitos, asi como el englobamiento de espermátides por las c é l u l a s de S e r t o l i ( 2 4 ) ; por éste moti_ vo es p o s i b l e que en cualquiera de éstas etapas el daño producido a una célj¿ l a pueda t r a n s m i t i r s e a todo el grupo, como se ha v i s t o después de l a aplica^ ción de radiaciones i o n i z a n t e s ( 37 ) . La extensión del daño producido ini-- cialmente en espermatocitos aislados a los de las regiones vecinas, observado en éste experimento, pudiera ser explicado igualmente por la presencia de t a l e s puentes intercelulares. . Para e l e s t u d i o u l t r a e s t r u c t u r a l de los cambios inducidos en c é l u l a s espermatogénicas del r a t ó n , a consecuencia del EMS, se descartaron los túbulos en los que el efecto t ó x i c o de éste agente causó graves a l t e r a c i o n e s y muerte de las c é l u l a s . La selección de túbulos con daño mínimo ó s i n é l , tu- vo el propósito de detectar cambios s u t i l e s en l a morfología de las c é l u l a s espermatogénicas, que pudieran dar información relacionada con los mecanismos que condujeron a las formas anormales de espermatozoides. Los resultados de éste estudio indican que el daño causado por el EMS, sea cual f u e r e su índole se m a n i f i e s t a en l a espermiogénesis avanzada. En l a l i t e r a t u r a se encontraron pocos estudios u l t r a e s t r u c t u r a l e s sobre los cambios inducidos en l a espermatogénesis a consecuencia de d i f e r e n t e s ti- pos de drogas. Parvinen (1979a), reporta a l t e r a c i o n e s en espermatocitos z i g o ténicos y paquiténicos medios, así cono en espermátides redondos, a consecuer^ c i a de l a a d m i n i s t r a c i ó n de Procarbazina. En nuestro estudio no se detectaron cambios en ninguna etapa previa a los estadios 9 y 10 de l a espermiogénesis. Nuestros hallazgos concuerdan con las a l t e r a c i o n e s reportadas en r a t o nes mutantes e s t é r i l e s , que presentan un porcentaje elevado de formas anormales de espermatozoides ( 1 7 , 1 8 , 3 8 , 4 0 ) . Alteraciones en el a r r e g l o de los micro t ú b u l o s , indentaciones nucleares anormales y f a l l a s en l a elongación n u c l e a r , semejantes a las observadas en éste experimento para el EMS, se han reportado en un ratón e s t é r i l , homocigoto para el a l e l o T ( 1 7 , 1 8 ) . Igualmente se han d e s c r i t o malformaciones acrosomales y defectos de l a c i t o c i n e s i s que conducen a l a formación de espermatozoides b i c é f a l o s , en r a t £ nes e s t é r i l e s con un gen mutante que ocasiona además marcha a s a l t o s , polidac^ t i l i a y e s t e r i l i d a d ( 38 ) . Otro r a t ó n mutante, con e s t e r i l i d a d y o j o rosa, también presenta esper. miogénesis a l t e r a d a , encontrándose en éste caso defectos en el proacrosoma de espermátides tempranos y formación de colas m ú l t i p l e s ( 40 ) . Según los cambios observados en espermiogénesis avanzada en nuestro ex perimento, podríamos deducir que los espermatozoides amorfos v i s t o s con e l e vada frecuencia a las cuatro semanas del t r a t a m i e n t o con EMS, son producidos por f a l l a p r i n c i p a l m e n t e en los mecanismos de elongación en espermátides de l o s estadios 9 y 10; l a f a l t a de desplazamiento del a n i l l o nuclear puede ser e l cambio i n i c i a l aunado a defectos de condensación de l a cromatina. Se ha sugerido que en el caso del EMS, la a l q u i l a c i ó n de la c i s t e í n a podría e v i t a r l a formación de puentes d i s u l f u r o e i n t e r f e r i r con l a condensación de l a ero matina ( c i t a d o por Lyon 1981). La formación de l o s microtúbulos del manchette parece i n i c i a r s e norma]_ mente, pero en algunos casos se v i ó desorganización en r e l a c i ó n a defectos de l a envoltura n u c l e a r . Se ha propuesto que ésta f a l l a en el mantenimiento en el a r r e g l o de los microtúbulos podría r e f l e j a r una anomalía subyacente en las c a r a c t e r í s t i c a s e s t r u c t u r a l e s y bioquímicas de las membranas con l a s que se asocian (17). El papel de los microtúbulos en l a morfogénesis de espermato zoides anormales se ha evidenciado también con l a a p l i c a c i ó n de c o l c h i c i n a - ( 34 ). Las formas filamentosas observadas con microscopía de l u z ; podrían ori_ ginarse por las segmentaciones nucleares que se presentaron en espermátides - .avanzadas. En éstos casos de nuevo se observa una estrecha r e l a c i ó n con l a presencia de microtúbulos de d i r e c c i ó n anormal,que parecen ser los causantes de ésta malformación. Las a l t e r a c i o n e s mínimas del gancho de los espermatozoides detectadas con el microscopio de l u z , corresponden u l t r a e s t r u c t u r a l m e n t e a malformaciones en el acrosoma y en el polo a n t e r i o r del núcleo, que se ven en esparmátides por l o demás de aspecto normal. Otros cambios que al igual éstas a l t e r a c i o n e s parecen ser independientes del patrón m i c r o t u b u l a r a l t e r a d o , son las vacuolas acrosomales y nucleares y los defectos en l a implantación del f l a g e l o . Las - formas b i c é f a l a s y fenómenos de d u p l i c a c i ó n nuclear v i s t a s al microscopio e l e c t r ó n i c o , podrían o r i g i n a r s e en f a l l a en la citocinesis. .Desde hace tiempo se ha sugerido que l a morfogénesis del se encuentra — espermatozoide bajo un e s t r i c t o c o n t r o l genético ( 4 8 , 6 5 ) . La complejidad del - proceso de espermiogénesis y l a m u l t i p l i c i d a d de organelos involucrados suge^ r í a n que la forma del espermatozoide era controlada por v a r i o s genes d i f e r e n tes ( 98 ) . Estudios genéticos han i d e n t i f i c a d o cerca de 10 regiones génicas que afectan l a morfología del espermatozoide, y están d i s t r i b u i d o s en los ero mosomas X y Y, así como en l o s autosomas ( 8 , 1 7 , 3 8 , 4 0 , 4 8 ) . Estos genes represe»! tan s i n duda un gran blanco para los agentes mutagénicos. Los f a c t o r e s genéticos que controlan el n i v e l y t i p o de formas anormales de espermatozoides, tienen un patrón de herencia r e c e s i v a , aunque efectos a d i t i v o s parecen e s t a r involucrados en la determinación del n i v e l de formas anormales ( 98 ) . Las anomalías morfológicas inducidas por agentes químicos ó f í s i c o s sobre los espermatozoides pueden ser t r a n s m i t i d a s como una mutación genética do minante que puede ó no a f e c t a r l a f e r t i l i d a d ó asociarse con aberraciones cro_ mosomales gruesas ( 1 0 , 9 5 ) . Sin embargo las a l t e r a c i o n e s en l a morfología del espermatozoide no parecen estar ligadas a la i n t e g r i d a d de los cromosomas n i al contenido de DNA (98). Algunos autores han señalado que l a s mutaciones l e t a l e s dominantes pro ducidas por el EMS, se presentan por daño al DNA en l a etapa de t r a n s i c i ó n de histonas a protaminas ( c i t a d o por Lyon 1981). Sega (1978) señala que el - EMS produce e t i l a c i ó n del DNA y de l a s protaminas ( 8 7 ) ; s i n embargo no parecen ser éstos los cambios que o r i g i n a n las a l t e r a c i o n e s morfológicas que conducen a espermatozoides anormales. Se ha postulado que e r r o r e s en l a producción, m o d i f i c a c i ó n ó d e g r a d a ción de las proteínas nucleares, puedan conducir a a l t e r a c i o n e s en l a cabeza del espermatozoide ( 1 0 , 9 0 ) . Los resultados de ésta i n v e s t i g a c i ó n parecen i n d i c a r que siendo los cam bios morfológicos evidentes en espermátides de los estadios 9 , 10 y estadios poster-iores, el daño producido por el EMS, tendrá lugar en estadios p r e v i o s . Dado que l a elevación producida en e l n i v e l de espermatozoides anormales ha sido mayor a las cuatro semanas, parece ser que las a l t e r a c i o n e s morfológicas tendrían su o r i g e n en el daño ocasionado a n i v e l de espermatocitos primarios y espermatogonias d i f e r e n c i a d a s , independientemente de que e l daño sea ó no de naturaleza g e n é t i c a . En v i s t a de que los cambios u l t r a e s t r u c t u r a l e s en la espermiogénesis, son muy semejantes a los reportados para mutaciones genéticas que causan est e r i l i d a d en r a t o n e s , las a l t e r a c i o n e s morfológicas producidas por e l EMS, podrían ser o r i g i n a d a s en el daño al DNA y no a las proteínas nucleares. Al margen de todo ésto débanos considerar a q u í , que l a c é l u l a de S e r t o l i posiblemente juegue un papel importante en l a génesis, de al menos, algunas de l a s a l t e r a c i o n e s observadas. Desde hace tiempo se reconoce l a de l a c é l u l a de S e r t o l i en el porceso de espermiogénesis La consistente importancia (25). observación de l a r e l a c i ó n entre malformaciones acroso- males y l a presencia de m a t e r i a l electrodenso f i l a m e n t o s o de aspecto r a d i a d o , en e l citoplasma v e c i n o , sugiere que t a l e s defectos acrosomales podrían ser - consecuencia de a l t e r a c i o n e s producidas en l a c é l u l a de S e r t o l i . VI.RESUMEN Y CONCLUSIONES. Se a d m i n i s t r ó un agente mutagénico: E t i l m e t a n o s u l f o n a t o , a dosis de 200 mg/Kg de peso, a ratones de l a cepa (C57BL X C3H)F1, diariamente duran^ t e 5 dfas consecutivos, por v i a i n t r a p e r i t o n e a l ; a consecuencia de éste t r a tamiento,se presentó en l o s ratones una elevación en el porcentaje de formas anormales de espermatozoides que fué mayor a las 4 semanas del t r a t a m i e n t o (de 1.8 hasta 1 4 . 6 ) ; e n t r e éstas formas anormales de espermatozoides se encon t r a r o n formas s i n gancho, espermatozoides amorfos, b i c é f a l o s y f i l a m e n t o s o s . Este ú l t i m o t i p o de espermatozoide anormal no había sido reportado en l a li- t e r a t u r a a consecuencia de l a a d m i n i s t r a c i ó n de agentes químicos ó de r a d i a ciones i o n i z a n t e s . Para indagar sobre l a forma de producción de éstas a l t e r a c i o n e s se h i zo un estudio morfológico con microscopía de luz y e l e c t r ó n i c a de los túbulos seminíferos de los ratones t r a t a d o s con EMS. El e s t u d i o con microscopía de luz demostró diversos grados de l e s i ó n t u b u l a r , observándose mayor número de túbulos lesionados a las 4 semanas des^ pués del t r a t a m i e n t o . Se produjeron notables cambios en l a morfología del epi_ t e l i o s e m i n í f e r o ; la población c e l u l a r disminuyó considerablemente a c o n s e — cuencia del e f e c t o c i t o t ó x i c o del EMS sobre todo a n i v e l de espermatocitos y espermátides tempranos, que mostraron c a r i ó l i s i s y c i t ó l i s i s . Se observó - también una disminución d i s c r e t a sobre el número de espermatogonias y su í n dice m i t ó s i c o , l o cual r e f l e j a l a f a l t a de s í n t e s i s de DNA producida por el agente mutagénico. Por el c o n t r a r i o , pocas a l t e r a c i o n e s se observaron permátides avanzados ( l o c a l i z a c i ó n anormal) y en c é l u l a s de S e r t o l i ción del c i t o p l a s m a ) y fueron consecutivas a l a desorganización del s e m i n í f e r o , por l a f a l t a de o t r o s t i p o s celulares. en es_ (disrupepitelio A n i v e l u l t r a e s t r u c t u r a l , los cambios que conducen a l a producción de espermatozoides anormales, s i bien pudieran tener su origen en a l t e r a c i o n e s genéticas tempranas, se m a n i f i e s t a n sólo tardíamente en la espermatogénesis observándose en nuestro estudio solamente cambios en los espermátides de - los estadios 9 a 16. Estos cambios en l a espermiogénesis implican una gran cantidad de est r u c t u r a s . Se observaron cambios nucleares r e f e r e n t e s a la condensación cro_ matfnica que fué mayor de lo normal en algunas formas de espermátides anormales. Otros cambios cromatínicos v i s t o s , fueron l a formación de agregados densos e i r r e g u l a r e s en l a p e r i f e r i a , así como modificaciones en la forma del nucléo, que con frecuencia se observó muy c o r t o y aplanado en su e x t r e mo a n t e r i o r . Por l o general éstos defectos nucleares se presentaron acompañados de cambios del acrosoma, que en éstas formas permanecía cubriendo solamente el extremo a n t e r i o r del núcleo. Sin embargo se observaron o t r o s defectos acrosomales independientes de las a l t e r a c i o n e s nucleares y relacionadas en cambio con a l t e r a c i o n e s en el citoplasma de la c é l u l a de S e r t o l i . Los defectos acrosomales más graves (for mas vacuoladas), parecen corresponder a f a l l a s en estadios tempranos del de s a r r o l l o de éstas e s t r u c u t r a s . Los defectos en l a elongación nuclear parecen ser los determinantes de l a producción de espermatozoides amorfos; la f a l t a de desplazamiento cau_ dal del a n i l l o nuclear podría ser uno de los mecanismos implicados en ésta malformación. Los microtúbulos del manchette, son importantes en la producción de espermátides sumamente l a r g o s ; el t r a y e c t o o b l i c u o en algunos casos, es res_ ponsable además de segmentación nuclear; éstos cambios fueron v i s t o s en espermátides del estadio 13 y son seguramente antecesores de l a s formas - fila- mentosas de espermatozoides. Las formas de espermatozoides con defectos mínimos, observados con mi eroscopía de l u z , corresponden a espermátides con a l t e r a c i o n e s leves, sobre todo defectos en l a formación del gancho y modelación del acrosoma ó defectos leves en l a forma del núcleo. finalmente observamos espermátides con dos núcleos que presentaron di_ versos grados de f u s i ó n ó separación. Generalmente éstos fenómenos de duplx cación nuclear se acompañaron de a l t e r a c i o n e s en el d e s a r r o l l o de o t r a s estructuras. Se cuestiona sobre el papel de l a c é l u l a de S e r t o l i en la producción de defectos acrosomales en los que se v i ó constantemente l a asociación ent r e el m a t e r i a l acrosoma! y m a t e r i a l electrodenso de aspecto anormal de l a c é l u l a de Sertol i . V I I . PERSPECTIVAS. A pesar de que en la presente i n v e s t i g a c i ó n no se hayan detectado, es p o s i b l e que los cambios morfológicos que culminan con l a producción de esper^ matozoides de forma a n o r m a l se i n i c i e n tempranamente en l a espermiogénesis y sean evidentes aún en fase de G o l g i . Un e s t u d i o u l t r a e s t r u c t u r a l de los túbulos seminíferos dos semanas después del tratamiento con EMb, pudiera per m i t i r l a detección de dichas a l t e r a c i o n e s . De acuerdo con los resultados de éste estudio y con o t r o s reportes (42, 6 2 ) , los microtubulos constituyen un f a c t o r muy importante en l a producción de a l t e r a c i o n e s en l a espermiogénesis. Un estudio más minucioso con métodos que permiten una observación mas d e t a l l a d a de l o s m i c r o t u b u l o s , en espermát i d e s expuestos al EMS, podría proporcionar mayor información sobre l a mación, número, for- d i r e c c i ó n y d i s t r i b u c i ó n de éstas e s t r u c t u r a s . El modelo experimental u t i l i z a d o podría s e r v i r también para e s t u a i o s u l t r a e s t r u c t u r a l e s enfocados al a n á l i s i s de l a evolución de las a l t e r a c i o n e s acrosomales, de l a envoltura nuclear ó de la heterocromatina señaladas en éste estudio como elementos que i n t e r v i e n e n en l a producción ae espermatozoi_ des anormales morfológicamente. Un estudio del comportamiento del retículo endoplásmico, recientemente señalado como uno de los elementos responsables de la d i f e r e n c i a c i ó n s i n c r ó n i c a en éstas células ( 1 3 ) , podría i n d i c a r su pa peí en l a producción de espermatozoides anormales, producidos por el tMS. Igualmente el estudio con microscopía e l e c t r ó n i c a enfocado a l a c é l u l a de S e r t o l i , sobre todo en lo r e f e r e n t e al c i t o e s q u e l e t o , p e r m i t i r í a estable cer su importancia en la inducción de espermatozoides de forma anormal. Los mecanismos implicados en l a producción de espermatozoides anormal e s , por d i f e r e n t e s t i p o s de drogas podrían ser semejantes ó d i f e r e n t e s ent r e s í . Un estudio morfológico comparativo, con microscopía de "luz y e l e c t r ó n i c a de túbulos seminíferos de ratones tratados con d i s t i n t o s agentes quí micos, reportados como inductores de espermatozoides anormales (92,95,103), podría proporcionar información sobre éstos mecanismos. En e l campo de l a a p l i c a c i ó n c l í n i c a , los hallazgos de nuestra investi_ gación, podrían s e r v i r como punto de comparación en el estudio con microsco pía e l e c t r ó n i c a de biopsias t e s t i c u l a r e s en: a) Pacientes sometidos a t r a t a m i e n t o con drogas o n c o l í t i c a s ó fármacos en los que se sospecha l a inducción de daño en las c é l u l a s espermatogénicas, so bre todo en i n d i v i d u o s en edad reproductora. b) Personas expuestas a agentes contaminantes del ambiente ó del lugar de — t r a b a j o ( 5 0 , 5 1 , 8 4 , 9 1 ) , en los que la potencia genotóxica de tales agentes po d r í a ser e s t a b l e c i d a por éste t i p o de e s t u d i o s . c) Pacientes con i n f e r t i l i d a d (21) ó bien en: d) La i n v e s t i g a c i ó n del f a c t o r masculino en l o s casos de aborto h a b i t u a l -- ( 3 9 ) . En éstos dos ú l t i m o s casos, las a l t e r a c i o n e s u l t r a e s t r u c t u r a l e s en la espermiogénesis, podrían ser f a c t o r e s determinantes de t a l e s problemas, y semejantes a los producidos por agentes mutagénicos en o t r o s mamíferos. B I B L I O G R A F I A . 1.- A d l e r , I . D . (1974). Comparative cytogenetic study a f t e r treatment of mouse spermatogonia w i t h Mitomycin C. Mut. Res. 23:369-379 2.- Ames, B . N . ; W.E. Durston; E. Yamasaki y F.D. Lee (1973). Carcinogens are mutagens: A simple t e s t system combining l i v e r homogenates f o r a c t i v a t i o n and b a c t e r i a f o r d e t e c t i o n . Proc. N a t l . Acad. S c i . U.S.A. 70:2281-2285 3.- Ashby, J . y I . F . A . Purchase (1977). The s e l e c t i o n of a p r o p i a t t e chemj_ cal class c o n t r o l s f o r use w i t h s h o r t - t e r m t e s t s f o r p o t e n t i a l c a r c i nogenicity. Ann. Occup. Hyg. 20:297-301 4.- B e l l v é , A.R.; J.C. Cavicchia; C.F. 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