propiedades antiinflamatorias, tolerogenicas e

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : A61K 38/02
11 Número de publicación:
2 169 724
7
51
ESPAÑA
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 93921770.9
kFecha de presentación: 04.10.1993
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 666 758
kFecha de publicación de la solicitud: 16.08.1995
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Propiedades antiinflamatorias, tolerogénicas e inmunoestimulantes de péptidos que enlazan
k
carbohidratos.
30 Prioridad: 02.10.1992 US 956043
21.12.1992 US 995503
250 Karl Clark Road
Edmonton Alberta T6H 5X2, CA
k
72 Inventor/es: Heerze, Louis D.;
k
74 Agente: Urizar Anasagasti, José Antonio
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.07.2002
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.07.2002
ES 2 169 724 T3
k
73 Titular/es: ALBERTA RESEARCH COUNCIL
Aviso:
k
Armstrong, Glen D. y
Smith, Richard
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 169 724 T3
DESCRIPCION
Propiedades antiinflamatorias, tolerogénicas e inmunoestimulantes de péptidos que enlazan carbohidratos.
5
Bases de la invención
Campo de la invención
10
15
Esta invención está dirigida a péptidos unidos a carbohidratos derivados de lectina, para utilizarlos
en métodos para la inhibición de las respuestas inmunes o interacciones celulares en mamı́feros. En particular, esta invención está dirigida a péptidos para utilizarlos en métodos para la supresión de respuestas
inflamatorias, inducción de la tolerancia a antı́genos, modulación de las respuestas inmunes a antı́genos,
y la inhibición de la adhesión celular en mamı́feros. Los péptidos unidos a carbohidratos de lectina empleadas en este punto, son preferiblemente fragmentos de las unidades S2 ó S3 de la toxina de pertussis
expresada por Bordetella pertussis o variantes equivalentes de ella.
Referencias
20
Las siguientes referencias se citan en este documento como superı́ndices en una zona relevante del
mismo:
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el 15 de Junio de 1990.
35
36. Paulson, et al., Patente U.S. N◦ 5.576.305 (Solicitud de Patente US N◦ de Serie 07/619319), archivado el 28 de Noviembre de 1990.
37. Paulson, et al., Patente U.S. N◦ 5.682.945 (Solicitud de Patente US N◦ de Serie 07/632390), archivado el 21 de Diciembre de 1990.
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38. Brandley et al., Publicación de la solicitud de patentes internacional N◦ W092/02527, (1992).
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Estado de la técnica
30
35
Los procesos importantes que implican a las células de mamı́feros, tales como el crecimiento, la
locomoción, el desarrollo morfológico y la diferenciación, son controlados parcialmente por señales extracelulares que actúan sobre la superficie de las células1−3 .
Mientras que algún estı́mulo externo alcanza a la célula por vı́a de fluidos extracelulares, se reciben
otras señales desde la superficie de células próximas o vecinas y ejercen sus efectos a través del contacto
directo célula a célula4,5 .
45
Hay evidencias, que sugieren que estos receptores especı́ficos pueden “sentir” una señal molecular de
una célula opuesta, vı́a unión especı́fica, y existen mecanismos bioquı́micos para traducir estas uniones
en una respuesta celular. Por ejemplo, el complejo de interacciones célula-superficie se cree que ayudan
a procesos directos, tales como la unión de patógenos a tejidos diana6,7, uniones de esperma y huevo8 ,
interacciones entre células en el sistema inmune9,10, y reconocimiento de células durante el desarrollo
embrionario. Además, se ha pensado que los defectos en el reconocimiento célula a célula, son los responsables subyacentes del crecimiento celular sin control, y la movilidad que caracteriza a la transformación
neoplásica y las metástasis12,13 .
50
Otra evidencia sugiere que los procesos de reconocimiento celular están mediados por cadenas de carbohidratos o por porciones de glicano de los glicoconjugados4,14−16. Por ejemplo, la unión de la superficie
de los glicoconjugados de una célula a la proteı́na unida a carbohidrato complementaria (lectinas) sobre
otra célula, puede resultar en la iniciación de una interacción especı́fica.
40
55
60
Un grupo importante de proteı́nas unidas a carbohidratos, son las proteı́nas (lectina+EGF+dominio
regulador complementario de adhesión de célula a molécula) selectinas (LEC-CAM). Se cree que éstas
u otras proteı́nas funcionalmente similares o lectinas juegan un papel crı́tico en las respuestas inmunes
(incluyendo respuestas antiinflamatorias) a través de la mediación del contacto célula a célula y a través
del trasvase de leucocitos17−22 . Se han identificado ligandos de carbohidratos especı́ficos, como parte de
las estructuras del supuesto receptor para la selección de proteı́nas y otras lectinas17−25. Las estructuras identificadas incluyen oligosacáridos glicósidos que contienen unidos terminalmente los grupos ácido
α-siálico (2→6) βGal- y ácido α-siálico (2→3) βGal. Se ha demostrado el uso de oligosacáridos y de sus
derivados, que tienen estos grupos terminales unidos, para controlar la inflamación, la inmunosupresión,
etc. por la interacción con proteı́nas selectinas o/y otras lectinas26−29,35−41.
4
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5
10
De igual modo, péptidos derivados de la selectina GMP-140, que inhiben la unión de GMP-140 y otras
selectinas a leucocitos, presumiblemente por interferencia de la unión de la proteı́na GMP-selectina con
el carbohidrato receptor de leucocitos, también ha sido demostrado que es útil en la supresión de una
respuesta inmune29. De forma similar, también son conocidos otros péptidos como potentes moduladores
de las funciones neutrófilas48 .
Es sabido que la toxina de pertussis (PT)42 , un factor muy virulento producido por el organismo
Bordetella pertussis, el agente etiológico de la tos espasmódica, se une a receptores de glicoproteı́na que
acaban en secuencias de azúcares de sialillactosamina43,44, y nosotros hemos demostrado previamente que
esta proteı́na es útil es la supresión de las respuestas inmunes en mamı́feros y en la adhesión celular45 . Se
ha demostrado que la especificidad de la unión de PT es similar a las de lectinas de plantas procedentes
del Sambucus nigra (SNA) y de Maackia amurensis (MAL)25 , la cual, se une con una gran afinidad al
ácido siálico que contiene glicoconjugados46,47 y la cual también se ha demostrado que tiene propiedades
inmunomoduladoras45.
15
20
De todas formas, el uso de proteı́nas o polipéptidos de elevado peso molecular en la inhibición de las
respuestas inmunes o en la interacción en mamı́feros, sufre de ciertos inconvenientes, incluyendo el hecho
de que son difı́ciles de obtenerse en grandes cantidades en forma pura, que producen efectos adversos
cuando se administran de forma repetida en mamı́feros, que pueden contener agentes infecciosos o sustancias tóxicas que están contraindicadas en la administración a mamı́feros, y que es difı́cil de modificar
las condiciones farmacocinéticas de dichas proteı́nas para mejorar su eficacia.
25
A la vista de lo anterior, serı́a particularmente beneficioso, el uso de péptidos que tienen estas propiedades de unirse a tipo lectina por los grupos terminales αAc5Neu(2→3)βGal- y αAc5Neu(2→6)βGal-,
para usarlos en la inhibición de las respuestas inmunes y en las interacciones celulares en mamı́feros,
comparado con la administración de proteı́nas tales como la toxina de pertussis y la lectina derivada de
SNA y MAL, porque tales péptidos podrı́an mitigar los problemas asociados con la administración de
proteı́nas y polipéptidos de alto peso molecular a mamı́feros.
30
Sumario de la invención
35
40
Esta invención, está dirigida, en parte, al descubrimiento de que los dominios de unión que llevan
terminalmente unidas las estructuras ácido α siálico(2→3)βGal- y/o el ácido α siálico(2→6)βGal-, se
han encontrado en ciertos fragmentos de péptidos de lectinas (por ej. proteı́nas y polipéptidos) tales
como la toxina de pertussis y que no es necesario emplear la completa lectina para efectuar la unión con
estos carbohidratos (oligosacáridos).
Esta invención, además, también está dirigida en parte, al descubrimiento de que cuando estos péptidos
unidos a carbohidratos de lectina son administrados a mamı́feros (por ej. humanos) en cantidades efectivas, inhiben las respuestas inmunes y las interacciones celulares. En particular, esta invención está
dirigida al descubrimiento de si dichos péptidos unidos a carbohidratos de lectina, pueden ser administrados a mamı́feros con el fin de inhibir las respuestas antiinflamatorias, modular la inducción de una
respuesta inmune a un antı́geno, inducir a largo plazo la tolerancia a un antı́geno, y suprimir la adhesión
celular.
45
50
Esta invención está dirigida particularmente al descubrimiento de si estos péptidos unidos a carbohidratos de lectina capaces de unirse terminalmente al ácido α-siálico(2→3)βGal- y/o al ácido αsiálico(2→6)βGal- (por ej. el αNeu5(2→3)βGal-), que son grupos presentes en moléculas (por ej. oligosacáridos, glicoproteı́nas, glicolı́pidos, etc.), los cuales pueden encontrarse en la superficie de células (por
ej. leucocitos), pueden ser administradas en mamı́feros como un medio para la inhibición de la adhesión
celular o para las respuestas inmunes mediadas por células. La respuesta inmune mediada por células
inhibida por los péptidos revelada en este punto, incluyen las respuestas inflamatorias, modulación de la
inducción de la respuesta inmune frente a un antı́geno y la inducción a largo plazo de la tolerancia frente
a un antı́geno.
55
Preferiblemente, los péptidos unidos a carbohidratos de lectina empleados aquı́, son fragmentos de
las subunidades S2 o S3 de la toxina de pertussis expresada por Bordetella pertussis o variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. Estos péptidos preferidos tienen una secuencia de aminoácidos que
aparecen más adelante en la Figura 1.
60
De acuerdo con el primer aspecto de la invención presente, se ha proporcionado un péptido escogido
del grupo consistente en un péptido de fórmula I (SEC ID N◦ :1)
5
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SPX1 GX2 C
5
(I)
En la cual x1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
de los mismos; y X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes
miméticos peptı́dicos de los mismos; y de fórmula II (SBQ ID N◦ : 2);
SPX1 GX2 CX3 X4
10
(II)
En la cual X1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
15
X3 es una secuencia de aminoácidos de 4 a 6 aminoácidos; y
X4 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos del
mismo y sus sales farmacéuticamente aceptables.
20
25
Los péptidos preferidos de acuerdo con el primer aspecto de la invención presente son aquellos que
aparecen en la Figura 1, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Un péptido preferido es el SPYGRC
(aminoácidos 18-23 de SEC ID N◦ : 3), ó sus sales farmacéuticamente aceptables.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención presente, se proporciona un péptido escogido del
siguiente grupo de péptidos
PQEQITQHGSPYGRC
30
PQEQITQHGSPYGRC-CO-NH2
SPTGIVIPPQEQITQHGSPYGRC
SPYGRC-CO-NH2
35
40
45
50
55
60
BIOTINA-SPYGRC-CO-NH2 , ó una sal aceptable farmacéuticamente de la misma.
De acuerdo con un tercer aspecto de la invención presente, se proporciona, una composición farmacéutica que comprende un soporte aceptable farmacéuticamente y un péptido de acuerdo con el primer
aspecto de esta invención, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención presente, se proporciona el uso de al menos un
péptido unido a carbohidrato derivado de lectina o un derivado del mismo, capaz de unirse terminalmente
a los grupos ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, sobre estructuras o moléculas que
incluyen tales grupos, donde dichos péptidos o de sus derivados no tienen más de 35 aminoácidos en la
porción del péptido que se une a estructuras de carbohidratos, para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de supresión de una respuesta inflamatoria de mamı́feros.
De acuerdo con un quinto aspecto de la invención presente, se proporciona el uso de al menos un
péptido unido a carbohidrato derivado de lectina o un derivado del mismo capaz de unirse terminalmente
a los grupos ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, sobre estructuras o moléculas que
comprenden tales grupos, donde dichos péptidos o de sus derivados, no tienen más de 35 aminoácidos en
la porción del péptido que se une a estructuras de carbohidratos, para la fabricación de un medicamento
destinado a la modulación de la inducción de una respuesta inmune, frente a un antı́geno en un mamı́fero,
por la administración de una cantidad efectiva de al menos una lectina en combinación con el antı́geno.
De acuerdo con un sexto aspecto de la invención presente, se proporciona el uso de al menos un péptido
unido a carbohidrato derivado de lectina o un derivado del mismo, capaz de unirse terminalmente a los
grupos ácido α-siálico(2→6) βGal- y/o ácido α-siálico(2→3) βGal-, sobre estructuras o moléculas que
incluyen tales grupos, donde dichos péptidos o de sus derivados no tienen más de 35 aminoácidos en la
porción del péptido que se une a estructuras de carbohidratos, para la fabricación de un medicamento
destinado a la inducción, en un mamı́fero sensibilizado, una tolerancia a largo plazo a un antı́geno, por
la administración de una cantidad efectiva de al menos una lectina después de la exposición de dicho
6
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mamı́fero con el antı́geno.
5
10
15
20
De acuerdo con un séptimo aspecto de la invención presente, se proporciona el uso de al menos uno o
más péptidos unidos a carbohidratos de lectina, o un derivado del mismo, capaz de unirse terminalmente
a los grupos ácido α-siálico(2→6) βGal- y/o ácido α-siálico(2→3) βGal-, sobre estructuras o moléculas
que incluyen tales grupos, donde dichos péptidos o de sus derivados, no tienen más de 35 aminoácidos en
la porción del péptido que se une a estructuras de carbohidratos, para la fabricación de un medicamento
destinado para el tratamiento de la inflamación pulmonar y/o lesión pulmonar en un mamı́fero.
De acuerdo con un octavo aspecto de la invención presente, se proporciona el uso de al menos un
péptido unido a carbohidrato derivado de lectina, o un derivado del mismo, capaz de unirse terminalmente
a los grupos ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, sobre estructuras o moléculas que
incluyen tales grupos, donde dichos péptidos o de sus derivados no tienen más de 35 aminoácidos en la
porción del péptido que se une a estructuras de carbohidratos, para la fabricación de un medicamento
destinado a la inhibición de metástasis o de células tumorales en un mamı́fero.
De acuerdo con un noveno aspecto de la invención presente, se proporciona el uso de al menos un
péptido unido a carbohidrato derivado de lectina o un derivado del mismo, capaz de unirse terminalmente
a los grupos ácido α-siálico(2→6) βGal- y/o ácido α-siálico(2→3) βGal-, sobre estructuras o moléculas
que incluyen tales grupos, donde dichos péptidos o de sus derivados no tienen más de 35 aminoácidos en
la porción del péptido que se une a estructuras de carbohidratos, para la fabricación de un medicamento
destinado a la inhibición de la infección en mamı́feros huésped para agentes bacterianos/vı́ricos y/o sus
toxinas, las cuales emplean estructuras unidas terminalmente del ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o del ácido
α-siálico(2→3)βGal-, como el sitio receptor de una célula de un mamı́fero huésped diana.
25
Descripción breve de los dibujos
La Figura 1 ilustra la secuencia preferida de aminoácidos de los péptidos unidos a carbohidratos de
lectina.
30
La Figura 2 ilustra el incremento en la inflamación de la planta del pie de ratones inmunizados Balb/c,
resultando de una respuesta inflamatoria DTH medida 24 horas después de la exposición con 20 µg de
antı́geno de OVA, donde algunos de los ratones habı́an sido tratados a las 5 horas después de la exposición
con 100 µg de un péptido unido a carbohidrato derivado de lectina.
35
La Figura 3 ilustra los efectos a largo plazo (2 semanas) sobre las respuestas DTH determinadas por
la inflamación de la planta del pie, en grupos de ratones Balb/c, los cuales se inmunizaron con 100 µg
del antı́geno de OVA, expuestos 7 dı́as después con OVA, y entonces tratados aproximadamente 5 horas
después con un péptido unido a carbohidrato derivado de lectina.
40
En la Figura 2 y 3, el péptido 2275 es ACS2P1 (aminoácidos 2-23 de SEC ID N◦ :3) y el péptido 2283
es SPYGRC (aminoácidos 18-23 de SEC ID N◦ :3), ambos aparecen ilustrados en la Figura 1.
De las Figuras 4 a la 7, se ilustran los mismos tests que en las Figuras 2 y 3 para otros péptidos.
45
Los residuos de aminoácidos ilustrados en la Figura 1 y usados a través de este documento están
designados por el código convencional de una sola letra, según:
50
55
60
A alanina
C cisteı́na
D ácido aspártico
E ácido glutámico
F fenilalanina
G glicina
H histidina
I isoleucina
K lisina
L leucina
M metionina
N asparragina
P prolina
Q glutamina
R arginina
S serina
T treonina
V valina
W triptófano
Y tirosina
Adicionalmente, como se indica convencionalmente, los residuos de aminoácidos que forman el extremo
terminal H2 N- del péptido se ponen en adelante en el lado izquierdo de la cadena peptı́dica, y el extremo
terminal -COOH del péptido se coloca en adelante en la parte derecha de la cadena peptı́dica.
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Descripción detallada de las realizaciones preferidas
5
Esta invención está dirigida, en parte, al descubrimiento de que ciertos péptidos unidos a carbohidratos de lectina cuando se administran a un mamı́fero, son efectivos en la supresión de las respuestas
inflamatorias, en la inducción de la tolerancia a un antı́geno, en la modulación de la inducción de respuestas inmunes a antı́genos, y en la inhibición de sucesos de adhesión celular, por ejemplo, sucesos de
adhesión celular involucrados en metástasis de células tumorales.
Definiciones
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Como se ha usado en este punto, los siguientes términos tienen los significados que se comentan a
continuación:
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El término “respuesta inflamatoria” o “trastorno inflamatorio” se referirá a reacciones inmunes que
involucran sistemas de defensa especı́ficos, y no especı́ficos. Una reacción especı́fica del sistema de defensa
es una reacción especı́fica del sistema inmune frente a un antı́geno. Ejemplos de reacciones especı́ficas
del sistema de defensa incluyen respuestas de anticuerpos frente a antı́genos tales como virus, alérgenos,
e hipersensibilidad de tipo retardado. Una reacción no especı́fica del sistema de defensa es una respuesta inflamatoria mediada por leucocitos que generalmente no poseen memoria inmunológica. Dichas
células incluyen macrófagos, eosinófilos y neutrófilos. Ejemplos de reacciones no especı́ficas incluyen la
inflamación inmediata después de una picadura de abeja, y la colección de leucocitos polimorfonucleares
(PMN) en sitios de infección bacteriana (por ej., infiltrados pulmonares en neumonı́as bacterianas y la
formación de pus en abscesos).
Otras “respuestas inflamatorias” o “trastornos inflamatorios” dentro del ámbito de esta invención
incluyen, por ejemplo, trastornos autoinmunes tales como la artritis reumatoide, el lupus, la esclerosis múltiple, la lesión tisular post isquémica mediada por leucocitos (lesión de reperfusión), lesión por
congelación o shock, enfermedad pulmonar aguda mediada por leucocitos (ARDS), el asma, el shock
traumático, el shock séptico, la nefritis, y la inflamación aguda y crónica incluyendo la dermatitis atópica,
la soriasis, y la enfermedad inflamatoria intestinal. Varias patologı́as mediadas por plaquetas, tal como la
aterosclerosis y la coagulación también se incluyen dentro de la definición de “respuestas inflamatorias” o
“trastornos inflamatorios”. Además, las “respuestas inflamatorias” o “trastornos inflamatorios” pueden
incluir la adhesión de células cancerı́genas circulantes, con ejemplos especı́ficos que incluyen el carcinoma
de colon y melanoma.
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Sin limitarnos a ninguna teorı́a, creemos que los sucesos primarios en la iniciación de dichas respuestas
inflamatorias y trastornos inflamatorios son la unión de los leucocitos a las selectinas (por ej., ELAM-1,
PADGEM, etc.) a través de receptores de carbohidratos que comprenden grupos del ácido α-siálico(2→3)
βGal- y/o del ácido α-siálico(2→6)βGal-35−40 encontrados en la superficie de los leucocitos. Ası́ mismo,
se ha demostrado que en mamı́feros y en particular las células de cáncer humano contienen los grupos
ácido α-siálico(2→3)βGal- y/o ácido α-siálico(2→6)βGal- en la superficie de las mismas49,50, y se cree
que la unión de dichas células cancerı́genas circulantes a selectinas es una parte integral del proceso de
metástasis36,37. De forma concordante, interfiriendo la unión de dichos receptores de carbohidratos con
estas selectinas, se consigue la supresión de las respuestas inmunes inflamatorias ası́ como la inhibición
de los procesos de metástasis.
El termino “antı́geno” se refiere a cualquier proteı́na, péptido, carbohidrato, ácido nucleico u otra
sustancia no endógena, a la cual cuando un mamı́fero se expone, induce una respuesta inmune en dicho
mamı́fero.
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Las condiciones de las enfermedades que se cree que son causadas por exposición a un antı́geno incluyen, a modo de ejemplo, la soriasis, el asma, la dermatitis, la artritis reumatoide, la hipersensibilidad
de tipo retardado, la enfermedad inflamatoria intestinal, la esclerosis múltiple, la neumonı́a vı́rica, la
neumonı́a bacteriana, y similares.
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El término “mamı́fero no sensibilizado” se refiere a aquellos mamı́feros cuyo sistema inmune aún no
ha sido educado para reconocer a un antı́geno particular.
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El término “mamı́fero sensibilizado” se refiere a aquellos mamı́feros que han sido previamente expuestos a un antı́geno particular y por consiguiente su sistema inmune si ha sido educado para reconocer a ese
antı́geno. Tı́picamente, la exposición inicial de un antı́geno a un mamı́fero prepara o educa la respuesta
inmune del mamı́fero frente a una exposición posterior con ese antı́geno, con una inflamación mı́nima
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durante dicha exposición inicial.
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El término “respuesta inmune secundaria” se refiere a la fase efectora de la respuesta inmune de un
mamı́fero frente a un antı́geno, frente al cual ha sido previamente sensibilizado. Una respuesta secundaria
de mamı́fero, está tı́picamente acompañada por una inflamación en el momento de la exposición con el
antı́geno.
El “sı́ndrome de dolor respiratorio agudo” o “ARDS”, se refiere a una condición inflamatoria que
comprende una lesión en el pulmón mediado por leucocitos. Sin limitarnos a ninguna teorı́a, se cree
que dicha lesión en el pulmón es exacerbada por infiltración y disrupción subsecuente de neutrófilos en
los pulmones. Especı́ficamente, la disrupción de neutrófilos en los pulmones da lugar a superóxidos, lo
cual resulta en una lesión endotelial vascular severa. Por consiguiente, mientras que esta lesión en el
pulmón no esté basada en antı́genos, la infiltración de los neutrófilos a los pulmones requiere un suceso
de adhesión.
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La “lesión de reperfusión” se refiere a una condición inflamatoria que comprende un lesión tisular
mediada por leucocitos. La lesión de reperfusión ocurre comúnmente después de un infarto de miocardio,
en respuesta a la inflamación causada por el infarto de miocardio, las células endoteliales son activadas
y producen selectinas (por ej., ELAM-1). A su vez, los neutrófilos son entonces capaces de unir las
selectinas expresadas en el endotelio vascular y causar lesiones posteriores.
El término “toxina de pertussis” o “PT” en este documento se refiere a factores de virulencia producidos por Bordetella pertussis, el agente etiológico de la tos espasmódica. El oligómero β de PT se une
con las estructuras ácido α-siálico(2→6) βGal- y el ácido α-siálico(2→3) βGal-. La PT tiene similares
caracterı́sticas de unión como los de la aglutinina del germen trigo (WGA) la cual puede reconocer secuencias sacarı́dicas terminales N-acetil glucosamina (GlcNAc) en adición al ácido siálico44,52,53.
La PT es una toxina clásica del tipo A-B comprendida por una subunidad A (designada como S1) que
contiene actividad enzimática ADP-ribosil transferasa, la cual es responsable de la mayorı́a de los efectos
biológicos de la PT54 . La actividad del tipo lectina se encontró en el complejo oligómero β de la PT, la
cual consiste en cuatro subunidades heterogéneas que se disponen en un par de dı́meros (S2-S4 (dı́mero 1)
y S3-S4 (dı́mero 2)) unidos por una subunidad más pequeña S5. La función del oligómero β, es la de unir
los receptores oligosacarı́dicos sialicilados a la célula huésped, ası́ como la de proporcionar de un sistema
de entrega para la subunidad A a través de la membrana citoplasmática54,55,56. El oligómero β por si
mismo puede inducir una respuesta mitogénica en linfocitos, y tiene la capacidad de aglutinar eritrocitos.
La PT también puede contribuir a la unión de B. pertussis a células epiteliales que revisten el tracto
respiratorio superior de humanos, el único huésped conocido de B. pertussis57. Además el oligómero β
también parece compartir homologı́a funcional con la familia de las selectinas de las lectinas de mamı́fero
que regulan la circulación de leucocitos58 .
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El término “respuesta inmune mediada por células”, se refiere a aquellas respuestas inmunes de
mamı́feros que están mediadas por interacciones entre célula y célula. Incluı́das dentro de este término
están las respuestas inflamatorias mediadas por células frente a un antı́geno incluyendo, a modo de ejemplo, tales respuestas como las de hipersensibilidad de tipo retardado (HTR), neumonı́a inducida por virus,
respuestas alérgicas, y similares ası́ como respuestas inflamatorias mediadas por células como resultado
de lesiones tales como infarto de miocardio, shock y secuelas (por ej., fallo orgánico múltiple), sı́ndrome
de dolor respiratorio agudo (ARDS), y similares. Generalmente, la respuesta inmune mediada por células
es una respuesta mediada por leucocitos.
El término “respuesta inmune humoral” se refiere a las respuestas inmunes de mamı́feros que involucran interacciones de tipo antı́geno-anticuerpo.
El término “respuesta de inflamación HTR” o “respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado” es
una reacción mediada por células T, que resulta en una inflamación rica en células mononucleares e inflamación que ocurre después de la exposición antigénica.
El término “tolerancia” o “tolerancia inmunológica” se refiere a una respuesta inmunogénica reducida,
provocada en un animal sensibilizado a un antı́geno particular sobre un segundo, o exposiciones antigénicas
subsecuentes, en comparación con la respuesta inmune primaria provocada por dicho antı́geno bajo condiciones equivalentes (por ej., la dosis). En la invención presente, dicha “tolerancia” será obtenida por
la administración de un antı́geno al mamı́fero sensibilizado, seguida de la administración de una o más
péptidos unidos a carbohidratos de lectina, la cual se une a las estructuras ácido α-siálico(2→6) βGal9
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y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-.
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El término “periodo para la inflamación máxima” se refiere al periodo de tiempo tı́picamente requerido para conseguir una inflamación máxima en un mamı́fero, debido a una respuesta inmune mediada
por células, incluyendo las respuestas inflamatorias mediadas por células en un mamı́fero sensibilizado
debido a las exposición del antı́geno, y a las respuestas inflamatorias mediadas por células en un mamı́fero
debido a la lesión (por ej. infarto de miocardio). Este perı́odo de tiempo depende de varios factores, tales
como la relación antı́geno/lesión que afecta al mamı́fero, las particulares especies de mamı́feros expuestas al antı́geno/lesión, etc. Por consiguiente, el periodo de tiempo requerido para efectuar la máxima
inflamación variará para, a modo de ejemplo, en la artritis reumatoide como opuesto en el infarto de
miocardio.
Por otra parte, mientras el tiempo especı́fico requerido para efectuar la inflamación máxima variará,
en cierto modo, en especies dadas de mamı́feros, el tiempo tı́picamente requerido para efectuar la inflamación máxima para diferentes afecciones debido tanto a la exposición con el antı́geno, o a la lesión en
humanos y otros mamı́feros es conocida en la técnica o es fácilmente indagable por una persona experta
en la técnica. Por ejemplo, en el caso de la respuesta HTR en ratones, la inflamación máxima aparece
tı́picamente a las 24 horas de exposición con el antı́geno.
El término “ácido siálico” se refiere a todas aquellas estructuras naturales del ácido siálico y análogos,
ası́ como los de sus derivados. Estructuras naturales del ácido siálico incluyen, a modo de ejemplo,
5-acetamido-3,5-didesoxi-D-glycerol-D-galacto ácido nonulopiranosilónico (“Ac5Neu”), ácido N-glicolil
ácido neuramı́nico (Neu5Gc) y 9-O ácido acetil neuramı́nicoAc2 (Neu5,9Ac2). Una lista completa de
los ácidos siálicos naturales conocidos hasta la fecha, está proporcionada por Schauer51 .
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Los derivados del ácido siálico se refieren a derivados de estructuras naturales del ácido siálico, incluyendo aquellos donde la unidad del ácido siálico ha sido quı́micamente modificada, tanto para introducir
y/o quitar uno o más grupos funcionales de tales estructuras. Por ejemplo, dichas modificaciones pueden
resultar de quitar un grupo -OH funcional, la introducción de una amina funcional, la introducción de
un grupo funcional halógeno, y similares.
Ciertos derivados del ácido siálico son conocidos en la técnica e incluyen derivados del ácido siálico modificados quı́micamente tal como, 9-azido-NeuAc, 9-amino-Neu5Ac, 9-desoxi-Neu5Ac, 9-fluoro-Neu5Ac,
9-bromo-Neu5Ac, 8-desoxi-Neu5Ac, 8-epi-Neu5Ac, 7-desoxi-Neu5Ac, 7-epi-Neu5Ac, 7-8-bis-epi-Neu5Ac,
4-O-metil-Neu5Ac, 4-N-acetil-Neu5Ac, 4,7-didesoxi-Neu5Ac, 4-uno-Neu5Ac, 3-hidroxi-Neu5Ac, ácido 3fluoro-Neu5Ac, ası́ como los análogos 6-tio del Ac5Neu. Los métodos para preparar dichos derivados del
ácido siálico se muestran en Ippolito et al., Patente U.S. N◦ 5,580,858 (Solicitud de Patente US N◦ de
Serie 07/889,017 archivada del 26 de Mayo, 1992).
La nomenclatura que describe en este punto a los derivados de los derivados del ácido siálico se debe
a Reuter et al.34.
El término “grupos o estructuras ácido siálico(2→6)βGal-” se refiere a moléculas que comprenden
una secuencia unida terminalmente al ácido αsiálico (2→6)galactosa o de sus derivados. Las moléculas
que contienen dichas estructuras terminales han sido identificadas como partes que comprenden las estructuras del supuesto receptor de las selectinas ELAM -1 y PADGEM38,40.
El término “estructuras o grupos ácido α-siálico(2→3)βGal-” se refiere a moléculas que comprenden
una secuencia unida terminalmente al ácido αsiálico (2→3)galactosa o de sus derivados. Las moléculas
que contienen dichas estructuras terminales han sido identificadas similarmente como partes que comprenden las estructuras del supuesto receptor de las selectinas ELAM -135−39.
El término “péptidos unidos a carbohidratos de lectina” se refiere a cualquier péptido o derivado del
mismo (incluyendo sales aceptables farmacéuticamente), derivadas de una lectina la cual es capaz de
unirse con estructuras de carbohidratos ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, las
cuales están incluidas preferiblemente en la superficie de las células de mamı́fero. Generalmente, en el
presente documento las “péptidos unidos a carbohidratos de lectina” se referirán a aquellos péptidos, que
en forma monomérica no tengan más de aproximadamente 35 aminoácidos en el dominio tipo lectina (por
ej. la parte del péptido responsable de la unión con dichas estructuras de carbohidratos). Los derivados
indicados de los péptidos unidos a carbohidratos de lectina, incluyen a aquellos péptidos que tienen las
funciones terminales NH2 y/o COOH bloqueadas por grupos convencionalmente bloqueadores, ası́ como
derivados que incluyen modificaciones, deleciones, o derivaciones de uno o más de los aminoácidos que
10
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forman un péptido, que es capaz de llevar unidas las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o al ácido
α-siálico(2→3)βGal-.
5
Más preferiblemente, los péptidos unidos a carbohidratos derivados de lectina, se refieren a los péptidos
que aparecen en la Figura 1.
10
Todavı́a más preferiblemente, los péptidos unidos a carbohidratos derivados de lectina, son péptidos
que tienen un alto grado de homologı́a con un dominio de unión de tipo lectina para las estructuras de
carbohidratos ácido α-siálico(2→6) βGal- y/o ácido α-siálico(2→3) βGal-, encontrados en la toxina de
pertussis. Estos péptidos están representados por la fórmula 1 (SEC ID N◦ :1):
SPX1 GX2 C
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I
En la cual, x1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
de los mismos; y X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes
miméticos peptı́dicos del mismo; o por la fórmula II (SEC ID N◦ :2):
SPX1 GX2 CX3 X4
20
II
En la cual, X1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
25
X3 es una secuencia de aminoácidos de 4 a 6 aminoácidos; y
X4 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos del
mismo.
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Más preferiblemente, el péptido unido a carbohidratos de lectina se refiere al hexapéptido SPYGRC
(aminoácidos 18-23 de la SEC ID N◦ :3).
Además de su uso como agentes moduladores de los procesos de inmunidad de mamı́feros y de adhesión
celular, los péptidos unidos a carbohidratos de lectina descritos en este punto, pueden ser usados posteriormente en métodos de análisis para determinar la presencia de las estructuras ácido α-siálico(2→6) βGaly/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, en moléculas y/o superficies tales como células cancerı́genas sospechosas,
para la determinación de la afinidad de unión relativa de péptidos y/o proteı́nas con las estructuras ácido
α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, y similares. Cuando son empleados ası́, los péptidos
unidos a carbohidratos de lectina serán tı́picamente derivatizados para incluir un marcador o un medio
de unión del marcador.
Son bien conocidos los marcadores indicados en la técnica, a modo de ejemplo, enzimas (por ej. la
peroxidasa del rábano picante), radioisótopos (por ej. 125I), medios fluorescentes, medios quimioluminiscentes, y similares. El marcador particular empleado no es crı́tico, y se conocen bien los medios para la
unión de marcadores a los péptidos en la técnica.
También se conocen bien los medios de unión de marcadores indicados e incluyen, a modo de ejemplo,
biotina, avidina, anticuerpos de estretavidina, etc. La biotina es un medio de unión de marcadores preferido, que permite la unión de hasta 4 aductos péptido/biotina a la avidina. La avidina puede ser marcada
apropiadamente de forma que pueda ser detectado el complejo péptido/biotina/avidina resultante.
El término “lectinas” se refiere a carbohidratos unidos a proteı́nas que no tienen origen inmune y a
menudo obtenidos de plantas, o bacterias, o microrganismos virales que incluyen sitios de unión a carbohidratos. Estas proteı́nas ligadoras, tı́picamente incluyen la capacidad de aglutinar células y precipitar
carbohidratos complejos. Las lectinas son clasificadas basándose en su especificidad para unirse a carbohidratos y son bien conocidas en la técnica.
El término “dominio tipo lectina” se refiere a aquel fragmento o fragmentos de una lectina responsable
de la unión al carbohidrato.
El término “sales aceptables farmacéuticamente” incluye las sales de adición aceptables farmacéuticamente de péptidos unidos a carbohidratos de lectina, capaces de unirse terminalmente las
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estructuras ácidoα-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, estas sales de adición aceptables
farmacéuticamente pueden estar derivadas de una variedad de sales inorgánicas y orgánicas que son bien
conocidas en la técnica e incluyen, solo a modo de ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio
tetraalquilo, y similares.
5
Utilidad
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Sin limitarse a ninguna teorı́a, se cree que los péptidos unidos a carbohidratos de lectina, afectan a la
respuesta inmune de varias formas. Los péptidos unidos a carbohidratos de lectina pueden inhibir a un
mamı́fero que se ha “educado” sobre un antı́geno especı́fico cuando los péptidos unidos a carbohidratos
de lectina son administradas simultáneamente junto con la primera exposición del sistema inmune con el
antı́geno.
Los péptidos unidos a carbohidratos de lectina pueden reducir las respuestas inmunes mediadas por
células, para dañar dichas respuestas inflamatorias resultantes del infarto de miocardio, ARDS, congelación, etc.. Los péptidos unidos a carbohidratos de lectina, también pueden inhibir la fase efectora de
una respuesta inmune mediada por células (por ej. el componente inflamatorio de una respuesta HTR),
cuando son administrados en un mamı́fero sensibilizado después de la exposición del sistema inmune
del mamı́fero sensibilizado con el antı́geno. En ambos casos, con el fin de reducir la respuesta inmune
mediada por células, es necesario administrar los péptidos unidos a carbohidratos de lectina después del
inicio de la respuesta inmune del mamı́fero, y antes o justo en la mitad del perı́odo requerido para la
inflamación máxima inducida por la lesión, o por la exposición al antı́geno.
Adicionalmente, los péptidos unidos a carbohidratos de lectina, pueden inducir una tolerancia hacia
los antı́genos en mamı́feros sensibilizados, cuando se administran junto con la segunda o posteriores exposiciones del sistema inmune al antı́geno, cuando la administración se da después del inicio de la respuesta
inmune secundaria del mamı́fero frente al antı́geno, y antes o justo en la mitad del perı́odo requerido para
la inflamación máxima inducida por la exposición al antı́geno.
30
Además, la administración de péptidos unidos a carbohidratos de lectina, que unen las estructuras ácido α-siálico(2→6) βGal- y/o ácido α-siálico(2→3) βGal-, inhiben la unión de proteı́nas LECCAM y otras selectinas con sus supuestos receptores, por lo tanto incluyen ambas estructuras, ácido
α-siálico(2→6) βGal-38,40 y ácido α-siálico(2→3) βGal-35−39.
35
Por consiguiente, el contenido de la invención proporciona la preparación de composiciones farmacéuticas usando péptidos unidos a carbohidratos de lectina capaces de unirse terminalmente a las
estructuras ácido α-siálico(2→6) βGaly ácido α-siálico(2→3) βGal-, las cuales son útiles en la inhibición
de las respuestas inmunes especı́ficas o interacciones celulares en mamı́feros. Dichas composiciones, pueden ser usadas en métodos que incluyan la administración de tales péptidos unidos a carbohidratos de
lectina a mamı́feros, para la inhibición de la respuesta inmune mediada por células.
40
45
Como se dijo anteriormente, los péptidos unidos a carbohidratos de lectina útiles para la modulación
de una respuesta inmune mediada por células en un mamı́fero, incluyen cualquier péptido derivado de
lectina o sus derivados, capaces de unirse terminalmente a las estructuras ácido α-siálico(2→6) βGal- y
ácido α-siálico(2→3) βGal-. Los péptidos unidos a carbohidratos de lectina indicados, son preferiblemente
péptidos que en forma monomérica no tienen más de aproximadamente 35 aminoácidos en el dominio tipo
lectina (por ej., la parte del péptido responsable de la unión con dichas estructuras de carbohidratos).
50
Más preferiblemente, los péptidos unidos a carbohidratos de lectina se refieren a los péptidos que
aparecen en la Figura 1.
55
Aún más preferiblemente, los péptidos unidos a carbohidratos de lectina, son péptidos que tienen un
alto grado de homologı́a con un dominio de unión tipo lectina para estructuras de carbohidratos ácido
α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal- unidas terminalmente, encontradas en la toxina de
pertussis. Estos péptidos están representados por la fórmula 1 (SEC ID N◦ :1):
SPX1 GX2 C
60
I
en la cual, X1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
de los mismos; y X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes
miméticos peptı́dicos del mismo; o por la fórmula II (SEC ID N◦ :2):
SPX1 GX2 CX3 X4
12
II
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en la cual, X1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
5
X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
X3 es una secuencia de aminoácidos de 4 a 6 aminoácidos; y
10
X4 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos del
mismo.
15
La preparación de tales péptidos se conoce bien en la técnica e incluye, a modo de ejemplo, sintetizadores de péptidos normalizados disponibles comercialmente como el modelo ABI 403A disponible
en Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, USA. Los métodos para la preparación de dichos
péptidos no forman parte de esta invención.
Los agentes miméticos peptı́dicos se refieren a grupos que mimetizan a un aminoácido en la cadena
peptı́dica. Dichos miméticos y su sı́ntesis se conocen bien en la técnica59 .
20
25
Los péptidos unidos a carbohidratos de lectina pueden ser usados tanto en forma monomérica como
polimérica. Ejemplos de polı́meros indicados incluyen la unión de biotina con los péptidos unidos a
carbohidratos de lectina, seguido de un complejamiento con avidina lo que resulta en un complejo tetravalente. De igual modo, derivados multivalentes de péptidos unidos a carbohidratos de lectina, pueden
ser sintetizados por la unión de dichos péptidos a polı́meros, tales como polilisina o una proteı́na inerte,
tal como la albúmina sérica humana. Los derivados multivalentes ası́ formados pueden contener una o
una mezcla de diferentes péptidos unidos a carbohidratos de lectina, para potenciar la eficacia.
En el caso de conjugados de péptidos y proteı́nas, serán polimerizados quı́micamente con el soporte de
proteı́na mediante agentes polimerizantes conocidos, usando una técnica con una metodologı́a reconocida.
30
Todavı́a en otras realizaciones, los péptidos unidos a carbohidratos derivados de lectina multivalentes,
pueden ser generados como un copolı́mero, donde los péptidos son unidos juntos a través de un espaciador
para proporcionar una subunidad repetitiva representada por los grupos:
35
(carbohidratos unidos a péptidos-espaciador)n
(carbohidratos unidos a péptidos)n -espaciador
40
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En estas subunidades, el péptido derivado de carbohidratos de lectina, puede ser la misma lectina o diferente, y el espaciador está escogido para proporcionar una distancia óptima para unirse al carbohidrato.
De todas formas, la invención no está restringida especı́ficamente al uso del péptido unido a carbohidrato derivado de lectina ejemplificado en la Figura 1, o a derivados multivalentes de la misma, pero
más bien abarca, el uso de cualquier péptido derivado de lectina o derivado del mismo, que se una terminalmente a las estructuras de carbohidrato ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3) βGal-.
Como se dijo anteriormente, los péptidos capaces de unir tales estructuras, cuando se administran a un
animal, resultan en la inhibición de respuestas inmunes e interacciones celulares, en particular, respuestas
o condiciones inflamatorias, tolerancia al antı́geno, y la inhibición de sucesos de la adhesión celular, que
están involucrados, por ej., en metástasis y en inflamación.
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60
Dentro del nivel de conocimientos ordinarios en esta técnica, está bien identificar otras péptidos derivados de lectina capaces de unirse terminalmente a las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido
α-siálico(2→3)βGal-, por métodos convencionales para el ensayo de unión entre ligandos. Estos métodos
incluyen, por ej., ensayos de unión competitiva y ensayos de unión de receptor. El contenido del documento, en particular, fija un método en los ejemplos que ilustran simples técnicas de ensayo, que son capaces de determinar la unión de las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGalunidas terminalmente. Otros métodos para la determinación de la unión de un péptido candidato con
dichas estructuras unidas terminalmente son conocidas en la técnica. Ver, por ej., Pearce-Pratt et al.31.
De este modo, pueden ser usados métodos, mediante los cuales los péptidos derivados de lectina
capaces de inducir o suprimir una o varias respuestas inmunes e interacciones celulares, por ej., inflamación, tolerancia antigénica, modulación de la respuesta antigénica, o adhesión celular, pueden ser
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identificados supuestamente, basándose en su capacidad para unirse terminalmente a las estructuras ácido
α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-.
5
En relación con lo anterior, marcadores o grupos que se unen a marcadores, son ligados a los péptidos
unidos a carbohidratos derivados de lectina, y/o a los péptidos unidos a carbohidratos derivados de lectina
candidatos, con el fin de facilitar los ensayos descritos anteriormente. Estos marcadores están formados
convencionalmente sobre los péptidos por métodos bien conocidos. Marcadores bien conocidos incluyen
a modo de ej., enzimas (por ej., peroxidasa de rábano picante), radioisótopos (por ej. 125 I), medios
fluorescentes, medios quimioluminiscentes, y similares.
10
Medios de unión de marcadores indicados también son bien conocidos en la técnica e incluyen, a modo
de ej., biotina, avidina, anticuerpos, etc. un medio de unión de marcador preferido es la biotina, que
permite la unión del aducto péptido/biotina a la avidina. La avidina puede ser marcada apropiadamente
de forma que el complejo péptido/biotina/avidina resultante pueda ser detectado.
15
También pueden usarse kits para realizar estos ensayos. Dichos kits, incluirı́an el péptido unido a
carbohidratos derivado de lectina marcado o el péptido unido a carbohidratos derivado de lectina unido
a grupos de unión marcados.
20
25
Los péptidos unidos a carbohidratos de lectina indicados para usar aquı́, son aquellos que son capaces
de unirse terminalmente a las estructuras ácido α-siálico(2→6) βGal- y/o ácido α-siálico(2→3) βGal-.
De todas formas, un prerrequisito adicional de la eficacia de el péptido unido a carbohidrato derivado de
lectina incluirá la idoneidad para la administración in vivo. En particular, el péptido unido a carbohidrato derivado de lectina no debe ser tóxica, y debe ser suficientemente soluble a las dosis requeridas, que
estarán tı́picamente en el rango de aproximadamente 0.5-50 mg/kg de peso corporal. A este respecto,
está reconocido que la solubilidad de el péptido unido a carbohidrato derivado de lectina pueden ser
potenciadas mediante la unión de grupos de aminoácido hidrofı́licos y puede ser reducida por la unión de
aminoácidos hidrofóbicos desde el extremo carboxilo terminal y/o el extremo amino terminal del péptido.
30
La invención contempla además fragmentos o derivados de péptidos capaces de unirse terminalmente
a las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, cuyos péptidos han sido modificados para que no sean tóxicos, por ej., por derivatización quı́mica, mutagénesis, etc. mientras todavı́a
retengan la capacidad de unir terminalmente dichas estructuras.
35
El contenido de la invención proporciona en particular, el uso de uno o más péptidos unidos a carbohidratos de lectina capaces de unirse terminalmente a las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o
ácido α-siálico(2→3)βGal-, o a las superficies de molécula/célula que incluyen dichas estructuras, para
la preparación de un medicamento útil en métodos para la supresión de las respuestas inmunes mediadas
por células en mamı́feros, incluyendo respuestas inflamatorias mediadas por células o trastornos. Las respuestas inmunes mediadas por células, o trastornos tratables por el contenido de la invención, incluyen
reacciones inmunes inflamatorias, que involucran a sistemas de defensa especı́fica y no especı́fica. Como
se discutió anteriormente, tales condiciones incluyen respuestas de anticuerpos frente a antı́genos, como
virus, alérgenos, hipersensibilidad de tipo retardado, trastornos de tipo autoinmunes como la artritis reumatoide, el lupus, la lesión tisular post isquémica mediada por leucocitos (lesión de reperfusión), la lesión
por congelación o shock agudo por lesión en el pulmón mediado por leucocitos (por ej., sı́ndrome de dolor
respiratorio agudo), el asma, el shock traumático, el shock séptico, la nefritis, y la inflamación crónica
y aguda, incluyendo la dermatitis atópica, la soriasis, y la enfermedad intestinal inflamatoria, además,
los trastornos inflamatorios tratables mediante el contenido de la invención, pueden incluir patologı́as
mediadas por plaquetas como la aterosclerosis y las difunciones de coagulación.
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Condiciones inflamatorias de especial interés, incluyen las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado, la reperfusión, y la lesión aguda del pulmón mediada por leucocitos (ARDS).
55
60
Uno o más péptidos unidos a carbohidratos de lectina, o fragmentos o derivados de los mismos, capaces
de unirse terminalmente a las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, o
superficies de moléculas/célula que incluyen dichas estructuras, pueden ser usadas en un método genérico
mediante el cual, las respuestas inmunes mediadas por células, tal como respuestas inflamatorias mediadas por células o trastornos en mamı́feros (por ej. humanos) puedan ser suprimidas. En una realización
preferente, la invención proporciona uno o más péptidos escogidos del grupo de péptidos que aparecen en
la Figura 1. Para usarlos en métodos mediante los cuales, respuestas inflamatorias o trastornos puedan
ser tratados o suprimidos.
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El contenido de la invención, además incluye el uso de uno o más péptidos unidos a carbohidratos
de lectina, o fragmentos o de sus derivados capaces de unirse terminalmente a las estructuras ácido
α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, o superficie de moléculas/célula incluyendo dichas
estructuras, para la preparación de un medicamento indicado en un método general para la inhibición de
la respuesta inmune y sucesos de adhesión celular en mamı́feros. Tales respuestas inmunes incluyen, respuestas inmunes mediadas por células y humorales. Como ya ha sido discutido, estas respuestas inmunes
incluyen, en particular, respuestas inflamatorias o trastornos inflamatorios.
Además, la invención incluye el uso de uno o más péptidos unidos a carbohidratos de lectina capaces
de unirse terminalmente a las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, o
superficies de moléculas/célula, que comprendan dichas estructuras para la preparación de un medicamento indicado en métodos para influir en la inducción de las respuestas inmunes frente a antı́genos,
comprendiendo la administración de un antı́geno a un mamı́fero en conjunción con uno o más péptidos
citados. Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del hexapéptido SPYGRC (aas 18-23
de SEC ID N◦ :3) a un mamı́fero con un antı́geno modulará la inducción de la respuesta inmune en el
mamı́fero hacia el antı́geno. Por consiguiente, los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina
pueden comprender una aplicación como modulador inmune, que puede ser administrado en conjunción
con vacunas, órganos artificiales, o transplante de tejidos, y órganos alogénicos y transplantes de tejidos
como medios para la modulación de la respuesta inmune frente a antı́genos extraños comprendidos allı́
dentro.
Posteriormente se ha encontrado que los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina capaces
de unirse terminalmente a las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, o
superficies de moléculas/célula que incluyen dichas estructuras, cuando se administran en una cantidad
efectiva a un mamı́fero que ha sido inmunizado con un antı́geno particular, resulta en la inducción de
tolerancia a largo plazo a dicho antı́geno. A este respecto, la administración se dirige después del principio
de la respuesta inmune secundaria, pero justo en el momento o antes de la mitad del periodo requerido
para la máxima inflamación en particular, se ha encontrado que la administración, durante el periodo
crı́tico dicho anteriormente, de una cantidad efectiva de péptidos S3P9a (SEC ID N◦ :9), ACS2P1 (2275)
(aas 9-23 de SEC ID N◦ .3), y SPYGRC (2283) (aas 18-23 de SEC ID N◦ :3) ilustrados en la Figura
1 a mamı́feros que han sido inmunizados con un antı́geno, resulta en una exhibición de una respuesta
inmune reducida sobre exposición(es) subsecuente(s) con dicho antı́geno (Figura 3) en dichos mamı́feros.
De este modo, los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina tienen aplicación como antı́genos
tolerógenos. Dada esta propiedad, estos péptidos unidos a carbohidratos de lectina, o fragmentos, o de
sus derivados pueden estar especialmente indicados para usarlos en el tratamiento de trastornos alérgicos,
ya que que la administración de los antı́genos tolerógenos derivados de alérgenos es un medio conocido
para el tratamiento de los trastornos alérgicos.
El contenido de la invención proporciona además, agentes para usar en métodos para inhibir la
adhesión de ciertos tipos de células (por ej., células tumorales y células polimorfonucleares (PMN)) a
células endoteliales. A este respecto, la técnica sugiere que las metástasis implican la adhesión de células
tumorales con células que llevan selectinas. A este respecto, las células cancerı́genas circulantes toman
aparentemente ventaja de los mecanismos inflamatorios normales del cuerpo, y se unen a áreas de las
paredes de los vasos sanguı́neos, donde el endotelio es activado, y por consiguiente, contiene selectinas.
Como se ha anotado anteriormente, los supuestos receptores para dichas selectinas contienen terminalmente unidas las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-. Por lo tanto, la
administración de los péptidos unidos a carbohidratos de lectina capaces de unirse terminalmente a las
estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, deberı́an proporcionar un método
para la inhibición de las metástasis. Por ejemplo, los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina
o fragmentos, o de sus derivados pueden ser administrados antes, durante o después de una intervención
quirúrgica o biopsia de cáncer, como medio para inhibir las metástasis de células tumorales que pueden
ser liberadas al sistema circulatorio durante la intervención quirúrgica. En estos métodos, los tipos de
péptidos unidos a carbohidratos de lectina son administrados tanto antes de, al mismo tiempo que la
intervención quirúrgica o la biopsia de cáncer, o poco tiempo después. Antes de la administración, se
refiere tı́picamente, a no mas de aproximadamente 5 horas antes de la intervención o la biopsia, y administración subsecuente se refiere a no mas de aproximadamente 15 horas después de la intervención o la
biopsia. En ambos casos, la administración es o bien continua o bien intermitente, pero preferiblemente
es continua.
En los métodos que atañen a la supresión de reacciones inflamatorias mediadas por células o trastornos
derivados de un daño o una exposición a antı́genos, los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina
o fragmentos o de sus derivados son administrados después de la iniciación de la respuesta inmune del
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mamı́fero, pero justo en el momento o antes de la mitad del periodo requerido para la inflamación máxima
a la exposición del antı́geno o lesión. Preferiblemente, los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de
lectina son administrados aproximadamente entre 1-10 horas después de la iniciación de la respuesta
inmune, y más preferiblemente entre 1-5 horas después de la iniciación de la respuesta inmune. De todas
formas, el tiempo especı́fico para la administración variará dependiendo del antı́geno/lesión particular y
de los péptidos unidos a carbohidratos de lectina que sean administrados.
En los métodos que atañen a la modulación de la inducción de una respuesta inmune a un antı́geno
en un mamı́fero no sensibilizado, una cantidad efectiva de los tipos de péptidos unidos a carbohidratos
de lectina o sus derivados serán administrados junto con el antı́geno. Tı́picamente, esta administración
en conjunto es simultánea con la administración del antı́geno pero puede ser de hasta ± 3 horas desde el
tiempo de la administración del antı́geno.
En los métodos que atañen a la inducción de la tolerancia a largo plazo a un antı́geno, una cantidad
efectiva de los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina o fragmentos o sus derivados, serán
generalmente administrados después de la exposición al antı́geno a un mamı́fero sensibilizado. En particular, la administración es después de la iniciación de la respuesta inmune secundaria del mamı́fero
frente a la exposición del antı́geno, pero justo en el momento o antes de la mitad del periodo requerido
para la inflamación máxima a la exposición del antı́geno. Preferiblemente, los tipos de péptidos unidos a
carbohidratos de lectina se administran entre 1-10 horas después de la iniciación de la respuesta inmune
a la exposición del antı́geno, y más preferiblemente entre 1-5 horas después de la iniciación de la respuesta inmune a la exposición del antı́geno. De todas formas, el tiempo especı́fico para la administración
variará dependiendo del antı́geno particular y de los péptidos unidos a carbohidratos de lectina que sean
administrados.
25
30
Generalmente, los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina o sus derivados se administrarán
parenteralmente, por ej., por vı́a intravenosa o intramuscular. Sin embargo otras formas de dosis podrı́an
estar también indicadas incluyendo, por ej., formulaciones orales, subcutáneas, rectales, intratraqueales e
intranasales. Por ej., la formulaciones intranasales e intratraqueales pueden ser preferidas si la condición
inflamatoria tratada implica inflamación del pulmón, por ej., el sı́ndrome de dolor respiratorio agudo
(ARDS). En contraste, una formulación oral probablemente podrı́a preferirse, si la condición inflamatoria
tratada implicara al tracto digestivo, por ej., la enfermedad intestinal inflamatoria.
40
Las composiciones farmacéuticas para usar en la invención, incluirán generalmente una cantidad
efectiva de uno o más de los tipos de péptidos o de sus derivados capaces de unirse terminalmente a
las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, en combinación con soportes
y/o excipientes aceptables farmacéuticamente. Los excipientes y/o soportes particulares aceptables farmacéuticamente variarán dependiendo de la forma de presentación. En una realización, algunos de los
tipos de péptidos o de sus derivados, son mezclados en la composición farmacéutica en forma de un
“cocktail” que tiene actividad potenciada.
45
Las indicaciones parenterales pueden contener como soporte tampón fosfato salino, mientras que las
formulaciones intranasales comprenderán inhalantes, y las indicaciones orales pueden contener revestimiento entérico. La selección de los soportes y excipientes indicados y la formulación de diferentes formas
de presentación, está bien dentro del nivel ordinario de conocimientos en el medio farmacéutico.
35
50
Como se dijo anteriormente, los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina o de sus derivados,
son administrados en cantidades efectivas. Una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para obtener
la terapia deseada sin causar toxicidades indebidas en el mamı́fero. Preferiblemente, los tipos de péptidos
son administrados a dosis que oscilan desde aproximadamente 0.5 a 50 mg/kg de peso corporal, siendo
más preferido de 5-10 mg/kg para cada uno de los métodos citados anteriormente. La dosis especı́fica
empleada es regulada por la respuesta inmune mediada por células particular, siendo tratada según el
criterio del facultativo dependiendo de factores como la severidad de la respuesta inmune adversa, la edad
y la condición general del paciente, y similares.
55
60
Generalmente, los métodos descritos anteriormente, incluirán la administración de una dosis única de
los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina. Sin embargo, la invención también contempla
la administración repetida de los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina o de sus derivados.
La administración repetida de estos péptidos puede ser deseable, por ej., en el tratamiento de trastornos
inflamatorios crónicos o sostenidos, tales como la artritis reumatoide, la inflamación crónica y aguda, la
soriasis, los trastornos inflamatorios intestinales, y los trastornos autoinmunes asociados con respuestas
inflamatorias tales como el lupus, la esclerosis múltiple o la artritis reumatoide.
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También está contemplado que los tipos de péptidos y derivados son útiles como fármacos antibacterianos y antivirales de receptores diana, donde la bacteria, virus, o las toxinas producidas por ellos
emplean las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal- terminalmente unidas,
como el receptor sobre una célula mamı́fera huésped.
10
Estas bacterias/virus y/o toxinas incluyen a modo de ejemplo, el virus influenza, la toxina de pertussis,
la toxina del cólera, etc. Estos métodos están ilustrados en los ejemplos que se describen a continuación,
donde ensayos in vitro, demuestran la capacidad de dos tipos de péptidos unidos a carbohidratos de
lectina, para neutralizar los efectos de la toxina de pertussis sobre células de ovario de hámster chino.
15
20
Por consiguiente, cuando se administran en cantidades efectivas, los tipos de péptidos unidos a
carbohidratos de lectina, son útiles en métodos para inhibir la inoculación en mamı́feros huésped de
agentes bacterianos/virales y/o sus toxinas que emplean unas estructuras terminalmente unidas ácido
α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, como el sitio receptor de una célula del mamı́fero
huésped diana, por eso se inhibe la probabilidad de que el mamı́fero huésped llegue a ser afectado con la
enfermedad producida por el agente bacteriano/viral y/o su toxina.
Cantidades efectivas de los tipos de péptidos unidos a carbohidratos de lectina o de sus derivados,
serán dosis preferiblemente entre 0.5 a 50 mg/kg de peso corporal, siendo más preferida la dosis de 5-10
mg/kg.
Ejemplos
25
30
Con el fin de ilustrar adecuadamente la invención presente y las ventajas de la misma, se dan los
ejemplos especı́ficos siguientes, debe entenderse que estos ejemplos intentan solamente ser ilustrativos y
de ninguna manera limitativos del alcance de la invención presente.
En estos ejemplos, ası́ como en el documento, todos los azúcares que aparecen aquı́ están en su forma
D excepto la fucosa que aparece en forma L, y todos los aminoácidos son convencionales.
En estos ejemplos, si no se define posteriormente de otra forma, las abreviaturas empleadas son aceptadas como:
35
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ABTS:
BSA:
cm:
HPLC:
MAL:
mg:
mM:
mm:
ng:
nm:
PBS:
PT:
SNA:
µg:
µl:
µM:
µmol:
v/v:
2,2’-azino-bis(ácido 3-etilenziantolina-6-sulfónico)
seroalbúmina bovina
centı́metro
cromatografı́a lı́quida de alta resolución
Maackia amurensis
miligramo
milimolar
milı́metro
nanogramo
nanómetro
tampón fosfato salino
toxina de pertussis
Sambucus nigra
microgramo
microlitro
micromolar
micromol
volumen/volumen
55
Si no se indica lo contrario, todas las temperaturas se expresan en la escala centı́grada de Celsius
(◦ C). Ası́ mismo, tal como se dijo anteriormente, los residuos de aminoácidos que aparecen aquı́, emplean
la abreviatura convencional de una sola letra.
60
Procedimientos generales
Todos los reactivos usados en los Ejemplos 1-10 se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis,
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Missouri, USA, excepto la toxina de pertussis (PT) que se obtuvo de Connaught Center for Biotechnology
Research, Willowdale, Ontario, Canada; las biotinas SNA, WGA y MAL, fueron obtenidas de Boehringer
Mannheim, Dorval, Quebec, Canada; y el IODO-GEN obtenido de Pierce Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA. Los análogos acetilados y biotinilados del péptido S2P1 (aas 9-23 de SEC ID N◦ :3) fueron
preparados usando métodos convencionales. La biotina-PT, ası́ como la asialo- y asialoagalactofetuina,
fueron preparadas como se describió anteriormente30,44 . las bandas de microconcentrado desechables de
Immunolon 2 eran de Dynatech, Alexandria, Virginia, USA.
Ejemplo 1
10
Sı́ntesis de péptidos sintéticos
15
20
25
Los péptidos correspondientes a las secuencias de aminoácidos encontrados en las subunidades S2 y
S3 de PT, fueron sintetizados usando un sintetizador de péptidos ABI 403A (Applied Biosystems, Inc;
Foster City, California, USA), separados mediante una resina por HF y purificado por HPLC de fase
inversa, en una columna semipreparada Vydac C4. Todos los péptidos sintéticos usados en el ensayo de
inhibición ELISA fueron puros en más del 95 %, como se comprobó por análisis en HPLC, estando los
análisis de aminoácidos en buena concordancia con las composiciones teóricas.
Regiones en la subunidades S2 y S3 de PT corresponden a secuencias de aminoácidos variables,
distinguiéndose de forma segura la subunidad S2 de la S3. Estas secuencias de péptidos fueron elegidas
en parte, basándose en su alto ı́ndice de β-recambio hidrofı́lico, como se juzga en el análisis de predicción
de la estructura secundaria60,61 . Sobre un examen más cuidadoso de las secuencias de PT, se sintetizaron
20 péptidos incluyendo aquellos que contienen los residuos de aminoácidos 62-73 de WGA (SEC ID N◦ :
11). La versión acetilada de S2P1 (aas 9-23 de SEC ID N◦ :3) También fue preparada con el fin de
mimetizar la cadena de péptidos original. Los péptidos sintetizados se muestran más abajo, en la Tabla I:
TABLA I
Posición
Secuencia∗
SEC ID NO
1. S2P1
9-23
PQEQITQHGSPYGRC
3 (aa 9-23)
2. ACS2P1-b
9-23
BIOTINA-PQEQITQHGSPYGRC-CO-NH2
3 (aa 9-23)
3. S2(14-23)
14-23
TQHGSPYGRC
3 (aa 14-23)
4. S2-b
14-23
BIOTINA-TQHGSPYGRC
3 (aa 14-23)
5. S2P2
1-23
STPGIVIPPQEQITQHGSPYGRC
3
6. SPYGRC
18-23
SPYGRC-CO-NH2
3 (aa 18-23)
7. SPYGRC-b
18-23
BIOTINA-SPYGRC-CO-NH2
3 (aa 18-23)
8. S2P3
78-98
GAFDLKTTFCIMTTRNTGQPA
4
9. S2P4
138-154
YDGKYWSMYSRLRKMLY
5 (aa 16-32)
10. S2P6
123-154
FVRSGQPVIGACTSPYDGKYWSMYSRLRKMLY
5
11. S3P1
9-23
PKALFTQQGGAYGRC
6 (aa 9-23)
12. S3P2
1-23
VAPGIVIPPKALFTQQGGAYGRC
6
13. S3P3
87-108
CITTIYKTGQPAADHYYSKVTA
7 (aa 10-31)
30
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50
55
60
18
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TABLA I (Continuación)
Posición
Secuencia∗
SEC ID NO
14. S3P4
78-108
AGFIYRETFCITTIYKTGQPAADHYYSKVTA
7
15. S3P5
134-154
CASPYEGRYRDMYDALRRLLY
8
16. S3P9a
110-127
RLLASTNSRLCAVFVRDG
9
17. S2(WGA)#
-
PQEQITQHGSQYGYC
10
18. S2(WGA)-b
-
BIOTINA-PQEQITQHGSQYGYC
10
19. WGA(62-73)
-
SQYGICGFGAEY
11
20. WGA(62-73)-b
-
BIOTINA-SQYGYCGFGAEY
11
5
10
15
20
∗
25
Las secuencias subrayadas corresponden a las secuencias encontradas el el péptido de PT que muestran
homologı́a con la secuencia SQYGHC (SEC ID N◦ :12) encontrada en el sitio de unión de la isolectina
2 WGA (24).
# La secuencia PT S2P1 (aas 9-23 de la SEC ID N◦ :3) insertada con el hexapéptido WGA de secuencia
(SQYGYC) (aminoácidos 10-15 de la SEC ID N◦ :10)
30
35
aa
aminoácido
b
biotina
Los péptidos anteriores fueron testados en el ejemplo de arriba, para comprobar su capacidad de unirse
terminalmente a las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, en los ejemplos siguientes. En estos ejemplos, los péptidos fueron en primer lugar seleccionados para comprobar su
capacidad de inhibir la unión de diferentes lectinas (PT, SNA y MAL), las cuales se sabe que se unen a la
fetuina, un carbohidrato que contiene múltiples copias de la estructura αNeu5Ac(2→3)βGal(1→4)βGlc-.
Ejemplo 2
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60
Ensayos de inhibición de la unión (péptido inicial seleccionado)
Las bandas de microconcentrado fueron cubiertas con 100 µl de fetuina o asialofetuina (50 µg/ml) en
50 mM de tampón fostato de sodio (pH 6.8) que contenı́an 5 mM de Mg Cl2 y 15 mM de NaN3 durante 16
horas a 4◦ C. Se aspiró la solución y se reemplazó con 100 µl de BSA al 1 % en PBS que contenı́a un 0.05 %
de Tween 20 (PBST). Después de la incubación durante 2-4 horas a temperatura ambiente las bandas
de microconcentrado se lavaron 4 veces con 300 µl de PBST. Los péptidos estaban en una concentración
entre 0.5 a 4.5 mg/ml en PBS (40 µl), fueron añadidos a cada pocillo, y entonces se añadió a la banda de
microconcentrado la biotina-PT (10 µl que contienen 10 ng en PBS). Después de incubar durante 1 hora,
la reacción de unión se detuvo por aspiración de las soluciones, la capa fue lavada con PBST (300 µl).
Ahora se añadió a los pocillos un conjugado de peroxidasa de rábano picante con avidina (100 µl, dilución
1/3000 en PBST a una concentración de 0.3 µg/ml), y las placas se incubaron a temperatura ambiente
durante 1 hora. Después de lavar los pocillos tal como se describió antes, se añadió la solución sustrato (1
mM de ABTS en 5 mM de tampón citrato, pH 4.2, conteniendo 0.01 % de peróxido de hidrógeno, v/v),
y las placas fueron incubadas durante 30 minutos, el desarrollo del color fue registrado a 405 nm usando
un lector de placa Titerteck Multiskan MC. La unión máxima se determinó en ausencia del péptido, y la
unión residual fue medida en pocillos cubiertos sólo con BSA. Los ensayos de unión para cada péptido se
hicieron por duplicado. Los experimentos de inhibición de la unión utilizando la biotina-SNA, -WGA, y
-MAL fueron desarrolladas como se describió anteriormente, usando 10 ng de cada lectina biotinilada en
PBS.
El panel de 20 péptidos fue analizado para comprobar la capacidad para inhibir la unión de la biotinaPT, -WGA, -MAL, a la fetuina o asialofetuina. Se ha comprobado que las lectinas de plantas biotiniladas
son controles útiles, ya que hemos demostrado previamente que estas lectinas poseen especificidades de
19
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10
unión similar a la PT25,46. Los resultados de este ejemplo aparecen más abajo en la Tabla II. Estos
resultados indican que los péptidos S2P3 (SEC ID N◦ :4) y S2P6 (SEC ID N◦ :5) inhibieron ambos en
un 15-20 % la unión de la biotina PT con la fetuina, ası́ como con la asialofetuina. Los péptidos S2P1
(aminoácidos 9-23 de SEC ID N◦ :3), ACS2P1 (aminoácidos 9-23 de SEC ID N◦ :3) y S2P2 (SEC ID N◦ :3)
mostraron casi 2 veces un aumento de la unión de la biotina-PT relacionada con los experimentos control
hechos en ausencia del péptido.
El péptido S2P3 (SEC ID N◦ :4) se encontró que inhibı́a la unión a la fetuina de todas las lectinas
biotiniladas. Sin embargo, se comprobó que los péptidos S2P1 aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) y
S2P2 (SEC ID N◦ :3) que mostraron una capacidad potenciadora de la unión PT a la fetuina, inhibı́an la
actividad ligadora de la WGA.
TABLA II
Cambios Porcentuales en la actividad ligadora
15
20
Péptido
SEC ID NO
Concentración
(mg/ml)
PT/
fetuina∗
MAL/
fetuina
SNA/
fetuina
WGA/
fetuina
PT/asialo
fetuina
S2P1
3 (aa 9-23)
1.2
+83±4
+8±4
-5±1
-18±2
+113(1)
ACS2P1
3 (aa 9-23)
1.0
+89±3
+16±9
-3±1
-22±6
+190±23
S2(14-23)
3 (aa 14-23)
1.0
+68±9
+32±1
+1±2
+7±1
ND
S2P2
3
1.1
+58±4
+14±2
-1±1
-15±2
+33(1)
S2P3
4
0.51
-21±0
-18±2
-15±4
-56±8
-15(1)
S2P4
5 (aa 16-32)
0.98
+14±22
+2(1)
+3(1)
+15±1
-3(1)
S2P6
5
0.85
-28±6
+18±16
+2±2
+57±0
-18(1)
S3P1
6 (aa 9-23)
3.2
+54±25
+4±6
-2±1
-9±4
+45±16
S3P2
6
3.1
+77±59
+12±16
+3±3
+9±4
+82±11
S3P3
7 (aa 10-31)
4.5
+19±67
+13±15
+3±0
+6±3
-28±7
S3P4
7
3.3
+12±2
+7±1
+1(1)
+13±1
+75±50
S3P5
8
0.48
+14±6
+3±6
0(1)
+35±8
-26±10
S3P9a
9
1.7
+328±10
+18±6
-41±3
ND
ND
SPYGRC
3 (aa 18-23)
4.4
+34±2
-16±0
-2±2
+7±3
+7±9
S2(WGA)
10
1.0
+79±15
+22±3
0±1
-4±3
ND
WGA(62-73)
11
1.0
-32±5
-1±4
-3±2
-9±1
ND
25
30
35
40
45
50
55
∗
lectina/glucoproteı́na biotinilada unidas en la banda de microconcentrado Los signos positivos que
preceden a los números, en esta Tabla, indican una potenciación de la unión, y los signos negativos,
una inhibición de la misma.
(1) una sola determinación
60
aa aminoácido
ND no determinado
20
ES 2 169 724 T3
Ejemplo 3
Ensayos de inhibición de la unión (Determinación de los valores de IC 50)
5
10
15
20
25
30
35
40
Los péptidos que resultaron tener actividad inhibitoria en los experimentos iniciales seleccionados,
fueron analizados posteriormente en experimentos de inhibición de la unión para determinar la concentración de péptido que era requerida para reducir la unión en un 50 % (valores IC50 ).
Los experimentos de inhibición fueron desarrollados mediante un método similar al descrito en el
Ejemplo 2, con el péptido PT diluido dos veces en PBS, excepto que los pocillos de la banda de microconcentrado se cubrieron con 3 µg/ml de fetuina o asialofetuina. Los ensayos de unión para la concentración
de cada inhibidor se hicieron al menos por duplicado, y el valor promedio varió menos de un 15 %. La
concentración requerida del péptido para una inhibición del 50 % (IC50 ) se determinó por representación
gráfica de la cantidad de unión observada en presencia del péptido inhibidor, como un porcentaje de la
unión máxima conseguida sin el inhibidor.
Dos de los péptidos derivados de la subunidad S2 fueron capaces de inhibir la unión de la biotina-PT
con la fetuina, a concentraciones submilimolares, pero fueron incapaces de inhibir la unión de la biotinaPT con la asialofetuina, en experimentos subsecuentes (Tabla III). Las dos secuencias peptı́dicas de la
subunidad 3 (S3P3 aminoácidos 10-31, de SEC ID n◦ : 7) y S3P5 (SEC ID N◦ : 8) inhibı́an la interacción
de la biotina-PT con la asialofetuina dependiendo de la concentración, pero sus valores IC50 estaban por
encima de los lı́mites de solubilidad del péptido en PBS. El péptido S2P3 (SEC ID N◦ :4) fue también
muy activo en la inhibición de la interacción de biotina-WGA y -MA con fetuina. En un examen más
detallado se comprobó que este péptido no era inhibidor para la biotina-SNA. Dos péptidos adicionales de
la subunidad S2 (S2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ : 3) y S2P2 (SEC ID N◦ :3)) fueron activos en la
inhibición de la unión de la biotina-WGA a concentraciones milimolares, sugiriendo que estas secuencias
peptı́dicas también pueden ser importantes en la interacción con oligosacáridos en el sitio de unión de la
WGA.
TABLA III
Concentraciones de péptidos PT y péptidos WGA resultantes en un 50 % de inhibición de la PT
biotinilada y lectinas unidas a fetuina o asialofetuina
Lectina biotinilada
(glucoproteı́na)
Péptido
SEC ID N◦
IC50 (mM)
PT-b (fetuina)
S2P3
4
0.19±0.09
PT-b (fetuina)
S2P6
5
0.22±0.06
WGA-b (fetuina)
ACS2P1
3 (aa 9-23)
3.25±0.45∗
WGA-b (fetuina)
S2P2
3
DI
WGA-b (fetuina)
S2P3
4
0.14±0.03
MAL-b (fetuina)
S2P3
4
0.86±0.02
PT-b (asialofetuina)
S3P3
7 (aa 10-31)
DI
PT-b (asialofetuina)
S3P5
8
DI
SNA-b (fetuina)
S3P9a
9
2.74±0.86
PT-b (fetuina)
WGA (62-73)
11
1.5±0
WGA-b (fetuina)
WGA (62-73)
11
3.4±0
45
50
55
60
DI débil inhibición, excepto que la concentración requerida del péptido para inhibir la unión en un 50 %
21
ES 2 169 724 T3
esté por encima del lı́mite de solubilidad del péptido.
∗
5
10
15
20
Forma no acetilada del S2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) que inhibió hasta cierto punto como
la forma acetilada.
aa Aminoácido.
Puesto que tres péptidos derivados de la subunidad S2 de la PT fueron capaces de inhibir la unión
de WGA, se examinó cuidadosamente la secuencia de aminoácidos que forman el sitio de unión de ácido
siálico de WGA, para determinar si existı́an homologı́as con la secuencia de péptidos de la subunidad inhibitoria S2 de la PT. Una secuencia corta de 6 aminoácidos (SQYGHC) (SEC ID N◦ :12) correspondiente
a los aminoácidos 62-67 en la isolectina 2 WGA, mostró tener una homologı́a razonable con la secuencia encontrada tanto en S2P1 aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3), como en péptidos S2P2 (SPYGRC,
aminoácidos 18-23 de SEC ID N◦ : 3) de la PT. Esta corta secuencia en WGA, es la responsable de la
unión con el carbonilo del grupo N-acetilo del ácido siálico o N-acetil glucosamina (por ej., la serina 62) a
través de un puente de hidrógeno. Ocurren interacciones no polares entre las cadenas laterales aromáticas
de la tirosina 64, ası́ como de la histidina 66 con la cadena lateral de glicerol del ácido siálico y del anillo
de piranosa del ácido siálico o N-acetil glucosamina, respectivamente62 . El otro péptido inhibidor S2P3
(SEC ID N◦ :4), no mostró tener buena homologı́a con la secuencias responsables de las interacciones con
el ácido siálico en WGA. Esto indica que tiene que haber otros motivos funcionalmente importantes para
la interacción con el ácido siálico.
Ejemplo 4
25
30
Estudios de inhibición de la unión utilizando S2P1 (aas 9-23 de SEC ID N◦ :3) biotinilado y acetilado
De los resultados de los péptidos iniciales seleccionado (Tabla II), los péptidos S2P1 (aminoácidos 923, de SEC ID N◦ :3), y S2P2 (SEC ID N◦ :4) mostraron un incremento doble en la unión de la biotina-PT
a la fetuina, en relación con los experimentos control. Una posible explicación de este incremento en la
unión, puede ser la capacidad del péptido de formar un puente entre la biotina-PT y la fetuina. Para que
el péptido actúe como una molécula puente, debe contener un sitio de reconocimiento para la fetuina, ası́
como una secuencia que se una a la PT por sı́ misma. Para resolver esta cuestión, se preparó una forma
biotinilada y acetilada del péptido S2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) (biotinilado en la prolina
terminal), para determinar si podrı́amos medir la unión directa del péptido a PT y a la fetuina.
35
Se llevaron a cabo ensayos de unión en PBS, como se describe en el Ejemplo 2, usando la biotinaASC2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3), a una concentración de 10 µg/ml en PBS. Los ensayos
se realizaron durante 1 hora a temperatura ambiente, y se determinó la cantidad de péptido biotinilado
usando la avidina peroxidasa.
40
A partir de estos estudios directos, se observó una concentración de la cual depende la unión tanto
con la fetuina, como con la PT, estando éstas inmovilizadas en los pocillos de la banda de microconcentrado. Además, la unión de la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) a la PT podrı́a
estar inhibida por la fetuina (IC50 = 50 µM; n=2), indicando que el péptido biotinilado se unı́a al sitio
de unión o sitios adyacentes de unión de la fetuina con la PT.
45
En vista de lo anterior, se concluyó que debido al potente puente mediado por el péptido entre la
lectina y la fetuina, cualquier secuencia de péptidos de la Tabla I que cause reducción en la unión de
cualquiera de las lectinas a la fetuina, era capaz de unirse terminalmente a las estructuras ácido αsiálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-.
50
Ejemplo 5
Estudios de inhibición de la unión utilizando oligosacáridos para inhibir la unión de biotina-ACS2P1
(aminoácidos 9-23 de SEC ID N◦ :3)
55
60
Los resultados de unión obtenidos para la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) descritos en el Ejemplo 4, indican una directa relación del medio del carbohidrato con la lectina a través del
puente con el péptido biotinilado.
Con el fin de valorar la unión a las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, mediante este péptido, ası́ como el hexapéptido SPYGRC (aminoácidos 18-23, de SEC
ID N◦ : 3) que sólo exhibió una reducción en la unión de una lectina con la fetuina (Tabla II), los experimentos de inhibición con sacáridos sencillos fueron conducidos para determinar si la interacción era
22
ES 2 169 724 T3
dependiente del carbohidrato. Los azúcares sencillos elegidos fueron ácido siálico, sialillactosa de calostro
bovino (contiene una mezcla de estructuras de ácido siálico unidas α(2→6) y α(2→3)), lactosa, y N-acetil
glucosamina.
5
10
Ensayos de la inhibición de la unión fueron realizados usando ácido siálico, sialillactosa, lactosa, o
N-acetil glucosamina a una concentración de 8 mM en PBS. Los ensayos se hicieron durante 1 hora, tal y
como se describió anteriormente ( por ej., Ejemplo 2) a temperatura ambiente, y la cantidad del péptido
biotinilado unido a la fetuina (3 µg/ml) se cuantificó mediante la avidina peroxidasa. El pH del ácido
siálico se controló cuidadosamente, y se ajustó a los valores de pH fisiológico con hidróxido de sodio
diluido. Los resultados de este ejemplo aparecen en la Tabla IV:
TABLA IV
Inhibición de la unión de Biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23 de SEC ID N◦ :3) y biotina-SPYGRC
(aminoácidos 18-23 de SEC ID N◦ :3) a la fetuina por sacáridos sencillos∗
15
Sacárido
Cambios porcentuales en la actividad ligadora
Biotina-ACS2P1 (n=3)
Biotina-SPYGRC (n=3)
Ácido siálico
-19±6
+9±8
Sialillactosa
-46±3
-24±6
Lactosa
+74±7
+20±11
N-acetil glucosamina
-10±2
+6±5
Sacarosa
0±3
ND
20
25
30
∗
35
Los experimentos de inhibición se llevaron a cabo como se resume arriba usando 0.1 µg ó 0.5 µg de
biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) y biotina SPYGRC (aminoácidos 18-23, de
SEC ID N◦ : 3) respectivamente.
Los signos positivos que preceden a los números en esta Tabla, indican un incremento y los signos
negativos indican inhibición de la unión a fetuina.
ND no determinado.
40
50
Los resultados anteriores indican que los dos péptidos testados eran capaces de unirse a las estructuras
ácido α-siálico(2→6)βGal- y ácido α-siálico(2→3)βGal- unidas terminalmente. Los experimentos control
indicaron que el ácido siálico era necesario para las interacciones de gran afinidad, ya que la lactosa falló
al reducir la unión de la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3), en la N-acetil glucosamina también se encontró que inhibe marginalmente la unión del péptido biotinilado (10 ± 2 %, n=3)
sugiriendo que la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) puede tener una débil afinidad
por la N-acetil glucosamina, lo que concuerda con los hayazgos descritos posteriormente, los cuales muestran una unión potenciada del péptido con la asialoagalactofetuina con relación a la asialofetuina. Esto
también está en gran concordancia con resultados previos que indican que la especificidad de unión de la
PT es similar a la de WGA44,52.
55
En vista de lo anterior, se concluyó que cualquiera de los péptidos que inhiben la unión de la fetuina con cualquiera de las lectinas que aparecen en la Tabla II anterior, son efectivos en la unión con
las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, ligadas terminalmente. Estos
péptidos aparecen en la Figura 1.
45
Ejemplo 6
60
Selección de los péptidos de las subunidades S2 y S3 de la PT para la capacidad de inhibir la unión de la
biotina-ACS2P1 a la fetuina y a la asialofetuina
Se realizaron ensayos de inhibición de la unión, usando los péptidos de las subunidades S2 y S3 de la
PT en PBS como competidores de la unión de la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3)
23
ES 2 169 724 T3
(10 µg/ml) a la fetuina o asialofetuina. Los ensayos de inhibición se realizaron durante 1 hora a temperatura ambiente, como se describió anteriormente y la cantidad de péptido biotinilado unido a la fetuina
o asialofetuina (3 µg/ml) se cuantificó mediante el uso de la avidina peroxidasa.
5
10
15
20
25
30
La especificidad y la relativa afinidad de la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) para
la fetuina se determinó por experimentos de inhibición de la unión con los péptidos mostrados en la Tabla
I. Los experimentos de inhibición de la unión (Tabla V) indicaron que el péptido ACS2P1 (aminoácidos
9-23, de SEC ID N◦ :3) se unı́a a la fetuina con gran afinidad (IC50 =4.1 µM; n=2) cuando la forma no
biotinilada del ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) se usaba como competidor. El péptido S2P2
(SEC ID N◦ :3) una versión ampliada del S2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3), también se encontró
que inhibı́a a la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) uniéndose a la fetuina pero con una
afinidad 10 veces menor (IC50 =42.5 µM) ambos péptidos no fueron capaces de competir por la unión de
la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) con la asialofetuina, indicando la importancia del
ácido siálico en las interacciones de gran afinidad con el péptido. Secuencias de hexapéptidos similares a
aquellas se encontraron en los péptidos S2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) y S2P2 (SEC ID N◦ :3),
también están presentes en un número de péptidos de la Tabla I (ver los segmentos subrayados) cada uno
de estos péptidos se analizaron para ver su capacidad de inhibir a la biotina ACS2P1 (aminoácidos 9-23,
de SEC ID N◦ :3) uniéndose a la fetuina y a la asialofetuina a concentraciones de péptido 10 veces mayor
que la IC50 determinada para el péptido S2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3). Ninguno de los
otros péptidos de la Tabla I examinados tuvieron la capacidad de inhibir la unión de la biotina-ACS2P1
(aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) a la fetuina o a la asialofetuina indicando hasta cierto punto, que
la secuencia del péptido SPYGRC puede jugar un papel crucial para la unión del ácido siálico. Esto se
confirmó posteriormente por la incapacidad de los péptidos S3P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ : 6)
y S3P2 (SEC ID N◦ : 6), los cuales poseen las mayores homologı́as con la secuencia encontrada en S2P1
(aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3), de inhibir la unión incluso a altas concentraciones del péptido. La
secuencia homóloga encontrada en los péptidos S3 (GAYGRC) (aminoácidos 18-23, de SEC ID N◦ : 6)
carece del residuo del aminoácido serina, el cual demostró ser importante en la formación de un puente
de hidrógeno importante con el carbonilo del grupo N-acetilo en el ácido siálico del sitio de unión de la
WGA62. Esto indica que el residuo de serina encontrado en el péptido S2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC
ID N◦ :3) puede funcionar de una forma análoga en la unión del S2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID
N◦ :3) con el ácido siálico.
Los resultados de este ejemplo aparecen en la Tabla V:
TABLA V
35
Selección de los péptidos S2 y S3 de la PT para la capacidad de inhibir la unión de la Biotina-ACS2P1
(aminoácidos 9-23 de SEC ID N◦ :3)
40
45
50
Péptido
SEC ID N◦
Concentración (µM)
Fetuina1
Asialofetuina1
ACS2P1
3 (aa 9-23)
4.1
-50
+101±2
S2P2
3
42.5
-50
+6±1
SPYGRC
3 (aa 18-23)
5520
-24±2
-54±3
S2P3
4
22.4
+70±11
+15±11
S2P4
5 (aa 16-32)
6.0
-8±16
+2±4
S2P6
5
319
+49±5
+18±16
S3P1
6 (aa 9-23)
1142
+245±28
+4±0
S3P2
6
934
+88±72
+12±16
55
60
24
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TABLA V (Continuación)
Péptido
SEC ID N◦
Concentración (µM)
Fetuina1
Asialofetuina1
S3P3
7 (aa 10-31)
16.1
-13±16
-10±11
S3P4
7
6.4
+55±26
+26±2
S3P5
8
22.5
-19±4
-17±8
5
10
15
El efecto de los péptidos S2 y S3 de PT sobre la unión de la Biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23 de
SEC ID N◦ :3) a la fetuina o asialofetuina. Los valores positivos y negativos se refieren al porcentaje de
inhibición o potenciación respectivamente.
aa aminoácido
1 porcentaje de cambios en la actividad ligadora –; y
20
Ejemplo 7
Yodación de Biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23 de SEC ID N◦ :3)
25
30
35
40
45
50
55
60
Documentos previos han sugerido la importancia de los residuos del aminoácido tirosina en la unión
de la PT a receptores de glicoproteı́na sializados44,63. Estos documentos se basaban en la observación de
que si la PT era iodada por el procedimiento convencional IODO-GEN (modifica selectivamente residuos
de tirosina) sin proteger primero el sitio de unión para la fetuina, se reducı́a la actividad ligadora de la
PT.
Para determinar si el residuo de tirosina encontrado en la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC
ID N◦ :3) juega un papel en la actividad ligadora, el péptido fue yodado por el procedimiento IODO-GEN
y su actividad ligadora fue comparada con el péptido sin yodar. Especı́ficamente, la biotina-ACS2P1
(aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) (100 µg 0.052 µmol) en 100 µl de PBS se depositaron en un tubo
de vidrio de 12 x 75 mm cubierto con IODO-GEN, y se añadió 0.1 mM de una solución de NaI (50
µL, 5 µmol), se mezcló suavemente durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente. La
reacción se detuvo al quitar la mezcla del tubo de IODO-GEN y el péptido yodado se purificó en una
columna Sephadex G-25 (1 x 15 cm equilibrados con PBS). Las fracciones individuales se analizaron para
averiguar si habı́a presencia de péptido mediante la medida de la absorbancia a 220 nm, y la concentración se determinó por comparación con la absorbancia de la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de
SEC ID N◦ :3) no derivatizada. Una muestra de biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3)
yodada y otra muestra no derivatizada, se diluyeron hasta una concentración de 10 µg/ml y se analizó
la unión con la fetuina en bandas de microconcentrado, como se describió en el Ejemplo 6. Además, la
unión de la biotina ACS2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) (10 µg/ml) a la fetuina, asialofetuina,
y asialoagalactofetuina (a 3 µg/ml cada una) se realizó de una forma similar.
Los resultados de este experimento indican que una alta yodación de biotina-ACS2P1 (aminoácidos
9-23, de SEC ID N◦ :3) reduce la unión del péptido a la fetuina en un 58 ± 3 % (n=3), lo cual sugiere la
importancia del aminoácido tirosina junto con la serina en la actividad ligadora de la biotina-ACS2P1
(aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) con las estructuras terminalmente unidas ácido α-siálico(2→6)βGaly ácido α-siálico(2→3)βGal-.
Para determinar si la secuencia de aminoácidos en la subunidad S2 de la PT que corresponde al
péptido S2P1 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) juega un papel actual en la actividad ligadora tipo
lectina de la PT, se comparó la especificidad en la unión del péptido biotinilado con la de la PT usando
fetuina, asialofetuina y asialoagalactofetuina. Un documento anterior habı́a determinado que la unión de
la PT-I125 con la asialofetuina era del 53 ± 7 %, mientras que con la asialoagalactofetuina fue del 81 ±
8 % relacionado con la unión control con fetuina44 . Esto concuerda bastante con los resultados obtenidos
con la biotina-ACS2PI (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3) que mostró un 45 ± 9 % y un 93 ± 18 %
(n=3) de unión con la asialo y la asialoagalactofetuina respectivamente, en relación con la fetuina. Estos
resultados sugieren que esta secuencia de aminoácidos puede contener una porción de un sitio de unión
tipo lectina en la subunidad S2 de la PT, la cual es responsable de los resultados de unión observados
previamente.
25
ES 2 169 724 T3
Ejemplo 8
5
10
Los ensayos de unión se llevaron a cabo de forma esencial, como se ha descrito anteriormente, usando
pocillos de bandas de microconcentrado, que eran cubiertos con 50 µl de glicoconjugado BSA (50 µg/ml)
en 50 µM de tampón fosfato de sodio (pH 6.8), que contenı́an 5 mM de MgCl2 y 15 mM de Na3 N durante
16 horas a 4◦ C la solución se eliminó por aspiración y se reemplazó con 100 µl de BSA al 1 % en PBS
conteniendo 0.05 % de Tween 20 (PBST), y se incubó a temperatura ambiente durante 2 ó 3 horas más.
Los pocillos de la banda de microconcentrado se lavaron 4 veces con 300 µl de PBST y se reemplazaron
con biotina-ACS2P1 (aminoácidos 18-23, de SEC ID N◦ : 3) en 50 µl de PBS. Después de incubar durante
1 hora, la reacción ligadora se detuvo mediante la aspiración de las soluciones y la placa se lavó con PBST
(4 X 300 µl). Se añadió avidina peroxidasa (100 µl de una dilución 1/3000 de una solución de 1 mg/ml en
PBST) y se incubó durante 1 hora más. Después de lavar los pocillos como ya se ha descrito, se añadió la
solución sustrato (1 mM de ABTS en 5 mM de tampón citrato, pH 4.2 conteniendo un 0.1 % de peróxido
de hidrógeno, v/v) y las placas se incubaron durante 30 minutos.
15
Los ensayos de unión para conjugado BSA se hicieron por triplicado, y la unión subyacente fue
medida en pocillos cubiertos sólo con BSA. La cantidad de péptido biotinilado unido se expresó como un
porcentaje en relación con fetuina, como se muestra en la Tabla VI:
TABLA VI
20
Unión de la biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23 de SEC ID N◦ :3) y de la biotina-SPYGRC
(aminoácidos 18-23 de SEC ID N◦ :3) con conjugados de SAB∗
25
Estructura del carbohidrato
de BSA conjugado
% de unión
relativa
de fetuina de
Biotina-SPYGRC
(n=3)
% de unión
relativa
de fetuina de
Biotina-SPYGRC
(n=3)
Nombre común
para la estructura
del carbohidrato
αNeuAc(2-3)βGal(1-4)βGlcNAc-BSA
117±12
120±7
SlacNAc
αNeuAc(2-3)βGal(1-3)βGlcNAc-BSA
70±4
97±12
SLe∗
αNeuAc(2-6)βGal(1-4)βGlcNAc-BSA
94±2
122±5
SlacNAc
αNeuAc(2-3)βGal(1-4)βGlcNAc-BSA
(1-3)
αFuc
84±3
120±4
SLe∗
αNeuAc(2-3)βGal(1-3)βGlcNAc-BSA
(1-4)
αFuc
84±14
103±8
SLe∗ (CI 9.9)
30
35
40
45
∗
50
los experimentos fueron hechos sumergiendo 50 µg/ml de conjugado de BSA o fetuina, y sondeados
con 0.1 µg de biotina-ACS2P1 (aminoácidos 9-23 de SEC ID NO. 3) ó 0.5 µg de biotina-SPYGRYC
(aminoácidos 18-23 de SEC ID NO. 3) durante 1 hora a temperatura ambiente.
Ejemplo 9
Formación del conjugado de biotina-SPYGRC-estreptavidina
55
60
Se combinó estreptavidina (50 µg) en PBS con biotina-SPYGRC (aminoácidos 18-23, de SEC ID N◦ :
3) (50 µl, 200 µg) y PBS (150 µl), y se mezclaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla
de reacción se cargó en una columna Sephadex G-25 (1 x 15 cm que habı́a sido equilibrada en PBS) y
se recogieron las fracciones. Las proteı́nas que contenı́an las fracciones se analizaron por electroforesis en
gel de SDS PAGE, y se determinó su peso molecular. Los resultados fueron coherentes con la formación
de un complejo tetravalente entre el péptido y la estreptavidina. Los experimentos de inhibición de la
unión de lectina se llevaron a cabo como se describieron previamente para la determinación de los IC50 s.
Los resultados aparecen en la Tabla VII:
26
ES 2 169 724 T3
TABLA VII
Efecto del péptido SPYGRC o del conjugado Biotina-SPYGRC-estreptavidina (aas 18-23 de SEC ID
N◦ . 3) sobre la unión de la PT biotinilada y lectinas a fetuina∗
5
Lectina
biotinilada
Concentración del
péptido SPYGRC (aa
18-23 de SEC ID N◦ .
3) en mg/ml
% de cambios
en la actividad
ligadora
Concentración del
conjugado péptidoestreptavidina
(µg/ml)
% de cambios en la
actividad ligadora
PT-b
4.4
+34±2
500
+13±11
MAL-b
4.4
-16±0
1.0
-50±3
SNA-b
4.4
-2±1
1.2
-50±5
WGA-b
4.4
+7±3
64
-50±1
10
15
20
∗
Los signos positivos que preceden a los números indican potenciación, y los negativos indican inhibición
de la unión.
aa aminoácidos
25
Ejemplo 10
Neutralización de la toxina de pertussis afectando a células de Ovario de Hamster Chino, célula (CHO),
por péptidos sintéticos
30
35
40
45
Las monocapas de células CHO confluentes se despegaron de frascos de plástico para cultivo tisular
con tripsina al 0.25 %, y se suspendieron a una concentración de 5 x 104 células/ml en medio de Ham
F12, que contenı́a un 10 % suero bovino fetal (FBS). Se añadieron 100 µl de la suspensión de células a 96
placas con pocillos para cultivo tisular y se dejaron durante 24-48 horas para que establecieran contacto
con el plástico. El medio agotado se eliminó y se añadió a las células CHO el péptido esterilizado por
filtración 5 veces diluido, en un rango de concentración de 300 a 30 fentogramos por ml (80 µl), en
medio de Ham F12 que contenı́a FBS. Entonces, se añadió 20 µl de una solución de PT (concentración
final de PT 2.7 ng/ml) a los pocillos para cultivo tisular que contenı́an el péptido. Las mezclas de
incubación se mezclaron suavemente y se incubaron a 37◦C durante 1 hora en un incubador de CO2 .
Las mezclas de incubación fueron eliminadas y reemplazadas con medio fresco. Las placas de cultivo
tisular fueron incubadas durante 24 horas a 37◦ C, fijadas con metanol al 100 % y teñidas con el colorante
de Geimsa. Los experimentos control se hicieron sólo en ausencia de péptido, o en ausencia de PT.
Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Las células CHO teñidas se estudiaron para ver
la inhibición de las agrupaciones de células CHO caracterı́sticas, que son producidas por la unión de la
toxina de pertussis y analizadas para ver si habı́a más de un 50 % de inhibición de las agrupaciones de
células de CHO relacionadas con pocillos control sólo en presencia de PT. Los resultados expresados en
la Tabla VIII muestran la concentración de péptido máxima requerida para causar un 50 % de reducción
de las agrupaciones de células CHO.
50
55
60
27
ES 2 169 724 T3
TABLA VIII
Experimentos de neutralización de células CHO usando péptidos de PT S2 y S3∗
5
Péptido PT
SEC ID N◦
Concentración máxima inhibitoria para más
del 50 % de inhibición.
ACS2P1
3 (aa 9-23)
96 pg/ml
SPYGRC
3 (aa 18-23)
480 pg/ml
S2P2
3
NI
S3P1
6 (aa 9-23)
NI
S3P2
6
NI
S3P9a
9
NI
10
15
20
∗
25
los experimentos de neutralización de células CHO se llevaron a cabo usando una concentración de PT
de 2.4 ng/ml. Las células CHO (5.4 x 104 células/ml) fueron expuestas a las mezclas de incubación
que contenı́an el péptido PT seco, durante 1 hora a temperatura ambiente. Los experimentos control
se hicieron en ausencia de péptido.
aa aminoácido
NI concentración del péptido de 300 ng/ml no inhibitoria
30
pg picogramo –.
35
40
Los datos anteriores demuestran, que al menos algunos de los tipos de péptidos serı́an efectivos en
la inhibición de la unión de agentes bacterianos/vı́ricos y/o sus toxinas, que utilizan las estructuras
ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal- como punto de unión a la superficie de células
mamı́feras. Dichos agentes/toxinas incluyen toxinas conocidas como la toxina de pertussis, toxina del
cólera, etc., y por consiguiente, la administración de una cantidad efectiva de al menos uno de los tipos
de péptidos a un mamı́fero serı́a efectiva en la inhibición de tales uniones.
Los Ejemplos 11 y 12 ilustran los resultados in vivo para los tipos de péptidos.
Ejemplo 11
Inhibición de la respuesta inflamatoria DTH
45
50
55
60
Las respuestas inflamatorias DTH fueron medidas usando ensayos de inflamación de la planta del pie
de ratón como se describe por Smith y Ziola64. Brevemente, grupos de ratón Balb/c (aproximadamente
19-20 g cada uno) se inmunizaron con 100 µg de antı́geno de OVA que contenı́an 20 µg del adyuvante
(DDA –dimetil-dioctadecilamonio bromuro) que también induce una fuerte respuesta inflamatoria DTH.
Siete dı́as después, cada grupo de ratones fue expuesto con 20 µg de antı́geno de OVA (sin adyuvante) en
la planta del pie. La inflamación resultante de la planta del pie, fue medida con un micrómetro Mitutoyo
24 horas después de la exposición.
Para valorar el efecto de diferentes péptidos sobre la respuesta inflamatoria DTH, grupos de ratones
recibieron 100 µg de los siguientes péptidos ACS2P1 (2275 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3), SPYGRC
(2283) (aminoácidos 18-23, de SEC ID N◦ : 3), y S3P9a (SEC ID N◦ : 9). Estos péptidos se inyectaron
como una solución intravenosa en la cola, cinco horas después de la exposición. Los grupos control se
dejaron sin tratar o recibieron 100 µl de tampón fosfato salino (PBS). Los resultados de este experimento
se muestran en la Figura 2, la cual ilustra que los péptidos empleados eran efectivos para la reducción de
la respuesta DTH en ratón.
28
ES 2 169 724 T3
Ejemplo 12
Persistencia de la supresión de la respuesta inflamatoria DTH a las 2 semanas de la exposición
5
10
Grupos idénticos de ratones tratados con los péptidos del Ejemplo 11 fueron expuestos de nuevo con
el antı́geno de OVA dos semanas después de la inmunización primaria. Los controles no tratados respondieron con el grado usual de inflamación de la planta del pie, mientras que los demás grupos mostraron
una inflamación de la planta del pie reducida. Especı́ficamente, estos resultados aparecen en la Figura
3, que ilustra la reducción en el grado de inflamación de la planta del pie en ratón, previamente tratado
con los tipos de péptidos.
Además de proporcionar una supresión de la inflamación inducida por el antı́geno en un ratón sensibilizado, los datos anteriores demuestran que el tratamiento con los tipos de péptidos como por esta
invención, también transmite tolerancia a posteriores exposiciones del mismo antı́geno.
15
20
En vista del hecho de que el sistema inmune de ratón sirve como un buen modelo para el sistema
inmune de humanos, los datos anteriores demuestran que los tipos de péptidos serı́an efectivos en la
supresión de las respuestas inmunes mediadas por células en humanos, y, cuando la respuesta inmune
mediada por células es frente a un antı́geno, estos datos también demuestran que los tipos de péptidos
también transmitirı́an tolerancia a exposiciones posteriores del humano con ese antı́geno.
TABLA IX
Selección inicial de los péptidos sintéticos para la actividad inhibitoria
25
Péptido
30
35
40
45
a
50
55
Concentración
(mg/ml)
Cambios en la actividad ligadora
PT/fetuinaa
MAL/fetuina
SNA/fetuina
WGA/fetuina
ACS2P1b
1.0
1.89±0.03
1.16±0.09
0.97±0.01
0.78±0.06
NSS2P1
2.4
1.18±0.03
1.03±0.02
1.10±0.02
1.03±0.02
SPYGRC
4.4
1.34±0.02
0.84±0.00
0.98±0.02
1.07±0.03
GSYRPC
2.2
1.48±0.21
0.95±0.16
0.96±0.02
1.09±0.01
SPYGYC
1.0
2.85±0.16
1.21±0.08
1.07±0.15
1.09±0.07
SPWGRC
1.0
1.75±0.53
1.39±0.13
1.00±0.02
1.11±0.01
SPFGRC
1.0
1.32±0.08
1.06±0.12
1.00±0.01
1.01±0.01
2420
1.0
1.79c
1.43c
1.11c
2.1c
lectina/glucoproteı́na biotinilada unida a pocillos. Los valores mayores de 1 en la Tabla, indican
potenciación, mientras que los números menores de 1 indican inhibición de la unión
b
valores demostrados previamente
c
sólo una determinación
Ejemplo 13
Ensayos de inhibición de la unión (péptido inicial seleccionado)
60
Los pocillos de la banda de concentrado se cubrieron con 100 µl de fetuina o asialofetuina (50 µg/ml)
en 50 mM de tampón fosfato de sodio (pH 6.8) conteniendo 5 mM de MgCl2 y 15 mM de Na3 N, durante
16 horas a 4◦C. La solución se eliminó por aspiración y se reemplazó con 100 µl de BSA al 1 % en PBS
conteniendo un 0.05 % de Tween 20 (PBST). Después de la incubación durante 2-4 horas a temperatura
29
ES 2 169 724 T3
5
10
ambiente, los pocillos de banda de microconcentrado fueron lavados 4 veces con 300 µl de PBST. Los
péptidos que estaban en una concentración de rango 1.0 a 4.4 mg/ml en PBS (40 µl) se añadieron a cada
pocillo, y entonces fue añadida biotina-PT (10 µl conteniendo 10 ng en PBS) a los pocillos de la banda
de microconcentrado. Después de una hora de incubación, la reacción ligadora se detuvo por aspiración
de las soluciones, y la placa fue lavada con PBST (300 µl). Seguidamente se añadió a los pocillos, el
conjugado peroxidasa de rábano picante-avidina (100 µl, dilución 1/3000 en PBST a una concentración de
0.3 µg/ml), y las placas se incubaron a temperatura ambiente por una hora. Después de lavar los pocillos
como ya se ha descrito, se añadió la solución sustrato (1mM ABTS en 5 mM de tampón citrato, ph 4.2,
conteniendo 0.1 % de peróxido de hidrógeno, v/v), y las placas se incubaron por 30 minutos. El desarrollo
del color se registró a 405 nm usando un lector de placa Titertek Multiskan MC. La unión máxima se
determinó en ausencia de péptido, y la unión subyacente se midió en pocillos cubiertos sólo con BSA.
Los ensayos de unión para cada péptido se hicieron por duplicado. Los experimentos de inhibición de la
unión utilizando biotina-MALL, SNA-, y WGA- se realizaron como se describió anteriormente usando 10
ng de cada lectina biotinilada en PBS.
15
El panel de 8 péptidos fue estudiado para comprobar la capacidad de inhibir la unión de la biotinaSNA, -PT, -WGA y -MAL con fetuina o asialofetuina. Se ha comprobado que las lectinas de plantas
biotiniladaS son controles útiles, ya que nosotros hemos demostrado previamente que estas lectinas poseen especificidades de unión similares a la PT25,46 .
20
Los resultados de este Ejemplo aparecen en la Tabla IX anterior. Estos resultados indican que los
péptidos basados en la secuencia SPX1 GX2 C (SEC ID N◦ : 1), inhibı́an la unión de la biotina PT.
TABLA X
Inhibición de la unión del péptido biotinilado a la fetuina por sacáridos sencillosa
25
Sacárido
Biotina-SPWGRC(n=3)
BiotinaSPFGRC(n=3)
Biotina-SPYGYCGFGAEY
(n=3)
Ácido siálico
0.71±0.11
1.09±0.03
1.21±0.09
Sialillactosa
0.65±0.05
0.92±0.04
1.08±0.03
Lactosa
0.96±0.12
0.78±0.05
1.06±0.00
N-acetil glucosamina
0.82±0.10
1.07±0.14
1.10±0.25
30
35
40
a
45
Cambios en la actividad ligadora
los experimentos de inhibición se llevaron a cabo como se resume en los métodos, usando 0.5 µg de
péptidos biotinilados respectivamente. Los valores de unión mayores de 1 en esta Tabla indican
potenciación de la misma, y los valores menores de 1 indican inhibición de la unión a la fetuina. La
concentración de los sacáridos usados fue de 8 mM.
Ejemplo 14
Ensayos de inhibición de la unión usando oligosacáridos
50
55
Con el fin de valorar la unión a las estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y ácido α-siálico(2→3)βGal-.
por ciertos péptidos, se realizaron experimentos de inhibición con sacáridos sencillos para determinar si la
interacción era carbohidrato dependiente. Los azúcares sencillos elegidos fueron ácido siálico, sialillactosa
del calostro bovino (contiene una mezcla de estructuras α(2→6) y α(2→3) de ácido siálico unidas), lactosa
y N-acetil glucosamina a una concentración 8 mM en PBS. Los ensayos de inhibición se hicieron durante
una hora como se describió anteriormente (por ej. Ejemplo 2) a temperatura ambiente, y la cantidad
de péptido biotinilado unido a fetuina (3 µg/ml) se cuantificó mediante el uso de avidina peroxidasa. El
pH del ácido siálico libre fue cuidadosamente monitorizado y ajustado a valores de pH fisiológico con
hidróxido de sodio diluido. Los resultados de este Ejemplo aparecen en la Tabla X.
60
Los resultados anteriores indican que algunos de los péptidos testados eran capaces de unirse a las
estructuras ácido α-siálico(2→6)βGal- y ácido α-siálico(2→3)βGal- unidas terminalmente.
30
ES 2 169 724 T3
TABLA XI
Unión de péptidos biotinilados con conjugados BSA sialiciladosa
5
Estructura del carbohidrato
del conjuntado BSA
Unión relativa a
la fetuina
de la SPWGRCBiotina
(n=3)
Unión relativa a
la fetuina
de la SPFGRCBiotina
(n=3)
Unión relativa a
la fetuina de la
SPYGYCGFGAEYBiotina
(n=3)
αNeuAc(2-3)βGal(1-4)βGlcNAc-BSA
αNeuAc(2-3)βGal(1-3)βGlcNAc-BSA
αNeuAc(2-6)βGal(1-4)βGlcNAc-BSA
αNeuAc(2-3)βGal(1-4)βGlcNAc-BSA
(1-3)
αFuc
αNeuAc(2-3)βGal(1-3)βGlcNAc-BSA
(1-4)
αFuc
0.49±0.07
0.43±0.10
0.07±0.03
0.67±0.14
0.63±0.27
0.36±0.17
0.29±0.05
0.42±0.15
0.27±0.12
0.25±0.04
0.28±0.11
0.33±0.04
0.77±0.19
0.52±0.18
0.51±0.12
10
15
20
a
25
los experimentos se realizaron sumergiendo 5.0 µg/ml de conjugado de BSA o fetuina, y sondeados
con 0.5 µg de péptido biotinilado durante 1 hora. La unión del péptido biotinilado a la fetuina está
fijado con un valor de 1.0.
Ejemplo 15
30
35
40
45
Los ensayos de unión se llevaron a cabo esencialmente como ya se ha descrito, usando pocillos de bandas de microconcentrado cubiertos con 50 µl de glicoconjugado BSA (50 µg/ml) en 50 mM de tampón
fosfato de sodio (pH 6.8) conteniendo 5 mM de MgCl2 y 15 mM de Na3 N, durante 16 horas a 4◦ C. La
solución se eliminó por aspiración y se reemplazó con 100 µl de BSA al 1 % en PBS conteniendo un 0.05 %
de Tween 20 (PBST) y se incubó a temperatura ambiente durante 2-3 horas más. Los pocillos de banda
de microconcentrado fueron lavados 4 veces con 300 µl de PBST, y entonces se reemplazaron con 0.5
microgramos de péptido biotinilado. Después de la incubación durante una hora, la reacción ligadora
se detuvo mediante aspiración de las soluciones y la placa se lavó con PBST (4 x 300 µl). Se añadió
avidina-peroxidasa (100 µl de una dilución 1/3000 de una solución de 1 mg/ml en PBST) y se incubó
por una hora más. Después de lavar los pocillos como ya se ha descrito, se añadió la solución sustrato
(1 mM de ABTS en 5 mM de tampón citrato, pH 4.2, conteniendo 0.1 % de peróxido de hidrógeno, v/v)
y se incubaron las placas durante 30 minutos. Ensayos de unión para conjugado BSA se hicieron por
triplicado, y la unión subyacente fue medida en pocillos cubiertos con BSA solamente. La magnitud de
la unión del péptido biotinilado es expresada como una razón en relación con la fetuina, como se muestra
en la Tabla XI anterior.
Ejemplo 16
Inhibición de la respuesta inflamatoria DTH
50
55
60
Las respuestas inflamatorias DTH fueron medidas usando ensayos de inflamación de la planta del pie
de ratón como se describe por Smith y Ziola64. Brevemente, grupos de ratón Balb/c (aproximadamente
19-20 g cada uno) se inmunizaron con 100 µg de antı́geno de OVA que contenı́an 20 µg del adyuvante
(DDA –dimetil-dioctadecilamonio bromuro), que también induce una fuerte respuesta inflamatoria DTH.
Siete dı́as después, cada grupo de ratones fue expuesto con 20 µg de antı́geno de OVA (sin adyuvante) en
la planta del pie. La inflamación de la planta del pie resultante fue medida con un micrómetro Mitutoyo
24 horas después de la exposición.
Para valorar el efecto de diferentes péptidos sobre la respuesta inflamatoria DTH, grupos de ratones recibieron 100 µg de los siguientes péptidos ACS2P1 (2275 (aminoácidos 9-23, de SEC ID N◦ :3),
SPFGRC (2418), SPWGRC (2416), AcSPYGYCGFGAEY-CONH2 (2420), SPYGYC (2365), SPYGRC
(aminoácidos 18-23, de SEC ID N◦ : 3) (2283), NSS2P1 (2295), y GSYRPC (2294). Estos péptidos se
inyectaron como una solución intravenosa en la cola cinco horas después de la exposición. Los grupos
control se dejaron sin tratar o recibieron 100 µl de tampón fosfato salino (PBS). Los resultados de este
31
ES 2 169 724 T3
experimento se muestran en las Figuras 4 y 6, las cuales ilustran que los péptidos empleados eran efectivos
para la reducción de la respuesta DTH en ratón.
Ejemplo 17
5
Persistencia de la supresión de la respuesta inflamatoria DTH después de 2 semanas de la exposición
10
15
20
Idénticos grupos de ratones tratados con los péptidos en el Ejemplo 16 anterior, fueron expuestos de
nuevo con el antı́geno de OVA dos semanas ó 15 dı́as después de la inmunización primaria. Los controles
no tratados respondieron con el grado usual inflamación de la planta del pie, mientras que todos los otros
grupos mostraron una inflamación de la planta del pie reducida. Especificamente, estos resultados se
muestran en las Figuras 5 y 7, las cuales ilustran una reducción en el grado de inflamación de la planta
del pie, en ratón previamente tratado con los tipos de péptidos.
Además para proporcionar una supresión de la inflamación inducida por el antı́geno en un ratón sensibilizado, los datos anteriores demuestran que el tratamiento con los tipos de péptidos como por esta
invención, también transmite tolerancia a posteriores exposiciones del mismo antı́geno.
En vista del hecho de que el sistema inmune de ratón sirve como un buen modelo para el sistema
inmune de humanos, los datos anteriores demuestran que los tipos de péptidos serı́an efectivos en la
supresión de las respuestas inmunes mediadas por células en humanos, y, cuando la respuesta inmune
mediada por células es frente a un antı́geno, estos datos también demuestran que los tipos de péptidos
también transmitirı́an tolerancia a exposiciones posteriores del humano con ese antı́geno.
25
30
35
40
45
50
55
60
32
ES 2 169 724 T3
REIVINDICACIONES
1. Un péptido está elegido del grupo consistente en un péptido de fórmula I (SEC ID N◦ 1)
SPX1 GX2 C
5
(I)
en la cual, X1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
de los mismos; y X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes
miméticos peptı́dicos del mismo; y de fórmula II (SEC ID N◦ : 2);
10
SPX1 GX2 CX3 X4
(II)
en la cual, X1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
15
X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
X3 es una secuencia de aminoácidos de 4 a 6 aminoácidos; y
20
25
X4 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos del
mismo y sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Un péptido de acuerdo con la reividicación 1, que es el péptido SPYGRC (aminoácidos 18-23, de
SEC ID N◦ : 3) ó una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
3. Un péptido escogido dentro del grupo siguiente de péptidos:
PQEQITQHGSPYGRC
30
PQEQITQHGSPYGRC-CO-NH2
SPTGIVIPPQEQITQHGSPYGRC
35
SPYGRC-CO-NH2
BIOTINA-SPYGRC-CO-NH2 , o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
40
4. Una composición farmacéutica que comprende un soporte farmacéuticamente aceptable y un
péptido de acuerdo con la reivindicación 1, 2, ó 3, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
45
5. Utilización de al menos un péptido de unión de un carbohidrato derivado de una lectina o de uno de
sus derivados capaz de unirse a un grupo ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-, sobre
una estructura o unas moléculas que comprendan tales grupos, en la cual dicho péptido o su derivado
no posea más de 35 aminoácidos en la porción del péptido que se une a las estructuras carbohidratadas,
para la elaboración de un medicamento destinado para el tratamiento de un mamı́fero para la supresión
de una respuesta inflamatoria.
50
6. Utilización según la reivindicación 5, en la cual la respuesta inflamatoria citada proviene de una
exposición a un antı́geno en un mamı́fero sensibilizado.
55
7. Utilización según la reivindicación 6, en la cual dicha exposición al antı́geno está elegida dentro del
grupo consistente en la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH), la artritis reumatoide, la soriasis, el
asma, la dermatitis, la enfermedad intestinal inflamatoria, la neumonı́a viral y la neumonı́a bacteriana.
8. Utilización según la reivindicación 5, en la cual la respuesta inflamatoria está asociada a una lesión
en un mamı́fero.
60
9. Utilización según la reivindicación 8, en la cual la lesión está escogida dentro del grupo consistente
en el sı́ndrome de distres respiratorio agudo (ARDS), una lesión de reperfusión de congelación, y un shock
séptico.
33
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5
10
15
10. Utilización de al menos un péptido de unión de carbohidrato derivado de una lectina, o de uno
de sus derivados capaz de unirse a los grupos ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal-,
unidos terminalmente sobre unas estructuras o moléculas que comprenden dichos grupos, en la cual dicho péptido o su derivado no posea más de 35 aminoácidos en la parte del péptido que se une a las
estructuras carbohidratadas, para la elaboración de un medicamento destinado a modular la inducción
de una respuesta inmune a un antı́geno en un mamı́fero, en la cual, el medicamento está adaptado a la
administración de una cantidad eficaz de al menos una lectina en combinación con el antı́geno.
11. Utilización según la reivindicación 10, en la cual la respuesta inmune comprende una respuesta
inmune humoral, o mediada por células.
12. Utilización de al menos un péptido de unión de carbohidrato derivado de una lectina, o de uno
de sus derivados capaz de unirse a los grupos ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGalunidos terminalmente sobre unas estructuras o moléculas que comprenden dichos grupos, en la cual dicho péptido o su derivado no posea más de 35 aminoácidos en la parte del péptido que se une a las
estructuras carbohidratadas, para la elaboración de un medicamento destinado a inducir en un mamı́fero
sensibilizado, una tolerancia a largo plazo a un antı́geno, en la cual el medicamento está adaptado a
la administración de una cantidad eficaz de, al menos una lectina después de haber expuesto a dicho
mamı́fero con el antı́geno.
20
13. Utilización según la reividicación 10 ó 12, en la cual el antı́geno comprende un alérgeno.
25
14. Utilización según la reividicación 5 ó 12, en la cual dentro de la aplicación terapéutica, dicho
péptido de unión de carbohidrato o su derivado, está destinado a ser administrado después de la iniciación de la respuesta inflamatoria del mamı́fero, pero justo en el momento o antes de la mitad del
periodo requerido para que se produzca la máxima inflamación.
30
15. Utilización de uno o varios péptidos de unión de carbohidrato derivado de una lectina, o de sus
derivados capaces de unirse a los grupos ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal- unidos terminalmente sobre unas estructuras o moléculas que comprenden dichos grupos, en la cual dicho
péptido o su derivado no posea más de 35 aminoácidos en la parte del péptido que se une a las estructuras
carbohidratadas, para la elaboración de un medicamento destinado al tratamiento de una inflamación
pulmonar y/o de una lesión pulmonar en un mamı́fero.
35
16. Utilización según la reividicación 15, según la cual la inflamación pulmonar o lesión pulmonar del
mamı́fero comprende el sı́ndrome de distres respiratorio agudo (ARSD).
40
17. Utilización de al menos un péptido de unión de carbohidrato derivado de una lectina, o de uno
de sus derivados capaz de unirse a los grupos ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGalunidos terminalmente sobre unas estructuras o moléculas que comprenden dichos grupos, en la cual dicho
péptido o su derivado no posea más de 35 aminoácidos en la parte del péptido que se une a las estructuras carbohidratadas, para la elaboración de un medicamento destinado a inhibir la metástasis de células
tumorales en un mamı́fero.
45
50
18. Utilización según la reividicación 17, en la cual, en la aplicación terapéutica, al menos una lectina
está destinada a ser administrada antes, durante, o después de una intervención quirúrgica o biopsia de
cáncer.
19. Utilización según la reividicación 17, en la cual, en la aplicación terapéutica al menos una lectina
está destinada a ser administrada entre 5 horas antes de la intervención quirúrgica o biopsia de un cáncer
hasta 15 horas después de la intervención quirúrgica o biopsia de un cáncer.
20. Utilización según la reividicación 17, en la cual el cáncer comprende un carcinoma de colon o
melanoma.
55
60
21. Utilización de al menos un péptido de unión de carbohidrato derivado de una lectina, o de uno
de sus derivados capaz de unirse a los grupos ácido α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGalunidos terminalmente sobre unas estructuras o moléculas que comprenden dichos grupos, en la cual dicho péptido o su derivado no posea más de 35 aminoácidos en la parte del péptido que se une a las
estructuras carbohidratadas, para la elaboración de un medicamento destinado a inhibir la infección en
un mamı́fero huésped por agentes bacterianos/vı́ricos y/o sus toxinas, que emplean las estructuras ácido
α-siálico(2→6)βGal- y/o ácido α-siálico(2→3)βGal- terminalmente unidas como sitio receptor sobre una
34
ES 2 169 724 T3
célula del mamı́fero huésped diana.
5
22. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 21, en la cual, en la aplicación terapéutica
el péptido de unión de carbohidrato derivado de una lectina está destinado a ser administrado a una dosis
comprendida dentro del intervalo de aproximadamente 0.5 a 50 mg/kg de peso corporal.
23. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 22, en la cual, en la aplicación terapéutica
la proteı́na de unión de carbohidrato derivado de una lectina o su derivado está destinado a ser administrado por vı́a parenteral, oral, intranasal, intratraqueal, subcutánea, intravenosa o intramuscular.
10
24. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 23, en la cual, el péptido está elegido del
grupo consistente en un péptido de fórmula I (SEC ID N◦ 1)
SPX1 GX2 C
15
20
(I)
en la cual, X1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
de los mismos; y X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes
miméticos peptı́dicos del mismo, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
25. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 23, en la cual el péptido está elegido del
grupo consistente en el péptido de fórmula II (SEC ID N◦ : 2)
SPX1 GX2 CX3 X4
25
(II)
en la cual, X1 está escogido del grupo de aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
X2 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, R, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos
del mismo;
30
X3 es una secuencia de aminoácidos de 4 a 6 aminoácidos; y
X4 está escogido del grupo constituido por aminoácidos Y, F, W, y H o agentes miméticos peptı́dicos del
mismo y sus sales aceptables farmacéuticamente.
35
40
26. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 23, en la cual el péptido es el péptido
SPYGRC (aminoácidos 18-23, de SEC ID N◦ : 3).
27. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 23, en la cual el péptido de unión de
carbohidrato derivado de una lectina que está elegido del grupo siguiente de péptidos:
PQEQITQHGSPYGRC
PQEQITQHGSPYGRC-CO-NH2
45
SPTGIVIPPQEQITQHGSPYGRC
SPYGRC-CO-NH2
50
BIOTINA-SPYGRC-CO-NH2
GAFDLKTTFCIMITRNTGQPA
FVRSGQEVIGACTSPYDGKYWSMYSRLRKMLY
55
PKALFTQQGGAYGRC
RLLASTNSRLCAVFVRDG
60
PQEQITQHGSQYGYC
SQYGYCGFGAEY.
35
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28. Péptidos según la reivindicación 3, destinado a ser utilizado en un método para inhibir las respuestas inmunes.
5
29. Péptidos según la reivindicación 3, destinado a ser utilizado en un método para inhibir las interacciones celulares.
10
30. Péptidos según la reivindicación 3, destinado a ser utilizado en un método que está elegido dentro
del grupo consistente: supresión de respuestas inflamatorias; inducción de una tolerancia a antı́genos;
modulación de la inducción de respuestas inmunes a antı́genos; y la inhibición de la adhesión celular en
mamı́feros.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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40
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43
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LISTAS DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
5
(i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: ALBERTA RESAEARCH COUNCIL
(B) CALLE: 250 KARL CLARK ROAD
10
(C) CIUDAD: EDMONTON
(D) ESTADO: ALBERTA
15
(E) PAIS: CANADA
(F) C.P.: T6H 5X2
(G) TELEFONO: 403-450-5111
20
(H) FAX: 403-461-2651
(ii) TITULO DE LA INVENCION: PROPIEDADES ANTIINFLAMATORIAS, TOLEROGENICAS
E INMUNOHINBIDORAS DE LOS PEPTIDOS UNIDOS A CARBOHIDRATOS.
25
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 12
(iv) DIRECCIÓN DE CORREO:
30
(A) DESTINATARIO: BLAKE, CASSELS & GRAYDON
(B) CALLE: BOX 25, COMMERCE COURT WEST
(C) CIUDAD: TORONTO
35
(D) ESTADO: ONTA
(E) PAIS: CANADA
40
(F) C.P. : M5L 1A9
(v) FORMATO INFORMÁTICO UTILIZADO:
(A) TIPO DE MEDIO: disquete
45
(B) ORDENADOR: PC IBM compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
50
(D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Versión # 1.25
(vi) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
(A) NÚMERO DE SOLICITUD:
55
(B) FECHA DE ARCHIVO:
(C) CLASIFICACIÓN:
60
(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
(A) NUMERO DE LA SOLICITUD: US 07/995, 503
1
ES 2 169 724 T3
(B) FECHA DE ARCHIVO: 02-OCT-1992
(viii) ABOGADO/ASESOR:
5
(A) NOMBRE: GRAY, BRIAN W.
(B) NUMERO DE REGISTRO: 3752
(C) REFERENCIA/NUMERO DE ETIQUETA:
10
(ix) INFORMACION DE TELECOMUNICACION:
(A) TELEFONO: 416-863-2400
15
(B) FAX: 416-863-2653
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N◦ :1
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
20
(A) LONGITUD: 6 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
25
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ix) CARACTERISTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
30
(B) LOCALIZACION: 3
(D) OTRA INFORMACION: /nota= “X está escogido del grupo de aminoácidos constituidos
por Tyr, Phe, Trp, e His, o agentes miméticos peptı́dicos de los mismos”.
35
(ix) CARACTERISTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
40
(B) LOCALIZACION: 5
(D) OTRA INFORMACION: /nota= “X está escogido del grupo de aminoácidos constituidos
por Tyr, Phe, Arg, Trp e His, o agentes miméticos peptı́dicos de los mismos”.
45
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :1:
Ser Pro Xaa Gly Xaa Cys
1
5
50
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :2:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 8 aminoácidos
55
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
60
(ix) CARACTERISTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
2
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(B) LOCALIZACION: 3
(D) OTRA INFORMACION: /nota= “X está escogido del grupo de aminoácidos constituidos
por Tyr, Phe, Trp, e His, o agentes miméticos peptı́dicos de los mismos”.
5
(ix) CARACTERISTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
10
(B) LOCALIZACION: 5
(D) OTRA INFORMACION: /nota= “X está escogido del grupo de aminoácidos constituidos
por Tyr, Phe, Arg, Trp, e His, o agentes miméticos peptı́dicos de los mismos”.
15
(ix) CARACTERISTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
(B) LOCALIZACION: 7
20
(D) OTRA INFORMACION: /nota= “4-6 aminoácidos”.
(ix) CARACTERISTICAS:
25
(A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
(B) LOCALIZACION: 8
30
(D) OTRA INFORMACION: /nota= “X está escogido del grupo de aminoácidos constituidos
por Tyr, Phe, Trp, e His, o agentes miméticos peptı́dicos de los mismos”.
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :2:
35
Ser Pro Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :3:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
40
(A) LONGITUD: 23 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
45
50
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :3:
Ser Thr Pro Gly Ile Val Ile Pro Pro Gln Glu Gln Ile Thr Gln
1
5
10
Gly Ser Pro Tyr Gly Arg Cys
20
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :4:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
55
(A) LONGITUD: 21 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
60
(D) TOPOLOGIA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :4:
3
His
15
ES 2 169 724 T3
Gly Ala Phe Asp Leu Lys Thr Thr Phe Cys Ile Met Thr Thr Arg Asn
1
5
10
15
Thr Gly Gln Pro Ala
20
5
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :5:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
10
(A) LONGITUD: 32 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
15
20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :5:
Phe Val Arg Ser Gly Gln Pro Val Ile Gly Ala Cys Thr Ser Pro Tyr
1
5
10
Asp Gly Lys Tyr Trp Ser Met Tyr Ser Arg Leu Arg Lys Met Leu Tyr
20
25
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :6:
25
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 23 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
30
(D) TOPOLOGIA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :6:
35
40
Val Ala Pro Gly Ile Val Ile Pro Pro Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gln
1
5
10
15
Gly Gly Ala Tyr Gly Arg Cys
20
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :7:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 31 aminoácidos
45
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
50
55
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :7:
Ala Gly Phe Ile Tyr Arg Glu Thr Phe Cys Ile Thr Thr Ile Tyr Lys
1
5
10
15
Thr Gly Gln Pro Ala Ala Asp His Tyr Tyr Ser Lys Val Thr Ala
20
25
30
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :8:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
60
(A) LONGITUD: 21 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
4
15
30
ES 2 169 724 T3
(D) TOPOLOGIA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :8:
5
10
Cys Ala Ser Pro Tyr Glu Gly Arg Tyr Arg Asp Met Tyr Asp Ala Leu
1
5
10
15
Arg Arg Leu Leu Tyr
20
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :9:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 18 aminoácidos
15
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :9:
Arg Leu Leu Ala Ser Thr Asn Ser Arg Leu Cys Ala Val Phe Val Arg
1
5
10
15
Asp Gly
25
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :10:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
30
(A) LONGITUD: 15 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
35
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :10:
Pro Gln Glu Gln Ile Thr Gln His Gly Ser Gln Tyr Gly Tyr Cys
1
5
10
40
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :11:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
45
(A) LONGITUD: 12 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
50
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :11:
Ser Gln Tyr Gly Tyr Cys Gly Phe Gly Ala Glu Tyr
1
5
10
55
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID N◦ :12:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
60
(A) LONGITUD: 6 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
5
15
ES 2 169 724 T3
(D) TOPOLOGIA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :12:
5
Ser Gln Tyr Gly His Cys
1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
6