AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE SUELOS

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE SUELOS
CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS
Francisco DE LA GARZA, Yessica ORTIZ, Blanca CASTRO, Patricio RIVERA,
Lorenzo HEYER
Unidad Academica Multidisciplinaria Agronomia y Ciencias, Laboratorio Ambienta
Universidad Autonoma de Tamaulipas Cd. Victoria Tamaulipas, Mexico, Codigo
Postal 87149. Correo electrónico: yortizca@uat.edu.mx
Palabras clave: bioremediación, disel, levadura, cuenca de Burgos
RESUMEN
En la Cuenca de Burgos la cual abarca al norte de Tamaulipas, se está extrayendo
gas natural, resultando alrededor de 144,000 toneladas por año de lodos
impregnados con disel y otros hidrocarburos. Estos materiales reciben un tratamiento
físico siendo insuficiente ya que deja residuos de entre el 2 y 3 % de hidrocarburos.
Una alternativa viable para resolver este problema, puede ser la biorremediación.
Este trabajo pretendió aislar microorganismos capaces de utilizar suelos
contaminados con hidrocarburos específicamente del municipio de Reynosa. Este
ensayo se llevo a cabo bajo condiciones de laboratorio; se muestreo según la NOM138-SEMARNAT/SS-2003. La composición del medio de cultivo utilizado fue:
(NH4)2SO4 7.0 g, KH2PO4 5.7g, K2HPO4 2.3g, MgSO4.7H2O 2.2g con y sin levadura,
usándose como caldo y medio sólido; el aislamiento de los microorganismos fue: a)
siembra en caldo con levadura, incubación a 37 oC durante 48 horas a 200 rpm b)
resiembra en caldo sin levadura, incubación a 37 oC durante 48 horas a 200rpm c)
siembra en medio sólido, incubación a 37 oC por 48 horas. Del crecimiento de cada
siembra se hicieron frotis para determinar la composición microbiana presente. En
las dos primeras siembras se detectó la presencia de levaduras y bacterias Gram
negativas. En el medio sólido se desarrollaron colonias color beige, de diámetro de
7.5 mm a 1 mm, solo en los medios con hidrocarburos, en los medios sin
hidrocarburos no se observo ningún crecimiento microbiano. En el suelo analizado
existen microorganismos capaces de utilizar hidrocarburos como fuente de carbono.
INTRODUCCIÓN
La Cuenca de Burgos es una zona de explotación de gas natural en el noreste de
México, en la cual la perforación de pozos genera alrededor de 144,000 toneladas
por año de residuos o lodos impregnados con diesel y otros hidrocarburos a los
cuales hay que darles una salida medioambiental. Se sabe que la disposición no
controlada de estos materiales puede crear problemas tales como la contaminación
de aguas subterráneas y contaminación atmosférica (Clark, 1995).
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La agencia de protección ambiental europea, sensibilizada cada vez más por la
problemática que éstos pueden llegar a ocasionar, incluyó 16 hidrocarburos en la
lista de contaminantes prioritarios (Ferrari, 1996). En la zona, estos materiales son
sometidos a tratamiento físico para reducir la concentración de tales sustancias
(REECOTEC, 2004) para confinarlos posteriormente en un relleno sanitario, sin
embargo dicho tratamiento deja residuos de entre el 2 y el 3 % de hidrocarburos.
Entre las técnicas de recuperación de los suelos contaminados con hidrocarburos se
pueden citar: a la extracción de hidrocarburos por vacío, incineración, y la
recuperación electrocinética (Clark, 1995). Debido al elevado costo de las técnicas
mencionadas, se buscan alternativas viables para la eliminación de los hidrocarburos
contenidos en estos suelos. Se pretende que estas alternativas sean ambientalmente
correctas, simples y económicas. Se tienen así técnicas de tratamiento que se
aplican a deshechos peligrosos o materiales contaminados, y que persiguen alterar
su estado en forma permanente por medios químicos, biológicos o físicos. Una
alternativa viable para resolver este tipo de problemas, puede ser la biorremediación
(Atlas y Pramer 1990) en la cual se utilizan una variedad de organismos vivos,
principalmente microorganismos como las bacterias y levaduras, para degradar,
transformar o remover compuestos orgánicos tóxicos a productos metabólicos
inocuos o menos tóxicos (Grady, 1985; Thomas y Ward, 1989; Van Deuren et al.,
1997). En el caso de los microorganismos estos eliminan el contaminante por
biodegradación proceso mediante el cual los microbios son capaces de aceptar como
sustrato sustancias orgánicas y transformarlas en compuestos menos tóxicos o
inocuos o, mejor aún, eliminarlos de forma total produciendo CO2, agua y biomasa
microbiana. Los hidrocarburos en el medio ambiente son degradados principalmente
por bacterias y hongos. Ambos son relativamente abundantes en el suelo (Bossert y
Bartha., 1984), aunque las bacterias asumen un rol predominante en medios
marinos, mientras que los hongos lo hacen en ecosistemas terrestres. Las bacterias
con capacidad degradadora de hidrocarburos en ambos medios, acuático y terrestre,
son:
Achromobacter,
Acinetobacter,
Alcaligenes,
Arthrobacter,
Bacillus,
Flavobacterium, Nocardia, Pseudomonas spp y Coryneforms. Entre los hongos
encontramos Aureobasidium, Candida, Rhodotorula, y Sporobolomyces spp, como
los más comunes en medio acuático, y Trichoderma y Mortierella spp. en suelos.
El conocimiento de los diversos aspectos de la ecología microbiana y su relación con
la fisiología es esencial para estudiar el potencial que presentan los microorganismos
para degradar petróleo en ambientes acuáticos y terrestres (Soto et al., 1996). La
presencia de microorganismos a la hora de diseñar un proceso de biorremediación
es esencial, ya que son los responsables de eliminar el contaminante. Por otro lado,
los suelos contaminados con hidrocarburos requieren de una concentración mínima
de microorganismos degradadores específicos así como de microorganismos
heterótrofos no específicos (Ercoli et al., 2000). Si esta masa crítica no es suficiente
se pueden incorporar microorganismos al suelo mediante inoculación, a través del
proceso conocido como "bioaumentación".
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Se sabe que microorganismos individuales sólo son capaces de metabolizar un
rango limitado de hidrocarburos (Briton, 1984), haciéndose necesario usar una
mezcla de poblaciones que posean una amplia capacidad enzimática a fin de poder
degradar grupos complejos de hidrocarburos en suelo (Bosscrt y Bartha, 1984).
El Objetivo de este trabajo fue el de detectar la presencia de microorganismos
capaces de utilizar hidrocarburos como fuente de carbono en suelos contaminados
provenientes de la cuenca de Burgos, los cuales puedan ser utilizados para
degradar, mediante la inoculación, a estos compuestos derivados del petróleo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Este trabajo de investigación se llevó a cabo en el Laboratorio Ambiental de la
Unidad Académica Multidisciplinaría Agronomía y Ciencias de la Universidad
Autónoma de Tamaulipas.
El suelo utilizado en este ensayo fue colectado en la cuenca de Burgos,
particularmente en la zona de perforación ubicada en el municipio de Reynosa
Tamaulipas, en un sitio contaminado y otro sitio sin contaminar en la misma zona
como lo marca la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003.
Una vez en el laboratorio se procedió a su análisis, utilizando el método para el
aislamiento de microorganismos degradadores de petróleo del Manual de Ecología
Microbiana del Instituto Politécnico Nacional (Félix et. al., 1996)
Los medios de cultivo usados para el aislamiento de microorganismos que estuvieran
presentes en los suelos contaminados, y que tuvieran la capacidad de utilizar a los
hidrocarburos como fuente de carbono, fueron dos principalmente: un medio basal
para degradadores de hidrocarburo con o sin extracto de levadura al 0.4% (Tabla I).
Compuesto
Cantidad
(NH4)2SO4
7.0 g
KH2PO4
5.7 g
K2HPO4
2.3 g
MgSO4.7H2O
2.2 g
Agua destilada
1000 ml
Tabla I. Medio de cultivo usado para el aislamiento de lo microorganismos presentes
en los suelos contaminados con hidrocarburos.
El caldo con y sin levadura, disuelto en agua destilada fue distribuido en matraces de
250ml colocándose 100ml por matraz para ser esterilizado en autoclave a 15 libras
de presión durante 15 minutos.
Se preparó una serie de 6 matraces conteniendo el medio basal más levadura a dos
de ellos se les añadió, a cada uno, 1ml de aceite para lubricación de motor y a otros
dos 1ml de diesel, dándoles los siguientes tratamientos (Tabla II):
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Tabla II. Diferentes tratamientos usados
: Tratamientos
1 Medio Basal + Levadura
2 Medio Basal + Levadura
3 Medio Basal + Levadura + Aceite
4 Medio Basal + Levadura + Diesel
5 Medio Basal + Levadura + Aceite
6 Medio Basal + Levadura + Diesel
Suelo
Intacto
Contaminado
Intacto
Intacto
Contaminado
Contaminado
Como se menciono anteriormente los suelos utilizados en este ensayo provenían del
municipio de Reynosa, Tamaulipas. Para la inoculación de los matraces conteniendo
el medio basal más levadura y los diferentes tratamientos se le agregó un gramo de
suelo, incubándose a temperatura ambiente en agitación a 200 rpm durante 48
horas (Fig. 1).
Figura1. Matraces conteniendo el medio basal más levadura y los diferentes
tratamientos, en agitación a 200 rpm.
Una vez que hubo crecimiento microbiano en los matraces, notado por la turbidez del
caldo y
corroborado a través de frotis que mostraban la presencia de
microorganismos, se transfirió 1ml de este cultivo a 100 ml de medio basal sin
levadura esterilizado (Fig. 2) colocándose en incubación en la mesa de agitación a
200 rpm durante 48 horas. Tres matraces contenían solo el medio basal, otros 3 se
les añadió 1ml de aceite y a otra serie de 3 1 ml de diesel.
Figura 2. Transferencia del cultivo microbiano inicial.
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Transcurrido el tiempo de incubación se observó crecimiento microbiano en los
matraces que contenían, además del medio basal, aceite o diesel. Se prepararon
cajas petri con este medio basal solidificado con agar. Como el objetivo en esta
etapa del ensayo era observar el crecimiento de microorganismos que utilicen a los
hidrocarburos o sus derivados como fuente de carbono, se incorporó separadamente
al medio de cultivo tanto aceite como diesel en una concentración del 1%. Se sembró
por estría a partir de los cultivos microbianos obtenidos en la etapa anterior, se
incubó a 37 oC durante 48 horas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En los matraces que contenían el medio basal más levadura mas aceite o diesel e
inoculados con suelo contaminado se presentó, a las 48 horas, turbidez que
manifestaba crecimiento microbiano. En los frotis realizados a este cultivo se observó
la presencia de un gran número de levaduras y de bacterias Gram negativas en
menor número. Estos microorganismos son los más comúnmente encontrados en
suelos contaminados con hidrocarburos (Bossert y Bartha., 1984) y denotan la
capacidad que tienen para degradar a estos compuestos utilizándolos como fuente
nutricia. Cabe mencionar que no se determinó el número más probable de
microorganismos.
Los microorganismos alóctonos como los que utilizan a los hidrocarburos como
fuente de carbono, pueden existir en suelos no contaminados en poblaciones
pequeñas las cuales son estimuladas por la presencia de estos compuestos (Mark et
al., 2004), esto se pudo observar en este ensayo ya que se presentó una ligera
turbidez en los matraces con medio basal + levadura + aceite o diesel + suelo intacto
de la vecindad de los suelos contaminados. En los frotis realizados aparecen
levaduras y hongos como los causantes de esa turbidez.
En la resiembra que se hizo utilizando como inóculo a los cultivos microbianos
obtenidos en la primera parte del ensayo, está vez con el caldo sin levadura, se
observó a las 48 horas una gran turbidez del medio de cultivo.
Los microorganismos encontrados en estos matraces eran levaduras y bacilos Gram
negativos.
Se pudo corroborar con una siembra en placa del crecimiento microbiano detectado
en el medio basal + agar + levadura + aceite o diesel e inoculados con suelo
contaminado. Se observo en el microscopio crecimiento de colonias color beige,
consistencia cremosa, colonias distribuidas a lo largo de la estría y también crecieron
en forma aislada, de forma ovalada, diámetro de entre 7.5 mm a 1 mm solo en los
medios con hidrocarburos (Fig. 3 4 y 5), en los medios con medio basal + agar +
levadura + aceite o diesel + suelo intacto no se observo ningún crecimiento de
bacterias o levaduras, al parecer el medio sólido no fue apropiado para el desarrollo
de las bacterias que estaban presentes en los cultivos presentes en los caldos.
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Figuras 3 4 y 5. Muestran el crecimiento y la forma de las colonias en las estrías, así
como en forma aislada
CONCLUSIONES
Se detectó en los suelos provenientes de la Cuenca de Burgos en el municipio de
Reynosa, Tamaulipas, la presencia de levaduras y bacilos Gram negativos capaces
de utilizar a los hidrocarburos como fuente de carbono; estos microorganismos
forman parte de las poblaciones normales de estos suelos, ya que se detectó su
presencia tanto en suelos intactos como en suelos contaminados.
REFERENCIA
Atlas, R.M. y Pramer, D. (1990). Focus on Bioremediation of Oil Spills. Journal
Chemical Technology Biotechnology. 52: 149-156.
Clark, L. (1995). Hydrocarbon pollution control and remediation of groundwater: a
brief review. Quarterly Journal of Engineering Geology. 28: 93-100
Empresa REECOTEC. (2004).
Félix J. N., Gutiérrez T. C, Lemos A. P., Ortiz M. J., Pescador N. E., Varela L. F.,
(1996) Manual de laboratorio de ecología microbiana. Instituto Politécnico Nacional,
México
Ferrari, M.D. (1996). Biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos y su
aplicación en la biorremediación de suelos y lodos contaminados. Revista Argentina
de Microbiología. 28: 83-98
Mark Ibekwe A., Sharon K. Papiernik and Ching-Hong Yang. 2004. Enrichment and
molecular characterization of chloropicrin- and metam-sodium-degrading microbial
communities. Applied Microbiology and Biotechnology Issue: Volume 66, Number 3.
Pages: 325 - 332
Soto J., Gutiérrez T., Lemos A., Ortiz M., Pescador N., Varela L. (1996).
Biodegradación y biotransformación de moléculas orgánicas. Manual de Laboratorio
de Ecología Microbiana. Instituto Politécnico Nacional.
Van Deuren, J., Z. Wang, Z. y J. Ledbetter (1997). Remediation Technologies
Screening Matrix and Reference Guide. 3ª Ed. Technology Innovation
Office, EPA. http://www.epa.gov/tio/remed.htm.
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