REMOCIÓN DE TRINITROTOLUENO (TNT) EN AGUA RESIDUAL SINTÉTICA MEDIANTE BACTERIAS AISLADAS DE AMBIENTES CON PRESENCIA DE EXPLOSIVOS. LEIDY CAROLINA BRAVO PÉREZ DIANA ALEXANDRA ALDANA LABRADOR UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERIA PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTA D.C 2010 REMOCIÓN DE TRINITROTOLUENO (TNT) EN AGUA RESIDUAL SINTÉTICA MEDIANTE BACTERIAS AISLADAS DE AMBIENTES CON PRESENCIA DE EXPLOSIVOS. LEIDY CAROLINA BRAVO PÉREZ DIANA ALEXANDRA ALDANA LABRADOR TESIS DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE INGENIERO AMBIENTAL Y SANITARIO Director JOAQUÍN LORENZO BENAVIDES LÓPEZ DE MESA UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERIA PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTA D.C 2010 Nota de aceptación ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ______________________ Firma de la directora ______________________ Firma del jurado ______________________ Firma del jurado Bogotá, Enero de 2010 Tengo que agradecer a todo lo que me rodea, no puedo omitir a nadie ni a ningún detalle; pese a la lucha el cansancio, los malos días, los compañeros de lucha, sin ellos no se hubiese podido cumplir un pequeño y a la vez grande sueño, que forma uno de los primeros escalones para seguir mi vida. A mi padre y a mi madre pasamos alegría, entusiasmo, satisfacción, pero también angustias. A los que me dieron la vida, que sin más remedio dando todo por mí, con su amor genuino y sincero. A ellos a los que siempre me han sostenido, me vieron crecer y son los escritores de este sueño. Gracias por este esfuerzo, gracias por ser quien son. A mi querido hermano, eres un tesoro, gracias por el acompañamiento. A mí querido amado, mi gran confidente, gracias por tu amor, comprensión, gracias por compartir este sueño y hacerlo tuyo; por esperarme todos estos años y aun seguir esperándome… Te AMO. Y por ultimo y mas importante en mi vida, a ti Dios que te debo todo, te debo mi gran preciada vida, te debo tu mirada sobre mi, te debo tanto, que ni aun en la eternidad alcanzaría a pagártelo. Gracias Dios por el conocimiento y sabiduría que me has dado hasta llegar a este punto, gracias por no dejarme desfallecer y darme fuerzas cada día aun cuando no quería levantarme. Gracias Eterno por estar presente en mi vida todos lo días. הנצחי לאל תודה Carolina Bravo A Dios por ser el que maneja este universo infinito de cosas maravillosas y ser él quien me permita disfrutarlas, por enviarme al ser que lógro llenarme de vida y esperanza para lograr terminar esta carrera, a ese hijo que me levanta en las mañanas con mil sonrisas, a él esta tesis, mi vida y mis ganas de seguir adelante. A mi mamá y hermano que se llenaron de paciencia y amor, y que sobre todo fueran el piso para que yo pusiera esta nueva base de mi vida. A mi familia en general, que siempre estuvieron presentes en la lucha y siempre esperaron lo mejor de mí. A mis compañeros de luz y amigos del alma, Gabo, Vanessa y Juli, porque siempre están ahí. DIANA ALDANA AGRADECIMIENTOS Agradecemos a las siguientes personas por su apoyo en la realización del presente proyecto de grado: A Joaquín Benavidez MSc. Director del proyecto. A Fabio Roldán PhD. Director del grupo y proyectos de Investigación de Biorremediación en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental, de la Pontificia Universidad Javeriana, por guiarnos y apórtanos conocimiento para la realización de este proyecto. Al Químico Ziv Arbeli. Coordinador de laboratorio. A Hoover Varón y Ricardo Amaya. Coordinadores de Laboratorio de Ciencias Básicas de la Universidad de la Salle y de la Unidad de Saneamiento y Biotecnología, por tener las respuestas a muchas preguntas. Al personal de laboratorios de Ciencias Básicas de la Universidad de la Salle. Al personal del Laboratorio de la Unidad de saneamiento Ambiental de la PUJ. y Biotecnología TABLA DE CONTENIDO TABLA DE CONTENIDO 1. MARCO DE REFERENCIA 1.1 MARCO TEÓRICO 1.1.1 Explosivos. 1.1.2 Características de los explosivos. 1.1.3 Clasificación de los explosivos. 1.1.4 Características del 2, 4,6 trinitrotolueno (TNT) 1.1.5 Propiedades químicas del TNT 1.1.6 Biorremediación de explosivos. 1.1.7 Metabolismo microbiológico de la degradación del TNT 1.1.7.1 Metabolismo con Enterobacter cloacae sp. 1.1.7.2 Metabolismo con Pseudomonas sp. 1.1.8 Formación del complejo Meisenheimer. 1.1.9 Medio de cultivo. 1.1.10 Características de la colonia. 1.1.11 Agua residual sintética. 1.2 MARCO LEGAL. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 DISEÑO METODOLOGICO. 2.1.1 Toma de muestras. 2.1.2 Análisis preliminares del suelo. 2.1.3 Medición de conductividad y pH de las muestras. 2.1.4 Pre-enriquecimiento de las muestras 2.1.5 Aislamiento de cepas. 2.1.6 Criterio de selección de colonias. 2.1.7 Bioensayo. 2.1.8 Análisis estadístico. 2.1.8.1 Modelo. 2.1.8.2 Hipótesis 7 22 22 22 22 23 23 24 25 28 29 29 29 30 31 33 35 38 39 39 41 41 43 46 47 58 62 62 63 3. Análisis de resultados 65 4. CONCLUSIONES 70 5. RECOMENDACIONES 71 6. BIBIOGRAFIA 72 ANEXOS LISTA DE TABLAS Tabla 1. Características explosivo TNT. ........................................................... 24 Tabla 2.Legislación ambiental aplicable para investigación. ............................ 35 Tabla 3. Puntos de toma de muestras. ............................................................. 40 Tabla 4. Método de medición de parámetros fisicoquímicos ............................ 41 Tabla 5. Valores de pH y conductividad de las muestras ................................. 42 Tabla 6. Composición de medio nutritivo. ......................................................... 43 Tabla 7. Cantidades para la elaboración del medio. ......................................... 44 Tabla 8. Composición fuentes de energía. ....................................................... 45 Tabla 9. Morfotipos 78 aislamientos seleccionados en la replica. .................... 48 Tabla 10. Lecturas de los 78 aislamientos por HPLC. ...................................... 54 Tabla 11. Aislamientos bacterianos con mayor capacidad de degradación del TNT seleccionados al azar................................................................................ 57 Tabla 12. Componentes agua residual sintética ............................................... 58 Tabla 13. Resultados medición por HPLC del bioensayo. ................................ 60 Tabla 14.Porcentajes de remoción a través del tiempo, por cada aislamiento bacteriano. ........................................................................................................ 62 Tabla 15.Análisis de varianza. .......................................................................... 63 Tabla 16.Resultados del análisis de varianza. .................................................. 63 Tabla 17. Concentraciones de TNT en bioensayo ............................................ 66 Tabla 18.Resultados Bioensayo en porcentajes de remoción de TNT. ............ 67 LISTA DE ILUSTRACIONES Ilustración 1.Estructura del 2, 4,6 Trinitrotolueno .............................................. 24 Ilustración 2. Biorremediación de contaminantes.............................................. 26 Ilustración 3. Metabolismo microbiano .............................................................. 26 Ilustración 4. Formación del complejo Meisenheimer. ...................................... 30 Ilustración 5. Toma de muestras. ........................ ¡Error! Marcador no definido. Ilustración 6. Muestras obtenidas de los doce ................................................. 40 Ilustración 7.Frascos de pre-enriquecimiento ................................................... 45 Ilustración 8. Población bacteriana caja de petri con T1. ................................. 47 Ilustración 9. Población bacteriana caja de petri con T2. .................................. 47 Ilustración 10.Cromatograma curva patrón 100mg/L. ....................................... 68 Ilustración 11.Cromatograma aislamiento T109. Tiempo 0 ............................... 68 Ilustración 12.Cromatograma aislamiento T109, tiempo3. ................................ 69 LISTA DE CROMATOGRAMAS Cromatograma. 1. 100 mg/l .............................................................................. 77 Cromatograma. 2. Cero. ................................................................................... 77 Cromatograma. 3 Patrón .................................................................................. 77 Cromatograma. 4 T54A .................................................................................... 77 Cromatograma. 5 T87B .................................................................................... 78 Cromatograma. 6 T88B .................................................................................... 78 Cromatograma. 7 T92B .................................................................................... 78 Cromatograma. 8. T 109 .................................................................................. 78 Cromatograma. 9. T54 A.2 ............................................................................... 79 Cromatograma. 10 T54B2 ................................................................................ 79 Cromatograma. 11. T54C1 ............................................................................... 80 Cromatograma. 12.T 54D2 ............................................................................... 80 GLOSARIO ACEPTOR DE ELECTRONES: Sustancia que acepta electrones durante una reacción de oxido reducción. ACIDÓFILO: Organismo que crece mejor a pH bajos. AEROBIO: Organismo que crece en presencia del oxigeno. AISLAMIENTO: El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las técnicas empleadas normalmente en microbiología. AGUA RESIDUAL SINTÉTICA: Agua elaborada a nivel de laboratorio que posee características de un agua residual industrial. ALCALÓFILOS: Organismo que crece mejor a pH Altos. BACTERIAS DESNITRIFICANTES: Bacterias con potencial de reducción nitritos relativamente altos de manera aeróbica las cuales están muy ampliamente distribuidas por los suelos y las aguas. Un grupo de organismo (Nitrosomonas) oxida amoniaco a nitrito y otro grupo (Nitrobacter) oxidan nitrito a nitrato. BIODEGRADACIÓN: Es el resultado de los procesos de digestión, asimilación y metabolismo de un compuesto orgánico llevado a cabo por bacterias, hongos, protozoos y otros organismos. BIOENSAYO: Es la evaluación de la actividad biológica de una sustancia mediante pruebas de su efecto sobre un organismo microorganismo. CEPA: población celular descendiente de una única célula. en general. COLONIA: Población de células que pueden observarse macroscópicamente, y que crecen en un medio solido, procedentes de una sola célula. CRECIMIENTO MICROBIANO: Aumento de número de células de un microorganismos en la que el numero de estas se dobla en un periodo de tiempo fijo. CULTIVO: Cepa particular o tipo de organismo que crece en un medio en el laboratorio. CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO: Empleo de medios de cultivo y condiciones de incubación selectivos para aislar microorganismos directamente de muestras naturales. DILUCIÓN: Es una mezcla homogénea, conformadas por un soluto y un solvente. DONADOR DE ELECTRONES: Compuesto que proporciona electrones durante una reacción de oxido reducción. ESPECIE: En procariotas colección de cepas estrechamente relacionadas (> 97% homología en las secuencias del rRNA16s) pero lo bastante distintas de las otras cepas como para ser reconocidas como una unidad diferente. EXPLOSIVOS: Son sustancias que mediante una reacción química se convierten en gases. Al hacerlo liberar presión y calor por igual, en todas las direcciones. Se clasifican en: alto explosivo y explosivo lento, de acuerdo con la rapidez con que se lleve a efecto este cambio. HPLC (CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA): Es un método para determinar concentraciones cuantitativas exactas de compuestos no volátiles, Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleícos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, etc. INÓCULO: Material biológico usado para hacer un cultivo microbiano. MEDIO DE CULTIVO: Solución acuosa o solida de varios nutrientes adecuada para el crecimiento de los microorganismos. METABOLISMO: Se refiere a la suma de reacciones bioquímicas requeridas para la generación de energía y el uso de la energía para sintetizar material celular a partir de moléculas del medio ambiente. MICROORGANISMOS. Son formas de vida muy pequeñas que sólo pueden ser observados a través del microscopio. NUTRIENTE: Substancia que la célula toma de su ambiente y que utiliza en reacciones catabólicas o anabólicas. TNT (2, 4,6-TRINITROTOLUENO): Es un sólido amarillo, sin olor, que no ocurre naturalmente en el ambiente. Comúnmente se le conoce como TNT y es un explosivo usado en proyectiles militares, bombas y granadas, en la industria, y en explosiones bajo el agua. QUIMIOLITÓTROFO: Organismo que obtiene su energía de la oxidación de compuestos inorgánicos. QUIMIOORGANOTROFO: Organismo que obtiene su energía de la oxidación de compuestos orgánicos. REACCIÓN DE OXIDACIÓN- REDUCCIÓN: Reacción en la que un compuesto se oxida mientras otro se reduce y toma los electrones oxidación. liberados en la RESIDUO PELIGROSO: Es aquel residuo o desecho que por sus características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables, infecciosas o radiactivas puede causar riesgo o daño para la salud humana y el ambiente. Así mismo, se considera residuo o desecho peligroso los envases, empaques y embalajes que hayan estado en contacto con ellos. RESPIRACIÓN: Reacciones catabólicas que producen ATP, cuyos donadores primarios de electrones son compuestos orgánicos o inorgánicos, 7y cuyos aceptores finales de electrones son también compuestos orgánicos o inorgánicos. SUBSTRATO: Molécula que reacciona con una enzima. También substancia que utiliza un microorganismo para crecer. XENOBIOTICO: Son aquellos compuestos químicos introducidos por el hombre que no pertenecen a la naturaleza. RESUMEN El 2,4,6 Trinitrotolueno (TNT), es un compuesto nitroaromático utilizado como materia prima para la elaboración de explosivos esenciales como pentolitas; se caracteriza por ser altamente tóxico al igual que las derivaciones provenientes de sus transformaciones. Las industrias productoras de esta clase de explosivos presentan una gran cantidad de desechos, que tienen una alta incidencia en el medio ambiente; debido a esto se encuentra en la lista de los contaminantes más importantes de la Agencia de protección Ambiental de los Estado Unidos(Halasz et al.,2002) La problemática en Colombia por el uso de este tipo de compuestos radica en los productos y subproductos que quedan sin detonar en el medio ambiente, acumulándose en los ecosistemas y microecosistemas; sumado a esto la carencia de investigaciones en nuestro país conlleva a una falta de implementación de mecanismos que apliquen fundamentos de la microbiología con el fin de desestabilizar la estructura molecular del explosivo sin generar mayores impactos negativos al medio ambiente. La presente investigación plantea una alternativa preliminar de reducción del explosivo TNT en agua residual sintética a partir de aislamientos bacterianos que posean mayor capacidad degradadora del explosivo. Este proyecto se llevo a cabo estableciendo en primer lugar las condiciones fisicoquímicas y microbiológicas para aislar las bacterias que tengan la capacidad de reducir el compuesto TNT en agua residual sintética, para ello se tomaron doce puntos de muestreo en ambientes expuestos al explosivo TNT, a partir de estas muestras se realizó un pre- enriquecimiento, donde hubo un aumento de la población bacteriana existente en ellas, para luego ser sembradas a partir de diluciones seriadas en medio mineral sólido con diferentes fuentes de energía. Después de verificar un crecimiento de la población, se dio paso a la resiembra teniendo como criterio de selección, el morfotipo de la colonia; estos aislamientos se sembraron en medio mineral líquido para luego realizar la lectura de las concentraciones de explosivo con el equipo de Cromatografía Liquida de Alta Eficacia (HPLC), de esta manera identificar las bacterias con mayor capacidad de degradación del 2,4,6 trinitrotolueno. Consecutivamente se realizo un bioensayo con las bacterias que presentaron una mayor capacidad degradadora, las cuales fueron inoculadas en agua residual sintética que contenía concentraciones específicas de TNT. Para determinar el porcentaje de remoción del explosivo se realizaron mediciones a través del tiempo donde se seleccionaron cinco aislamientos que presentaron mayor capacidad de degradación los cuales se inocularon en agua residual sintética por un periodo de cuatro días; en este ensayo se obtuvo bajos porcentajes de remoción en cada una de las lecturas realizadas cada 24 horas mediante el equipo HPLC, los aislamientos bacterianos presentaron un comportamiento homogéneo en la degradación, lo que nos indica que el tiempo de inoculación de las bacterias en el agua residual sintética y los aislamientos seleccionados no tuvieron efecto significativo sobre el porcentaje de remoción esperado. ABSTRACT 2,4,6 Trinitrotoluene (TNT) is a nitroaromatic compound used as raw material for the manufacture of explosives as pentolite essential and is characterized by being highly toxic as well as referrals from their transformations. Industries producing this kind of explosives have a lot of waste, which have a high impact on the environment, because this is in the list of the major pollutants of the Environmental Protection Agency of the United States (Halasz et al., 2002) The problem in Colombia for the use of this compound lies in the products and byproducts that remain unexploded on the environment and accumulate in ecosystems and microecosystem, in addition to that the lack of research in our country leads to a lack of implementation mechanisms involving the microbiological to destabilize the molecular structure of the explosive without causing major negative environmental impacts. This preliminary investigation raises an alternative reduction of the explosive TNT in synthetic sewage isolates from having more explosive degrading abilities. This project was carried out by establishing physicochemical and microbiological conditions to isolate bacteria that are capable of reducing TNT compound in synthetic sewage for it took twelve points of sampling in exposed to the explosive TNT, from these samples conducted a pre-enrichment, there was an increase of the bacterial population existing in them and then be sown from serial dilutions on solid mineral medium with different substrates, after checking the growth of population, led to the reseeding each bearing bacteria isolated as a selection criterion, the morphotype of the colony, these isolates were inoculated in liquid mineral medium and then doing the reading of explosive concentrations with the team of high-performance liquid chromatography (HPLC ), thereby identifying the bacteria with greater capacity for degradation of 2,4,6 trinitrotoluene. Running a bioassay was conducted with the identified bacteria, were inoculated in synthetic wastewater containing specific concentrations of TNT. In determining the rate of removal of explosive measurements were made over time where five isolates were selected that showed higher degradation capacity which were inoculated in synthetic sewage for a period of four days in this test is low removal percentages obtained in each of the readings taken every 24 hours using the HPLC equipment, the bacterial isolates showed a homogeneous behavior in the breakdown, which indicates that the time of inoculation of bacteria in the synthetic sewage and the selected isolates had no effect significant on the percentage of expected removal. INTRODUCCIÓN La fabricación y uso de explosivos por la industria militar, la minería y la de construcción deja grandes áreas de suelo y agua contaminados, debido a los residuos generados por la manufactura, almacenamiento y disposición de estos explosivos se han introducido al ambiente una cantidad de compuestos nocivos considerados residuos peligrosos por sus características de toxicidad y volatilidad, ya que interaccionan con el medio ambiente propiciando la destrucción y desequilibrio de los ecosistemas.1 Los explosivos en su mayoría poseen una estructura molecular compleja ya que están constituidos por compuestos nitro aromáticos o esteres de nitrato, en lo que radica su alto poder de detonación y hace complejo el proceso de degradación natural, acumulándose en el medio ambiente sin llegar a ser degradado debido a la falta de mecanismos biológicos que contribuyan a su disminución. Por estas características, los explosivos representan un alto riesgo a la salud humana debido a sus propiedades mutagénicas y carcinogénicas2. Las técnicas tradicionales de remediación para la eliminación de los explosivos han sido la incineración y el almacenamiento en depósitos; la primera genera graves problemas en el ambiente ya que al incinerar estos compuestos se provoca emisión de gases tóxicos que contribuyen al deterioro de la calidad del aire, además de la destrucción de los suelos en los que se realizan estas actividades; y la segunda técnica requiere de la implementación de vertederos 1 Biological degradation of 2, 4, 6 trinitrotoluene Microbioligy and molecular biology reviews 2001. 2 Ibíd. 1 pág. 35. 19 de almacenamiento lo que genera riesgos de infiltración a las aguas subterráneas contaminando estas importantes fuentes hídricas.3 Por esta razón, se han adelantado investigaciones para buscar métodos biológicos que permitan disminuir el efecto que los explosivos tienen sobre el ambiente. El uso de microorganismos como las bacterias ha sido uno de los métodos que contribuye en procesos naturales de degradación por su versatilidad metabólica y su capacidad de adaptarse con gran rapidez a condiciones en su hábitat natural, siendo estos factores importantes para la transformación a moléculas más simples y de fácil degradación. La presente investigación plantea la reducción del explosivo TNT a partir de bacterias aisladas en laboratorio que tengan un posible potencial degradador del 2, 4,6 trinitrotolueno, este proceso se evaluará mediante un bioensayo realizado en agua residual sintética para determinar el porcentaje de remoción en un periodo de cuatro días en condiciones de laboratorio. 3 BRANCO, S.M: Limnología sanitaria, estudio de la polución de aguas continentales. Monografía científica No 28, 1984 serie Biología, OEA, 119 p. 20 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Determinar la remoción de trinitrotolueno (TNT) en agua residual sintética mediante bacterias aisladas de ambientes con presencia de explosivos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Establecer las condiciones fisicoquímicas y microbiológicas para el aislamiento de las bacterias degradadoras de TNT. Aislar bacterias degradadoras de TNT a partir de muestras de ambientes (agua, suelo y lodo), con presencia de explosivos. Identificar las bacterias con mayor capacidad degradadora de TNT con base en la reducción del sustrato estudiado. Evaluar de manera preliminar el porcentaje de remoción de TNT en agua residual sintética mediante cromatografía líquida (HPLC). 21 1. MARCO DE REFERENCIA 1.1 MARCO TEÓRICO 1.1.1 Explosivos. Son Es todas aquellas sustancias o compuestos de naturaleza química, cuya reacción de descomposición está determinada por la detonación, concluyendo en un tiempo muy breve; esta detonación produce una gran cantidad de energía química (reacción exotérmica). Se debe tener en cuenta, que todo explosivo debe tener como obligación la presencia de un agente oxidante, es decir una sustancia con preferencia a ceder oxígeno, y un agente combustible; Estas dos sustancias anteriores se pueden encontrar incluidas dentro de la molécula que hacen parte del explosivo.4 1.1.2 Características de los explosivos. Estas son las que permiten elegir cuál de los explosivos es idóneo para un fin determinado, dichas características pueden predecir cuales serán los posibles efectos que se presentaran en el momento de ser utilizados. Una de las principales características de los explosivos es la estabilidad, que define la modificación del explosivo en sus condiciones normales de operación, desde el punto de vista de los riesgos que pueden generar, la variación de sus propiedades o efectos explosivos. La estabilidad puede considerarse desde el punto de vista químico y físico. Otras características importantes son: Temperatura, humedad, potencia explosiva, densidad, resistencia al agua, resistencia al contacto con el agua, resistencia a la humedad y resistencia al agua bajo presión de la misma 5. 4 Determinación del impacto ambiental al recurso agua ocasionado por la desactivación de los explosivos pólvora y anfo con el método de disolución química y valoración del ruido producido por la destrucción de los explosivos incautados por la Policía Nacional 5 Ibíd. 4. Pág. 24. 22 1.1.3 Clasificación de los explosivos. Los explosivos se pueden clasificar según su origen en: Explosivos artesanales. Como su nombre lo indica son sustancias o mezclas fabricadas artesanalmente, son muy peligrosos por no tener normas de fabricación específicas y son generalmente usados por grupos al margen de la ley. Ejemplo: Amonal, R1, BENCLO, ANFO, Amatol. Explosivos industriales. A diferencia de los anteriores estos se fabrican bajo normas y pautas comúnmente señaladas en tratados o leyes internacionales, debiendo llevar el mismo patrón de fabricación. Explosivos comerciales: son utilizados en actividades cotidianas como en industria, minería, obras civiles, se deben trabajar bajo todas las normas de seguridad, por ser altamente peligrosos. Ejemplos: ANFO, Pentofex, Indugel, entre otros.6 1.1.4 Características del 2, 4,6 trinitrotolueno (TNT) El TNT es un explosivo fabricado mediante una nitración secuencial tolueno, empleando ácido nítrico y sulfúrico (C 6 H 2 (NO 2) 3 CH del 3), generalmente es un procedimiento realizado en lotes, tanto para la producción de mono-, di-, y, finalmente, trinitrotolueno. Este explosivo sirve para la detonación directa o como materia prima para la elaboración de otros explosivos esenciales como la Pentolita, lo que lo hace un elemento importante para la Industria militar. El TNT tiene una velocidad de detonación de 6900m/s, solo basta dejarlo caer a 35cm de altura del suelo para que este detone; esta reacción proveniente de 6 Manual técnico de explosivos. España: Dirección General de Armamento y Material, 1984. 450 p. 23 la detonación es exotérmica lo que produce la destrucción total alrededor de un radio de 12 metros, es insoluble en agua pero soluble en acetona y benceno, este explosivo 2,4,6 trinitrotolueno no produce vapores, pero si genera un polvo toxico en el momento de la detonación. Este explosivo es un compuesto altamente tóxico al igual que sus derivaciones provenientes de sus posibles transformaciones, debido a esto se encuentra en la lista de los contaminantes más importantes de la Agencia de protección Ambiental de los Estado Unidos. Tabla 1. Características explosivo TNT. Compuesto explosivo TNT Formula empírica C7H5N3O6 Peso Densidad 3 Velocidad Estructura Presión de molecular (g/cm ) a de de vapor (Pa) (g/mol) 20°c detonación explosivo a 20°c 227.1 1.654 6900 1.46X10-4 CH3 Ilustración 1.Estructura del 2, 4,6 Trinitrotolueno Fuente: Esteve A,Caballero A, Ramos J. 2001. 1.1.5 Propiedades químicas del TNT El 2, 4,6 TRINITROTOLUENO presenta una estructura aromática tipo bencillo distribuida simétricamente con tres grupos nitro, la electronegatividad de estos grupos ejerce una atracción sobre los electrones beta del anillo aromático, confiriendo a este cierto carácter electrófilo. Este referente será fundamental para el metabolismo microbiano. 24 El grupo nitro está conformado por dos elementos diferentes, estos dos muy electronegativos los cuales compiten por los electrones disponibles, debido a que la electronegatividad del oxígeno es mayor que la del nitrógeno se origina una polarización del enlace entre estos dos elementos. La carga positiva sobre el átomo de nitrógeno, combinada con la electronegatividad del elemento hace que el grupo nitro sea fácilmente reducible. En la molécula de TNT la velocidad con la que se reduce el primer grupo nitro es mucho mayor que los restantes, esto se debe a que la conversión de grupo nitro a grupo amino disminuya la deficiencia electrónica del anillo, haciendo más difícil la reducción del el otro grupo nitro. 1.1.6 Biorremediación de explosivos. La biorremediación comprende cualquier proceso que utilice microorganismos para retornar a su estado natural un recurso alterado por contaminación. Esta técnica de remediación consiste en que los microorganismos transforman un contaminante en compuestos menos tóxicos o inicuos, eliminado o removiendo de manera eficiente y controlada el contaminante presente en el suelo, agua o aire sin transferirlo de un ambiente a otro (Kulkarni y Chaudhari, 2007; Bar et al., 2006). Este proceso se favorece debido a que los microorganismos son ubicuos y poseen una amplia versatilidad metabólica para degradar y utilizar diferentes compuestos como fuente de carbono y energía para su crecimiento. Las actividades microbianas en el proceso de biorremediación se pueden resumir en el siguiente esquema: 25 Ilustración 2. Biorremediación de contaminantes. Para que pueda ocurrir la biorremediación del explosivo (TNT), se debe tener en cuenta que la biodegradación es parte fundamental en ello, por eso el metabolismo en cada una de las bacterias va estar sujeto a diferentes variables, según sus requerimientos. Los microorganismos muestran una impresionante variedad de procesos metabólicos, para ello se puede establecer dos grandes categorías, aquellos que la fuente de energía es un compuesto químico y aquellas que la fuente de energía es la luz, como lo podemos ver en el siguiente gráfico. Ilustración 3. Metabolismo microbiano TODOS LOS MICROORGANISMOS Quimiótrofos (Compuestos químicos como fuente primaria de energía) Quimiólitotrofos (Compuestos Fotótrofos (Luz como fuente principal de energía) Quimioorganotrofos (Compuestos orgánicos) inorgánicos) 26 Fuente: Brock, Biología de los microorganismos Los explosivos como el 2-4-6 TRINITROTOLUENO, contienen compuestos nitrogenados, que requieren para su degradación microorganismos quimiótrofos, específicamente las llamadas bacterias nitrificantes. Estas bacterias oxidan el amoniaco y el nitrito (compuestos nitrogenados más comunes como donadores de electrones), y lo transforman en nitrato, la oxidación completa del compuesto implica la pérdida de ocho (8) electrones y se realiza por dos grupos de consorcios actuando secuencialmente. La nitrificación del amoniaco es el resultado de la acción secuencial de dos grupos separados de organismos; las bacterias oxidantes de amoniaco, que producen acido nitroso es decir nitritos y las bacterias oxidantes de nitrito que son las verdaderas bacterias nitrificantes; estas bacterias a su vez trabajan de la mano de enzimas para que ocurra la oxidación y dirigir la síntesis del ATP energía 7 .Hasta ahora no se conoce la primera bacteria nitrificante que realice por si sola la oxidación completa de amoniaco a nitrato. Las bacterias nitrificantes están ampliamente distribuidas en el suelo y en el agua, estas se encuentran en gran cantidad en hábitats donde abunda el amoniaco, tales como lagos y corrientes de agua que reciben aportes de agua residual no tratada.8 En diferentes investigaciones, se han encontrado diversos microorganismos en suelos contaminados por explosivos, donde utilizan el TNT en este caso, como sustrato respiratorio y como fuente de energía, ya que este explosivo resulta ser una buena fuente de nitrógeno que las bacterias pueden utilizar, sin embargo la biodegradación de este compuesto resulta ser diferente a otros compuestos tóxicos, por la complejidad de la estructura y la localización del grupo amonio y nitrito. Para ello se han aislados microorganismos de muestras de suelos específicos, con el fin de proporcionar la información requerida para encontrar o establecer 7 MANDIGAN Michel T., MARTINKO Jhon M., PARQUER Jack Brock,:Biología de los microorganismos; Prentice Hall, octava edición 2001. 8 Ibíd 7 pág. 502 27 rutas metabólicas que sigan el patrón de degradación, estos estudios se han realizado en EE.UU y España9 1.1.7 Metabolismo microbiológico de la degradación del TNT10 Las rutas metabólicas para reducir este compuesto, consisten en una degradación donde los microorganismos pueden romper la molécula y reducirla. El 2,4,6-trinitrotolueno, consta de un anillo de benceno, un grupo metilo, y tres grupos nitro); Cuando se produce mediante la reducción de la degradación de estos grupos nitro en un forma gradual, se va dejando el anillo aromático de manera cada vez más reducido. La degradación de estos intermediarios, son Am-DNT (Dinitrotolueno), 2,4-DA-6-NT (Di-amino 6, nitrotolueno), 2-6-DA-4-NT(Di-amino,4 nitrotolueno), 2,4-DNT(Dinitrotolueno), 4-A-2-NT(Amino,2 nitrotolueno), 2-A-4 – NT(Amino ,4 nitrotolueno), y 2,4DAT(Di-amino-tolueno. Sin embargo se ha demostrado (ejurnal.vudat.msu.edu, Robert Weise) que muchos de los microorganismos que trabajan en esta degradación no necesariamente pasan por todas las sustancias intermedias peligrosas, dependiente tanto la bacteria como las condiciones anaerobias y aerobias del medio. Las especies de bacterias encontradas en la degradación del TNT son: 9 Enterobacter cloacae Pseudomonas putida11 Clostridium sp. SCHEIBNER et al., 1997; Boopathy, 1994; Funk et al., 1996. 10 Bases Genéticas y Bioquímicas . ESTEVE NUÑEZ, Abraham , DUQUE MARTIN DE Oliva, Estrella pseudomona putida y su empleo en la eliminación biológica de TNT. 11 28 1.1.7.1 Metabolismo con Enterobacter cloacae sp. La Bacteria Enterobacter cloacae, del genero Escherichia, hace parte de los bacilos facultativos Gram negativos, estos se caracterizan por ser aerobios facultativos, con requerimientos nutritivos muy sencillos ya que pueden crecer a partir de una gran variedad de fuentes de carbono y energía. En investigaciones realizadas (SCHEIBNER et al., 1997; Boopathy, 1994; Funk et al., 1996), esta cepa fue aislada directamente de focos contaminados con TNT, para confirmar la capacidad de utilizar el nitrato de esteres (base para la fabricación del TNT) como única fuente de energía para el crecimiento. 1.1.7.2 Metabolismo con Pseudomonas sp. Las pseudomonas son bacilos rectos o ligeramente curvados; GRAM negativos, que utilizan los compuestos orgánicos como fuente de energía (quimioorganotrofo) y a su vez utilizan el H2 y CO, como únicos donadores de electrones; algunos usan nitrato como aceptor de electrones anaeróbicamente (Brock, Biología de los microorganismos Cap. 16). Las pseudomonas tienen requerimientos nutritivos muy sencillos, crecen a pH neutro y temperaturas en la zona mesófila, una de las propiedades más importante de este grupo es la gran variedad de compuestos orgánicos que usan como fuente de carbono y como donadores de electrones para la producción de energía, en el caso particular de de la degradación de TNT, las pseudomonas utilizan el mismo explosivo como fuente de carbono. 1.1.8 Formación del complejo Meisenheimer. La formación del complejo Meisenheimer consiste en una sustitución nucleofílica al anillo aromático de TNT, debido a la alta densidad de electrones que presenta el benceno, los tres grupos nitro presentes en el TNT, son los atrayentes de electrones haciendo que los electrones del anillo sean atacados reductivamente. 29 Estos compuestos presentan una intensa coloración rojo- anaranjada en solución y una carga negativa deslocalizada sobre el anillo y los grupos nitro. Ilustración 4. Formación del complejo Meisenheimer. Fuente: Esteve A,Caballero A, Ramos J. 2001. 1.1.9 Medio de cultivo. Para conocer mejor las características de los microorganismos es necesario estudiarlas en un medio puro. Un cultivo puro es aquel formado por células que provienen un solo microorganismo perteneciente a la misma especie y cepa. Por eso es de gran importancia evitar la contaminación en los medios de cultivo, para esto se debe cultivar con la cantidad de nutrientes y los medios necesarios12. Las condiciones adecuadas en que se debe preparar un medio de cultivo son la disponibilidad de nutrientes apropiados, consistencia del medio, presencia o ausencia de oxigeno y otros gases, condiciones adecuadas de humedad, luz ambiental, pH, temperatura y esterilidad del medio. La solución acuosa con los nutrientes necesarios se llama medio de cultivo. Un medio de cultivo requiere de una fuente de carbono, nitrógeno y otros nutrientes. La célula requiere de dos tipos de nutrientes: macro y micronutrientes. El carbono es muy importante porque a partir de éste la célula fabrica material celular. El siguiente elemento más abundante es el nitrógeno 12 Op. Cit. 230.Biología de los microorganismos 1999. 30 ya que forma parte de proteínas, ácidos nucléicos y otros constituyentes celulares. Algunos otros macronutrientes son el fósforo, el azúfre, el potasio, magnesio, calcio, sodio y hierro. Entre los micronutrientes se encuentran metales que forman parte de enzimas, trazas,sales etc. Los factores de crecimiento incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. En el medio de cultivo se emplea un elemento solidificante, el agar se licua con agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40°C 1.1.10 Características de la colonia. Tras un periodo de incubación a una temperatura apropiada en el medio de cultivo solido donde previamente se ha realizado la siembra, se espera es que aparezcan unas pequeñas masas visibles a simple vista que han sido formadas por el crecimiento de una célula bacteriana. La multiplicación de esa bacteria en el medio de cultivo sólido es conocida como colonias.13 Estas colonias presentan morfología propia de las bacterias que esta constituida por una serie de características fundamentales entre las que se encuentra: el tamaño, forma, estructura y tipo o modo de agrupación. Tamaño: Característica de cada tipo bacteriano, se observa muchas veces con mayor exactitud a través del microscopio, por las dimensiones microscópicas de las bacterias. Forma: Puede presentarse formas: esféricas, cocoides, cilíndricas o bacilares, de espirales o helicoidales, formas coco bacilares, de coma, etc. Agrupación: Se pueden agrupar macroscópicamente y microscópicamente, la primera puede visualizarse a simple vista estas corresponden al crecimiento en un punto medio de la colonia en el medio de cultivo, puede visualizarse a simple vista, estas presentaran características distintas para cada tipo bacteriano. Por otra parte las segundas son visualizables por microscopia pudiendo observar los distintos tipos bacterianos que se asocian entre sí formando pequeños grupos de 2 o más bacterias, por 13 GRANADOR PEREZ Raquel, Villaverde María del Carmen: Bacteriología, características y clasificación bacteriana. Microbiología tomo 1, pág.249-261. 31 ejemplo: tétradas, diplococos, racimos, cadenas, etc. Las anteriores también conforman parte de la morfología de una colonia. Es importante considerar las diferentes formas, tamaños y aspectos de las colonias ya que esto puede servir como: Un dato para identificar el tipo de colonia y poderla clasificar taxonómicamente. Medida de control apara una siembra correcta. Lo ideal es que las colonias estén separadas y que el medio no presente contaminación. Estas características son diferentes para cada uno de los tipos bacterianos, aunque algunas especies presenten otras características de las ya mencionadas. Tamaño de las colonias: El tamaño de la colonia se considera un factor importante que suele ser uniforme para cada género y especies bacterianos. El tamaño de las colonias puede variar y ser clasificado en: Tamaño pequeño, de 1-2 mm de diámetro. Tamaño grande, de 4 -6 mm de diámetro. Extendidas en forma de velo invadiendo todo el medio de cultivo (tamaño muy grande). Puntiformes con aproximadamente 0.5 mm de diámetro o inferiores. Forma de las colonias: La forma de la colonia depende de su espesor y borde, en la primera cuando el espesor es mucho mayor en el centro disminuye uniformemente hacia el borde se dice que la colonia es elevada, también pueden haber planas, semiconvexas, cóncavas, semiconcavas, semiesféricas, en meseta, etc. El borde puede ser liso o irregular y aserrado en mayor o menor grado. (Wolin, et al. 1973) 32 Superficie de la colonia: Corresponde al aspecto de la colonia y se divide en: lisa, rugosa, plana, acuminada, umbilicada, seca, etc. Consistencia de la colonia: las colonias pueden ser duras, viscosas, mucosas, secas, muy secas, cremosas, etc. Por ejemplo las colonias mucosas son típicas en levaduras y menos frecuentes en bacterias. Estas características de las colonias son un criterio importante para su posterior aislamiento tanto en medio sólido como en medio líquido.14 1.1.11 Agua residual sintética. El agua residual sintética es una composición de compuestos orgánicos e inorgánicos basada en aguas residuales, esta es utilizada en estudios de pequeña escala ya que muchas veces se hace difícil trabajar con aguas residuales industriales o domesticas, ya sea por el tipo de tratamiento o el contaminante. Este tipo de agua tiene la ventaja de ser plenamente controlada tanto en composiciones como en concentraciones, de forma que se evita todos los problemas inherentes al agua residual real tanto por su composición y estado, adaptándose el efluente al requerimiento marcado por la experimentación.15 1.1.12 Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC) La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija y líquida para separar los compuestos que se encuentran disueltos en solución. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de 14 Ibíd 13. Pág.251- 252 Torres Lozada Patricia, Foresti Eugenio, Vazoller Rosana F Composición y uso de agua residual doméstica en reactores a escala de laboratorio Univalle.Fac.Ing. Pág, 2. 15 33 fase fija va disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual genera la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. 16 Los instrumentos del HPLC consisten en un depósito de la fase móvil, una bomba, un inyector, una columna de separación, y un detector. Los compuestos están separados por la inyección de la mezcla de la muestra en la columna. Los diferentes componentes de la mezcla pasa a través de la columna a diferentes velocidades debido a diferencias en su comportamiento de partición entre la fase líquida móvil y la fase estacionaria. El método EPA 8330B para Nitroaromáticos, nitraminas, y ésteres de nitrato es aplicable para análisis de trazas de explosivos y residuos de carburante por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un doble longitud de onda ultravioleta (UV) en un detector de agua, suelo, o de la matriz de sedimentos. 17 16 www.quiminet.com . Cromatografía liquida. Consultado Ene 10 de 2010 Método 8330 A para nitroaromáticos y nitraminas, HPLC planteado por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) del año 2007. 17 34 1.2 MARCO LEGAL. La Legislación Ambiental Colombiana hace referencia al conjunto de normatividad que definen objetivos principios, criterios y orientaciones generales para la protección del Ambiente de nuestro país. En Colombia la normatividad ambiental se ha fortalecido en las tres últimas décadas, en especial desde la llamada Constitución ecológica y la Ley 99 de 1993, donde se estableció la organización y principios para propender por el buen manejo y uso de nuestros Recursos Naturales. Para la ejecución de este proyecto se contempla la siguiente legislación. Tabla 2.Legislación ambiental aplicable para investigación. NORMA Constitución Política de Colombia. Ley 99 de 1993 Ley 61 de1993 Decreto 2811 de 1974 Ley 525 de1999 Ley 540 de 1999 Ley 554 de 2000 CORRESPONDE A Art. 7, 79, 80. Art. 83, 84 sanciones y medidas de policía ART 85 sanciones y medidas de policía. por lo cual se reviste al presidente al presidente de la república de facultades extraordinarias sobre armas municiones y explosivos y para reglamentar la vigilancia y seguridad privada Por el cual se expide el Código Nacional de los Recursos Renovables y de Protección del Medio Ambiente Por medio de la cual se aprueba la "Convención sobre la prohibición del desarrollo, la producción, el almacenamiento y el empleo de armas químicas y sobre su destrucción" hecha en París el trece (13) de enero de mil novecientos noventa y tres (1993). Por medio de la cual se aprueba la "Convención Interamericana contra la fabricación y el tráfico ilícito de armas de fuego, municiones, explosivos y otros materiales relacionados". Por medio de la cual se aprueba la "Convención sobre la prohibición del empleo, almacenamiento, producción y transferencia de minas antipersonal y sobre su destrucción", hecha el dieciocho (18) de septiembre de mil 35 Ley 670 de 2001 Ley 737 de 2002 Decreto 2003 de 1982 Decreto 695 de 1983 Decreto 1594 de 1.984 Decreto1335 de 1987 Decreto 2535 de 1993 Decreto 334 de 2002 Decreto 1609 de 2002 novecientos noventa y siete (1997). Por medio de la cual se desarrolla parcialmente el artículo 44 de la Constitución Política para garantizar la vida, la integridad física y la recreación del niño expuesto al riesgo por el manejo de artículos pirotécnicos o explosivos. del 5 de Marzo Diario Oficial No 44.734, de 9 de marzo de 2002 por medio de la cual se aprueba la "Convención Interamericana contra la fabricación y el tráfico ilícitos de armas de fuego, municiones, explosivos y otros materiales relacionados". Por el cual se modifica parcialmente el Decreto No. 1663 del 06 de Julio de 1979. Modifica el Estatuto Nacional para el control comercio armas, municiones y explosivos. Por el cual se determina el material de Guerra o reservado de las fuerzas militares y la Policía Nacional. Clasifica sistemas de armas, armamento mayor y menor de todos los tipos, modelos o calibres usado por las Fuerzas militares y la Policía Nacional. Este decreto reglamenta el uso del agua y los residuos líquidos a nivel nacional. En este decreto se establecen los parámetros y las concentraciones máximas admisibles, que pueden estar presentes en un residuo líquido según el uso que se quiera dar a este. Reglamento de seguridad en las labores subterráneas Regula aspectos relacionados con productos explosivos los cuales son vendidos por Indumil. Por el cual se expiden normas sobre armas, municiones y explosivos. En este decreto se fijan normas y requisitos que se deben tener en cuenta para la tenencia y el porte de armas, municiones, explosivos y sus accesorios. Además establece algunas condiciones para la importación y exportación de armas, municiones y explosivos. Por el cual se establecen normas en materia de explosivos. Mecanismos de control relacionados con la producción, importación, comercialización, distribución, venta directa, almacenamiento de explosivos. Por el cual se reglamenta el manejo y transporte terrestre de mercancías peligrosas por carretera. Tiene por objeto establecer los 36 Decreto 4741 de 2005 Resolución número 02400 Mayo 22 de1979 Resolución 081 de 2002 requisitos técnicos y de seguridad para el manejo y transporte de mercancías peligrosas por carretera en vehículos automotores en todo el territorio nacional. Por el cual se reglamenta parcialmente la prevención y el manejo de los residuos peligrosos en el marco de la gestión integral. Disposiciones sobre vivienda, higiene y seguridad industrial en establecimientos de trabajo. En esta resolución se establecen algunas consideraciones relacionadas con la manipulación, transporte y almacenamiento de explosivos. Por la cual se clasifican como explosivos para todos los efectos legales, las materias primas o insumos que sin ser explosivos individualmente, en conjunto conforman una sustancia explosiva Fuente. Adaptado por las autoras, 2010. 37 2. MATERIALES Y MÉTODOS Para realizar esta investigación se tomaron doce muestras de diferentes ambientes donde la presencia del explosivo es relevante en cuanto a tiempo de exposición y fabricación del producto. Las muestras se obtuvieron de suelo, lodos y agua, tomando parámetros físicos en términos de pH y conductividad, para determinar en que condiciones se encontraban las muestras y de este modo adaptarlas a los medios de aumentación microbiana. Se realizo un pre-enriquecimiento en medio mineral líquido con una concentración de 50 mg/l de TNT, durante 45 días, con el fin de aumentar la población bacteriana en las muestras tomadas. Para determinar donde se presenta más población y diversidad bacteriana se utilizaron tres tipos de tratamientos: explosivo como única fuente, explosivo más fuente de Carbono y explosivo más fuente de Nitrógeno. Los pre-enriquecimientos fueron sembrados en medio mineral sólido por triplicado, mediante diluciones seriadas base 10; el cultivo se incubó a 26 ºC durante 20 días, realizando monitoreo diario. Las colonias obtenidas en cada uno de los tratamientos, fueron repicadas en medio mineral liquido con fuente de carbono y en medio mineral sólido con las fuentes de nitrógeno, carbono y solo explosivo, aumentando la concentración de explosivo de 50 mg/L a 100 mg/L, y usando como criterio la diversidad morfotípica en cuanto a su color, borde, tamaño y forma (selección de las colonias). A los aislamientos bacterianos obtenidos bajo esta nueva condición, se les determinó su capacidad de degradación del explosivo TNT, mediante monitoreo por HPLC Cromatografía Liquida de Alta Eficacia aplicando el método de la EPA 8330B para la extracción y filtración. Con el área de cada curva obtenida durante la corrida se estableció el límite mínimo de TNT que registra el equipo, con esta información se establecieron los cinco aislamientos bacterianos que presentaron mayor degradación. 38 Finalmente se realizó un bioensayo con agua residual sintética a la cual se le agrego explosivo TNT; los cinco aislamientos bacterianos fueron inoculados en esta agua y se realizaron mediciones a través del tiempo (cuatro días), tomando un blanco de referencia (tiempo cero) para establecer la concentración inicial del explosivo; posteriormente se realizó una medición diaria para determinar la degradación de este a través del tiempo; estos ensayos se hicieron por triplicado. Se llevo a cabo un total de 78 análisis en HPLC para el caso de la selección de las cinco cepas con mayor capacidad degradadora y se realizaron un total de 45 análisis de HPLC durante el periodo de experimentación de bioensayo con el agua residual sintética. Las etapas desarrolladas para ejecutar la investigación se describen a continuación en el diseño metodológico. 2.1 DISEÑO METODOLOGICO. Para la realización del proyecto de grado es de importancia resaltar que se hizo bajo un contrato de confidencialidad con la parte interesada donde no se podía mencionar, el nombre de la entidad financiadora y la ubicación geográfica de donde se obtuvieron la muestras con las que se desarrollo la investigación. 2.1.1 Toma de muestras. Para la realización de este proyecto se trabajó con doce muestras extraídas de diferentes puntos de muestreo (agua, suelo y lodo) los cuales presentaban exposición directa al explosivo ya sea por el proceso de fabricación o el tiempo de exposición a este. Primero se limpió el terreno superficial sobre los puntos de muestreo y se procedió a introducir un barreno recto para tomar una muestra de suelo. 39 Ilustración 5. Toma de muestras Ilustración 6. Muestras obtenidas de los doce puntos de muestreo. La siguiente tabla menciona los puntos de la toma de muestras. Tabla 3. Puntos de toma de muestras. MUESTRA PUNTO DE MUESTREO 1 Exterior, frente a la planta de cristalización. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Canal exterior. Trampa taller multiplicador. Canal trampa producción. Caneca residuos de lavado. Tanque de transporte. Tanque exterior caja de captación Tanque concentración de tenso activo Campo de prueba Lodos de la PTAR Fitorremediación Caño PTAR Fuente: las autoras 40 2.1.2 Análisis preliminares del suelo. Inicialmente se le realizó un análisis a las doce muestras recolectadas. Estas muestras se analizaron de acuerdo a los parámetros establecidos por la EPA en los métodos 9050 A y 9045 C del año 2000. Tabla 4. Método de medición de parámetros fisicoquímicos Ensayo pH Conductividad Norma /especificación ICE -131/203-092 Método valido base de referencia EPA 9045C Potenciometría Equipo utilizado potenciómetro Fisher Accumet® pH-meter model 600 ICE -131/203-096 Método valido base de referencia EPA 9050ª Producto al que se le aplica Suelos, lodos. Suelos, lodos Fuente.www.cesmec.cl 2.1.3 Medición de conductividad y pH de las muestras. Estas mediciones se realizaron con el fin de establecer las condiciones fisicoquímicas iniciales de las muestras obtenidas, para de esta manera estandarizar estas condiciones a los medios de cultivo. Para desarrollar este análisis se pesan 20 g de muestra de suelo, se le adicionan 20 ml de agua destilada y se agita a 200 rpm durante 5 minutos. Luego la muestra se deja en suspensión por una hora. Para la medición de conductividad se utilizo una celda conductimétrica que consta de dos electrodos del mismo tipo. Finalmente se inserta el electrodo en el sobrenadante acuoso y se reporta el resultado de pH y conductividad. 41 Los resultados de conductividad y pH para las doce muestras se muestran en la siguiente tabla: Tabla 5. Valores de pH y conductividad de las muestras MUESTRA PUNTO DE MUESTREO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Exterior, frente a la planta de cristalización. Canal exterior. Trampa taller multiplicador. Canal trampa producción. Caneca residuos de lavado. Tanque de transporte. Tanque exterior caja de captación Tanque concentración de tenso activo Campo de prueba Lodos de la PTAR Fitorremediación Caño PTAR CONDUCTIVIDAD (g/l) 0.34 0.22 0.17 1.15 1.47 0.70 0.44 14.96 0.63 1.57 0.47 0.44 pH 7.11 7.34 6.58 3.68 2.11 7.10 7.54 9.20 6.72 8.73 7.42 8.95 Fuente: Pontificia Universidad Javeriana. Sonia Villegas 2009. La tabla 5 muestra los valores de conductividad los cuales presentan uniformidad a diferencia del punto 8, donde hay una concentración de sales iónicas por tenso activos haciendo que los valores de conductividad se eleven. Así mismo se evidencia un rango de valores de pH entre 2.11 y 9.20, lo que indica que las muestras proviene de diferentes ambientes, por lo tanto se hace necesario estandarizar el pH con una solución buffer en los medios utilizados para el pre- enriquecimiento, siembra y replica. 42 2.1.4 Pre-enriquecimiento de las muestras A partir de las muestras tomadas en los doce puntos de muestreo, se realizó el pre enriquecimiento el cual consiste en adicionar dichas muestras en un medio mineral líquido para aumentar la población microbiana existente en las muestras dicho medio contiene las condiciones necesarias para el crecimiento de las bacterias a aislar teniendo en cuenta reportes hechos por diferentes investigaciones donde se mencionan los componentes necesarios de macronutrientes y micronutrientes, condiciones ambientales, concentración del explosivo y tiempo de crecimiento de las bacterias en los medios de cultivo. Con base a lo anterior se obtuvieron componentes y concentraciones para la elaboración del medio mineral tanto líquido como sólido. Tabla 6. Composición de medio nutritivo. Sustancias Sales Buffer Vitaminas Trazas Tipo y Cantidad Concentración HCl (3 ml) NaCl (12.5 g) MgSO4 – 7H2O (5 g) CaCl2 2H2O (1g) K2HPO4 (17,5 g) K2H2PO4 (7,5 g) Clorhidrato de piridoxina (0,05 g) Ácido p-aminobenzoico (0,025 g) Ácido nicotínico (0,025g) Pantotenato de calico (0,025 g) Riboflavina (0,025 g) Vitamina B12 (0,025 g) Tiamina-HCl (0,025 g) Biotina (0,01 g) Ácido fólico (0,01 g) α-lipoico (0,01 g) HCl (20 ml) MnSO4 H2O (0,2 g) H3BO3 (0,1g) ZnSO4 7H2O (0,1 g) 1M 8,5 mM 0,81 mM 0,27 mM 4,02 mM 2,2 mM 43 18 -19% CaSO4 5H2O (0,05 g) CoCl2 H2O (0,05 g) CuSO4 5H2O ( 0,01 g) Na2MoO4 2H2O (0,01 g) NiSO4 6H2O Explosivo TNT (2,5 ml) HCl (3 ml) FeSO4 7H2O ( 0,3 g) Hierro 1M 10, 8 µM Fuente: las autoras Las cantidades para la elaboración del medio se mencionan en la tabla 7. Tabla 7. Cantidades para la elaboración del medio. Preparación del medio mineral para 1L de medio Solución de Buffer 10 ml Solución de Sales 10 ml Fuente de carbono 10 ml Fuente de nitrógeno 10 ml Después del Autoclave se adicionará Solución de Hierro 1 ml Elementos de trazas 1 ml Solución de vitaminas 1 ml Solución de explosivo 2,5 ml Fuente: las autoras Del medio mineral se toma 45 mL y se lleva a frascos tapas azul debidamente marcadas según la procedencia del punto de muestreo, al cual se le agrega 5gr/mL de la muestra (agua, suelo, lodo). Este procedimiento se hace con tres tipos de tratamientos: explosivo como única fuente de energía, explosivo más fuente de carbono y explosivo mas fuente de nitrógeno. Los componentes de cada fuente de energía se muestran a continuación en la tabla 8. 44 Tabla 8. Composición fuentes de energía. FUENTE DE ENERGIA COMPOSICIÓN Y CANTIDAD Fuente de Carbono Glucosa Citrato Glicerol Acetato 2,5 g Fuente de Nitrógeno 2,5 g NH4NO3 2 ml 2,5 g 1g Fuente: Las autoras A continuación se menciona la composición de cada uno de los tres tratamientos. T1: Medio de cultivo mineral liquido (MML)+ Fuente de Nitrógeno (FN)+ Explosivo (EXP). (MML+FN+EXP). T2: Medio de cultivo mineral liquido (MML) + Fuente de Carbono (FC) + Explosivo (EXP). (MML+FC+EXP). T3: Medio de cultivo mineral liquido (MML) + Explosivo. (EXP) (MML+EXP). Se realizaron dos pre-enriquecimientos, el primero para las muestras de uno a seis, y el segundo para las muestras siete a la doce con un tiempo diferencia de 45 días18 estos dos pre-enriquecimientos se mantuvieron a temperatura ambiente, con una agitación de 120 rpm, como se muestra en la siguiente ilustración: Ilustración 7.Frascos de pre-enriquecimiento 18 El pre-enriquecimiento fue necesario hacerlo en dos partes, por las grandes cantidades de material que se requerían. 45 2.1.5 Aislamiento de cepas. Luego de los cuarenta y cinco días de pre- enriquecimiento donde se bioaumento la población bacteriana, fue necesario hacer diluciones seriadas base 10, ya que se parte del supuesto que estas presentan un alto grado de diversidad y cantidad de heterótrofos totales, por lo tanto se hicieron diluciones de 10-2 a 10-7, en solución salina (0.86%); para esto se tomo de cada uno de los pre enriquecimientos una cantidad de 0.5 mL y se agregó en los tubos de ensayo que contenían 10 mL de solución salina. Las tres diluciones más altas fueron sembradas en medio mineral solido, en los tratamientos mencionados anteriormente: explosivo como única fuente, explosivo más fuente de Carbono y explosivo mas fuente de Nitrógeno, partiendo de una concentración inicial del explosivo TNT de 50mg/L. Cada siembra se realizo por triplicado, en condiciones asépticas y fueron incubadas a 21 ºC durante 20 días. Después de un monitoreo continuo se evidencio presentaban un crecimiento lento y una diversidad que las bacterias en morfología, a continuación se muestran dos ilustraciones donde se evidencia algunas de las bacterias encontradas, en los diferentes tratamientos. 46 Ilustración 9. Población bacteriana caja de petri con T1. Fuente: las autoras Ilustración 8. Población bacteriana caja de petri con T2. Fuente: las autoras 2.1.6 Criterio de selección de colonias. Para la selección de las bacterias se tomaron como criterios de los morfotipos (color, forma, tamaño, borde, textura). Las bacterias seleccionadas se sembraron en cajas de petri divididas con cuadriculas de igual de igual tamaño 1.5 X 1.5 mm para así colocar cada aislamiento esta siembra se realizo mediante capilares de vidrio sellados, limados y esterilizados. Simultáneamente, las bacterias aisladas fueron inoculadas en medio mineral liquido con fuente de carbono y 100 ppm de TNT con el fin de inhibir el crecimiento de las colonias que tengan menor capacidad degradadora. Los aislamientos fueron incubados a 21°C durante 20 días. Los aislamientos bacterianos obtenidos fueron en total setenta y ocho. A continuación se presenta la tabla 9 donde se describe la morfología bacteriana, la nomenclatura y el origen. 47 Tabla 9. Morfotipos 78 aislamientos seleccionados en la replica. MUESTRA TRATAMIENTO AISLAMIENTO COLOR TEXTURA TAMAÑO ELEVACIÓN FORMA BORDE T2 + 10- 6 T1 Amarillo Cremosa Pequeño Convexa Irregular Ondulado T2 + 10- 6 T2 Transparente cremosa Grande Convexa Irregular Irregular T2 + 10- 7 T3 Amarilla viscosa grande Convexa Circular Redondo 7 T4 Transparente viscosa pequeño Plana Circular Ovalado 7 T5 Lechosa blanca mucosa grande Convexa Circular Redondo -7 T6 cremosa grande Plana Papilada Irregular -7 T7 Amarillo viscosa pequeño Fusiforme Irregular -7 T8 Amarillo transparentoso Mucosa Pequeño Plano convexa Plana Irregular Irregular -7 T9 Blanca Mucosa Pequeño Plana Fusiforme Alargado -7 T10 Transparente viscosa Pequeño Convexa Circular Lobulado -7 T11 Blanca centro amarillo Mucosa Pequeño Plana Circular Ondulado -7 T12 Tranparente viscosa grande Papilada Ondulado -7 T13 Transparente viscosa Pequeño Plano convexa Convexa Circular Redondo -7 T14 Naranja dura grande Convexa Circular Redondo T2 + 10- 5 T15 Amarilla oscuro cremosa grande Plana Circular Redondo T3 + 10- 6 T16 Blanca con centro amarillo cremosa Pequeño Convexa Rizoide Rizoide -5 T17 Transparente Dura grande Plana Circular Redondo T2 + 10T1 + 10T1 + 10 T2 + 10 T1 + 10 T2 + 10 N°1 T2 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T3 + 10 Trasparente con centro amarillo 48 -6 T23 Amarilla cremosa Pequeño Convexa Circular Redondo -6 T24 Blanca viscosa grande Convexa Circular Redondo -6 T25 Blanca Dura Pequeño Plana Rizoide Irregular T1 + 10 T1 + 10 T1 + 10 N°2 6 T26 Amarilla cremosa Pequeño Plana Circular Redondo -6 T27 Rosado claro cremosa Pequeño Plana Circular Redondo -6 T28 Rosado intenso cremosa Pequeño Convexa Circular Redondo T2 + 10- 6 T29 Amarillo claro Dura Pequeño Plana Irregular Ondulado T2 + 10- 6 T30 Rosado claro Dura Mediano Plana Circular Redondo T2 + 10- 6 T31 Transparente centro amarillo cremosa Mediano Convexa Circular Redondo -6 T45 cremosa Pequeño Convexa Circular Redondo -6 T46 Transparente Mucosa Pequeño Convexa Irregular Ondulado 4 T47 Transparente Mucosa Pequeño Convexa Circular Redondo -6 T48 Transparente Mucosa Mediano Plana Circular Redondo -4 T49 Transparente cremosa Pequeño Plana Rizoide Irregular -6 T50 Transparente cremosa Pequeño Plana Rizoide Irregular 6 T51 Blanca cremosa Pequeño Convexa Circular Redondo -5 T52 Amarillo quemado Dura Mediano Plana Circular Redondo -5 T53 Blanca centro amarillo Cremosa Mediano Plana Circular Irregular -4 T54 Amarilla Cremosa Grande Plana Circular Redondo -5 T55 Amarilla Dura Grande Plana Circular Redondo -5 T67 Amarilla centro quemado amarillo Dura Pequeño Convexa Irregular Ondulado -6 T68 Transparente Mucosa Pequeño Plana Irregular Ondulado -4 T69 Transparente Cremosa Mediano Plana Circular Redondo -4 T70 Transparente Mucosa Pequeño Acuminada Circular Redondo T1 + 10T1 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T1 + 10 T2 + 10T1 + 10 T2 + 10 N°3 T3 + 10 T3 + 10T1 + 10 T1 + 10 T2 + 10 T1 + 10 T1 + 10 N°4 T1 + 10 T2 + 10 T2 + 10 Amarilla 49 -4 T71 Blanca centro amarillo Cremosa Mediano Plana Rizoide Filamentoso -5 T72 Transparente Cremosa Pequeño Acuminada Circular Redondo -6 T73 Amarilla Mucosa Pequeño Papilada Circular Redondo -6 T74 Blanca Mucosa Mediano Acuminada Circular Redondo -6 T75 Naranja Cremosa Pequeño Convexa Irregular ondulado -5 T76 Transparente Mucosa Mediano Convexa Filamentoso Filamentoso -6 T2 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T1 + 10 T3 + 10 T77 Transparente Mucosa Mediano Papilada Irregular Filamentoso -4 T89 Rosada Dura Pequeño Plana Circular Irregular -5 T90 Rosada Cremosa Pequeño Plana Circular Redondo -6 T91 Naranja Mucosa Pequeño Convexa Circular Redondo -6 T109 Naranja con centro amarillo Viscosa Pequeña Convexa Irregular Ondulado -6 T110 Amarilla Mucosa Pequeño Plana Circular redondo -6 T111 Café Dura Pequeño Plana Irregular Ondulado -4 T112 Blanca Mucosa Mediano Papilada Circular redondo -6 T113 Transparente con centro blanco Cremosa Grande Papilada Circular redondo -6 T114 Blanca Cremosa Mediano Papilada Irregular Ondulado -6 T115 Amarilla Cremosa Pequeño Umbilicada Irregular Ondulado -2 T1B Blanca Cremosa Pequeño Convexa Circular redondo -6 T2B Transparente Cremosa Pequeño Convexa Irregular Ondulado -6 T3B Rosada Cremosa Grande Papilada Circular redondo -5 T4B Blanco en el centro un circulo amarillo Cremosa Grande Papilada Circular redondo -6 T23B Café Cremosa Pequeño Convexa Circular redondo -6 T24B Café borde transparente Mucosa Grande Convexa Irregular Ondulado -6 T25 B Rosada Cremosa Pequeño Convexa Circular redondo T2+ 10 N°5 T1 + 10 T2 + 10 T1 + 10 T1 + 10 T1 + 10 N°6 T2 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T1 + 10 T1 + 10 T1 + 10 T1 + 10 N° 7 T1 + 10 T2 + 10 T1 + 10 50 -6 T26 B Transparente Mucosa Pequeño Plana Circular redondo -4 T27B Café Dura Pequeño Plana Circular redondo -4 T28B Café Mucosa Grande Papilada Irregular Ondulado -4 T29B Amarillo quemado Cremosa Pequeño Papilada Circular redondo -6 T30B Café Mucosa Pequeño Convexa Circular redondo -6 T45 B Café Dura Pequeño Plana Circular redondo -5 T87B Blanco Dura Mediana Plana Irregular Ondulado -5 T88B Café Dura Mediana Plana Irregular Ondulado -5 T89B Naranja en el centro punto blanco Mucosa Pequeño Papilada Circular redondo -5 T90B Blanca Cremosa Mediano Convexa Circular redondo -5 T91B Transparente Mucosa Grande Convexa Circular redondo -5 T92B Blanco Mucosa Pequeña Convexa Irregular Ondulado -5 T110B T111B Blanca con borde café Café Cremosa Dura Grande Mediana Papilada Convexa Circular Circular redondo redondo T1 + 10 T2 + 10 T2 + 10 N°8 T2 + 10 T2 + 10 T1 + 10 N°9 T2 + 10 T2 + 10 T2 + 10 T1 + 10 N°11 T2 + 10 T2 + 10 N°12 T1 + 10 -5 T1 + 10 Fuente: Las autoras 51 En la tabla anterior se evidencia un mayor crecimiento en la muestra 1 frente a la planta de cristalización, así mismo en las diluciones 10- 5 y 10-6. El tratamiento que presento mayor crecimiento fue tratamiento con fuente de carbono con 54%, seguido el tratamiento con fuente nitrógeno con 40%, por ultimo se puede ver un menor crecimiento en el tratamiento que tenía como única fuente explosivo con un 6%. Como se puede observar en la gráfica 1. Grafica 1. Porcentajes de aislamientos en los tratamientos. Porcentajes de aislamientos en los tratamientos 54% 40% % de aislamientos 6% Explosivo T1 Fuente de carbono +Explosivo T2 Fuente. Las autoras. 52 Fuente de Nitrógeno +Explosivo T3 2.2.3 Selección de los aislamientos bacterianos con mayor capacidad de degradación. Para determinar cuáles de los setenta y ocho aislamientos bacterianos tenían mayor capacidad de degradación del explosivo TNT, fue necesario realizar una extracción y filtración para separar la biomasa (células bacterianas) del sobrenadante (MML+ Explosivo). Este proceso consistió en homogenizar con vortex durante 1 min los aislamientos inoculados en MML; posterior a esto se realizo el lavado de las células en un nuevo tubo de ensayo, se centrifugo a 6000 rpm por veinte minutos, luego se tomaron 650 µl del sobrenadante y se adicionaron 650 µL de acetonitrilo grado HPLC, en un eppendorf, esto se homogenizo en vortex por 1 min. Por otro lado el tubo donde se hizo el lavado de las células se unifico con el contenido del eppendorf ya homogenizado en un frasco de vidrio cerum, este último se pasa por vortex 30 segundos; del volumen unificado se toma 1 mL y es filtrado con filtros membrana 11mm x 0.22µ tipo HPLC, se tomar con una jeringa 0,5 mL de acetonitrilo y se pasa por el filtro, para realizar el lavado de este, depositando el volumen en el mismo vial para un volumen total de 1.5 ml. Por último el sobrenadante filtrado (MML+ Explosivo) se pasa por HPLC para método 8330 A cuantificar la concentración de explosivo. Se siguió el de cromatografía líquida de Alta Eficacia (HPLC) para nitroaromáticos y nitraminas. Se utilizo una columna C-18 fase de fase reversa, 25 cm X4.6 mm (Shimadzu) y un HPLC marca Shimadzu; prominence LC 20AT, equipo que fue prestado por la Unidad de Saneamiento Ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad Javeriana. Las condiciones de cromatografía se ajustaron a las recomendaciones del fabricante, estas fueron: un flujo de 1 ml /min con un volumen de inyección de 20 µl, detector UV a 254 nm. Para la corrida de las muestras se empleo una fase móvil 54:10:34 (Metanol: acetonitrilo: agua tipo1). La tabla 10 muestra los valores de concentración, tiempo de retención y área para el sobrenadante filtrado (MML+ Explosivo) para cada uno de los setenta y ocho aislamientos. Con el área de cada cromatograma que se obtuvo durante la corrida 53 por HPLC, se establecieron las concentraciones más bajas que se registraron de TNT en el equipo; con esta información se seleccionaron las cinco muestras que presentaron mayor degradación por el aislamiento bacteriano contenido en cada uno de ellas. Tabla 10. Lecturas de los 78 aislamientos por HPLC. MUESTRA EXPLOSIVO CONCENTRACIÓN DEL EXPLOSIVO (PPM) 96,56 CONCENTRACIÓN FINAL (PPM) TNT TIEMPO DE RETENCIÓN (MIN) 6,35 PATRON T1A TNT 6,34 1,75 2,62 T2A TNT 6,33 2,38 3,56 T6A TNT 6,34 1,73 2,60 T7A TNT 6,36 1,68 2,52 T8A TNT 6,33 1,69 2,53 T10A TNT 6,36 1,72 2,58 T11A TNT 6,35 1,69 2,53 T12A TNT 6,35 1,68 2,52 T13A TNT 6,33 1,86 2,79 T14A TNT 6,34 1,75 2,63 T15A TNT 0,00 0,00 T16A TNT No peak is detected. 6,32 1,68 2,51 T17A TNT 0,00 0,00 T23A TNT No peak is detected. 6,35 1,98 2,96 T24A TNT 6,33 1,83 2,74 T30A TNT 6,35 1,69 2,54 T45A TNT 6,35 1,70 2,55 T47A TNT 6,35 1,69 2,53 T48A TNT 6,36 1,70 2,55 T49A TNT 6,33 1,71 2,56 T50A TNT 0,00 0,00 T51A TNT No peak is detected. 6,58 1,71 2,56 T52A TNT 6,60 1,80 2,71 T53A TNT 6,73 1,70 2,55 T54A TNT 6,57 1,70 2,55 T70A TNT 6,64 1,72 2,58 54 144,84 T71A TNT 6,54 1,71 2,56 T74A TNT 0,00 0,00 T1B TNT 0,00 0,00 T2B TNT No peak is detected. No peak is detected. 6,71 1,72 2,57 T3B TNT 6,74 1,71 2,56 T4B TNT 6,74 1,70 2,55 T25B TNT 6,75 1,71 2,56 T26B TNT 6,75 1,82 2,73 T0 TNT 6,74 96,27 144,41 T29B TNT 6,75 2,74 4,11 T30B TNT 6,76 1,71 2,57 T45B TNT 6,76 1,71 2,57 T65B TNT 6,45 1,71 2,56 T84B TNT 0,00 0,00 T87B TNT 0,00 0,00 T88B TNT 0,00 0,00 T90B TNT 0,00 0,00 T91B TNT 0,00 0,00 T92B TNT 0,00 0,00 T110B TNT 0,00 0,00 T111B TNT 0,00 0,00 T54 TNT 0,00 0,00 T66 TNT 0,00 0,00 T67 TNT 0,00 0,00 T4B.2 TNT 0,00 0,00 T24B TNT 0,00 0,00 T65A TNT 0,00 0,00 T68 TNT 0,00 0,00 T109 TNT No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is detected. No peak is 0,00 0,00 T69 TNT No peak is 0,00 0,00 T110 TNT No peak is 0,00 0,00 T112 TNT No peak is 0,00 0,00 Autor. Adaptación por las autoras. 55 Fuente. Equipo HPLC de la Pontificia Universidad Javeriana. De los setenta y ocho aislamientos se evidencio una mayor capacidad de degradación en veinticuatro, los cuales registraron lecturas en la concentración cero del explosivo TNT, de estos se escogieron bacterianos como se presentan en la tabla 11. 56 al azar cinco aislamientos Tabla 11. Aislamientos bacterianos con mayor capacidad de degradación del TNT seleccionados al azar. Muestra Tratamiento Aislamiento Color Textura Tamaño Elevación Forma Borde T2 +10-5 T54 Amarillo Cremosa Grande Convexa Circular Redondo T2 +10-5 T88 Café Dura Mediana Plana Irregular Ondulado T2 +10-5 T87 Blanco Dura Mediana Plana Irregular Ondulado T2 +10-5 T92 Blanco Mucosa Pequeña Convexa Irregular Ondulado T2+10-6 T109 Naranja Viscosa Pequeña Convexa Irregular Ondulado 3. Canal exterior 11.Fitorremediacion 11.Fitorremediacion 11.Fitorremediacion 6.Tanque de transporte Fuente: las autoras 57 2.1.7 Bioensayo. Con los cinco aislamientos bacterianos seleccionados que poseían mayor capacidad de degradación se realizo el bioensayo. Para esto es importante determinar las siguientes condiciones: tiempos de retención, concentración del explosivo, componentes del agua residual sintética, unidades experimentales y densidad óptica de los Inóculo. Para el tiempo de retención se estimo un periodo de cuatro días19, los cuales se les asigno una nomenclatura especifica con mediciones cada veinte cuatro horas ±1, la concentración del explosivo fue de 100 mg/L, se trabajaron cinco unidades experimentales con un control. Estas unidades se trabajaron por triplicado (n=3) para un total de 18 unidades experimentales. Para determinar la concentración de los inóculos en los bioensayos, se hizo necesario hacer una escala de Mac Farland (Ver Anexo D), la cual fue comparada con los aislamientos bacterianos inoculados en 10 mL de medio mineral líquido después de cinco días en agitación a 75 rpm y a temperatura ambiente en shaker. El valor obtenido en esta comparación fue igual al tubo 3 es decir que contenía 9.0X108 u.f.c/ml. Para el bioensayo se trabajo con agua residual sintética (ARS), que contiene los siguientes componentes: Tabla 12. Componentes agua residual sintética Material Cantidad Unidades Suero de leche 0,326 mg/L Sucrosa 0,49 mg/L Fosfato ácido 0,45 mg/L Urea 2,4 mg/L Acetato de sodio 1,12 mg/L de potasio Fuente. Escuela de Ingeniería de Antioquia, Medellín (Colombia )20 19 Este periodo de tiempo fue estipulado de acuerdo a la disponibilidad de material y utilización del equipo HPLC. 20 Remoción Biológica De Materia Orgánica, Nitrógeno Y Fósforo en un Sistema Tipo anaerobio-Anóxico-Aerobio Revista EIA, ISSN 1794-1237 Número 10, p. 45-53. 58 Las cinco cepas son inoculas por separado en el ARS en tubos de ensayo de 10 mL; las proporciones para cada tubo fueron 5mL de ARS, 0.125 mL de explosivo y de inoculo 5 mL de inoculo. Para determinar las concentraciones iniciales del explosivo en el bioensayo se realizo una primera medición donde el ARS no contenía inoculo del aislamiento bacteriano. Seguido de esto se inoculo el aislamiento bacteriano en el ARS, incubando a 25°C±1 por un periodo de 24 horas, después de este periodo de tiempo se realizaron las siguientes mediciones. Las mediciones para el bioensayo se hicieron con el mismo método de filtración antes mencionado, estos se llevaron al HPLC con las condiciones antes mencionadas de corrida. La curva de calibración (Anexo E) reporto un factor de correlación (r2) de 0.9936 indicando la estrecha relación entre los valores del eje X y el eje Y, que se ve representado en la distribución lineal de la curva y por ende el comportamiento normal de los datos. f(x)=2.26479e-005*x+11.1662 Rr1=0.9968314 Rr2=0.9936729 La tabla 13 muestra los resultados obtenidos por HPLC y los porcentajes de remoción para cada uno de los aislamientos bacterianos tanto en las concentraciones iniciales, como en la variación con respecto al tiempo, este último se hizo con el fin de obtener la representatividad en cuanto a la degradación por periodo de tiempo y comportamiento individual de los aislamientos bacteriano (porcentaje de remoción acumulado). 59 Tabla 13. Resultados medición por HPLC del bioensayo. Tiempo (días) Muestra Tiempo de retención (min) Concentración del explosivo (ppm) Concentración Final (ppm) Patrón 100mg/l 7,47 93.50 N/A t1 50,1 53,05 75,15 79,575 t3 7,47 7,47 7,47 51,42 77,13 T54A2 7,47 60,05 T54A.1 7,47 77,15 T54A 7,47 29,8 T54B2 7,46 52,58 T54B1 7,47 51,77 T54B 7,47 45,162 T54C 7,47 42,72 T54C1 7,46 42,08 T54C2 7,46 40,12 T54D 7,47 38,54 T54D1 7,46 36,96 T54D2 7,47 33,36 100mg/l 7 103.48 T109.A 7 59,75 T109.A1 7,11 56,62 T109.A.2 7 57,34 T109.B 7 53,83 T109.B1 7,11 52,79 T109.B2 7,12 52,47 Control t0 t1 t2 t3 Patrón t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 T109.C 7,11 43,56 T109.C1 7,11 52,14 T109.C2 7,11 52,79 T109.D 7,12 41,17 T109.2D 7,12 28,34 T109.2 7,11 36,15 T87A 6,9 42,13 T87A1 6,9 42,4 T87.A2 6,9 43,05 T87.B2 6,9 42,6 T87.B1 6,9 39,13 60 Porcentaje de remoción Porcentaje de remoción acumulado 74,76 10,47 10,47 62,46 25,19 16,45 54,43 34,81 12,86 79,54 8,42 8,42 78,7 9,38 1,06 52,83 39,17 32,87 5,92 5,93 83,5 86,85 63,79 60,01 t2 t3 t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 t3 T87.B 6,9 38,31 T87.C 6,9 31,84 T87.C1 6,9 34,14 T87.C2 6,9 29,53 T87D2 6,9 28,13 T87.D1 6,9 28,83 T87.D 6,9 25,16 T92.A 6,9 39,605 T92.A1 6,9 35,41 T92.A2 6,9 35,14 T92.B 6,9 35,21 T92B1 6,9 32,63 T92B2 6,9 33,51 T92C 6,9 30,51 T92.C1 6,9 30,25 T92.C2 6,9 28,73 T92.1D 6,9 26,28 T92.D 6,9 26,94 T92.D2 6,9 25,69 T88A2 6,9 45,9 T88.A1 6,9 49,61 T88A 6,9 39,6 T88.B1 6,8 38,75 T88.B 6,9 36,16 T88.B2 6,8 31,75 T88.C 6,9 29,92 T88.C2 6,8 30,51 T88.C2 6,9 30,3 T88.D 6,9 28,05 T88.D1 6,9 27,08 T88.D2 6,9 27,24 47,76 25,12 20,41 41,05 35,6 14,05 50,67 8,01 8,01 44,74 18,77 11,70 39,45 28,37 11,82 53 21 21,07 45,36 32,85 14,94 41,46 38,63 8,60 55,08 67,56 Fuente. Las autoras .Equipo HPLC de la Pontificia Universidad Javeriana. Los datos de cada uno de los triplicados del ensayo con las bacterias aisladas se promediaron para obtener las concentraciones finales a través de los tiempos establecidos y se multiplican por el factor 1.5 ya que hubo una dilución en acetonitrilo 0,5mL y ARS 1mL. 61 2.1.8 Análisis estadístico. El bioensayo tuvo como propósito determinar el porcentaje de remoción en agua residual sintética mediante los aislamientos bacterianos seleccionados, a través de un tiempo pre establecido. Para ello se eligió un periodo de cuatro días, haciendo mediciones cada veinticuatro horas por HPLC. Para esto se aplico un diseño por bloques para determinar el efecto que tiene el tiempo (pre–establecido) y las cepas aisladas sobre la remoción del explosivo TNT. 2.1.8.1 Modelo. El número de unidades experimentales para cada bloque coincide con el número de tratamientos, en este caso el boque es el tiempo y el tratamiento es el aislamiento bacteriano. Yij = μ + αi + βj + εij Donde: Yij: Porcentaje de remoción. μ: Es el porcentaje de remoción que se espera. αi: Período de tiempo utilizado en el bioensayo. Βj: Aislamiento bacteriano utilizado en cada bioensayo. εij: Error estándar. Tabla 14.Porcentajes de remoción a través del tiempo, por cada aislamiento bacteriano. Tiempo(días) T54 T109 T87 T88 T92 t1 10% 8% 5% t2 16% 1% 20% 15% 1% t3 13% 33% 14% Fuente: Las autoras 62 21% 8% 8% 32% 2.1.8.2 Hipótesis Ho: El tiempo y el aislamiento bacteriano no tienen efecto sobre el porcentaje de remoción. μ + tiempo + cepa =0 Ha: El tiempo y el aislamiento bacteriano tienen efecto sobre el porcentaje de remoción. μ + tiempo + cepa ≠0 Se obtiene una tabla ANOVA Tabla 15.Análisis de varianza. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las variaciones Tiempo Bacteria Error Total Suma de cuadrados Grados de libertad 0,02917142 0,00058638 0,10111253 0,13087033 2 4 8 14 Promedio F Probabilidad de los cuadrados 0,01458571 1,15401791 36% 0,0001466 0,01159862 100% 0,01263907 Fuente: Las autoras ANOVA Tabla 16.Resultados del análisis de varianza. Variables Hipótesis P valor Tiempo αi =0 vs αi ≠ 0 0.36 Aislamiento Βj =0 vs Βj ≠0 1.00 0 0 Yij = μ + αi + βj + εij 63 Valor crítico para F 4,458970108 3,837853355 Los resultados obtenidos tabla 16 (análisis de varianza), nos indican que tanto el tiempo utilizado para el bioensayo 4 días, como los cinco aislamientos bacterianos no tienen efecto en la remoción esperada del explosivo TNT. Frente a la hipótesis planteada anteriormente el p valor dio mayor del 0.5 en el tiempo y en los aislamientos bacterianos lo que indica que estas dos variables no tienen representatividad; aunque se haya presentado un porcentaje de remoción por los aislamientos bacterianos, mostrando un comportamiento homogéneo de la degradación a través del tiempo. 64 3. Análisis de resultados Los aislamientos bacterianos en las muestras tuvieron la capacidad de crecer a un pH neutro, ya sea por tolerancia o adaptación debido a la regulación de su pH citoplasmático que es cercano a 7, indicando que estas bacterias no son acidofilas o alcalofilas obligadas. De las siembras realizadas al pre- enriquecimiento se obtuvieron setenta y ocho aislamientos bacterianos las cuales presentaron una amplia gama morfo- típica. En algunos de los medios de cultivo incubados a 21° C presentaron una coloración naranja indicando la presencia del complejo Meisenheimer (Ver ilustración 2), a partir de lo anterior se puede deducir que las bacterias emplearon este vía de degradación. Se pudo observar que en el tratamiento T2 se presentó un mayor porcentaje (54%) de crecimiento bacteriano, esto quiere decir que las bacterias aisladas tomaron la fuente de carbono como su fuente de energía y la fuente de nitrógeno la tomaron del explosivo. Los sitios de muestreo de donde se aislaron 3 de las 5 bacterias con mayor capacidad de degradación del TNT, se caracterizan por estar directamente involucrados con algún tratamiento biológico como es el punto de muestreo de fitorremediación, donde las bacterias están adheridas a las raíces siendo allí donde se presenta la degradación enzimática del TNT por los bacterios21; se aislaron las bacterias T87, T88, T92,con las cuales se trabajo en el bioensayo; lo que nos muestra que estos aislamiento bacterianos presenten una adaptación a este tipo de degradación biológica. En la primera medición (cero) se encontró que los valores iniciales de la concentración del explosivo no eran iguales, como se muestra en la Tabla 14 esto se debe a que posiblemente se presento una pérdida de TNT por adsorción en el 21 Revista científica Ozono 21. 31 de Julio de 2009. http://ozono21.blogcindario.com/2009/07/00198 65 plástico y en el vidrio de los elementos de laboratorio utilizados, como los tubos falcon, tubos de ensayo, tubos eppendorf, etc. Otra razón por la cual se pudo presentar variabilidad en las concentraciones iniciales del explosivo, puede obedecer a que el TNT, se retenga en el filtro de nylon utilizado durante las filtraciones. Tabla 17. Concentraciones de TNT en bioensayo Tiempo(días) T54 T109 T87 T88 T92 t0 t1 t2 t3 83.50 ppm 74.76 ppm 62.46 ppm 54.43 ppm 86.85 ppm 79.54ppm 78.70ppm 52.83ppm 63.79ppm 60.01ppm 47.76ppm 41.05ppm 67.56ppm 53.325ppm 45.36ppm 41.46ppm 55.08ppm 50.67ppm 44.74ppm 39.45ppm Fuente: las autoras Grafica 2. Comportamiento de la concentración del TNT en el tiempo. Concentración /Tiempo Concentración (ppm) 90 80 T54 T109 T87 T88 T92 70 60 50 40 30 T0 T1 T2 Tiempo (Min) Fuente. Las Autoras. 66 T3 Aunque el valor final de la concentración del explosivo TNT, no fue representativo con referencia a los valores iniciales, se puede observar que la concentración del explosivo disminuye a través del tiempo (grafica 2). Tabla 18.Resultados Bioensayo en porcentajes de remoción de TNT. Tiempo(días) t1 t2 t3 T54 T109 T87 T88 T92 10% 16% 13% 8% 1% 33% 5% 20% 14% 21% 15% 8% 8% 1% 32% Fuente. Las autoras. Los porcentajes de reducción encontrados en los aislamientos después de un periodo de cuatro días oscilan en un rango de 83 % y 32 %, lo que indica que estos aislamientos poseen una capacidad para reducir los grupos nitro y de esta manera degradar el TNT. Para este bioensayo se parte de una curva patrón 100 ppm, la cual sirve de referencia para comparar los picos de concentración obtenidos después de correr las muestras del bioensayo. A continuación se presenta los cromatogramas obtenidos del aislamiento bacteriano T109, indicando para cada uno los tiempos de retención y las concentraciones de explosivo parciales. 67 Ilustración 10.Cromatograma curva patrón 100mg/L. Explosivo: TNT. Tiempo de retención: 6.64 min. Concentración :103.56 mg/L Ilustración 11.Cromatograma aislamiento T109. Tiempo 0 Explosivo: TNT. Tiempo de retención: 6.989min. Concentración :59.75mg/L 68 Ilustración 12.Cromatograma aislamiento T109, tiempo3. Explosivo: TNT. Tiempo de retención: 6.989min. Concentración :40.7mg/L Se obtuvo los picos de concentración, evidenciando una disminución en la concentración con respecto al patrón de 100mg/l, encontrándose una concentración en el tiempo final (t3) de 33.36 mg/L. Los cromatogramas presentaron, colas y solapamientos esto puede deberse a las sustancias detectadas y los metabolitos resultado del proceso de degradación del TNT. 69 4. CONCLUSIONES Las condiciones fisicoquímicas establecidas para el crecimiento bacteriano en los medios minerales, favorecieron la bioaumentación, tanto en el preenriquecimiento como en las siembras y replicas de los aislamientos. Los valores de pH muestran un rango muy amplio entre 2.11 – 8.95 lo que nos indica que las muestras tomadas tienen variedad de ambientes dependiendo de la línea de producción del explosivo y de los procesos físicos y biológicos que se llevan a cabo en cada punto donde fue tomada la muestra. De los tratamientos evaluados T1, T2 y T3, se considera el mejor de ellos es el tratamiento T2 ya que los aislamientos bacterianos presentaron un mayor porcentaje (54%) de crecimiento bacteriano en la fuente de carbono más explosivo. Se obtuvieron setenta y ocho aislamientos procedentes de las muestras tomadas, de los cuales veinticuatro presentaron una posible degradación del explosivo. Obteniendo concentraciones de TNT con valores de cero en los análisis realizados en HPLC. Los análisis realizados en HPLC corresponden se presentaron picos que no al explosivo, lo que puede indicar la presencia de otras sustancias o metabolitos producto de la degradación del explosivo 2, 4,6 trinitrotolueno, por los aislamientos bacterianos. Los resultados obtenidos demuestran que los aislamientos bacterianos seleccionados poseen una capacidad degradadora del 35 % en promedio, en un periodo de tiempo de 4 días, en condiciones de laboratorio. 70 5. RECOMENDACIONES El bajo porcentaje de remoción del explosivo en el bioensayo, se debe principalmente al tiempo de retención del aislamiento bacteriano en el agua residual sintética, por lo que se sugiere que estos bioensayos superen un tiempo de 30 días, para corroborar si el porcentaje de remoción del explosivo, sigue disminuyendo de manera considerable. Es necesario estandarizar la extracción y filtración de los bioensayos para evitar la pérdida de explosivo por la variabilidad de recipientes utilizados para dichos procedimientos, ya que esto altera los tiempos de retención de la muestra y por consiguiente los datos obtenidos por el equipo. Se recomienda tener en cuenta los diez y nueve aislamientos bacterianos que presentaron concentración cero de explosivo, ya que estos posiblemente poseen un potencial para la degradación del 2,4,6 TRINITROTOLUENO. 71 6. BIBIOGRAFIA FRENCH Christopher E. NICKLIN, Stephen, BRUCE Neil C: Aerobic Degradation of 2,4,6-Trinitrotoluene by Enterobacter cloacae PB2 and by Pentaerythritol Tetranitrate Reductase. Applied and environmental microbiology, Aug. 1998, p. 2864–2868. BRANCO, S.M: Limnología sanitaria, estudio de la polución de aguas continentales. Monografía científica No 28, 1984 serie Biología, OEA, 119 p. CARREÑO C: Selección y evaluación de bacterias con capacidad para degradar el 2,4,6 TRINOTROTOLUENO. Tesis de Grado. Bogotá 2009, Pontificia Universidad Javeriana. 33p. COSTA V. BOOPATHY R, Manning: Isolation and characterization of a sulfate-reducing bacterium that remove TNT under sulfate-reducing CANO DOMINGUEZ Samuel: Escala .http://perso.wanadoo.es/microdominguez/c.htm. de Mack consultado: Farland 30 de Noviembre de 2009. ESTEVE A, CABALLERO A, RAMOS J.L: Biological degradation of 2,4,6 trinitrotoluene Microbioligy and molecular biology reviews 2001. ESPAÑA. DIVISION TECNICA DE ARMAMENTOS TERRESTRES. 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Pág, 2. 74 ZULEIMA PEÑA Yudy, SILVA RIAÑO Rodrigo Eduardo: Determinación del impacto ambiental al recurso agua Ocasionado por la desactivación de los explosivos Pólvora y anfo con el método de disolución química y Valoración del ruido producido por la destrucción de los explosivos incautados por la policía nacional de Colombia. Bogotá: Universidad de la Salle. 2008. 151p. VALLEJO ROSERO, María del Carmen: Toxicología Ambiental, efectos de los contaminantes en la salud humana, Bogotá, segunda edición, Colombia, grupo empresarial Hill Ltda, 2007. VORBECK C, LENKE H: Initial reductive reactions in aerobic microbial metabolism of 2,4,6 trinitrotoluene. Appilied and Environmental Microbiology 1998; 62p. 75 ANEXOS. 76 ANEXO A. CROMATOGRAMAS AISLAMIENTOS ESCOGIDOS AL AZAR 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 /8.501 /7.352 tnt/6.712 /5.355 0 /4.266 /4.487 /1.703 /1.810 250 /4.894 /3.204 /3.407 mAU 500 254nm,4nm (1.00) /6.180 Cromatograma. 1. 100 mg/l 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min Cromatograma. 2. Cero. 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 /8.860 /8.335 0 0.0 /4.960 /4.111 /2.781 25 /3.419 50 /10.874 tnt/6.336 mAU 254nm,4nm (1.00) 9.0 10.0 11.0 min 10.0 11.0 min 11.0 min Cromatograma. 3 Patrón 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 /8.841 /8.213 /7.637 /6.965 0 /4.937 250 /4.327 /1.635 /1.745 /1.938 /2.101 /2.296 tnt/6.347 /3.411 mAU 500 254nm,4nm (1.00) 9.0 /8.743 /9.020 tnt/6.574 /4.479 1 /0.427 2 /2.921 /0.883 mAU 254nm,4nm (1.00) /9.971 Cromatograma. 4 T54 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 77 7.0 8.0 9.0 10.0 /9.449 /8.103 /8.528 /5.113 /4.701 1 /4.314 /3.412 /3.541 2 /3.989 /2.910 mAU 3 254nm,4nm (1.00) /6.215 Cromatograma. 5 T87 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min 9.0 10.0 11.0 min 9.0 10.0 11.0 min 9.0 10.0 11.0 min 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 /5.727 /5.131 0 /4.075 /3.395 /1.426 1 6.0 /8.139 mAU 254nm,4nm (1.00) /2.900 2 /6.260 Cromatograma. 6 T88 7.0 8.0 Cromatograma. 7 T92 /8.146 1 /4.487 /3.387 2 /6.241 /2.938 mAU 254nm,4nm (1.00) 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 /8.132 /2.716 /2.805 2.5 /3.083 /3.385 mAU 5.0 254nm,4nm (1.00) /6.230 Cromatograma. 8. T 109 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 78 7.0 8.0 ANEXO B. CROMATOGRAMAS BIOENSAYO Cromatograma. 9. T54 para el tiempo 0 mAU 210nm,4nm (1.00) tnt/60.052 225 200 175 150 125 100 75 50 0 /0.000 /0.000 /0.000 /0.000 25 -25 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 min Cromatograma. 10 T54para el Tiempo 1 TNT/52.587 mAU 160 210nm,4nm (1.00) 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 79 10.0 11.0 12.0 13.0 min Cromatograma. 11. T54 tiempo 2 mAU 210nm,4nm (1.00) 170 160 tnt/42.085 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 /0.000 /0.000 0 /0.000 10 /0.000 20 -10 -20 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 min mAU 210nm,4nm (1.00) 180 /0.000 Cromatograma. 12.T 54 tiempo 3. 170 160 150 140 130 tnt/33.366 120 110 100 90 80 70 60 50 40 /0.000 /0.000 /0.000 0 /0.000 10 /0.000 /0.000 /0.000 20 /0.000 30 -10 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 80 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min Cromatograma. 13 T109, tiempo 1. /0.000 mAU 210nm,4nm (1.00) TNT/59.757 120 110 100 90 80 70 60 /0.000 50 40 /0.000 30 20 10 0 -10 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 Cromatograma. 14 T109.tiempo 2. TNT/52.792 mAU 140 210nm,4nm (1.00) 130 120 110 100 90 80 70 /0.000 /0.000 60 50 /0.000 40 30 /0.000 PETN/2.025 20 10 0 -10 -20 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 81 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min min Cromatograma. 15 T109 tiempo 2. TNT/43.567 mAU 110 210nm,4nm (1.00) 100 90 80 70 60 /0.000 /0.000 /0.000 /0.000 50 40 30 /0.000 PETN/2.492 20 10 0 -10 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min Cromatograma. 16 T109 tiempo 3 TNT/41.174 mAU 120 210nm,4nm (1.00) /0.000 110 100 90 80 70 60 50 40 30 /0.000 /0.000 /0.000 10 /0.000 20 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 82 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min Cromatograma. 17 T87tiempo 0. TNT/42.137 mAU 100 210nm,4nm (1.00) 95 90 85 80 75 70 /0.000 65 60 /0.000 55 50 45 /0.000 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min Cromatograma. 18 T87 tiempo 1. TNT/38.317 mAU 210nm,4nm (1.00) 75 70 65 60 55 /0.000 50 /0.000 45 /0.000 40 35 30 25 20 15 5 /0.000 10 0 -5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 83 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min Cromatograma. 19 T87.tiempo 2. /0.000 70 TNT/31.846 /0.000 mAU 75 210nm,4nm (1.00) 65 60 55 50 45 40 35 30 /0.000 25 20 /0.000 15 /0.000 10 5 0 -5 -10 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 mAU 90 210nm,4nm (1.00) /0.000 Cromatograma. 20 T87.tiempo 3. 85 80 75 70 65 /0.000 60 55 TNT/25.167 50 45 40 35 30 20 PETN/23.781 /0.000 25 5 /0.000 /0.000 10 /0.000 15 0 -5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 84 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min min Cromatograma. 21 T92.tiempo 0. /0.000 TNT/35.412 mAU 210nm,4nm (1.00) 70 65 60 /0.000 55 50 45 /0.000 40 35 30 25 20 15 /0.000 10 5 0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min Cromatograma. 22 T92 tiempo1. /0.000 55 TNT/32.631 mAU 210nm,4nm (1.00) 50 /0.000 45 40 /0.000 35 30 25 20 /0.000 10 PETN/8.980 /0.000 15 5 0 -5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 85 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min Cromatograma. 23 T92.tiempo 1. /0.000 mAU 210nm,4nm (1.00) 95 90 85 80 75 TNT/28.737 70 65 /0.000 60 55 /0.000 50 45 /0.000 40 35 30 25 20 15 /0.000 10 5 0 -5 -10 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min Cromatograma. 24 T92.tiempo3. /0.000 mAU 210nm,4nm (1.00) 120 110 100 90 80 /0.000 70 TNT/25.695 60 /0.000 /0.000 50 40 30 10 /0.000 /0.000 /0.000 20 0 -10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 86 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Cromatograma. 25 T88 tiempo 0. TNT/39.605 mAU 210nm,4nm (1.00) 85 80 /0.000 75 70 /0.000 65 60 55 50 /0.000 45 40 35 30 /0.000 25 20 5 /0.000 /0.000 10 /0.000 15 0 -5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min /0.000 mAU 210nm,4nm (1.00) TNT/36.163 Cromatograma. 26 T88 tiempo1. 80 75 70 /0.000 65 60 /0.000 55 50 /0.000 45 40 35 30 25 20 PETN/1.613 /0.000 /0.000 5 /0.000 10 /0.000 /0.000 15 0 -5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 87 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min Cromatograma. 27 T88 teimpo2. mAU 210nm,4nm (1.00) TNT/29.925 /0.000 70 65 /0.000 60 55 50 /0.000 45 35 /0.000 40 30 25 20 /0.000 15 /0.000 10 5 0 -5 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 9.0 10.0 min Cromatograma. 28 T88 tiempo3. mAU 210nm,4nm (1.00) TNT/28.055 /0.000 65 60 /0.000 55 50 45 /0.000 /0.000 40 35 30 25 20 /0.000 10 /0.000 15 5 0 -5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 88 7.0 8.0 min ANEXO C.PROTOCOLOS DE LABORATORIO. 89 ANEXO D.CURVA DE CALIBRACION PARA LAS LECTURAS DE HPLC. 90 ANEXO D. ESCALA DE MAC FRALAND TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cl2Ba 1% 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 SO4H2 1% 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0 Fuente: http://perso.wanadoo.es/microdominguez/c.htm 91 u.f.c/ml 3,0x108 6,0x108 9,0x108 1,2x109 1,5x109 1,8x109 2,1x109 2,4x109 2.7x109 3,0x109 ANEXO E.CROMATOGRAMAS CORRESPONDIENTES AL BIOENSAYO. Cromatograma: curva patrón de 100 ppm. Cromatograma: aislamiento T 54 para el tiempo 0. Cromatograma: aislamiento T 54 para el tiempo 3. Cromatograma: aislamiento T 87 para el tiempo 0. Cromatograma: aislamiento T87 para el tiempo 3. Cromatograma: aislamiento T 88 para el tiempo 0. Cromatograma: aislamiento T88 para el tiempo 3. Cromatograma: aislamiento T 92 para el tiempo 0. Cromatograma: aislamiento T92 para el tiempo 3. Cromatograma: aislamiento T109 para el tiempo 0. Cromatograma: aislamiento T109 para el tiempo 3. 92 ANEXO F.REGISTRO FOTOGRAFICO 93 Extracción de las muestras en los doce puntos designados 1. Afluente caja de cristalización 2.Canal de recepción exterior. Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación. 3. Caja de recepción taller multiplicadores 4. Canal recepción Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación. 5. Caneca 6.Tanque transporte Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación. 94 7. Caja de captación Muestras empacadas de los doce puntos de muestreo. Explosivos Fuente. Grupo de investigación. 95 ACTIVIDADES REALIZADAS EN EL LABORATORIO ELABORACIÓN PRE-ENRIQUECIMIENTO Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación. MONITOREO SIEMBRA AISLAMEINTOS BACTERIANOS Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación. 96 Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación. Medio de cultivo liquido Caja de petri sembrada Fuente. Grupo de investigación. MEDIOS DE CULTIVO SEMBRADOS Siembre Cajas de petri Siembra Bacterias 97 AISLAMIENTOS BACTERIANOS Diversos morfo tipos encontrados Muestras 1. Tratamiento 2 98 Cajas de petri siembra 99 100