FACULTAD DE VETERINARIA UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA ESTUDIO ELECTROFORÉTICO DE LA PROTEINURIA EN PERROS SANOS Y EN PERROS CON ENFERMEDAD RENAL Memoria presentada por la Licenciada en Veterinaria Concepción Zaragoza Bayle para optar al grado de Doctora en Veterinaria Cáceres, 2001 Da. María Cinta Mañé Seró y D. Rafael Barrera Chacón, Profesores Titulares del Departamento de Medicina y Sanidad Animal, y D. Francisco Centeno Velázquez, Profesor Titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética de la Universidad de Extremadura, en calidad de Directores del presente trabajo de Tesis Doctoral, tienen el honor de informar que: Da. Concepción Zaragoza Bayle viene trabajando desde 1996 en el tema “Estudio electroforético de la proteinuria en perros sanos y en perros con enfermedad renal” bajo nuestra dirección. Que una vez concluido el trabajo y tras el oportuno análisis, reúne la calidad suficiente para ser presentado ante el correspondiente tribunal con objeto de ser juzgado. Lo que firman y rubrican en Cáceres el 30 de Mayo de 2001 Fdo. Ma Cinta Mañé Seró Fdo. Rafael Barrera Chacón Fdo. Francisco Centeno Velázquez Este trabajo de investigación ha sido financiado por la Junta de Extremadura – Consejería de Educación y Juventud – y el Fondo Social Europeo, a través del I Plan Regional de Investigación y Desarrollo Tecnológico de Extremadura (O. de 15 de Julio de 1998, D.O.E. de 25 de Julio). A mis padres A Jose Antonio AGRADECIMIENTOS - Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a mis directores por confiar en mí para la realización de esta Tesis Doctoral, y por su apoyo y buenos consejos. Además, y concretamente, quiero agradecer a Da. María Cinta Mañé Seró y D. Rafael Barrera Chacón el enseñarme todo lo que sé en el campo de la docencia y la clínica. De igual modo, quiero agradecer a D. Francisco Centeno Velázquez el haberme introducido en el complicado mundo de la bioquímica. - A mi madre, Da. Concepción Bayle Bonilla, por su cariño, paciencia con mis malos momentos y apoyo. - A D. Joaquín Sánchez Peinado, D. Antonio Jiménez Redondo y D. Santiago Andrés Díaz, miembros de la Unidad de Patología General y Médica, por el cariño que siempre me han demostrado y sus ánimos. - A D. Jose Antonio Tapia García por su ayuda incondicional en la realización de la presente Tesis Doctoral. - A la Unidad de Patología Quirúrgica, especialmente a Da. Eva María Pérez Merino y Da. Beatriz Chacón López, por su ayuda y apoyo en la ejecución de este trabajo y, sobre todo, su amistad. - A la Unidad de Bioquímica, especialmente a Da. Ara Rangel Bermejo y D. Alfonso Mora Corral, por ayudarme a resolver las dudas que surgieron en el laboratorio. - A Da. Esther Durán Flórez y Da. Marta González Huecas por su colaboración en el estudio anatomopatológico. - A D. Pedro Rodríguez Medina por la ayuda prestada en el análisis estadístico de este trabajo. - A todas las personas que me han acompañado día a día con su apoyo y ánimo en la realización de esta Tesis Doctoral. A todos ellos muchas gracias. ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN ------------------------------------------------------------------------------------------------1 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ------------------------------------------------------------------------------6 II.1.- CONCEPTO DE PROTEINURIA --------------------------------------------------------------------------7 II.2.- FISIOLOGÍA -------------------------------------------------------------------------------------------------9 II.2.1.- Proteína urinaria en perros sanos -----------------------------------------------------------------9 II.2.2.- Proteinuria funcional------------------------------------------------------------------------------ 11 II.2.3.- Origen de la proteína normal urinaria --------------------------------------------------------- 12 II.2.3.1.- Filtración glomerular ------------------------------------------------------------------------ 12 II.2.3.2.- Secreción tubular ----------------------------------------------------------------------------- 15 II.2.3.3.- Procedente del tracto urogenital inferior------------------------------------------------- 16 II.3.- FISIOPATOLOGÍA ---------------------------------------------------------------------------------------- 16 II.3.1.- Proteinuria prerrenal ------------------------------------------------------------------------------ 16 II.3.2.- Proteinuria renal ----------------------------------------------------------------------------------- 17 II.3.2.1.- Glomerular------------------------------------------------------------------------------------- 18 II.3.2.2.- Tubular ----------------------------------------------------------------------------------------- 31 II.3.2.3.- Inflamación del parénquima renal -------------------------------------------------------- 34 II.3.3.- Proteinuria postrenal ------------------------------------------------------------------------------ 35 II.4.- DIAGNÓSTICO -------------------------------------------------------------------------------------------- 35 II.4.1.- Anamnesis------------------------------------------------------------------------------------------- 36 II.4.2.- Exploración física---------------------------------------------------------------------------------- 37 II.4.3.- Análisis laboratoriales ---------------------------------------------------------------------------- 37 II.4.3.1.- Sangre ------------------------------------------------------------------------------------------ 37 II.4.3.1.1.- Hematología ----------------------------------------------------------------------------- 38 II.4.3.1.2.- Bioquímica------------------------------------------------------------------------------- 38 II.4.3.1.3.- Serología --------------------------------------------------------------------------------- 40 II.4.3.2.- Orina -------------------------------------------------------------------------------------------- 40 II.4.3.2.1.- Análisis físico-químico---------------------------------------------------------------- 40 II.4.3.2.1.1.- Proteínas---------------------------------------------------------------------------- 40 II.4.3.2.1.2.- Densidad---------------------------------------------------------------------------- 54 II.4.3.2.1.3.- Cociente proteína/creatinina---------------------------------------------------- 55 II.4.3.2.1.4.- Otras determinaciones ----------------------------------------------------------- 62 II.4.3.2.2. - Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo -------------------------------- 63 II.4.3.2.3. - Sedimento urinario -------------------------------------------------------------------- 64 II.4.4.- Otros métodos complementarios de diagnóstico -------------------------------------------- 66 II.5.- COMPLICACIONES -------------------------------------------------------------------------------------- 67 II.6.- PRONÓSTICO --------------------------------------------------------------------------------------------- 71 II.7.- TRATAMIENTO------------------------------------------------------------------------------------------- 73 III. MATERIALES Y MÉTODOS ----------------------------------------------------------------------------- 78 III.1.- MATERIALES -------------------------------------------------------------------------------------------- 79 III.1.1.- Material animal ----------------------------------------------------------------------------------- 79 III.1.2.- Material de extracción y conservación de las muestras ----------------------------------- 82 III.1.2.1.- Sangre entera--------------------------------------------------------------------------------- 82 III.1.2.2.- Plasma ----------------------------------------------------------------------------------------- 82 III.1.2.3.- Orina ------------------------------------------------------------------------------------------- 83 III.1.3.- Material analítico --------------------------------------------------------------------------------- 83 III.1.3.1.- Sangre entera--------------------------------------------------------------------------------- 83 III.1.3.2.- Plasma ----------------------------------------------------------------------------------------- 84 III.1.3.2.1.- Determinación de alanín-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, urea, creatinina, bilirrubina total, calcio, fósforo, albúmina y proteínas totales----------------- 84 III.1.3.2.2.- Determinación de colesterol--------------------------------------------------------- 85 III.1.3.2.3.- Determinación de sodio y potasio-------------------------------------------------- 85 III.1.3.3.- Orina ------------------------------------------------------------------------------------------- 86 III.1.3.3.1.- Determinación de proteínas --------------------------------------------------------- 86 III.1.3.3.2.- Determinación de creatinina y fósforo -------------------------------------------- 87 III.1.3.3.3.- Determinación de sodio y potasio-------------------------------------------------- 87 III.1.3.3.4.- Determinación de la densidad urinaria -------------------------------------------- 87 III.1.3.3.5.- Otras determinaciones analíticas de la orina ------------------------------------- 87 III.1.4.- Material para electroforesis de muestras de orina en gel de poliacrilamida----------- 88 III.1.5.- Material para Western blotting----------------------------------------------------------------- 90 III.1.5.1.- Material para la transferencia de proteínas--------------------------------------------- 90 III.1.5.2.- Material para el revelado por quimioluminiscencia ---------------------------------- 90 III.1.6.- Material para el estudio de microscopía óptica --------------------------------------------- 91 III.1.6.1.- Material para el estudio de secciones en parafina------------------------------------- 91 III.1.6.2.- Material para el estudio de secciones semifinas--------------------------------------- 92 III.1.7.- Material fotográfico------------------------------------------------------------------------------ 93 III.1.8.- Material informático ----------------------------------------------------------------------------- 93 III.1.9.- Material estadístico------------------------------------------------------------------------------- 94 III.2.- MÉTODOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 94 III.2.1.- Método general empleado en cada animal--------------------------------------------------- 94 III.2.2.- Análisis clínicos ---------------------------------------------------------------------------------- 96 III.2.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------- 96 III.2.2.2.- Bioquímica plasmática --------------------------------------------------------------------- 97 III.2.2.2.1.- Determinación de alanín-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, urea, creatinina, bilirrubina total, calcio, fósforo, albúmina y proteínas totales----------------- 97 III.2.2.2.2.- Determinación de colesterol--------------------------------------------------------- 97 III.2.2.2.3.- Determinación de sodio y potasio-------------------------------------------------- 97 III.2.2.2.4.- Determinación del cociente albúmina/globulina -------------------------------- 98 III.2.2.3.- Urianálisis ------------------------------------------------------------------------------------ 98 III.2.2.3.1.- Examen físico -------------------------------------------------------------------------- 98 III.2.2.3.2.- Examen químico----------------------------------------------------------------------- 98 III.2.2.3.2.1.- Proteínas--------------------------------------------------------------------------- 98 III.2.2.3.2.2.- Creatinina y fósforo ------------------------------------------------------------- 99 III.2.2.3.2.3.- Sodio y potasio------------------------------------------------------------------100 III.2.2.3.3.- Densidad de la orina -----------------------------------------------------------------100 III.2.2.3.4.- Sedimento urinario -------------------------------------------------------------------100 III.2.2.3.5.- Determinación del cociente proteína/creatinina --------------------------------100 III.2.3.- Pruebas de funcionalidad renal ---------------------------------------------------------------100 III.2.3.1.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo ------------------------------------100 III.2.4.- Electroforesis vertical en gel de poliacrilamida SDS-------------------------------------101 III.2.4.1.- Preparación de los geles de poliacrilamida--------------------------------------------101 III.2.4.2.- Preparación de las muestras --------------------------------------------------------------103 III.2.4.3.- Tinción y secado del gel de poliacrilamida -------------------------------------------104 III.2.5.- Western blotting ---------------------------------------------------------------------------------104 III.2.5.1.- Transferencia de proteínas al filtro de nitrocelulosa---------------------------------105 III.2.5.2.- Revelado y detección ----------------------------------------------------------------------106 III.2.6.- Estudio de microscopía óptica ----------------------------------------------------------------107 III.2.6.1.- Estudio de secciones en parafina--------------------------------------------------------107 III.2.6.2.- Estudio de secciones semifinas ----------------------------------------------------------107 III.2.7.- Estudio estadístico-------------------------------------------------------------------------------108 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN --------------------------------------------------------------------------110 IV.1.- OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE ELECTROFORESIS-------------------------------111 IV.1.1.- Concentración de acrilamida ------------------------------------------------------------------111 IV.1.2.- Marcador de pesos moleculares---------------------------------------------------------------112 IV.1.3.- Cantidad de proteínas (µg) de cada muestra------------------------------------------------113 IV.1.4.- Conservación y validez de las muestras tras sucesivas congelaciones ----------------115 IV.2.- OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE WESTERN BLOTTING ---------------------------116 IV.2.1.- Anticuerpos a utilizar ---------------------------------------------------------------------------116 IV.2.2.- Dilución óptima del anticuerpo primario: anti-IgA y anti-IgG -------------------------117 IV.2.3.- Dilución óptima del anticuerpo secundario-------------------------------------------------119 IV.3.- GRUPO CONTROL -------------------------------------------------------------------------------------120 IV.3.1.- Anamnesis y exploración física---------------------------------------------------------------120 IV.3.2.- Análisis de sangre -------------------------------------------------------------------------------120 IV.3.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------120 IV.3.2.2.- Bioquímica sanguínea---------------------------------------------------------------------121 IV.3.3.- Urianálisis -----------------------------------------------------------------------------------------122 IV.3.3.1.- Examen físico-------------------------------------------------------------------------------122 IV.3.3.2.- Densidad -------------------------------------------------------------------------------------123 IV.3.3.3.- Sedimento urinario-------------------------------------------------------------------------123 IV.3.3.4.- Examen químico ---------------------------------------------------------------------------125 IV.3.3.4.1.- Proteínas -------------------------------------------------------------------------------125 IV.3.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de proteínas-------------125 IV.3.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting -------------------------------------------126 IV.3.3.4.2.- Otras determinaciones---------------------------------------------------------------134 IV.3.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo ------------------------------------------135 IV.4.- PIOMETRA ----------------------------------------------------------------------------------------------136 IV.4.1.- Anamnesis y exploración física---------------------------------------------------------------136 IV.4.2.- Análisis de sangre -------------------------------------------------------------------------------139 IV.4.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------139 IV.4.2.2.- Bioquímica sanguínea---------------------------------------------------------------------142 IV.4.3.- Urianálisis -----------------------------------------------------------------------------------------145 IV.4.3.1.- Examen físico-------------------------------------------------------------------------------145 IV.4.3.2.- Densidad -------------------------------------------------------------------------------------146 IV.4.3.3.- Sedimento urinario-------------------------------------------------------------------------147 IV.4.3.4.- Examen químico ---------------------------------------------------------------------------149 IV.4.3.4.1.- Proteínas -------------------------------------------------------------------------------149 IV.4.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de proteínas-------------149 IV.4.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting -------------------------------------------150 IV.4.3.4.2.- Otras determinaciones---------------------------------------------------------------165 IV.4.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo ------------------------------------------166 IV.5.- LEPTOSPIROSIS ----------------------------------------------------------------------------------------167 IV.5.1.- Anamnesis y exploración física---------------------------------------------------------------167 IV.5.2.- Análisis de sangre -------------------------------------------------------------------------------170 IV.5.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------170 IV.5.2.2.- Bioquímica sanguínea---------------------------------------------------------------------172 IV.5.3.- Urianálisis -----------------------------------------------------------------------------------------175 IV.5.3.1.- Examen físico-------------------------------------------------------------------------------175 IV.5.3.2.- Densidad -------------------------------------------------------------------------------------176 IV.5.3.3.- Sedimento urinario-------------------------------------------------------------------------177 IV.5.3.4.- Examen químico ---------------------------------------------------------------------------178 IV.5.3.4.1.- Proteínas -------------------------------------------------------------------------------178 IV.5.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de proteínas-------------178 IV.5.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting -------------------------------------------180 IV.5.3.4.2.- Otras determinaciones---------------------------------------------------------------192 IV.5.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo ------------------------------------------194 IV.6.- LEISHMANIOSIS ---------------------------------------------------------------------------------------195 IV.6.1.- Anamnesis y exploración física---------------------------------------------------------------195 IV.6.2.- Análisis de sangre -------------------------------------------------------------------------------200 IV.6.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------200 IV.6.2.2.- Bioquímica sanguínea---------------------------------------------------------------------202 IV.6.3.- Urianálisis -----------------------------------------------------------------------------------------207 IV.6.3.1.- Examen físico-------------------------------------------------------------------------------207 IV.6.3.2.- Densidad -------------------------------------------------------------------------------------209 IV.6.3.3.- Sedimento urinario-------------------------------------------------------------------------210 IV.6.3.4.- Examen químico ---------------------------------------------------------------------------212 IV.6.3.4.1.- Proteínas -------------------------------------------------------------------------------212 IV.6.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de proteínas-------------212 IV.6.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting -------------------------------------------213 IV.6.3.4.2.- Otras determinaciones---------------------------------------------------------------223 IV.6.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo ------------------------------------------224 IV.6.5.- Anatomía patológica ----------------------------------------------------------------------------226 V. CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------------233 VI. RESUMEN----------------------------------------------------------------------------------------------------236 VII. SUMMARY --------------------------------------------------------------------------------------------------240 VIII. BIBLIOGRAFÍA ------------------------------------------------------------------------------------------244 I. INTRODUCCIÓN I. Introducción Los primeros pasos en medicina humana para la caracterización de las proteínas urinarias, en función de su peso molecular, se llevaron a cabo mediante el empleo de ultracentrifugación o filtración en gel con el fin de contribuir al diagnóstico de las enfermedades renales(87). A partir de aquí, y en medicina veterinaria, el papel que la electroforesis desempeña en la separación e identificación de las proteínas urinarias en el perro suscitó interés sobre todo desde la década de los sesenta. Porter(317), ya en 1964, realizó un estudio de los coloides que aparecían en la orina de perros sanos. Desde entonces se ha intentado clarificar el papel que la determinación e identificación de proteínas en la orina juega en el diagnóstico de la enfermedad renal en el perro(256). En este sentido, la electroforesis se ha constituido en una técnica fundamental en cuanto que permite la separación de las proteínas en función de su peso molecular. Con los datos que proporciona, la proteinuria puede ser clasificada en prerrenal, renal o postrenal con la consiguiente ayuda que ello supone en la determinación de la etiología de la enfermedad(250). Además, en función del peso molecular de las proteínas detectadas en la orina, se puede ayudar a localizar la lesión renal, clasificándola en glomerular, tubular o de tipo mixto(366). Por otra parte, en la orina de perros aparentemente sanos pueden aparecer proteínas que, por los medios convencionales de detección, pasan inadvertidas y que mediante electroforesis pueden evidenciarse, lo que permite el establecimiento de un diagnóstico con prontitud. No obstante, la identificación de proteínas específicas, por electroforesis y según su tamaño molecular, se limita a conclusiones generales sobre el origen de la proteinuria (glomerular, tubular o ambos). La explicación para esta conclusión estriba en que proteínas de peso molecular similar, al migrar la misma distancia, pueden encontrarse en la misma banda(346), algunas proteínas no se visualizan tras realizar la tinción y, por último, fragmentos de albúmina y sus polímeros pueden presentar cualquier peso molecular. Sin embargo, el sistema SDS-PAGE junto con Western -2- I. Introducción blotting, proporciona información útil desde un punto de vista clínico y experimental(399), ya que permite identificar con exactitud las proteínas que se eliminan por el riñón. Aunque este método es demasiado complejo para el análisis rutinario, aporta una información inestimable sobre las distintas formas de disfunción renal(223). Entre aquellas patologías que provocan un daño renal importante, y que cuentan con una casuística notable en nuestra área geográfica, ocupan un lugar destacado la piometra, la leptospirosis y la leishmaniosis, las dos últimas como consecuencia de determinadas condiciones medioambientales. La piometra es un desorden hormonal asociado al diestro que cursa con una infección bacteriana en el útero, con bacteriemia de moderada a grave y toxemia, que pueden poner en peligro la vida del animal(98, 396). Tradicionalmente, la piometra se ha descrito en hembras de edad media (mayores de 6 años), con estimulaciones repetidas del útero por la progesterona en el ciclo estral(289). Sin embargo, con el uso común de estrógenos como inhibidores del celo, la piometra también puede llegar a diagnosticarse en hembras jóvenes(129). En esta enfermedad, el depósito de complejos inmunes en el glomérulo puede causar una glomerulopatía reversible y moderada(220). De hecho, la enfermedad renal y el posterior fallo de los riñones son complicaciones graves de la piometra en la perra(370). La lesión glomerular, en este proceso, precede a la tubular siendo la sucesión normal de acontecimientos: piometra - disfunción glomerular - lesión tubular - fallo renal(91). En estos casos, el diagnóstico de enfermedad renal se basa en la detección de proteinuria, lo que sugiere lesión glomerular, y en una incapacidad de concentrar orina en animales deshidratados, lo que indica lesión tubular distal(184). En estos animales, el -3- I. Introducción pronóstico de la enfermedad va a depender, en gran medida, de la rapidez en el establecimiento del diagnóstico y en la pronta instauración del tratamiento. La leptospirosis es una enfermedad de carácter zoonósico, producida por la infección de serotipos, antigénicamente distintos, de Leptospira interrogans(170). Afecta a muchas especies de animales, tanto domésticos como salvajes(361, 395) , que actúan como reservorios y sirven, a su vez, como fuente potencial de infección para los seres humanos y para otros huéspedes accidentales(171). Se caracteriza, sobre todo, por provocar daño hepático y renal(12, 380) y la gravedad del proceso depende de muchos factores como la edad y el estado inmunitario del animal, y la virulencia del serovar infectante(172). El reservorio natural de las leptospiras patógenas es la luz de los túbulos renales, asociándose la enfermedad a una nefritis túbulo-intersticial aguda o subaguda(138). En general, los cambios laboratoriales que se producen en la leptospirosis se correlacionan con la gravedad de la enfermedad clínica y pueden utilizarse en el diagnóstico del proceso cuando se combinan con estudios serológicos y el aislamiento del organismo del riñón o de la orina(283). La leishmaniosis canina, por último, es un proceso multisistémico, parasitario y enzoótico en el área mediterránea, que está causado por el protozoo Leishmania infantum(243, 341, 355) . Se trata de una zoonosis en la que el perro es considerado el principal reservorio del parásito(130). En esta enfermedad el daño hepático no es frecuente(130), mientras que la afectación renal se caracteriza por una glomerulonefritis por complejos inmunes, que puede llegar a ser muy grave en ausencia de otra sintomatología(76), nefritis intersticial y, en raras ocasiones, amiloidosis(219, 310, 355) . Los complejos inmunes provocan una -4- I. Introducción reacción inflamatoria secundaria(202) y la disminución de la perfusión de los capilares peritubulares conduce a isquemia tubular y del tejido intersticial(350). Las enfermedades a las que se ha hecho referencia cuentan, entre sus signos clínicos más comunes, con la aparición de proteinuria, que puede ser de moderada a grave según la evolución del proceso. Este hecho, unido a las anteriores consideraciones sobre la importancia de la determinación de las proteínas en la orina, nos han animado a plantear los objetivos de esta Tesis Doctoral en los siguientes términos: 1.- Establecer el patrón electroforético de la proteinuria oculta en perros sanos. 2.- Determinar el patrón electroforético de la orina de perros con enfermedad renal, provocada por procesos muy comunes en nuestra área geográfica: piometra, leptospirosis y leishmaniosis. 3.- Identificar el origen de las proteínas detectadas en la orina de perros enfermos con el fin de contribuir a localizar la lesión renal. 4.- Determinar el grado de pérdida de las inmunoglobulinas G y A a nivel renal en las distintas patologías objeto de nuestro estudio. -5- II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA II. Revisión bibliográfica La revisión bibliográfica se ha efectuado en: 1.- Servicio de Teledocumentación de la Universidad de Extremadura, en el que se han consultado las siguientes bases de datos: - Medline, en el período comprendido entre 1966 y la actualidad. - Biosis Previews, en el período comprendido entre 1969 y la actualidad. - Cab Abstracts, en el período comprendido entre 1972 y la actualidad. 2.- Base de datos CABI Publishing desde 1973 hasta la actualidad. 3.- Base de datos INGENTA desde 1973 hasta la actualidad. II.1.- CONCEPTO DE PROTEINURIA La orina de perros sanos contiene una pequeña cantidad de proteínas, que se puede incrementar con ciertas patologías sistémicas, renales y urogenitales(134, 195), en cuyo caso se dice que el animal presenta proteinuria. Ésta se define como una concentración anormalmente alta de proteína en la orina(15, 296, 339) y su causa más frecuente es la infección del tracto urinario(220). El término proteinuria se prefiere al de albuminuria porque en la orina normal se han encontrado más de cuarenta proteínas distintas que pueden aparecer en procesos asociados también con albuminuria(296). En el caso concreto de que las proteínas presentes sean cadenas ligeras de inmunoglobulinas, se denomina proteinuria de Bence-Jones. Las gamma-globulinas se componen de cuatro cadenas peptídicas enlazadas como una unidad. Las dos internas son más largas y grandes y se llaman “cadenas pesadas” (cadenas H). Las dos externas más pequeñas, se denominan “cadenas ligeras” (cadenas L). Podemos encontrar dos tipos de cadenas ligeras: kapa y lambda(296). El monómero de cadena ligera tiene un -7- II. Revisión bibliográfica peso molecular aproximado de 22,5 kDa mientras que en los dímeros asciende a 45 kDa. Debido a su pequeño tamaño, monómeros y dímeros de proteínas de BenceJones atraviesan fácilmente los capilares del glomérulo dando lugar a la mencionada proteinuria(35, 197). Las proteínas de Bence-Jones se denominan así desde que Henry Bence Jones, en 1846, determinó la importancia de su detección en la orina. Normalmente se asocian a mielomas múltiples(58, 392) apareciendo, en el perro, en el 40% de los casos(383), pero pueden encontrarse también en animales con macroglobulinemia(296), leucemia(35, 82) , amiloidosis(322, 349), leishmaniosis visceral(144) y pioderma crónica(53). Las proteínas de Bence-Jones no son productos de degradación de proteínas anómalas de mielomas, sino que son sintetizadas por células plasmáticas(296). En el hombre se ha descrito la proteinuria ortostática o postural. Aparece en un porcentaje pequeño de personas y consiste en una proteinuria moderada durante el día que disminuye cuando el individuo se acuesta(106). La pérdida de proteína diaria es menor de 1 gramo y se trata principalmente de albúmina(325). El mecanismo de la proteinuria postural se desconoce pero se asocia con congestión o isquemia renal(106). No se ha descrito en animales(295). En el estudio de la proteinuria existen dos conceptos importantes de definir: concentración de proteína y contenido proteico. La “concentración de proteína” de la orina se define como la cantidad de proteína por unidad de volumen de orina, mientras que el “contenido de proteína” relaciona el volumen de orina y la concentración de proteína de la misma. La concentración de proteína urinaria no refleja con fiabilidad la pérdida diaria de proteína -8- II. Revisión bibliográfica debido a las variaciones del volumen urinario en el mismo animal y entre distintos animales. De este modo, la medida del contenido proteico es más fiable porque se considera el volumen de orina que se está produciendo(134). II.2.- FISIOLOGÍA II.2.1.- Proteína urinaria en perros sanos Las proteínas presentes en la orina de perros sanos son las filtradas por el glomérulo y que no se reabsorben en el túbulo, proteínas de Tamm-Horsfall, globulinas secretoras procedentes del tracto urinario(106), células epiteliales de túbulos y vías urinarias bajas, enzimas(195), pequeñas cantidades de albúmina y proteínas de peso molecular alto(276). La cantidad de proteína presente en la orina humana es menor de 10 mg/dl(189, 295, 317, 325). En la orina de animales sanos también es normal encontrar un contenido pequeño de proteínas: valores inferiores a 20 mg/kg/día(103), a (202, 366) 30 mg/kg/día , o concentraciones situadas entre 0 y 56 mg/dl en muestras (189, 295, 317) obtenidas al azar . La importancia de la concentración de proteína urinaria varía de acuerdo a la densidad de la orina(338). Normalmente, concentraciones de 100 mg/dl o inferiores en una orina normal no son significativas. Sin embargo, si la orina es hipostenúrica, cualquier cantidad de proteína puede ser anormal(220). La pérdida diaria normal de proteína urinaria en perros se ha cifrado en menos de 1 g/día(358), menos de 400 mg/día(17, 37) y menos de 300 mg/día(119). Existe cierta confusión porque métodos distintos dan resultados también diferentes(111). Utilizando -9- II. Revisión bibliográfica Coomassie Brilliant Blue (CBB), Grauer et al.(168) obtuvieron en Beagles adultos, aunque jóvenes aún, valores que oscilaban entre 0,6 y 5,1 mg/kg/día de excreción de proteína en orina. Este valor es inferior al obtenido por McCaw et al.(263), que encontraron utilizando el mismo método (CBB) que los perros objeto de su estudio excretaban de 1,8 a 22,4 mg/kg/día de proteína en orina. Usando el método del ácido tricloroacético Ponceau-S (TAC-PS) para esta determinación, White et al.(408) y Center et al.(67) obtuvieron resultados similares (la excreción máxima de proteína fue de 11,7 mg/kg/día). Según estos resultados, una concentración de proteína urinaria superior a 20 mg/kg/día evaluada por los métodos CBB y TAC-PS no es normal(250). Esta cifra se corresponde con un cociente proteína/creatinina en orina (U P/C) situado entre 0,67 y 0,96, valor acorde con las ecuaciones de regresión lineal establecidas para perros(67, 168, 263, 408). Barsanti y Finco(17), en 1979, midieron la concentración de proteína urinaria por los métodos CBB y TAC-PS en 193 orinas producidas por 157 Beagles que no presentaban enfermedad del tracto urinario. Esta concentración fue similar en 145 muestras, tanto por el método CBB (media = 23 mg/dl, rango de 4 a 64 mg/dl) como por el TAC-PS (media = 20 mg/dl, rango de 4 a 95 mg/dl). La pérdida media de proteína urinaria en 24 horas en 10 animales fue más alta para el método CBB (media = 70 mg, rango de 24 a 197 mg) que para el TAC-PS (media = 38 mg, rango de 18 a 141 mg). El cociente U P/C en muestras de orina de 24 horas se correlacionó mejor (r = 0,96) con la pérdida de proteína en 24 horas que la concentración de proteína urinaria (r = 0,83) con ese mismo valor. Esto implica que dicho cociente predeciría mejor la pérdida de proteína en 24 horas que únicamente la medida de la concentración de proteína urinaria. - 10 - II. Revisión bibliográfica Biewenga et al.(32), en 1982, evaluaron 29 perros clínicamente normales de varias razas, sexos y edades y obtuvieron un rango de valores situado entre 2,7 y 23,2 mg/kg de excreción diaria de proteína por el método de TAC-PS, mientras que DiBartola et al.(106), por el mismo método y en 17 perros (6 machos y 11 hembras), obtuvieron unos valores de 4,55 a 28,3 mg/kg/día. En ellos la excreción de proteína en 24 horas no fue significativamente diferente entre machos (16,5 ± 10 mg/Kg/día) y hembras (12,4 ± 6,1 mg/kg/día). En el estudio realizado por Barsanti y Finco(17) reseñado anteriormente, no existieron diferencias significativas en la concentración de proteína urinaria entre muestras recogidas por micción voluntaria, cistocentesis o sondaje. La concentración de proteína urinaria de perros machos y hembras no fue significativamente diferente (p > 0,05) cuando la orina se recogió por cistocentesis o por sondaje. Sin embargo, sí fue significativamente mayor (p < 0,01) la de orina recogida por micción voluntaria en perros machos que en hembras. La concentración de proteína urinaria no se correlacionó con el peso o área corporal o edad. Tampoco se correlacionó estadísticamente con la concentración de creatinina urinaria (r = 0,43) y la densidad urinaria (r = 0,49). II.2.2.- Proteinuria funcional La proteinuria funcional, caracterizada por un aumento en la excreción de proteína urinaria en ausencia de enfermedad renal, es temporal, reversible y, normalmente, moderada y no patológica(263, 366). Aparece en situaciones caracterizadas por un aumento en la actividad del sistema nervioso simpático y consiste fundamentalmente en la pérdida de albúmina(106). Su mecanismo de producción se relaciona con una vasoconstricción renal o con cambios en la permeabilidad capilar del - 11 - II. Revisión bibliográfica glomérulo(263) que fuerzan el paso de proteínas a la orina(134). Se asocia a ejercicio intenso(263, 295, 325, 366) , convulsiones(195), fiebre, exposición a temperaturas extremas, estrés y fallo cardíaco congestivo(15, 295, 325, 366) . La proteinuria del fallo cardíaco congestivo se considera un tipo de proteinuria funcional como resultado de la congestión pasiva crónica de los riñones(295, 325, 331) . La proteinuria funcional se ha caracterizado muy bien en medicina humana, pero en perros aún no se conoce todo sobre ella(15, 366). II.2.3.- Origen de la proteína normal urinaria Cuando la sangre fluye a través del glomérulo, el grado con el que las proteínas plasmáticas son filtradas depende de su concentración en el plasma, tamaño molecular, forma y carga(96). La proporción de proteínas plasmáticas filtradas que aparecen en orina depende también del grado de reabsorción a nivel tubular. Así, proteínas de bajo peso molecular son reabsorbidas activamente desde el filtrado tubular, catabolizadas por las células del túbulo proximal, y retornadas a la sangre como aminoácidos(250). II.2.3.1.- Filtración glomerular La orina es un ultrafiltrado del plasma. El filtrado atraviesa tres capas al pasar desde la luz capilar a la cápsula de Bowman(15, 43): - 12 - II. Revisión bibliográfica - Células endoteliales que revisten los capilares glomerulares. - Membrana basal del glomérulo (no celular): - Lámina interna. - Lámina densa. - Lámina externa. - Células epiteliales de la cápsula de Bowman (podocitos), con sus interdigitaciones (pedicelos). La integridad de las tres láminas asegura el paso restringido de proteínas al filtrado glomerular(43). Las células endoteliales impiden el contacto de los glóbulos rojos y las plaquetas con la membrana basal (filtro principal). Los podocitos mantienen esta membrana y realizan una función fagocítica al retirar macromoléculas atrapadas en el filtro. En las tres láminas del filtro hay glucoproteínas, que proporcionan una carga negativa que restringe el transporte de aniones(15). Localizadas entre las células epiteliales existen células mesangiales que proporcionan soporte estructural a la membrana basal del glomérulo y que, como pertenecen al sistema reticuloendotelial, tienen capacidad fagocítica(202). El paso de moléculas a través del filtro glomerular depende, por tanto, de la concentración plasmática, tamaño molecular, estructura y carga eléctrica(15). El tamaño de la proteína parece ser el factor más determinante a la hora de atravesar la membrana basal del glomérulo(295, 325, 331). El paso de proteínas disminuye a medida que aumenta el peso molecular, por eso, proteínas de alto peso molecular (p. ej. IgM, cuyo peso molecular es de 900 kDa) no aparecen en el filtrado glomerular en cantidades apreciables(250). En general, proteínas con un peso molecular mayor o igual a 70 kDa(295, 325, 331) y un diámetro superior a 34 nm(166) no atraviesan la barrera - 13 - II. Revisión bibliográfica glomerular. La discriminación del tamaño molecular parece ser una función, principalmente, de la membrana basal del glomérulo(43, 166). Aunque el plasma contiene altas concentraciones de albúmina, en el filtrado glomerular sólo aparecen pequeñas cantidades, ya que posee un peso molecular de aproximadamente entre 66 kDa(250) y 69 kDa, y un diámetro de 36 nm(166). Esta proteína, con carga negativa y peso molecular que se aproxima al tamaño de los poros de la barrera de filtración, puede constituir el 40 al 60% de las proteínas urinarias normales(195). Las proteínas de bajo peso molecular, que para Lulich y Osborne(250) son las de peso molecular inferior a 45 kDa, son filtradas libremente por el glomérulo renal. La concentración de estas proteínas en la orina, como lisozima, mioglobina(195) y amilasa(81), depende de sus niveles en plasma. Así, proteínas plasmáticas de peso molecular comprendido entre 1,5 y 45 kDa se filtran fácilmente pero aparecen en menor cantidad en la orina porque su concentración también es menor en el plasma. Aunque la hemoglobina tiene un peso molecular pequeño, raramente aparece en el filtrado ya que, normalmente, se encuentra unida a la haptoglobina, cuyo peso molecular es muy grande y que utiliza como sistema de transporte(250). Existen otros factores que, en menor medida que el tamaño molecular, también intervienen en el paso de moléculas a través del glomérulo. Uno de ellos es la forma de la proteína. Moléculas con forma alargada atraviesan mejor la pared del glomérulo que las que tienen forma esférica. Esto es lo que se conoce como “impedimento estérico”(106). - 14 - II. Revisión bibliográfica La interacción electrostática entre macromoléculas y el filtro glomerular es un factor limítrofe importante en la inclusión de proteínas aniónicas, como la albúmina, en el filtrado glomerular. Todas las láminas de la pared glomerular contienen glucoproteínas que son el origen de la carga negativa fija del glomérulo(43). Con ello se facilita el paso de cationes y se impide el de aniones(195) como la albúmina(250). El endotelio capilar y la lámina interna de la membrana basal del glomérulo son el obstáculo más grande a la circulación de polianiones. En un estudio experimental en el que se provocó daño glomerular, se redujo la carga negativa fija de la pared glomerular con el consiguiente aumento en la filtración de polianiones(43). II.2.3.2.- Secreción tubular Las células epiteliales de los túbulos renales secretan pequeñas cantidades de proteínas a la luz tubular. La proteína de Tamm-Horsfall, también llamada uromucoide, es una mucoproteína sintetizada por las células epiteliales y con actividad antiviral(15, 143, 366) . Se trata de una alfa-globulina que procede del asa ascendente de Henle, túbulos distales y túbulos colectores y se encuentra presente en la orina del perro en una concentración de 0,5 a 1 mg/dl(317). Su localización tan precisa hace que la proteína de Tamm-Horsfall constituya un marcador útil de daño renal a ese nivel(88). En seres humanos se ha demostrado que puede estar relacionada con la patogénesis de algunos procesos renales como el síndrome de Fanconi o una nefropatía por cadmio(85, 161). Los túbulos renales secretan también una uroquinasa e inmunoglobulina A secretora(15, 366). - 15 - II. Revisión bibliográfica II.2.3.3.- Procedente del tracto urogenital inferior En condiciones normales, además de las proteínas ya enumeradas que aparecen en la orina (filtradas por el glomérulo y secretadas por los túbulos renales), puede también encontrarse una pequeña cantidad de proteína procedente de los tractos genital y urinario inferior(15, 366). II.3.- FISIOPATOLOGÍA La proteinuria patológica puede aparecer por causas prerrenales, renales y postrenales(71). Según esto, la clasificación de la proteinuria se realiza normalmente dependiendo de cuál sea la zona anatómica de la que procede el exceso de proteínas: II.3.1.- Proteinuria prerrenal La proteinuria prerrenal se produce por el paso de proteínas desde la sangre a la orina a través de un riñón sano(134). Es consecuencia de alteraciones en sistemas orgánicos no localizados en el tracto urogenital y consiste normalmente en una albuminuria de grado medio, de presentación temporal(250), poco frecuente en animales de compañía(217) y rara vez de importancia clínica. Suele acompañarse de una concentración sérica anormalmente alta de proteínas de bajo peso molecular(402) provocada entre otras causas, por ejemplo, por deficiencia de proteínas plasmáticas transportadoras, que conlleva el aumento de proteínas libres disponibles para la filtración. Las proteínas atraviesan la barrera de filtración glomerular y su alta concentración supera la capacidad de reabsorción tubular(15). - 16 - II. Revisión bibliográfica Existen otras causas, como son: - Los monómeros y dímeros que constituyen las cadenas ligeras de inmunoglobulinas (proteínas de Bence-Jones), de peso molecular de 22 kDa(106) y que aparecen en el mieloma múltiple, también pueden causar proteinuria prerrenal(214). - Las paraproteinemias son desórdenes que implican la producción de grandes cantidades de inmunoglobulinas de un único clon de células plasmáticas y se asocian con algunos casos de leucemia, linfoma e infecciones crónicas(117). También dan lugar a proteinuria prerrenal. - El exceso de hemoglobina en la circulación (peso molecular de 68 kDa)(106), como resultado de hemólisis intravascular (p. ej. anemia hemolítica autoinmune), puede superar la capacidad transportadora de la haptoglobina y hacer que toda la hemoglobina libre sea filtrada por el glomérulo provocando hemoglobinuria(15). Otras causas de hemólisis intravascular las constituyen las patologías microangiopáticas, enfermedades hereditarias eritrocitarias y procesos oxidativos de los glóbulos rojos (en casos de intoxicación por cebolla, paracetamol y cobre)(366). - Otra forma de proteinuria prerrenal es la pérdida masiva de mioglobina (peso molecular de 17 kDa)(106) por daño muscular grave como consecuencia de trauma(15), polimiositis grave, ejercicio extremo u otras causas de rabdomiolisis(366). II.3.2.- Proteinuria renal La proteinuria asociada con enfermedad renal primaria puede tener tres orígenes(163): - 17 - II. Revisión bibliográfica - Glomerular, por aumento de la filtración de proteínas. - Tubular, por disminución de la reabsorción o aumento de la secreción de proteínas. - Por inflamación del parénquima renal. II.3.2.1.- Glomerular Aunque puede existir daño glomerular moderado sin aumento detectable de proteínas urinarias(32), una proteinuria persistente, en ausencia de infección del tracto urinario o de sedimento urinario que indique inflamación del tracto urinario inferior, es el rasgo distintivo de la enfermedad glomerular(66, 168) . En fases iniciales de la enfermedad glomerular, los túbulos, el intersticio renal y los vasos sanguíneos pueden no estar afectados. Cuando avanza la enfermedad, lo que normalmente es inevitable, estas estructuras también resultan dañadas(142). Además, la proteinuria puede aparecer en las fases iniciales de otras patologías, persistir durante meses o años en algunos animales y observarse en perros con morfología glomerular aparentemente normal(32). En general, la enfermedad glomerular y la pielonefritis son las únicas condiciones que dan lugar a una proteinuria renal clínicamente significativa(220, 271). Se ha inducido experimentalmente una proteinuria glomerular por “sobrecarga” en perros y ratas mediante administración parenteral de grandes cantidades de proteínas plasmáticas. Cuando la concentración de proteínas plasmáticas alcanzaba un valor de 9 g/dl, se excretaban en orina grandes cantidades de albúmina y proteínas de alto peso molecular(226). En otra experiencia, se han detectado alteraciones morfológicas en el glomérulo en ratas en los episodios de hiperproteinemia y proteinuria(275, 406) . Estas alteraciones desaparecen tras la resolución de la hiperproteinemia y la proteinuria. La proteinuria glomerular por “sobrecarga” debería - 18 - II. Revisión bibliográfica ser considerada como causa de proteinuria en animales que presentan hiperproteinemia (p. ej. animales con mieloma múltiple o ehrlichiosis)(65). En el perro, la excreción de proteína urinaria por encima de 29 mg/kg/día(106), de 65 mg/dl con cualquier densidad(17), o un cociente U P/C mayor de 2(67), generalmente denota enfermedad glomerular(108). La proteinuria es más intensa en su fase inicial aunque puede disminuir, cuando el proceso avanza, por disminución de la filtración glomerular(67). A menudo supera los 400 mg/kg/día(366) y es la más conocida y grave en el perro. Se produce por alteraciones en la barrera glomerular como consecuencia de enfermedades que actúan a este nivel dando lugar a la pérdida de proteínas plasmáticas(366). La proteinuria puede mantenerse sin mostrar sintomatología hasta que la pérdida de proteína supere los 3,5 g/día, situación asociada, normalmente, con el síndrome nefrótico(240). Aunque éste se define como la combinación de proteinuria, hipoalbuminemia, edema, hiperlipidemia y lipiduria, actualmente es sinónimo de pérdida urinaria masiva de proteínas(366). El daño glomerular se caracteriza por la pérdida de las cargas negativas fijadas en los capilares del glomérulo(250). Estos cambios estructurales pueden producirse por procesos primarios como neoplasias(340), enfermedad por autoanticuerpos de la membrana basal o inflamación, y secundarios como depósito de inmunocomplejos, amiloidosis, hiperfiltración(250) o (196, 292) hiperadrenocorticismo . En las glomerulopatías inicialmente predomina la albuminuria pero si progresa la lesión renal aparecen proteínas de alto peso molecular (inmunoglobulinas y proteínas de la coagulación)(250, 295, 325). Se ha demostrado que la pérdida de cargas negativas glomerulares se asocia con proteinuria(150), más concretamente con la pérdida de albúmina y transferrina, y con la pérdida de podocitos(194). Pero aún no se ha encontrado explicación a las variaciones en la permeabilidad a la IgG y a proteínas plasmáticas mayores. Aunque su pérdida puede implicar daño estructural en la membrana basal del glomérulo, se ha demostrado que en - 19 - II. Revisión bibliográfica algunas personas con glomerulonefritis, únicamente la IgG con un pk inferior a 8 se pierde selectivamente, a pesar de que el pk de la IgG sérica abarca un rango de 5,5-10(280). A medida que el proceso avanza y se dañan más nefronas, la filtración glomerular va disminuyendo. Las nefronas que aún son funcionales compensan la pérdida de tejido renal no funcional incrementando el grado de filtración glomerular por nefrona(312). La hiperfiltración de las nefronas aún funcionales puede exacerbar la proteinuria y aumentar la hialinización glomerular y la esclerosis. La relación causal entre hiperfiltración glomerular y glomeruloesclerosis o depósito glomerular de fibrina no se ha establecido(166) pero la teoría de la hiperfiltración se ha demostrado en perros(50, 160) . Las dos causas más comunes de proteinuria son amiloidosis renal y glomerulonefritis(15, 366) , sobre todo esta última(80, 250, 278) con proteinuria, en casos aislados, por encima de 20 g/día(298). Se diferencian mediante microscopía óptica porque la amiloidosis presenta depósitos en el glomérulo con propiedades tintoriales específicas, y en la glomerulonefritis las lesiones glomerulares no contienen sustancia amiloide(202). Amiloidosis renal La amiloidosis se refiere a un grupo diverso de enfermedades caracterizadas, histológicamente, por el depósito extracelular de fibrillas formadas por la polimerización de proteínas, que adoptan el denominado patrón transversal beta(24, 77, 100, 109) . La configuración que poseen dota a estas proteínas de sus propiedades de insolubilidad, resistencia a la proteolisis y características específicas de tinción(15, 101). - 20 - II. Revisión bibliográfica Así, por microscopía óptica y con hematoxilina-eosina, la sustancia amiloide se visualiza con aspecto homogéneo y eosinófilo(101, 166) . La sustancia amiloide tiene birrefringencia verde teñida con rojo Congo y observada con luz polarizada(74, 100). Esta característica se usa en el diagnóstico clínico de la enfermedad, siendo la conformación de la proteína y no su secuencia aminoacídica la responsable de esta propiedad(101). La amiloidosis se clasifica según la distribución de los depósitos (localizada o sistémica) y la naturaleza de la proteína fibrilar y de su precursor. La amiloidosis localizada afecta exclusivamente a un órgano y es rara en animales domésticos. El proceso sistémico afecta a más de un órgano y se han descrito la amiloidosis reactiva (secundaria), la asociada a inmunoglobulinas y la familiar. La primera de ellas se caracteriza por el depósito tisular de la proteína amiloide A (amiloide AA)(166). La amiloidosis familiar en la raza Shar Pei es un ejemplo de amiloidosis sistémica reactiva(100). La asociada a inmunoglobulinas se caracteriza por el depósito tisular de fragmentos amino-terminal de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y se ha descrito en animales domésticos(349). Las distintas proteínas amiloides tienen tropismo hacia determinados tejidos, pero el motivo de esto no se conoce: la proteína amiloide AA tiene predilección por riñón, bazo e hígado y la asociada a inmunoglobulinas por riñón, bazo, hígado, lengua, corazón y sistema musculoesquelético. También se desconoce porqué la sustancia amiloide tiene tropismo por tejidos diferentes según la especie: en el perro por el riñón, en el gato por el hígado, etc.(166). Los distintos tipos de sustancia amiloide, teñidos con rojo Congo, presentan birrefringencia verde, pero el único sensible a la oxidación por permanganato (pierde su afinidad por la tinción) es el formado por la proteína amiloide AA, típica de la - 21 - II. Revisión bibliográfica amiloidosis reactiva, y por β2-microglobulina(105, 101, 110, 166) . Aunque los depósitos constituidos por β2-microglobulina se han observado en personas con fallo renal crónico(105) y amiloidosis(166), no se han descrito en animales domésticos(99, 105, 110, 166). En el hombre se han referido distintas clases de amiloidosis pero, en pequeños animales, la única significativa es la amiloidosis sistémica reactiva que se asocia a procesos inflamatorios, neoplasias y enfermedades infecciosas crónicas(105, 259) . Es decir, a procesos que provocan una estimulación inmunológica crónica aunque la amiloidosis puede desarrollarse sin causa predisponente conocida(108). Los depósitos amiloides son fragmentos amino-terminal de la proteína amiloide A sérica (AAS) que se ha caracterizado en distintas especies. En todas ellas, los aminoácidos de las posiciones 33 a la 45 son los mismos, lo que sugiere un importante papel funcional de esta parte de la molécula. Aún no está claro si la proteína amiloide A sérica es degradada parcialmente a amiloide AA en el plasma y, posteriormente, depositada en los tejidos o si se deposita en ellos y allí es parcialmente fragmentada para iniciar la formación de fibrillas(166). La concentración sérica normal de proteína amiloide A es aproximadamente de 1 mg/l y aumenta de 100 a 1000 veces cuando se produce daño tisular (neoplasia, inflamación, trauma, etc.)(166). Sin embargo, unos niveles altos de amiloide A sérica no provocan automáticamente amiloidosis, lo que sugiere la implicación de factores hereditarios o medioambientales en su aparición(105). La proteína amiloide A sérica está presente en concentraciones elevadas en procesos inflamatorios crónicos(15, 25, 100). Sin embargo, sólo un 10% de individuos con enfermedad inflamatoria crónica acaban por desarrollar una amiloidosis(100). El daño crónico en el organismo y a nivel tisular - 22 - II. Revisión bibliográfica desencadena la síntesis hepática excesiva de la proteína amiloide A sérica que sufre polimerización y origina un daño progresivo(105). La capacidad que tiene el plasma, en condiciones normales, para degradar la proteína amiloide A disminuye en casos de amiloidosis y de enfermedad inflamatoria crónica(21). Esta actividad se relaciona con la concentración sérica de albúmina, de modo que la hipoalbuminemia, en casos de amiloidosis, puede contribuir a la disminución de esa capacidad. Por otro lado, en casos de inflamación crónica aumenta la síntesis de inhibidores de proteasas, aumenta la concentración de proteína sérica amiloide A y, consecuentemente, se favorece la formación de depósitos amiloides(166). En los perros el depósito amiloide se produce sobre todo en el riñón(112), con más frecuencia en el glomérulo que en la médula renal(74, cualquier otro órgano 109, 358) y antes que en (142) . La sustancia amiloide se sitúa en el mesangio y en las paredes capilares del glomérulo, interfiriendo en el funcionamiento normal glomerular por su presencia física(166). El depósito glomerular suele ser difuso, global y marcado(109, 112) mientras que el medular es menos grave y, normalmente, multifocal(109). También se ha descrito en bazo, hígado, glándulas adrenales, páncreas y submucosa intestinal(70, 174, 381) . El examen histológico de los riñones con amiloidosis reactiva pone en evidencia la existencia de glomérulos grandes o pequeños y escleróticos y casi totalmente reemplazados por sustancia amiloide. La cápsula de Bowman se engrosa y, generalmente, se produce atrofia y degeneración tubular. En el intersticio aparecen grupos dispersos de linfocitos y células plasmáticas(39). La sustancia amiloide da lugar a fibrosis y disminución del aporte sanguíneo hacia la parte más interna de la médula con la consiguiente necrosis papilar e incapacidad del riñón de concentrar la orina(15). Se ha - 23 - II. Revisión bibliográfica demostrado que, en la amiloidosis, las lesiones histológicas se correlacionan mal con los parámetros laboratoriales de funcionalidad renal(109). En perros con amiloidosis la proteinuria es moderada o grave porque la localización predominante de los depósitos amiloides es glomerular(67, 100, 108, 109) . Aunque la amiloidosis se produce también como una enfermedad familiar en perros Chinese Shar Pei(110) de los que un 36% presentan depósitos en médula renal, sin presencia significativa en glomérulo(15, 100) , y proteinuria media o inexistente(100). Por todo esto, la ausencia de proteinuria no descarta el diagnóstico de amiloidosis, especialmente en esta raza de perros(101). En un estudio en 1992 realizado por Bowles y Moiser(39) en perros Beagles con amiloidosis, los signos más comunes fueron letargia, anorexia, vómitos y pérdida de peso. Las anomalías clinicopatológicas más frecuentes fueron anemia normocítica y normocrómica, hipoalbuminemia, azotemia, hipercolesterolemia, proteinuria e hipostenuria. El examen histológico del riñón reveló amiloidosis glomerular de moderada a grave y amiloidosis medular intersticial media. Secciones de riñón teñidas con rojo Congo fueron sensibles a permanganato potásico, lo que sugiere amiloidosis reactiva. Ninguno de los signos clínicos o hallazgos laboratoriales, aunque sugieran la existencia de amiloidosis, son lo suficientemente específicos para permitir su diagnóstico. Por tanto, la diferenciación entre la amiloidosis renal y otras nefropatías que cursen con pérdida de proteínas requiere invariablemente el examen histológico de tejido renal(358). - 24 - II. Revisión bibliográfica Glomerulonefritis El término glomerulonefritis describe la proliferación celular del glomérulo y el engrosamiento de la pared de sus capilares(164, 277) . Se trata de un proceso inmuno-mediado asociado a estímulos antigénicos crónicos, enfermedades infecciosas, inflamatorias y neoplásicas(15, 79), desórdenes metabólicos como diabetes mellitus(371) e hiperadrenocorticismo y a la administración de determinados fármacos y vacunas(162, 366) . No existe predisposición racial ni de sexo para el desarrollo de glomerulonefritis, aunque suele aparecer en torno a los cinco años de edad en el perro(240). La glomerulonefritis, ya sea primaria o secundaria a otro proceso, no es una causa frecuente de enfermedad en animales de granja(320). 1.- Glomerulonefritis por complejos antígeno-anticuerpo: los complejos antígeno-anticuerpo, situados en el glomérulo, activan el complemento y provocan daño glomerular por una reacción de hipersensibilidad de tipo III(165). Puede ocurrir de dos maneras: a) Los complejos circulantes previamente quedan atrapados en el glomérulo antígeno-anticuerpo formados (15, 164, 165) . Ocurre cuando existe un exceso moderado de antígenos o un número equivalente de antígenos y anticuerpos en la circulación(166). Si los anticuerpos son grandes los complejos formados también alcanzan un gran tamaño, son insolubles y se eliminan rápidamente de la circulación por células fagocíticas. Si, por el contrario, los antígenos son los de tamaño elevado, los complejos inmunes no se unen fácilmente al complemento y, por tanto, tienen poca capacidad para producir daño inmunológico(264). El depósito glomerular de complejos inmunes formados previamente da lugar a un patrón inmunofluorescente granular con una localización mesangial o subendotelial de dichos complejos(166). - 25 - II. Revisión bibliográfica b) Los complejos inmunes se forman en el glomérulo debido a antígenos de origen no glomerular y, posteriormente, quedan atrapados en su membrana(15, 164, 165) . Los antígenos se localizan en los capilares del glomérulo por interacción eléctrica o afinidad bioquímica con la membrana basal glomerular(164). Su depósito da lugar a un patrón inmunofluorescente liso y lineal y se produce, principalmente, a nivel subepitelial(166). 2.- Glomerulonefritis autoinmune: existe una producción temporal de anticuerpos dirigidos contra la propia membrana basal del glomérulo(417). Puede surgir espontáneamente, o seguir a un daño glomerular que origine una membrana basal antigénica. En algunos casos, su origen se produce por una combinación de factores: en el hombre se cree que la glomerulonefritis posterior a una infección estreptocócica es de tipo autoinmune(180), aunque Markowitz et al.(255) demostraron que algunos estreptococos y la membrana basal del glomérulo cuentan con antígenos comunes. Así, la respuesta inmune que seguiría a la infección podría ir, en parte, dirigida contra la membrana basal del individuo enfermo. Es un proceso raro en personas porque su diagnóstico requiere estudios de microscopía electrónica y/o inmunofluorescencia(180). No se ha demostrado en condiciones naturales en el perro(15, 80, 108, 166, 179), aunque sí se ha inducido experimentalmente en esta especie(421) y se ha descrito en un caballo(14). 3.- Depósito de inmunoglobulinas: las inmunoglobulinas son de tipo G, M o A y su localización puede ser intramesangial, subepitelial o subendotelial a lo largo de la membrana basal(48). En personas está descrita una nefropatía por depósito de IgA llamada enfermedad de Berger(26). Este depósito es frecuente en perros sanos y, aunque es más frecuente acompañando a lesiones glomerulares, en los casos de perros proteinúricos el depósito de IgA no se asocia específicamente con este tipo de lesiones(32). Miyauchi et al.(272) realizaron la necropsia de 100 perros y encontraron que, - 26 - II. Revisión bibliográfica por inmunofluorescencia, el 47% tenía depósitos de IgA. En algunos animales, además de IgA, encontraron IgG, IgM y complemento. Aunque en algunos perros que presentaban depósitos de IgA se identificaron lesiones glomerulares, la localización de los complejos inmunes dentro del glomérulo no significa necesariamente lesión glomerular importante. Existen procesos no renales, como ciertas patologías hepáticas, que provocan el depósito glomerular de inmunocomplejos, especialmente IgA(124). En el perro la causa de glomerulonefritis parece ser la formación de complejos inmunes en el glomérulo o el hecho de que, una vez formados, queden atrapados en él(66, 89). Los antígenos que pueden inducir daño glomerular inmunomediado pueden ser exógenos, como agentes químicos, bacterianos, parasitarios o virales(410, 420) o endógenos, como ADN, inmunoglobulinas, tiroglobulina, antígenos asociados a tumores y antígenos del epitelio tubular renal(5, 269, 410). Entre los procesos relacionados con el desarrollo de glomerulonefritis se han descrito: piometra, neoplasias, lupus eritematoso sistémico, dirofilariosis, adenovirus canino tipo 1, pancreatitis, diabetes mellitus(5, 8, 31, 239, 419, 420) y leishmaniosis(76, 145, 228, 356, 393). También se han descrito, en perros clínicamente sanos, cambios glomerulares similares a los observados en varias formas de glomerulonefritis(372). Al daño glomerular contribuye la acción de células inflamatorias (leucocitos polimorfonucleares, monocitos y macrófagos), proteínas del complemento, plaquetas, factores que intervienen en la coagulación y metabolitos del ácido araquidónico(410). Las plaquetas juegan un papel importante en el inicio y progresión de la enfermedad. La activación plaquetaria en el endotelio glomerular, dañado por los complejos inmunes, aumenta la lesión glomerular porque se liberan agentes vasoactivos y proteínas catiónicas que alteran la permeabilidad glomerular(57). Por otro lado, los linfocitos T son activados al reconocer el antígeno, contribuyendo al daño glomerular inmunomediado - 27 - II. Revisión bibliográfica ya que activan a otras células mononucleares. Las células mesangiales también activan a los linfocitos T(267). Los tromboxanos, las prostaglandinas y los leucotrienos son metabolitos del ácido araquidónico. Los primeros parecen ser importantes mediadores de la inflamación y de la proteinuria asociada a la glomerulonefritis(167, 246) . Inducen la agregación plaquetaria, tienen quimiotaxis para los neutrófilos y provocan vasoconstricción y contracción de las células mesangiales, lo que disminuye la filtración glomerular(281). Las prostaglandinas, por el contrario, inhiben la agregación plaquetaria y tienen efectos anti-inflamatorios y vasodilatadores en el riñón. Los leucotrienos, al igual que los tromboxanos, disminuyen la filtración glomerular por vasoconstricción y contracción de las células mesangiales(208). Además, los leucotrienos atraen neutrófilos y promueven la activación leucocitaria así como la proliferación de las células mesangiales(365). La excreción urinaria elevada de tromboxanos se relaciona con inflamación glomerular mientras que la de leucotrienos es más específica para la inflamación aguda(235). La localización de los complejos inmunes en las paredes capilares del glomérulo puede influir en la respuesta inmune. Por ejemplo, a nivel subepitelial activan el complemento y producen proteinuria, pero no hay respuesta inflamatoria mediada por neutrófilos y macrófagos. La activación del complemento provoca la llegada de neutrófilos y macrófagos pero la membrana basal retira los depósitos inmunes de la circulación y se impide la adherencia de células inflamatorias. Según esto, los complejos inmunes a nivel subepitelial pueden aumentar la permeabilidad glomerular en ausencia de células inflamatorias. Si, por el contrario, los complejos inmunes se forman o se localizan cercanos a la luz capilar, p. ej. a nivel subendotelial, encontramos más evidencia histológica de inflamación(166). El glomérulo responde a - 28 - II. Revisión bibliográfica esta agresión con proliferación celular del mesangio, engrosamiento de su membrana basal(66) y, finalmente, hialinización glomerular y esclerosis(166). La glomerulonefritis se puede clasificar según la apariencia de las paredes capilares del glomérulo, infiltración celular, y grado de fibrosis en: membranosa, proliferativa, membranoproliferativa y esclerótica(260). En el hombre esta clasificación se usa para instaurar el tratamiento y establecer el pronóstico pero, en pequeños animales, esta clasificación no se ha correlacionado con el proceso(15). Las características más importantes desde el punto de vista de microscopía óptica son: 1.- Membranosa: se produce el engrosamiento difuso de la pared capilar de la membrana basal y el depósito subepitelial de los complejos inmunes(48, 80, 199), con una población celular normal(66) o incluso con disminución de esta población(202). 2.- Proliferativa o mesangioproliferativa: se caracteriza por proliferación celular a nivel del mesangio(48, 80) , lo que resulta en el aumento del entramado glomerular(66), estrechamiento de la luz capilar del glomérulo y, por tanto, disminución del flujo sanguíneo y del grado de filtración glomerular(202). 3.- Membranoproliferativa: se produce un aumento del número de células mesangiales y del grosor de las paredes capilares del glomérulo(48, 80), sobre todo a nivel periférico(66). 4.- Esclerótica: el glomérulo aparece retraído y en el mesangio es evidente la existencia de mucho tejido fibroso conectivo(80). - 29 - II. Revisión bibliográfica Aunque para algunos autores la prevalencia más alta de glomerulonefritis se asocia a la forma proliferativa(66, frecuentemente (80) 337) , para otros es la membranosa la observada más y en la que la pérdida de proteína/kg en 24 horas en orina y el cociente U P/C alcanzan los valores más altos(31, 66). La magnitud de la proteinuria se correlaciona mejor con la naturaleza de la lesión glomerular que con el estado de la enfermedad renal(108, 372) y el grado de (80) filtración glomerular . La proteinuria varía entre los diferentes tipos de enfermedad glomerular. Es mayor, en orden decreciente en importancia, en amiloidosis, glomerulonefritis, glomeruloesclerosis(108), atrofia glomerular o nefritis intersticial(80), aunque a veces la glomerulonefritis presenta una proteinuria más marcada que la amiloidosis(100) porque existen variaciones individuales(102). La excreción urinaria de proteínas en 24 horas y el cociente proteína/creatinina en orina también son mayores en caso de amiloidosis que en glomerulonefritis(100, 109). La proteinuria glomerular, si está causada por glomerulonefritis o amiloidosis, se caracteriza por ser de gran magnitud y, en muchos casos, dar lugar a signos clínicos relacionados con la pérdida de proteínas, como pérdida de peso, letargia y, con el tiempo, síndrome nefrótico. En algunos animales aparecen signos clínicos de tromboembolismo por la deficiencia de antitrombina III(162), una α2-globulina de 65 kDa aproximadamente de peso molecular que inhibe la coagulación(48). El tromboembolismo es más frecuente en casos de amiloidosis, probablemente porque ésta lleva asociada una pérdida mayor de proteínas que la glomerulonefritis(66). Inicialmente, la proteinuria puede ser el único signo clínico. Sin embargo, la glomerulonefritis o la amiloidosis darán lugar a daño renal y, si no se soluciona, a fallo renal y síndrome urémico(15). - 30 - II. Revisión bibliográfica II.3.2.2.- Tubular La proteinuria tubular se produce, principalmente, por la pérdida de globulinas de bajo peso molecular que son filtradas normalmente pero no son reabsorbidas en los túbulos renales. Otros dos mecanismos de producción de esta proteinuria son la secreción tubular de proteínas y la necrosis de los túbulos y la consiguiente entrada de proteínas al fluido tubular(175, 276, 303) . La proteinuria tubular, caracterizada por la presencia en orina de proteínas de bajo peso molecular, se correlaciona con daño túbulo-intersticial(22, 418). La proteinuria tubular por “sobrecarga” se asocia con una producción excesiva de proteínas de peso molecular bajo (mioglobina o hemoglobina) o con una reducción de las zonas de unión de moléculas transportadoras de estas proteínas (p. ej. la haptoglobina en el caso de la hemoglobina)(156, 384). Cuando la concentración plasmática de proteínas de peso molecular bajo (< de 45 kDa) y, por tanto, con gran facilidad para atravesar los capilares del glomérulo, es muy alta, los mecanismos de reabsorción tubular se superan y estas proteínas aparecen en orina en cantidades detectables(250). La proteinuria tubular primaria se caracteriza por una reabsorción tubular incompleta de proteínas con permeabilidad glomerular normal(15). Se debe a proteínas de bajo peso molecular (entre 1,5 y 45 kDa)(178) que atraviesan normalmente la barrera de filtración glomerular. Entre éstas encontramos enzimas (p. ej. lisozima, ribonucleasa, alanina aminopeptidasa), hormonas polipeptídicas (p. ej. calcitonina, glucagón, insulina, prolactina, hormona paratiroidea), fibrina y sus productos de degradación, proteína ligante de retinol(15), α1-microglobulina (27 kDa), β2-microglobulina (sobre 12 kDa) y aminoácidos(15, 366) . Mientras que la albúmina, la transferrina o la IgG se consideran - 31 - II. Revisión bibliográfica indicativas de daño glomerular(409), el aumento en la orina de β2-microglobulina, α1-microglobulina, lisozima y proteína ligante de retinol indica alteración tubular(423). La lisozima aparece en pequeñas concentraciones en la orina de individuos sanos pero aumenta mucho en casos de patología tubular. Ya en 1968, Hayslett et al.(187) correlacionaron la lisozimuria con un diagnóstico histopatológico de daño tubular cuando su concentración en plasma excedía los 45 µg/l. Es utilizada como marcador de disfunción tubular junto con la γ-glutamiltranspeptidasa(158) y la fosfatasa-alcalina, dos enzimas localizadas en el epitelio tubular y que, normalmente, sólo aparecen en la orina en cantidades pequeñas. Las dos cuentan con pesos moleculares altos (200 kDa y 126 kDa respectivamente), lo que impide su pérdida elevada si la membrana basal del glomérulo es normal. Incluso con niveles altos de estas enzimas en sangre, no son normalmente filtradas por el glomérulo(188). La cuantificación de β2-microglobulina también se usa para detectar daño tubular pero presenta desventajas como son su inestabilidad a pH urinario ácido (pH < 6) y la posibilidad de que varíe su concentración plasmática, independientemente de la función glomerular(183). En este sentido, la α1-microglobulina(423) y la proteína ligante de retinol(27) no presentan estas desventajas y se pueden utilizar como alternativa(28). La proteinuria tubular es rara, moderada y se asocia a casos de necrosis tubular aguda(332), fallo renal agudo(391) y crónico, riñón poliquístico y síndrome de Fanconi. La proteinuria mixta (glomerular y tubular) es más común y puede dificultar el diagnóstico(15). El síndrome de Fanconi representa un grupo de anormalidades metabólicas, asociadas a defectos de reabsorción en el túbulo proximal, que provocan la pérdida de glucosa, aminoácidos, calcio, fosfato, sodio(38, 69, 352), bicarbonato y proteínas de peso molecular inferior a 50 kDa, acompañado todo esto de acidosis tubular y poliuria, por insensibilidad a la ADH(69). Su patogénesis, independientemente de su - 32 - II. Revisión bibliográfica etiología, la explican dos hipótesis. La primera se refiere a la disminución en la reabsorción de solutos por alteración de la membrana tubular y la segunda sugiere un fallo en el metabolismo intracelular de los túbulos en la producción de energía para el transporte de solutos(19). El síndrome de Fanconi puede ser hereditario (raza Basenji) o adquirido (intoxicaciones por aminoglucósidos y metales pesados)(15, 366) . Los signos clínicos varían en función de la gravedad del defecto tubular. Generalmente, las pérdidas de glucosa y aminoácidos no son importantes pero frecuentemente aparecen polidipsia, poliuria, progresión hacia fallo renal(15) y una proteinuria normalmente moderada(19). Se ha demostrado la existencia de correlación entre la gravedad de lesiones, presumiblemente primarias, glomerulares y túbulo-intersticiales. Las alteraciones hemodinámicas y la proteinuria resultante de la disfunción glomerular pueden jugar un papel importante en la patogénesis de las lesiones túbulo-intersticiales(216). Así, en casos de fenómenos de coagulación a nivel glomerular, se produce una disminución del flujo sanguíneo intersticial(363). También influye en el daño tubular el aumento de la presión hidrostática en la luz tubular como consecuencia de la existencia de cilindros hialinos formados por la proteinuria(216). Un daño glomerular y la proteinuria derivada de ello pueden afectar por mecanismos inmunes a los túbulos. La alteración inmunomediada de los túbulos, activada por mecanismos humoral y celular, se produce por la llegada de antígenos a la membrana apical de las células tubulares por la proteinuria existente(123, 138) . La proteinuria, por sí misma, puede contribuir al daño tubular al provocar el aumento de la reabsorción a ese nivel(166). Finalmente, la filtración de transferrina en procesos que cursen con pérdida de proteína urinaria se asocia a la formación de radicales hidroxilos y a daño tubular(3). - 33 - II. Revisión bibliográfica II.3.2.3.- Inflamación del parénquima renal Los procesos catalogados como glomerulonefritis no tienen lesiones confinadas únicamente al glomérulo. Del mismo modo, las enfermedades categorizadas como nefritis túbulo-intersticiales también pueden tener lesiones glomerulares(138). Cualquier causa que provoque inflamación del parénquima renal induce la exudación de proteínas inflamatorias hacia el filtrado y por tanto proteinuria(15) generalmente de media a moderada(138). Entre las más frecuentes se encuentran infecciones, toxinas, alteraciones inmunológicas y reacciones a fármacos(15). Como consecuencia del mayor daño tubular que glomerular, la detección clínica de la nefritis túbulo-intersticial se realiza observando una alteración en la función tubular desproporcionadamente mayor(138). Entre las causas más frecuentes de inflamación del parénquima renal se encuentra la leptospirosis, zoonosis caracterizada sobre todo por provocar daño hepático y renal(12, 170, 171, 380) y que cuenta entre sus signos clínicos más comunes con proteinuria. En este proceso, el examen histológico de tejido renal revela nefritis túbulo-intersticial neutrofílica y linfoplasmocítica de moderada a grave(33) y de curso agudo o subagudo(138). Estos cambios se deben al paso de las leptospiras por las células túbulo-intersticiales para alcanzar la luz de los túbulos contorneados. Allí se multiplican y son eliminadas con la orina(270). La causa principal de la nefritis parece ser, más que las leptospiras, los determinantes antigénicos retenidos en el riñón que provocarían la reacción inflamatoria(377). - 34 - II. Revisión bibliográfica II.3.3.- Proteinuria postrenal Las proteínas plasmáticas o tisulares responsables de este tipo de proteinuria se incorporan a la orina cuando ésta ha atravesado ya el riñón. Se produce por secreciones genitales y alteraciones del revestimiento epitelial del tracto urogenital por inflamación, neoplasia, isquemia o trauma distal a los riñones(250). Esta proteinuria es normalmente moderada y está asociada a un sedimento urinario activo(15, 102). Su diagnóstico resulta sencillo pues los signos clínicos se atribuyen fácilmente al tracto urinario inferior. Las lesiones pueden afectar a los uréteres, vejiga, próstata o uretra(15), e incluyen cistitis, prostatitis, urolitiasis, neoplasia del tracto urogenital, especialmente carcinomas de células transicionales(15, 366), y vaginitis(15). La proteinuria postrenal puede distinguirse de la renal evaluando los signos clínicos y el sedimento urinario. Así, la primera se asocia normalmente con piuria y/o hematuria microscópica. En la segunda, estas células no aparecen(250). II.4.- DIAGNÓSTICO El diagnóstico de la proteinuria no sólo persigue determinar la magnitud de la misma sino también establecer si está asociada a una neoplasia, enfermedad inmuno-mediada o infecciosa, hipertensión o administración de drogas o vacunas(366). El proceso patológico causante de la proteinuria prerrenal se deduce de la historia, examen físico y otros tests laboratoriales rutinarios. La proteinuria derivada de lesiones renales es más difícil de diagnosticar y es frecuentemente asintomática en los estados iniciales de la enfermedad, cuando la pérdida de proteína es moderada. Por el contrario, la patología causante de proteinuria postrenal generalmente resulta de fácil - 35 - II. Revisión bibliográfica diagnóstico. En ella encontramos signos relacionados con el tracto urinario inferior o genital como disuria, polaquiuria, estranguria y hematuria. La investigación, identificación y tratamiento del proceso puede prevenir o enlentecer la progresión del daño renal a fallo renal. Sin embargo, muchos animales con proteinuria renal no presentan signos hasta que la enfermedad está avanzada y aparecen signos de uremia(15). La aproximación al diagnóstico debería basarse en las siguientes preguntas(15): - ¿La proteinuria es persistente?. - ¿La cantidad de proteína en la orina es significativa?. - ¿De dónde procede la proteína que se pierde?. Identificar la proteína puede ayudarnos a determinar cuál es su fuente. II.4.1.- Anamnesis Debe realizarse una historia completa ya que existen causas de proteinuria con predisposición de edad, sexo y raza. También debe preguntarse sobre la historia familiar de los animales(233, 257, 336) , sobre todo en razas con lesiones renales hereditarias(307) como amiloidosis en Shar Peis(110), síndrome de Fanconi en Basenjis(15), nefritis hereditaria en Bull Terriers(191) y Cocker Spaniels(232, 234) o glomerulopatías en Samoyedos(200), Beagles(330) o perros de las montañas de Berna(329). Otras preguntas se refieren a síntomas que hagan sospechar de enfermedad del tracto urinario inferior (volumen, color y olor anormales de la orina, incontinencia, polaquiuria y disuria)(192). Debe investigarse la administración de fármacos, vacunas y la existencia de enfermedades inflamatorias crónicas que, actuando como estímulo antigénico, provocan amiloidosis o glomerulonefritis(15). En casos de daño renal grave, con tres cuartas partes de las nefronas no funcionales, podemos encontrar fallo renal y, consecuentemente, - 36 - II. Revisión bibliográfica poliuria, polidipsia, anorexia, nauseas, vómitos(164, 334), diarrea, depresión y un aumento en la profundidad de la respiración(334). II.4.2.- Exploración física Una inflamación crónica o una neoplasia a veces está asociada a la existencia de glomerulonefritis o amiloidosis. Relacionados con fallo renal crónico podemos encontrar signos sistémicos inespecíficos, mal pelaje, depresión(15, 209), pérdida de peso, deshidratación y ulceración de la mucosa oral(166). Resulta de gran utilidad realizar un análisis minucioso del sistema urogenital, como palpación de ambos riñones, vejiga y próstata(15). Los riñones, con frecuencia, son pequeños e irregulares en perros con fallo renal crónico como consecuencia de una enfermedad glomerular, pero pueden tener un tamaño normal en animales proteinúricos sin azotemia(166). Un examen oftalmológico podría revelar hipertensión: dilatación y tortuosidad de vasos retinianos, hemorragia retiniana e hipema. Todo ello presente en casos de hipertensión sistémica grave(118, 220). También se han descrito lesiones oculares en casos de proteinuria prerrenal. Esto se debe a la alta concentración de proteínas circulantes y al consiguiente aumento de la viscosidad sanguínea(214). II.4.3.- Análisis laboratoriales II.4.3.1.- Sangre Los resultados de la hematología y bioquímica sanguínea pueden ser de utilidad en casos de proteinuria prerrenal y renal. Así, por ejemplo, la hiperproteinemia o la existencia de hemólisis o leucemia puede sugerir una causa prerrenal. Un cociente - 37 - II. Revisión bibliográfica P/C urinario elevado con pocas células en el sedimento urinario y ausencia de hiperproteinemia es una fuerte evidencia de un problema glomerular(15). II.4.3.1.1.- Hematología En perros con fallo renal y proteinuria asociada podemos encontrar una anemia normocrómica, normocítica y no regenerativa(236) y linfopenia(166). La leucocitosis es indicativa de proceso inflamatorio y, más concretamente, en un fallo renal el hallazgo de neutrofilia con desviación a la izquierda sugiere pielonefritis(261). II.4.3.1.2.- Bioquímica Debe sospecharse una enfermedad glomerular cuando se detecta hipoalbuminemia y no hay evidencia de afección preglomerular o de trastornos postglomerulares(195). La hipoalbuminemia se produce cuando la pérdida de albúmina por orina supera la capacidad del hígado de sintetizarla(366). La consiguiente disminución de la presión oncótica predispone al animal a la aparición de ascitis o edemas, hecho que ocurre con valores de albúmina plasmática de 1-1,5 g/dl(164). El hígado responde aumentando la síntesis de lipoproteínas, especialmente de colesterol, apareciendo hipercolesterolemia(6, 366). La concentración plasmática de proteínas en un proceso glomerular es variable. En la amiloidosis, la pérdida de proteínas en la orina es mayor que en casos de glomerulonefritis y, por tanto, la hipoalbuminemia será más grave(31, 108) y la cantidad de globulinas en sangre menor. En casos de glomerulonefritis podemos encontrar hiperglobulinemia por la naturaleza inflamatoria e inmunológica de la enfermedad(80). - 38 - II. Revisión bibliográfica En perros con sospecha de enfermedad glomerular se debe investigar la existencia de una enfermedad sistémica subyacente que provocara el depósito de complejos inmunes en las paredes de los capilares glomerulares(195), ya que la función renal puede estar tan disminuida que, en algunas causas renales de proteinuria, se produzcan elevaciones de urea, creatinina y fósforo(15). Los valores de urea y creatinina plasmáticos no reflejan con precisión la función renal(60, 141) ya que ambos se encuentran influidos, en mayor medida la urea, por factores extrarrenales. Además, sólo se produce su elevación significativa cuando se ha perdido en torno al 70% de la función renal(158) y está muy avanzada la enfermedad(157). En cualquier caso, unos niveles elevados de urea se asocian con signos clínicos que reducen la calidad de vida del animal y contribuyen a la morbilidad del proceso(321). En el 50% de los casos de glomerulonefritis o amiloidosis renal la azotemia puede ser moderada o estar ausente(80, 109) , aunque se observa frecuentemente, por ejemplo, en perros Shar Pei con amiloidosis. Aún así, la azotemia puede reflejar factores prerrenales (p. ej. deshidratación) o renales (más de un 75% de nefronas no funcionales)(166). Una vez instaurado el fallo renal pueden aumentar los niveles séricos de fósforo y, en ocasiones, disminuir los de calcio(72). Sin embargo, los mecanismos reguladores de la homeostasis intentan ajustar las concentraciones de fósforo y calcio aumentando la secreción de hormona paratiroidea(261). El potasio y la amilasa sérica, al igual que el fósforo, se excretan por el riñón. Así, una disminución de la función renal puede provocar hiperamilasemia. Por otro lado, en casos de fallo renal crónico en los que la reducción de la función renal avanza lentamente, los niveles de potasio se mantienen normales(83, 284) . Cuando el fallo renal se produce rápidamente, como en casos agudos o en patologías postrenales, la concentración sérica de potasio puede estar incrementada(261, 284). - 39 - II. Revisión bibliográfica II.4.3.1.3.- Serología Las pruebas serológicas están indicadas para detectar enfermedades infecciosas, dirofilariosis y anticuerpos antinucleares (AAN). La amiloidosis renal suele acompañarse así mismo de un trastorno infeccioso, inflamatorio o neoplásico subyacente pero, igual que la glomerulonefritis, con frecuencia no se encuentra un factor predisponente(195). II.4.3.2.- Orina II.4.3.2.1.- Análisis físico-químico II.4.3.2.1.1.- Proteínas Los tests laboratoriales tienen distinta capacidad para detectar proteínas en la orina. Los cualitativos permiten identificarlas y caracterizarlas mientras que los semicuantitativos, aunque son sencillos de realizar, no son muy sensibles ni específicos. Los cuantitativos proporcionan resultados fiables pero son más difíciles de llevar a cabo y requieren equipos más sofisticados que los semicuantitativos. En cualquier caso, todos los tests deberían realizarse con el sobrenadante de muestras de orina centrifugadas(106). - 40 - II. Revisión bibliográfica Métodos semicuantitativos: 1.- Tiras reactivas La persistencia de proteinuria, diagnosticada mediante esta técnica, debe ser confirmada por el examen de muestras sucesivas. Una segunda muestra, obtenida preferiblemente por cistocentesis, confirmará la persistencia de proteinuria y ayudará a la localización anatómica del origen de las proteínas. Tras esto, un resultado negativo implicaría la existencia de proteinuria temporal o de un proceso distal a la vejiga, aunque hay que tener en cuenta que la muestra recogida por cistocentesis puede contener elementos procedentes de la uretra proximal y próstata por reflujo de orina hacia la vejiga(15). La interpretación de los tests debe realizarse conjuntamente con la densidad de la orina ya que, por ejemplo, una reacción positiva es más significativa en una orina diluida que en una concentrada. La muestra de elección es la primera de la mañana por ser la más concentrada(15). La excreción normal de proteína en orina es inferior a 20-30 mg/kg/día(17). Según esto, los efectos de la densidad de la orina sobre la importancia de la proteinuria son los siguientes(17, 366): - En el test la proteína en la orina es “negativa” y la orina tiene cualquier densidad: normalidad a menos que la proteína principal no sea la albúmina y existan proteínas de Bence-Jones, globulinas, etc. En este primer caso deberían usarse métodos cuantitativos de determinación de proteínas como el del ácido sulfosalicílico. - 41 - II. Revisión bibliográfica - En el test el resultado es “indicio” y la densidad es < 1.030: si esa densidad está próxima a 1.030 se debería repetir la analítica. Si, por el contrario, la orina está muy diluida, se debería cuantificar la proteinuria con un método más fiable. - En el test el resultado es “indicio” o “+” y la densidad es > 1.030: no requiere intervención. Quizás repetir el análisis en el futuro. - En el test el resultado es “+” (30 mg/dl) y la densidad es < 1.030: debería repetirse la prueba. Si aún persiste el resultado debería cuantificarse por un método más seguro (ácido sulfosalicílico, cociente urinario P/C). - En el test el resultado es “++” y la densidad > 1.030: el resultado es cuestionable, conviene repetir el test. - En el test el resultado es “++” o más (> 100 mg/dl) y la densidad es < 1.030: si se descartan artefactos que provoquen el resultado, debería realizarse inmediatamente una bioquímica sanguínea y un cociente urinario P/C. La proteinuria induce un cambio de color rápido por reacción con determinados colorantes a concentraciones proteínicas de 20 mg/dl y mayores(195, 295). La mayoría de estos tests se basan en el azul de tetrabromofenol, muy sensible a la albúmina pero insensible a determinadas proteínas urinarias patológicas(15, 189, 366) , apareciendo falsos negativos en presencia de globulinas, proteínas de Bence-Jones(15, , amonio cuaternario(134, 366) 366) y en orinas ácidas o muestras muy diluidas(106, También podemos encontrar falsos positivos en casos de pH alcalino(134, (15, 366) muestras contaminadas con clorhexidina 131) . 190, 366) y (106, 375) y cloruro de benzalconio . La muestra de orina no debe ser recogida en las 24 horas siguientes a la realización de - 42 - II. Revisión bibliográfica radiografías de contraste porque puede aparecer proteinuria temporal y, por tanto, falsos positivos(126). Por todo esto resulta insuficiente para el diagnóstico definitivo de proteinuria(134, 253). Además, el test da una intensidad de color máxima para todas las concentraciones proteicas iguales o superiores a 1 g/dl y, por tanto, no es útil para valorar la magnitud de la proteinuria por encima de este valor(106). 2.- Tests del ácido sulfosalicílico, ácido nítrico y ácido acético al 5% (métodos turbidimétricos) Se basan en la precipitación de las proteínas inducida por agentes químicos (la mezcla de orina y ácidos provoca turbidez). La densidad del precipitado puede estimarse visualmente o cuantificarse utilizando densitometría óptica(366). El test del ácido sulfosalicílico llega a detectar concentraciones de proteínas de 5-10 mg/dl y es 2,4 veces más sensible a la albúmina que a las globulinas(295, 325) aunque también detecta globulinas, proteínas de Bence-Jones y glucoproteínas(366). Podemos encontrar falsos positivos en orinas sin centrifugar, con medio de contraste con iodo, penicilina, cefalosporinas, sulfisoxazol(134, 295, 366) y metabolitos de la tolbutamida(295). Por el contrario, los falsos negativos aparecen en orina muy alcalina(106, diluidas (106) . En un estudio realizado por Shiba et al. (354) 195) y en las muy en el que se comparaban los métodos del ácido sulfosalicílico y el Coomassie Brilliant Blue, se encontró que el 18% de las muestras de orina mostraban valores de proteína dos veces más altos con el segundo método que con el primero, por lo que se concluyó que existían proteínas solubles en ácido sulfosalicílico y que, por tanto, no podían ser cuantificadas por este método. - 43 - II. Revisión bibliográfica Métodos cuantitativos: Estos métodos son igual de sensibles para la albúmina y para las globulinas, detectando también proteínas de Bence-Jones y glucoproteínas. Con ellos se analizan muestras urinarias obtenidas en 24 horas o se usan para determinar el cociente U P/C(195). 1.- Técnicas * El método Biuret es una técnica colorimétrica que se basa en la formación, en condiciones alcalinas, de un complejo péptido-cobre que proporciona un color azul a la muestra de intensidad variable(207). Se utiliza para la determinación de proteína sérica pero es poco sensible para medir concentraciones proteicas de miligramos, a menos que se modifique la concentración de la muestra(302). Si ésta se concentra por precipitación ácida, los restos de sustancias cromógenas dan lugar a resultados falsos muy altos(56). * El método de Lowry está basado en el método de Biuret. La reacción de las proteínas con el cobre, en condiciones alcalinas, produce Cu+. Este reacciona, a su vez, con el reactivo de Folin-fenol para dar un fuerte color azul, cuya intensidad dependerá, fundamentalmente, del contenido en tirosina y triptófano de la proteína. Presenta la ventaja de ser muy seguro a la hora de medir una mezcla de proteínas(403), aunque componentes no proteicos de la orina pueden producir interferencia(302). Entre otras ventajas se encuentran el ser cien veces más sensible que el método Biuret y no presentar interferencia con la urea, guanidina, algunos compuestos de sodio, etc.(248). - 44 - II. Revisión bibliográfica * El método del ácido tricloroacético-Ponceau S (TCA-PS) se ha utilizado para medir la proteína en orina(189) y en líquido cerebroespinal en el perro(413). Este método no se ve afectado por el cociente albúmina/globulina o por la temperatura(306). Requiere un volumen de muestra pequeño (50-100 µl), es igual de sensible para la albúmina que para las globulinas y esta sensibilidad se cifra en 2 mg/dl. Su mayor desventaja es que requiere espectrofotometría(106). Aunque resulta simple de realizar, requiere la precipitación de proteínas y la retirada del líquido sobrenadante antes del desarrollo del color para la medida espectrofotométrica. Si el sobrenadante no se retira en su totalidad aparecerán valores más altos. Por el contrario, si se produce pérdida de precipitado en la extracción del sobrenadante, los valores estarán por debajo de lo normal(17). * El método del Coomassie Brilliant Blue (CBB) está indicado para cuantificar la proteína en líquidos biológicos(40). Presenta la ventaja de la simplicidad porque sólo requiere pipetear el reactivo en la muestra y determinar por espectrofotometría la absorbancia. Este método es sensible y preciso(265). Tiene la desventaja de variar en su afinidad para teñir distintas proteínas. Así, es más reactivo a la albúmina que a las globulinas. Por otra parte, la reacción no es lineal y requiere el uso de una curva estándar más que la extrapolación de la Ley de Beer(40). 2.- Colección de orina durante 24 horas El examen de la orina recogida en un período de 24 horas es el método de elección para cuantificar la proteinuria. Utilizando este período de tiempo se minimizan los errores en dicha cuantificación debidos a variaciones en la densidad urinaria, pero se requiere caja metabólica o sondaje del animal, lo que encarece el procedimiento(168). Para su realización el animal se aclimata 24 horas por lo menos a la caja metabólica - 45 - II. Revisión bibliográfica donde se recoge la orina. La vejiga se vacía antes y al final de cada período de 24 horas de recolección, utilizándose un inhibidor del catabolismo bacteriano de la proteína urinaria. El resultado más fiable se consigue tras repetir varias veces la obtención de orina en 24 horas(134). La excreción de proteína en 24 horas se halla multiplicando la concentración de proteína de la muestra por el volumen de la misma producida en esas 24 horas y dividiendo este número por el peso del animal. El valor se expresa en mg/kg/día(195). Es el método más aceptado para medir la excreción de proteína urinaria aunque, entre distintos laboratorios, por utilizar distintas técnicas, no coinciden los valores considerados como normales. Predispone a la infección urinaria si se usa para la recogida de orina el sondaje uretral y éste se realiza repetidas veces(134). La recogida de la orina por micción voluntaria presenta el mayor índice de contaminación bacteriana posterior (86%) seguido por el sondaje (26%). La cistocentesis no predispone a dicha contaminación. Por otro lado, esa predisposición es mayor en el caso de las hembras que en el de los machos(78). Métodos cualitativos: 1.- Electroforesis La electroforesis se ha usado, rutinariamente, para la identificación y separación de proteínas en la orina de perros sanos y enfermos(63, 166, 317) . Se ha demostrado, además, que las diferentes localizaciones de las lesiones renales se caracterizan también por distintas distribuciones de las proteínas urinarias según su peso molecular(230, 276). Si se asume que el glomérulo se comporta como una membrana de filtración que retiene proteínas de peso molecular alto, y que los túbulos actúan, - 46 - II. Revisión bibliográfica fundamentalmente, reabsorbiendo proteínas de peso molecular bajo, se puede admitir lo siguiente(279): 1.- Una patología glomerular provoca un aumento en la filtración de proteínas de peso molecular medio y alto, no reabsorbidas por los túbulos y, por consiguiente, que aparecen en la orina. El sistema tubular sano reabsorbe proteínas de peso molecular bajo y, por tanto, no se encuentran en la orina. 2.- La lesión tubular disminuye la reabsorción de proteínas de peso molecular bajo, mientras que el glomérulo sano impide la filtración de proteínas de peso molecular mayor. De este modo, en la orina predominan las primeras. 3.- La lesión que afecte al glomérulo y a los túbulos, hecho que ocurre en cualquier proceso grave del riñón, provoca la aparición en la orina de proteínas de peso molecular alto y bajo. Por tanto, la electroforesis de proteínas urinarias puede ayudar a localizar la lesión renal. Así, la proteinuria glomerular se caracteriza por la presencia de albúmina y proteínas plasmáticas de tamaño molecular superior a la albúmina y la tubular también por albúmina, pero en este caso acompañada por proteínas de tamaño molecular inferior a la misma(249, 303). Tanto las enfermedades glomerulares iniciales como las hemorragias tienen patrones electroforéticos semejantes a la electroforesis sérica normal de proteínas, en los que la albúmina representa la fracción mayor de la pérdida de proteínas. Esta proteinuria selectiva ocurre cuando los glomérulos pierden sus cargas negativas fijas y la albúmina pasa libremente por la barrera de filtración en tanto se retienen las proteínas de peso molecular mayor(195). A medida que progresa la enfermedad glomerular, se pierden moléculas más grandes, incluso inmunoglobulinas, - 47 - II. Revisión bibliográfica lo que resulta en una proteinuria no selectiva(175, 195, 295) caracterizada electroforéticamente por una proporción mayor de proteínas en la región gamma. La proteinuria de peso molecular bajo, como ocurre en la proteinuria tubular, se acompaña de un incremento de las fracciones alfa y beta(195). Todo esto ha apoyado el uso de métodos basados en la separación proteica, según el tamaño molecular, para la caracterización de patrones de proteínas urinarias(319). Los primeros trabajos usaron ultracentrifugación o filtración en gel sobre Sephadex(87). Los resultados fueron de gran interés y valor clínico, pero eran métodos que consumían mucho tiempo para su uso rutinario en el laboratorio. También se intentó la determinación inmunológica de proteínas individuales(230). Aunque más fáciles de aplicar, estos métodos presentan la desventaja de medir sólo un número limitado de proteínas, pasando por alto otras que pueden tener gran importancia(11). El método electroforético para la caracterización de las proteínas urinarias, usado habitualmente, se basa fundamentalmente en la carga molecular más que en el tamaño, y la orina debe concentrarse si queremos visualizar las bandas de proteínas(304), aunque las muestras que contienen más de 100 mg/l de proteína no requieren concentración, con el ahorro de tiempo y la ausencia de pérdida de proteína, por precipitación, que esto supone(147). El sistema de electroforesis debe permitir la diferenciación clara de los patrones de proteínas urinarias en cada muestra de orina, independientemente de la concentración, que puede variar enormemente (10-10.000 mg/l). Su sensibilidad debería permitir el análisis de las proteínas con una concentración baja(346). Cuando una mezcla de proteínas es sometida a electroforesis, la distancia de migración está, para cada proteína, influida por su carga electrostática así como por su peso molecular. El tratamiento de esta mezcla con dodecil sulfato sódico (SDS) impulsa la formación de - 48 - II. Revisión bibliográfica micelas, cargadas negativamente, y constituidas por proteínas y SDS(279). La unión del SDS a la proteína provoca un cambio conformacional en su estructura y proteínas diferentes llegan a poseer una densidad de carga idéntica(242). Así, cuando las sometemos a electroforesis en gel de poliacrilamida, estas micelas migran una distancia a través del gel que se correlaciona bien con el tamaño molecular de las proteínas sin influir dicha carga(400). El detergente aniónico SDS fue utilizado por Shapiro et al.(353) en 1967 y, más tarde, por Weber y Osborn(405) (1969) en un sistema de gel continuo, que restringía la movilidad de las proteínas en base a su peso molecular. Posteriormente, Laemmli(225) (1970) combinó el efecto del SDS con el sistema de electroforesis discontinuo en gel de poliacrilamida y el tampón tris-glicina. Se han descrito otras combinaciones de detergentes y tampones(287), pero la técnica SDS de Laemmli es la de uso más extendido en la electroforesis de proteínas(242). El sistema SDS-PAGE presenta la ventaja, en comparación con otras técnicas, de consumir menos tiempo y de permitir el análisis de proteínas de peso molecular muy distinto(22, 303). Así, es el método de elección para el análisis simultáneo de patrones que cuenten con proteínas de bajo y alto peso molecular en casos de patología renal(345, 378). Por contra, cuenta con la desventaja de que proteínas de peso molecular muy elevado (α2-macroglobulina, fibrinógeno, etc.) quedan atrapadas en el punto de migración y proteínas de peso molecular muy bajo (insulina) no son separadas del resto(303). Se ha demostrado que existe una correlación buena entre los resultados de la electroforesis de orina en SDS-PAGE y los datos clínicos e histopatológicos de distintas patologías renales en seres humanos(309) y proteinurias caninas(348). Balant et al.(11), en personas, correlacionaron la excreción predominante de proteínas de bajo peso - 49 - II. Revisión bibliográfica molecular con daño tubular, y de medio y alto peso molecular con daño glomerular. Además, el sistema SDS-PAGE se comparó con la cromatografía en Sephadex G 100, con la electroforesis sobre acetato de celulosa, inmunoelectroforesis y electroforesis en acrilamida sin SDS y se concluyó que el sistema SDS-PAGE proporciona la mayor información en concordancia con el estado clínico del paciente. Aún así, en la interpretación de los patrones de orina mediante SDS-PAGE, hay que ser consciente de los riesgos que conlleva, especialmente en la proteinuria tubular. En estos casos puede ser necesario otro test de funcionalidad tubular, e incluso una biopsia(249). Lubega(249), con marcadores de peso molecular en SDS-PAGE, caracterizó las proteínas urinarias de individuos con patología renal y su frecuencia de presentación. La albúmina presentó la frecuencia mayor aunque, generalmente, su filtración glomerular es moderada. Se encontraron bandas de 130 kDa (40%) y 140 kDa (36%), que podrían coincidir con albúmina polimérica, ya que las muestras de orina se mantuvieron a -20°C lo que, según Boesken et al.(34) y Hardwicke(182), promueve la dimerización de la albúmina. La lisozima (20%) se relacionó con daño tubular, aunque la β2-microglobulina (46,6%) es, probablemente, un indicador mejor de disfunción tubular(204). En la polimerización de la albúmina urinaria intervienen una molécula de albúmina alterada, un factor urinario de bajo peso molecular y, por último, la congelación de la muestra de orina a -14°C durante al menos 48 horas. El factor urinario cuenta con un peso molecular cifrado en 0,7 kDa y no parece ser un péptido, un aminoácido o un ácido graso. Por otro lado, la alteración de la molécula de albúmina se produce una vez que ha abandonado la circulación sanguínea porque en el plasma no se localiza esa albúmina anómala(116). Pero también en la orina se pueden encontrar fragmentos de albúmina con varios orígenes. Pueden ser el resultado de una proteolisis en la orina ya formada o ser consecuencia de una fragmentación parcial en las células del túbulo proximal y sufrir, posteriormente, exocitosis hacia la orina. Los fragmentos - 50 - II. Revisión bibliográfica de albúmina cuentan con un peso molecular de 30 kDa y 45 kDa. Por tanto, la albúmina en la orina (sobre todo en muestras congeladas) debe considerarse como un grupo heterogéneo de proteínas que incluye polímeros, monómeros y varios fragmentos de 30 kDa y 45 kDa(412). Estudios electroforéticos realizados en la orina de perros sanos revelan la presencia fundamentalmente de albúmina, proteínas de bajo peso molecular(276), α1-globulinas, α2-globulinas, β1-globulinas y γ-globulinas(422). Por el contrario, en un trabajo realizado por Biewenga et al.(32) en perros sin signos de enfermedad renal, se evidenció una proteinuria fisiológica intermedia constituida por albúmina y proteínas de bajo y alto peso molecular. Schultze y Jensen(348) diferenciaron, mediante electroforesis en SDS-PAGE, varios patrones de proteínas urinarias. El que aparecía en perros clínicamente sanos y no proteinúricos (< 30 mg/dl) se caracterizó por tres bandas finas y tenues con pesos moleculares situados entre 65 kDa (albúmina) y 100 kDa (transferrina). En perros con glomerulonefritis proliferativa o membranosa crónica (lesiones principalmente glomerulares) se encontraron entre 12 y 20 bandas, más gruesas y teñidas intensamente, con pesos moleculares en un rango entre 65kDa y más de 100 kDa (transferrina). El patrón electroforético tubular se obtuvo en perros con proteinuria temporal y estuvo formado por 15 bandas de pesos moleculares situados entre 16 kDa y 198 kDa, de las que la mayoría contó con un peso molecular inferior al de la albúmina. Por último, se observó un patrón acorde con daño túbulo-intersticial grave y lesiones glomerulares (patrón mixto) formado por un número entre 16 y más de 40 bandas y con pesos moleculares situados entre 10 kDa y más de 264 kDa. La caracterización de las proteínas séricas y urinarias, según su peso molecular, ofrece además la posibilidad de expresar el paso de proteínas desde el plasma a la orina como el “aclaramiento” para cada fracción proteica. El aclaramiento - 51 - II. Revisión bibliográfica de la albúmina es inferior al de otras proteínas de peso molecular bajo debido a la permeabilidad selectiva de la barrera de filtración glomerular. Por el contrario, proteínas de peso molecular alto tienen un aclaramiento mayor explicable, únicamente, por la adición renal o no renal de estas proteínas a la orina o por una disminución selectiva en la reabsorción. Este último mecanismo, sin embargo, no se ha demostrado(32). 2.- Western blotting La identificación de proteínas específicas, por electroforesis y según su tamaño molecular, se limita a conclusiones generales sobre el origen de la proteinuria (glomerular, tubular o ambos). Las razones para esta conclusión son que proteínas de peso molecular similar, al migrar la misma distancia, pueden encontrarse en la misma banda(346), algunas proteínas no se visualizan tras realizar la tinción y, por último, fragmentos de albúmina y sus polímeros pueden presentar cualquier peso molecular. Sin embargo, el sistema SDS-PAGE junto con Western blotting, proporciona información útil desde un punto de vista clínico y experimental(399). También presenta ventajas frente a otras técnicas inmunológicas como el ELISA, ya que aporta información sobre el peso molecular de la proteína a investigar(273) y, por tanto, aunque el Western blotting es un método demasiado complejo para el análisis rutinario, proporciona más información sobre las distintas formas de disfunción renal(223). Tras el desarrollo, en 1975, de la técnica del Southern blotting para identificar fragmentos de ADN(362), y del Northern blotting para el ARN(4), Towbin et al.(385) desarrollaron en 1979 la técnica del “blotting” de proteínas que se empezó a conocer, en una clara alusión a las precedentes, como Western blotting(152, 153) . Esta técnica constituye un método simple y muy efectivo a la hora de identificar antígenos - 52 - II. Revisión bibliográfica específicos en una mezcla compleja de proteínas(351). Inicialmente, los componentes polipeptídicos de la muestra son separados mediante el sistema SDS-PAGE, o por otra técnica para, posteriormente, ser transferidos a un filtro de nitrocelulosa(326). A partir de aquí, pueden identificarse proteínas específicas por el uso de anticuerpos que se unan a los antígenos retenidos en dicho filtro, y la visualización posterior del complejo antígeno-anticuerpo formado(222). Aunque existen diferentes técnicas para la detección de los anticuerpos unidos a la membrana de nitrocelulosa, los métodos más utilizados emplean dos tipos de proteínas de unión. El primero de ellos es la proteína A que se utiliza con un marcaje radioactivo, o bien conjugada con un marcador enzimático. Esta proteína se une, específicamente, a la región Fc de la inmunoglobulina G de muchos mamíferos(382). El segundo método utiliza un anticuerpo específico (anticuerpo secundario) frente a la IgG de la especie que ha producido el anticuerpo primario. La ventaja que presenta frente a la proteína A es que el anticuerpo reconoce, únicamente, la inmunoglobulina G de una determinada especie. El anticuerpo secundario puede estar conjugado con un marcador enzimático o encontrarse unido a la biotina. En este último caso, la detección se lleva a cabo mediante la avidina unida a un marcador enzimático(222). El último paso consiste en la visualización del anticuerpo buscado; para ello existen múltiples sistemas, aunque la quimioluminiscencia es el de uso más extendido(242). Los anticuerpos utilizados llevan conjugada peroxidasa, directamente al anticuerpo primario o bien al secundario que interacciona con el primario. La detección se realiza incubando las membranas con el sustrato de la peroxidasa, de este modo se produce una reacción de quimioluminiscencia y la luz producida es capaz de impresionar un film(176). - 53 - II. Revisión bibliográfica Las ventajas que presenta la técnica del Western blotting son muchas: elevada sensibilidad y resolución, es un método rápido, no utiliza radioactividad y puede utilizarse con distintos tipos de geles(176). Pero, sobre todo, juega un papel fundamental a la hora de identificar proteínas específicas. Así, por ejemplo, Berneman et al.(30) al enfrentar sueros de perros infectados con leishmaniosis a antígenos específicos de esta enfermedad, demostraron que los anticuerpos que reaccionan son IgG y principalmente de la subclase IgG4. II.4.3.2.1.2.- Densidad La densidad urinaria presenta grandes variaciones individuales pero lo estimado como normal es un valor de 1.025 o superior a él(133, 184, 294, 368) . Se ha demostrado que estas variaciones no se relacionan con el sexo del animal y que la densidad disminuye por la tarde y con la edad del perro(398). La densidad de la orina se relaciona con la función tubular y los túbulos renales modifican esta densidad concentrando o diluyendo la orina para mantener el equilibrio homeostático del organismo(293, 368). Normalmente, la capacidad de concentrar la orina se pierde antes que la de diluirla; la pérdida de concentración ocurre cuando los riñones pierden dos tercios de su funcionalidad(72). En muchos perros con fallo renal crónico por enfermedad glomerular podemos encontrar isostenuria. Éste es el caso de la amiloidosis, donde los depósitos situados en el intersticio medular contribuyen, por su presencia física, a la incapacidad de concentrar la orina por parte de los riñones(166). A veces, y a pesar de existir daño glomerular, con disminución de la filtración glomerular, la isostenuria aparece en un porcentaje pequeño de muestras por la conservación de la capacidad de concentrar la orina que tiene el riñón(298). - 54 - II. Revisión bibliográfica II.4.3.2.1.3.- Cociente proteína/creatinina El cociente proteína/creatinina en orina (U P/C) es un método útil, sensible y rápido para la detección y cuantificación de proteinuria en muestras de orina recogidas aleatoriamente. A diferencia de otros tests, este cociente no se afecta por la densidad y el volumen de orina(250). Se calcula dividiendo las concentraciones de proteína y creatinina urinarias. Para ello estos dos valores deben tener las mismas unidades (mg/dl)(15). Los factores de conversión son(15, 366): - Proteína total desde g/l a mg/dl → x 100 - Creatinina desde µmol/l a mg/dl → /88,4 La evaluación laboratorial cuantitativa de la proteína urinaria depende no sólo de la cantidad de proteína filtrada, sino también de la concentración que los túbulos hacen del filtrado. Por tanto, la excreción total de proteína en 24 horas resulta más útil para cuantificar la pérdida de proteína pero su recogida no es práctica para el clínico(15). Se ha demostrado que, en el perro, el U P/C en una muestra recogida al azar se correlaciona bien con la excreción de proteína urinaria medida en 24 horas, con la presencia de proteinuria o sin ella(2, 10, 17, 67, 168, 408). Así, estudios de regresión lineal han demostrado que la multiplicación del cociente U P/C por 20, para el método Coomassie Brilliant Blue (CBB), o por 30 en el del ácido tricloroacético Ponceau-S (TCA-PS) se aproxima en gran medida a la pérdida de proteína en 24 horas en mg/kg/día(250). Para otros autores(168, 408), las ecuaciones propuestas para la determinación de la pérdida de proteína diaria (mg/kg) en orina, según el método utilizado en su cuantificación son las siguientes: - 55 - II. Revisión bibliográfica - Método de CBB: 3,1 + (19,2 x U P/C) - Método de TCA-PS: 2,8 + (28,72 x U P/C) Esto ocurre porque la concentración de proteína y de creatinina en la orina se ven afectadas por la concentración total de solutos y con su cociente no ocurre lo mismo(103). Además, cuando la función renal es estable, los mecanismos de filtración glomerular y concentración tubular afectan de igual forma a la proteína y creatinina(67, 250) . Sin embargo, a medida que el cociente U P/C excede de un valor estimado de 5 en el perro(2), la correlación entre las dos metodologías es menos consistente y es posible que el contenido de proteínas en la orina de 24 horas sea un indicador más seguro y preciso de la pérdida de proteínas(195). El U P/C sólo se correlaciona con la excreción de proteína en 24 horas en los casos en que(250): * El grado de filtración glomerular es estable. * La pérdida de proteína durante un período de 24 horas es constante. * La filtración glomerular y la concentración tubular de orina afectan de igual forma a la proteína y a la creatinina. * No exista proceso inflamatorio del tracto urinario o no sea significativo el sedimento urinario(10, 15). Todo esto puede no ser aplicable bajo ciertas condiciones. P. ej., si el ritmo de administración de fluidos supera al de producción de orina hay un aumento de la filtración glomerular(374). También el fallo renal agudo se asocia con cambios rápidos y - 56 - II. Revisión bibliográfica significativos en el grado de filtración glomerular. En estos casos, el U P/C contribuye a determinar el grado de compromiso glomerular. Como consecuencia de la rapidez de estos cambios, calcular la pérdida proteica diaria a partir del U P/C puede conducir a error(250). El método y tiempo de recolección de la muestra de orina, sexo del animal, si éste está confinado en una caja metabólica y el contenido proteico de la dieta tienen poco efecto sobre el U P/C(203, 263). Por tanto, estas variables no son importantes en la interpretación clínica del U P/C. Por otro lado, los gatos excretan creatinina únicamente por filtración glomerular(136), mientras que los perros machos también eliminan creatinina por secreción tubular(291, 335). Esta secreción normalmente es mínima pero se incrementa al aumentar la concentración de creatinina sérica(373). Por esto, los cocientes U P/C pueden ser menores de lo esperado en perros machos con fallo renal azotémico de moderado a grave(250). Las propiedades selectivas del glomérulo en cuanto a tamaño y carga y las fuerzas hemodinámicas que intervienen a nivel de los capilares glomerulares influyen en el movimiento de proteína a través de estos últimos. Esas fuerzas hemodinámicas son importantes por, al menos, dos razones: una perfusión normal mantiene una carga negativa a través de las paredes de los capilares glomerulares y la cantidad de proteína que se pierde por orina se relaciona con la cantidad que llega al glomérulo. En animales con hipoalbuminemia grave, el volumen vascular está disminuido por reducción de la presión osmótica coloidal. Consecuentemente también se reduce el grado y la cantidad de proteína que atraviesa el glomérulo, se pierde menos proteína por la orina y el U P/C puede ser más pequeño que con un volumen vascular normal(250). En este caso, la hipoalbuminemia interferirá en el uso del cociente U P/C para detectar alteraciones - 57 - II. Revisión bibliográfica glomerulares y monitorizar a animales con evidencia de progresión de la enfermedad renal(67). Los factores que podrían influir en el U P/C son: 1.- Momento del día: los primeros estudios realizados con orina recogida entre las 10 AM y las 2 PM demostraron una buena correlación entre el U P/C y los valores obtenidos en muestras recogidas en 24 horas(408). Estudios posteriores también encontraron excelente correlación en muestras obtenidas a lo largo del día(168), así como entre muestras recogidas en el día y en la noche(263). 2.- Método de recogida de la orina: no se encontraron diferencias significativas en la concentración de proteína de muestras recogidas por micción voluntaria, cistocentesis o sondaje uretral. Sin embargo, en la orina recogida por micción voluntaria se encontró mayor concentración de proteína en machos que en hembras. Como entre muestras obtenidas por cistocentesis no se obtuvieron esas diferencias, se llegó a la conclusión de que la mayor concentración de los machos se debe a la adición de proteína desde el tracto urinario inferior(17). En un estudio realizado por Grauer et al.(168) en 1985, se midió la correlación entre la excreción de proteína urinaria (en 24 horas) y el U P/C de orinas obtenidas al azar por micción voluntaria en 16 perros sanos y en 14 perros con sospecha de proteinuria renal. Los resultados obtenidos indican que muestras elegidas al azar y recogidas por micción voluntaria pueden utilizarse para determinar el U P/C y reflejar la pérdida de proteína en 24 horas. 3.- Dieta: se ha demostrado que la proteína dietética aumenta el aclaramiento de creatinina. Un aumento proporcional en la proteinuria no causaría cambio en el U P/C, mientras que un cambio desproporcional en la proteinuria, - 58 - II. Revisión bibliográfica comparada con el aclaramiento de creatinina, podría alterar el U P/C(134). Un aumento de la ingesta proteica no afecta significativamente al cociente P/C en perros con fallo renal crónico(140) o en perros viejos con un único riñón(139). 4.- Hemorragia: la llegada de sangre a la orina hipotónica provoca hemólisis y la hemoglobina, así como las proteínas plasmáticas que se pierden con la hemorragia, aumentan el cociente U P/C(134). A pesar de la contaminación con sangre que existe en la recogida de orina por sondaje uretral (el sedimento muestra 5-20 eritrocitos/campo), el cociente es fiable en casos de proteinuria renal grave(10). 5.- Inflamación: la inflamación del tracto urinario inferior aumenta significativamente el cociente U P/C. Sin embargo, un cociente > 2,0 acompañado de un sedimento de tipo inflamatorio indica proteinuria patológica del tracto urinario superior(9). 6.- Infección: en un estudio realizado por Bagley et al.(9) se demostró que una infección del tracto urinario inducida experimentalmente (por E. coli) aumenta el cociente U P/C, aunque la magnitud de este aumento no se correlaciona bien con los recuentos de eritrocitos y leucocitos en orina. 7.- Ejercicio: en personas, un ejercicio físico intenso causa proteinuria temporal(134). La natación incrementa levemente la proteinuria mientras que la carrera no produce ninguna variación(250). 8.- Fármacos: la administración de prednisona a perros sanos aumenta el cociente P/C urinario a valores de 1,2 en un mes y 0,9 en 42 días(404). - 59 - II. Revisión bibliográfica Los valores considerados normales del U P/C varían entre distintos laboratorios porque usan técnicas diferentes para analizar la proteína urinaria. Los intervalos dados por distintos autores son: 0,01-0,38(67); 0,0-0,31(263); 0,02-0,14(168) y 0,08-0,54(408), aunque Jergens et al.(203) obtuvieron valores situados entre 0,08-1,18. Según Lulich y Osborne(250) debe valorarse el U P/C de la siguiente forma: * 0-0,5 = normal * 0,5-1 = cuestionable * > 1 = patológico Otros autores sugieren esta norma(195): * < 0,5 = normal * 0,5-1 = importancia dudosa. Repetir la medida. El cociente U P/C no debe valorarse como algo individual sino en combinación con otras pruebas diagnósticas. El U P/C aumentado en ausencia de hematuria o inflamación del tracto urinario sugiere proteinuria prerrenal o renal(134). Aunque la hematuria microscópica origina reacciones positivas persistentes a proteínas en pruebas cualitativas, la contaminación urinaria con sangre debe ser importante para que cause un incremento considerable del cociente U P/C(10). Posiblemente, la magnitud de la proteinuria glomerular sea un indicador del daño de la barrera de filtración y, de este modo, cocientes cada vez mayores sugieran una gravedad creciente de la enfermedad(195). El U P/C no puede diferenciar la proteinuria asociada a disfunción glomerular de los aumentos en la concentración plasmática de proteínas de bajo peso molecular (hemoglobina, mioglobina y proteína de - 60 - II. Revisión bibliográfica Bence-Jones) o de la exudación de proteínas plasmáticas o tisulares. Así, junto con el U P/C es necesario el uso de otros tests para descartar proteinuria preglomerular (test para hemoglobinemia, aumentos en la concentración de globulinas plasmáticas o en la de creatin fosfoquinasa sérica), y proteinuria postglomerular (cultivo de orina o análisis del sedimento) y otros para confirmar la existencia de proteinuria glomerular (albúmina y creatinina sérica y albúmina urinaria). Si no existe hiperproteinemia y no se encuentran células anormales en el sedimento, un U P/C alto es una fuerte evidencia de disfunción glomerular(250). En la evaluación de casos de enfermedad glomerular con evidencia microscópica de glomeruloesclerosis o atrofia por varias causas, a menudo el U P/C es inferior a 5 mientras que U P/C situados entre 5 y 13 a menudo se asocian con glomerulopatía no amiloide(250). En muchos casos de enfermedad postglomerular, el U P/C no ofrece ventajas con respecto a los resultados de un urianálisis completo. La interpretación del U P/C se basa en suponer que, tanto la proteína como la creatinina, se encuentran influidas de forma similar por los mecanismos de filtración glomerular y concentración tubular. En animales con proteinuria postglomerular, sin embargo, este exceso de proteína no se ha filtrado por el glomérulo o se asocia con defectos en la reabsorción tubular de proteínas. En aquellos casos de hemorragia o inflamación postglomerular el grado de excreción de creatinina es distinto del de proteína. U P/C elevados en pacientes con enfermedad postglomerular obligarían a considerar la existencia de proteinuria glomerular; sin embargo, se requieren estudios complementarios para confirmar que exista una combinación de ambos desórdenes. Se han observado U P/C superiores a 10 en animales con infección estafilocócica del tracto urinario inferior(250). - 61 - II. Revisión bibliográfica Aunque la magnitud de la proteinuria puede predecir el origen de la proteína urinaria, existe gran variabilidad entre los cocientes. Como guía general se puede usar lo siguiente: U P/C < 0,5: Normal(67, 250). U P/C = 0,5-1,0: Puede ser normal, pero se sospecha de enfermedad moderada(67, 250) . U P/C = 1,0-5,0: Pérdida de proteína media. Sugiere enfermedad prerrenal(67, 250, , glomerular moderada o postglomerular(366). 366) U P/C = 5,0-13,0: Pérdida de proteína de media a moderada. Sugiere enfermedad postrenal, aunque existen lesiones glomerulares que pueden dar valores en este rango(67, 250) como glomerulonefritis o glomeruloesclerosis progresivas(195). U P/C > 13,0: Pérdida de proteína grave. Normalmente aparece en casos de proteinuria glomerular (los animales con amiloidosis tienden a tener los valores más altos)(67, 250) y también aparece en casos de glomerulonefritis grave(195, 366). II.4.3.2.1.4.- Otras determinaciones La determinación de cetonas, bilirrubina y urobilinógeno es útil para el diagnóstico de determinadas patologías, pero no para procesos que cursen con daño renal y, consecuentemente, con proteinuria(262). - 62 - II. Revisión bibliográfica El pH y la concentración de glucosa de la orina ayudan en el diagnóstico de patologías poco frecuentes como la acidosis tubular renal en el primer caso, y el síndrome de Fanconi en el segundo(72). La existencia de sangre oculta indica la presencia de hemoglobina en la orina y, aunque hay muchas causas no renales de hemoglobinuria, la principal causa renal es la hematuria(414). La hemólisis, generalmente, va acompañada de glóbulos rojos en el sedimento urinario(72). Los hematíes se lisan extravascularmente a consecuencia de una alcalinidad elevada o de la dilución de la orina(290). En ocasiones puede existir hematuria, con una sangre oculta en orina negativa, si los eritrocitos no se han roto como ocurre en una orina concentrada(262). II.4.3.2.2.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo La excreción de determinados electrolitos en la orina puede ser útil para valorar el grado de reabsorción o secreción tubular y, por tanto, evaluar la funcionalidad tubular(163) y relacionarla con la aparición en la orina de proteínas de bajo peso molecular(22). La excreción fraccional de un electrolito se define como la proporción de ese electrolito que escapa a la reabsorción tubular y aparece en la orina(135). Su cálculo se lleva a cabo relacionando el aclaramiento del electrolito y el de la creatinina mediante la fórmula(158): Excreción fraccional y = (Uy x Pcr) / (Ucr x Py) x 100 * y = electrolito a determinar su excreción fraccional. * Uy = concentración del electrolito en orina (mg/dl). * Pcr = concentración plasmática de creatinina (mg/dl). - 63 - II. Revisión bibliográfica * Ucr = concentración de creatinina en orina (mg/dl). * Py = concentración plasmática del electrolito (mg/dl). El cálculo de las distintas excreciones fraccionales presenta la ventaja de no necesitar un período de tiempo de recolección de orina, aunque debe ser realizado tras un período de ayuno de 12-15 horas porque la ingesta de alimento y la reabsorción intestinal pueden influir en su determinación(163). Los valores elevados de la excreción fraccional pueden indicar disfunción tubular; p. ej. en el síndrome de Fanconi aumentan las excreciones fraccionales de todos los electrolitos. Aunque sus valores deben interpretarse con cautela ya que su aumento puede proceder también de la necesidad de mantener la homeostasis del organismo, p. ej. en casos en los que la masa funcional renal se encuentra reducida(137). II.4.3.2.3.- Sedimento urinario El análisis del sedimento urinario ayuda en la localización de las lesiones del tracto urinario cuando éstas no van acompañadas de proteinuria(132). Por otro lado, cuando se detecta una reacción positiva a proteínas en un análisis de orina rutinario es necesario valorar el sedimento urinario(195). Si hay piuria debe enviarse una muestra de orina para cultivo de bacterias(73, 231, 338). En caso de hematuria es necesario valorar las causas de hemorragia de vías urinarias. Un resultado positivo de sangre oculta, sin eritrocitos intactos en el sedimento, podría indicar hemólisis en una muestra no procesada a tiempo. A veces está indicado hacer pruebas específicas para detectar hemoglobinuria o mioglobinuria(195). La proteinuria debida a exudado inflamatorio puede identificarse por examen microscópico del sedimento urinario. Un sedimento activo (piuria y hematuria) - 64 - II. Revisión bibliográfica generalmente se asocia a proteinuria postglomerular(366). Este hecho ocurre en procesos inflamatorios o neoplásicos del tracto urinario superior o inferior. La existencia sólo de hematuria, sin piuria, se asocia a neoplasia(411), inflamaciones del tracto urinario, trauma, urolitiasis, nefrolitiasis, enfermedad del riñón poliquístico (por erosión de vasos) y coagulopatías. La presencia de cilindros leucocitarios o eritrocitarios confirmaría el daño renal. Sin embargo, estos cilindros tienden a desintegrarse en orinas diluidas y son difíciles de encontrar(15). El hallazgo de cilindros sugiere enfermedad renal(202, 290, 296) , aunque revela muy poco acerca de la gravedad o reversibilidad de las lesiones renales(296). Los cilindros son estructuras constituidas principalmente por mucoproteína, también llamada mucoproteína de Tamm-Horsfall(342), secretada por las células epiteliales que tapizan las asas de Henle, túbulos distales y colectores(344). En caso de enfermedad glomerular es frecuente la presencia de cilindros granulosos e hialinos(241), sobre todo de los segundos(102). Los cilindros granulosos aparecen por degeneración de células en otros cilindros o por precipitación de proteínas plasmáticas filtradas y sugieren daño tubular nefrotóxico(103). Los cilindros hialinos son frecuentes en casos de proteinuria (glomerulonefritis y amiloidosis) porque son precipitados puros de la mucoproteína de Tamm-Horsfall(103, 193, 296) y de albúmina(103). Los cilindros de grasa son raros en el perro. En presencia de hipercolesterolemia aparecen por la degeneración tubular siguiente a la ingestión por las células del epitelio y posterior metabolismo de los lípidos filtrados a través del glomérulo dañado(41) y aparecen en casos de diabetes mellitus y síndrome nefrótico(103). Una proteinuria significativa con pocas células en el sedimento sugiere procesos que no implican inflamación activa del tracto urinario. En esta situación la - 65 - II. Revisión bibliográfica evaluación del U P/C, para cuantificar la pérdida de proteína, ayudará a determinar la magnitud de la proteinuria y su lugar de procedencia(15). II.4.4.- Otros métodos complementarios de diagnóstico La medida cualitativa y cuantitativa de proteínas urinarias proporciona información clínica adicional, pero no tiene valor pronóstico real. Esto hace necesario el examen histológico del riñón para el diagnóstico final(23, 31) aunque, en personas, parece ser que la biopsia renal no tiene valor como guía terapéutica en pacientes proteinúricos(237). La biopsia renal en perros está indicada cuando es necesario obtener información más específica sobre la causa, duración y gravedad de una afección o insuficiencia renal. Los datos obtenidos de esta manera pueden modificar el tratamiento del caso. Sin embargo, cabe señalar que las enfermedades renales no necesariamente se correlacionan con la función renal. El objetivo de la biopsia renal es obtener una muestra diagnóstica del riñón y, a la vez, minimizar el riesgo que supone la anestesia, una hemorragia o el daño renal inducido por el procedimiento quirúrgico(195). La biopsia también está indicada en animales no azotémicos o con azotemia moderada y con proteinuria grave y persistente(366) y en aquellos con proteinuria glomerular idiopática que persiste o progresa a pesar de la terapia(195). No es necesaria en animales que muestran algún grado de fallo renal crónico, porque éste es irreversible y no informa del pronóstico cualquiera que sea la causa originaria(15). La biopsia renal permite diferenciar la insuficiencia renal aguda de la crónica(389), determinar la causa específica de la enfermedad renal, como pielonefritis o toxicidad por etilenglicol, y caracterizar y diferenciar lesiones glomerulares que causan - 66 - II. Revisión bibliográfica nefropatía con pérdida de proteínas(195) como la glomerulonefritis y la amiloidosis renal(15, 100, 164) . En los perros de raza distinta a la Shar Pei la amiloidosis es, principalmente, una enfermedad glomerular que se diagnostica por biopsia de la corteza renal. En perros de raza Shar Pei con amiloidosis familiar, el depósito amiloide puede ser medular sin afección glomerular. En estos casos el proceso puede ser difícil de comprobar, a menos que se obtenga suficiente muestra de tejido medular(100, 110). Esta técnica, no obstante, no es un test diagnóstico para usar ligeramente. La biopsia percutánea guiada por ecografía es el método de elección(52, 201) aunque lleve aparejados algunos riesgos(366). La mayoría de los animales presentan hematuria microscópica durante 1 a 3 días después de la biopsia. La mayor complicación que tiene es la aparición de hemorragia aunque esto ocurre en menos de un 3% de los casos y, generalmente, asociada a fallos en la técnica empleada. Antes de su realización debería efectuarse un análisis hematológico completo con recuento de plaquetas incluido(166). La biopsia renal está contraindicada en casos de coagulopatías, un único riñón, hipertensión sistémica grave y lesiones renales asociadas con acúmulo de líquido (hidronefrosis, quistes o abscesos)(146, 166). II.5.- COMPLICACIONES Los individuos que presentan proteinuria grave tienden a padecer trombosis, aunque es más común en perros con amiloidosis renal (la pérdida de proteína es mayor) que en casos de glomerulonefritis(66). Son propensos a tromboembolismos por el estado de hipercoagulabilidad en el que se encuentran como consecuencia de lo siguiente: - 67 - II. Revisión bibliográfica 1.- Pérdida en la orina de antitrombina III, lo que provoca la activación de los factores de coagulación IX, X, XI y XII(1, 120, 173, 323). 2.- Activación de la agregación plaquetaria por la hipoalbuminemia y la hipercolesterolemia(1, 323, 324). 3.- Aumento de la producción de fibrinógeno proporcional a la pérdida de proteína y a la hipercolesterolemia(1, 120, 323). 4.- Aumento de los factores de coagulación V y VI para compensar la disminución de la presión oncótica como consecuencia de la proteinuria(323). 5.- Reducción de la fibrinolisis por disminución de la concentración de sus inhibidores(1, 120, 323). 6.- Pérdida en la orina de la proteína S, co-factor de la proteína C que neutraliza los factores de la coagulación Va y VIIIa(86, 245, 252). La concentración sérica de antitrombina III se relaciona estrechamente con la de albúmina porque tienen pesos moleculares parecidos y su pérdida a través del glomérulo dañado también será similar. Por eso, en lugar de medir la antitrombina podemos determinar la albúmina y pronosticar el riesgo de padecer tromboembolismo, cifrado en los perros en concentraciones séricas de albúmina inferiores a 2 g/dl(80). La manifestación más frecuente es el tromboembolismo pulmonar(213), caracterizado por la aparición aguda de disnea grave, taquipnea y cianosis y por radiografías torácicas normales en esta primera fase. Otras localizaciones del trombo - 68 - II. Revisión bibliográfica pueden ser aorta abdominal(366), vasos mesentéricos y coronarios y en la bifurcación de la aorta(80). Lógicamente, las manifestaciones clínicas dependerán del tamaño y localización del trombo. Las complicaciones tromboembólicas en animales con síndrome nefrótico conllevan mal pronóstico(366). En animales con proteinuria a veces se observa hiperlipidemia (hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia)(48). Se produce un aumento en la síntesis hepática de lípidos y una disminución de su catabolismo como respuesta a la disminución de la presión oncótica plasmática y/o a la pérdida urinaria de una proteína reguladora de su catabolismo(29). El grado de hiperlipidemia, en condiciones de ayuno, se relaciona directamente con el de hipoalbuminemia(48). Así, en animales con síndrome nefrótico, la concentración plasmática de albúmina es inversamente proporcional a la de colesterol(13). La concentración de lípidos y colesterol aumenta cuando desciende la de albúmina al estimularse la síntesis hepática de lipoproteínas de baja densidad(6). Además, disminuye el catabolismo hepático de lipoproteínas por una función anormal de la lipasa(166). Estudios hechos en personas y ratas demuestran que la hipercolesterolemia es un factor de riesgo para el padecimiento de gran variedad de procesos vasculares, incluyendo la enfermedad renal progresiva(211). En los perros, también existe esta asociación pero aún no se ha establecido una relación causa-efecto(48). La hipertensión sistémica es una complicación, en seres humanos, que contribuye a la pérdida progresiva de la funcionalidad renal(149). En perros con proteinuria persistente se puede observar una prevalencia de hipertensión sistémica de un 80%(84). Se produce por la combinación de una serie de factores: retención de sodio, fibrosis vascular glomerular, alteración en la liberación de vasoditadores renales y activación del sistema renina-angiotensina-aldosterona. En perros con sospecha de - 69 - II. Revisión bibliográfica enfermedad glomerular se debe monitorizar la presión sanguínea, pues el control de la hipertensión puede retrasar la progresión de la enfermedad(166). La retención de sodio es otra complicación de una proteinuria masiva. La disminución de la presión oncótica por la hipoalbuminemia provoca la aparición de edema. El descenso resultante del volumen plasmático y del gasto cardíaco estimula el sistema renina-angiotensina-aldosterona, causando retención de agua y sales y favoreciendo aún más la formación de edema. Sin embargo, la concentración de aldosterona frecuentemente es normal o incluso baja en personas con síndrome nefrótico y el tratamiento con inhibidores de la enzima conversora de angiotensina no siempre previene la retención de sodio. Por tanto, parece ser que actúan mecanismos intrarrenales, independientes de la aldosterona, que estarían basados en el aumento de la reabsorción de sodio a nivel distal de la nefrona o en un defecto en la filtración glomerular de agua y sodio(166). En casos de proteinuria grave encontramos alteraciones en la farmacocinética. Así, por ejemplo, en pacientes proteinúricos, el volumen de distribución de los fármacos puede estar aumentado resultando en concentraciones plasmáticas subterapéuticas(48). Por último, en la orina también se pueden perder sustancias ligadas a proteínas: - La pérdida urinaria de hierro podría provocar anemia microcítica e hipocrómica, y la de zinc interferir con la cicatrización de heridas o la función inmune(48). - 70 - II. Revisión bibliográfica - La pérdida de la globulina transportadora de calcitriol puede interferir con el metabolismo de la vitamina D, aumentando los niveles plasmáticos de la paratohormona(159). - La pérdida de la globulina transportadora de la hormona tiroidea puede interferir con el metabolismo de la misma(127). - La pérdida de inmunoglobulinas aumenta la susceptibilidad a las infecciones bacterianas, particularmente en animales con inmunosupresión inducida por procesos víricos(48). II.6.- PRONÓSTICO El pronóstico, en caso de proteinuria, es muy variable y depende de su etiología. En ocasiones aparece una proteinuria media y temporal de causa desconocida, que no requiere investigación a menos que se vea perjudicada la función renal o aparezcan alteraciones en la bioquímica sérica o en el sedimento urinario. La proteinuria prerrenal o postrenal normalmente es reversible con una terapia específica a menos que la etiología sea neoplásica. El pronóstico, en casos de proteinuria renal inmunomediada, depende de la localización de la fuente antigénica. En algunos casos, el tratamiento de una infección, extirpar una masa neoplásica o interrumpir una terapia lleva a la resolución completa de la proteinuria. Sin embargo, en la mayoría de los casos, el proceso causante de la proteinuria no se encuentra y la lesión se denomina idiopática. Se ha descrito la resolución espontánea de la proteinuria pero en la mayor parte de los casos se produce daño renal importante(15). El pronóstico de la proteinuria glomerular es reservado, con una esperanza de vida de aproximadamente un mes en - 71 - II. Revisión bibliográfica algunos perros con enfermedad primaria, aunque no hay correlación entre los datos bioquímicos en el inicio del proceso y el tiempo de vida media. A diferencia de los casos con patologías estrictamente tubulares, el final del proceso en las glomerulares es impredecible. Factores como la aparición de trombosis, ascitis o emaciación pueden complicar el proceso(80). La glomerulonefritis puede tener un curso clínico variable caracterizado por la remisión clínica del proceso o bien, por una función renal estable durante un periodo de tiempo largo. La amiloidosis, por el contrario, generalmente es un enfermedad progresiva y con un desenlace fatal(166). Como el daño renal es casi inevitable en estos casos, es importante que se establezca el tratamiento antes de que se desarrolle el fallo renal. Cuando éste se presenta el pronóstico es malo(15). La cuantificación de proteínas permite seguir la progresión de la enfermedad renal y la respuesta a la terapia(31). Se debe tener en cuenta que en procesos glomerulares, debido a la continua reducción del grado de filtración glomerular y a la hipoalbuminemia progresiva, la disminución de la pérdida diaria de proteínas no necesariamente implica mejoría del animal ya que puede reflejar un deterioro de la funcionalidad renal(325). Es necesario valorar la estabilidad del cociente U P/C día a día en pacientes con función renal estable, aunque este cociente no sirve para vigilar la progresión de la enfermedad cuando la filtración glomerular cambia con rapidez (p. ej. en insuficiencia renal aguda). Deben vigilarse la densidad urinaria y la creatinina sérica porque la disminución de la filtración glomerular, que acompaña al deterioro de la función renal, provoca la disminución del cociente U P/C. En tanto no se disponga de más datos, la estimación de la progresión de la enfermedad y los cambios terapéuticos consecuentes deben basarse en el contenido de proteínas en la orina de 24 horas o en lo observado en el muestreo repetido del U P/C más que en uno o dos datos clínicos(195). - 72 - II. Revisión bibliográfica II.7.- TRATAMIENTO El tratamiento debe ir encaminado a la causa que provoca la pérdida de proteína y a controlar los signos clínicos derivados de ella(142). En casos, por ejemplo, de glomerulonefritis, la producción de inmunocomplejos depende de la presencia del antígeno. Es el caso de procesos como dirofilariosis, ehrlichiosis(164) y pioderma bacteriana(20, 95) . Sin embargo, a veces no se determina la causa que provoca la proteinuria o, una vez identificada, no se puede eliminar y, por tanto, la terapia va encaminada a impedir que la enfermedad progrese(142). El tratamiento consiste en lo siguiente: 1.- La proteína de la dieta afecta directamente a la excreción renal y a la síntesis hepática de proteínas(210). En muchos animales, la restricción de proteínas modifica muy poco la concentración plasmática de albúmina porque disminuye, en igual medida, su síntesis hepática y la excreción renal de proteína(48, 316) . Para compensar la albuminuria se ha utilizado la proteína del huevo pero se ha demostrado que restringir el contenido proteico al del huevo provoca acidosis metabólica hiperclorémica(313). Conocer la pérdida proteica diaria permite estimar la proteína necesaria en la dieta para mantener la homeostasis de la albúmina. Sin embargo, la suplementación dietética con proteína, en animales proteinúricos, se cuestiona porque puede contribuir a la progresión de la enfermedad glomerular y a la proteinuria(61, 164, 221, 268, 350) . El aumento de la ingesta proteica aumenta la perfusión renal pero la hiperfiltración que conlleva daña los capilares glomerulares, perpetúa la proteinuria(44, 311, 313) y conduce finalmente a una glomeruloesclerosis. Por tanto, se debe reducir moderadamente la ingesta proteica utilizando una proteína de alta calidad(166) y aportando, inicialmente, de 2 a 2,5 g de proteína/kg/día(315). En el tratamiento dietético - 73 - II. Revisión bibliográfica de estos animales es necesario un control periódico del peso corporal, concentración de albúmina sérica y excreción de proteína en la orina(47, 250). 2.- La proteinuria grave da lugar a malnutrición proteica y a retención de líquidos con la aparición de edema o ascitis(48). Los animales con síndrome nefrótico pueden retener sodio, lo que contribuye a la ascitis, el edema, la hipertensión y la ganancia de peso(67, 104). En el control de la retención de sodio y la hipertensión se puede utilizar furosemida (2-4 mg/kg/8 h) y restringir la ingesta de sodio (0,1-0,3% de la dieta) para retrasar la progresión de los signos clínicos(142). 3.- Los fármacos antihipertensivos reducen la proteinuria mediante sus efectos a nivel de presión arterial sistémica, flujo sanguíneo en el glomérulo o permeabilidad selectiva glomerular(48). Los inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (IECA) y los antagonistas de los canales de calcio disminuyen la proteinuria, aunque los últimos provocan glomeruloesclerosis. Los IECA reducen la proteinuria sin afectar a la síntesis hepática de proteínas e independientemente de la ingestión de proteína con la dieta(51). Basan su acción en la vasodilatación que provocan en la arteriola eferente del glomérulo, lo que disminuye la filtración glomerular(49). Parece demostrado que en seres humanos, la administración de IECA atenúa la proteinuria por disminuir el tamaño de los poros capilares del glomérulo y, además, mejora el metabolismo de las lipoproteínas. El depósito de lípidos en el mesangio glomerular puede contribuir a la proteinuria y a la aparición de glomeruloesclerosis(164). 4.- Los antiinflamatorios no esteroides disminuyen la producción de prostaglandinas vasodilatadoras que actúan en la arteriola aferente del glomérulo(49). Reducen la tasa de filtración glomerular y, consecuentemente, la pérdida de proteínas. Sin embargo, su uso es limitado debido a su toxicidad a nivel gastrointestinal y renal(48). - 74 - II. Revisión bibliográfica 5.- Existe controversia respecto a la utilización de agentes esteroides e inmunosupresores para tratar procesos glomerulares aunque pueden ser de gran valor porque, por ejemplo, muchas glomerulonefritis caninas son inmunomediadas(202). Se han utilizado, clínica y experimentalmente, corticoesteroides, azatioprina, ciclofosfamida y ciclosporina para impedir la producción de inmunoglobulinas por los linfocitos B o para alterar la función de los T(164). En todos los casos y, más concretamente, en el de la ciclosporina, la frecuencia de aparición de efectos secundarios desaconseja su uso(390). Entre estos efectos secundarios encontramos la inhibición de la respuesta de los tejidos a la agresión, el empeoramiento de la uremia por los efectos catabólicos de los glucocorticoides y, por último, la formación de complejos inmunes activos que aumentan el daño glomerular(202). Aún así, si se utilizan agentes inmunosupresores se debe controlar el cociente P/C urinario mensualmente y suspender su administración al aumentar la proteinuria(164). En seres humanos con amiloidosis reactiva se ha obtenido buenos resultados con terapia citotóxica basada en clorambucil, ciclofosfamida y azatioprina(376). En perros con glomerulonefritis se cuestiona el uso de corticoides por la asociación que existe entre hiperadrenocorticismo o administración de corticoides prolongadamente y glomerulonefritis(404) y tromboembolismo, así como por la falta de respuesta terapéutica a su uso. La excepción se produce en aquellos casos en los que el proceso primario responde al tratamiento con corticoides como en el lupus eritematoso sistémico(166). 6.- En el tratamiento de la glomerulonefritis es fundamental disminuir la respuesta glomerular a los complejos inmunes y para ello se está utilizando la aspirina(324). Existen evidencias que demuestran que las plaquetas y tromboxanos intervienen en la patogénesis de la glomerulonefritis y la aspirina, a bajas dosis, inhibe - 75 - II. Revisión bibliográfica selectivamente la producción de tromboxanos(164, 386) . Esto se traduce en una disminución de la proteinuria, de la infiltración de neutrófilos y, finalmente, de la proliferación celular y depósito de fibrina en el glomérulo(167, 246) . También se están utilizando análogos de prostaglandinas y una suplementación dietética con ácidos grasos omega-3 poliinsaturados para disminuir la síntesis de tromboxanos y leucotrienos(164). Se ha demostrado que los ácidos grasos, en seres humanos con síndrome nefrótico, disminuyen la hipertensión, las concentraciones de triglicéridos y de colesterol y la agregación plaquetaria(7, 177). 7.- La medida de las concentraciones de antitrombina III y de fibrinógeno es necesaria para determinar qué individuos deben ser tratados por problemas de hipercoagulabilidad. Los perros con concentraciones de antitrombina III inferiores al 70% de lo normal y de fibrinógeno superiores a 300 mg/dl son candidatos a la terapia anticoagulante(164). Para ello se han utilizado agentes antiplaquetarios, heparina y cumarinas(324). Si se usa warfarina, su dosis debe individualizarse monitorizando el tiempo de protrombina. La aspirina a dosis bajas se administra fácilmente en el tratamiento ambulatorio y no requiere monitorización especial como las cumarinas, por eso es el tratamiento anticoagulante de elección. En casos de glomerulonefritis, una consecuencia que aparece es el acúmulo de fibrina en el glomérulo, por lo que el tratamiento anticoagulante cumpliría un doble propósito(164). 8.- En el tromboembolismo se han utilizado, experimentalmente, en medicina veterinaria agentes fibrinolíticos: estreptoquinasa y uroquinasa(213, 215) . Pero estas sustancias son caras para su uso en veterinaria(324) y su acción inespecífica puede potenciar la hemorragia espontánea(333). - 76 - II. Revisión bibliográfica 9.- El uso del dimetilsulfóxido (DMSO) en el tratamiento de la amiloidosis en el perro es controvertido. Los beneficios obtenidos con él incluyen la solubilización de las fibrillas amiloides, disminución de la concentración sérica de su precursor (proteína sérica AA) y la reducción de la inflamación intersticial y la fibrosis de los riñones afectados. Por otro lado, su administración produce efectos secundarios no deseables como náuseas, anorexia y disminución de la ingesta de agua(166). 10.- La colchicina entorpece la liberación de la proteína sérica AA por los hepatocitos al cerrar los microtúbulos e impedir su secreción y, por tanto, es utilizada en el tratamiento de la amiloidosis. Sin embargo, no existe evidencia de que su efecto sea beneficioso una vez que el proceso ha dado lugar a fallo renal(166). La colchicina es un poco tóxica en seres humanos y entre sus efectos secundarios nos encontramos con vómitos, diarrea y nauseas(238). Existen tratamientos experimentales para la amiloidosis con terbutalina y aminofilina, porque aumentan la adenosín monofostato cíclica e inhiben el depósito amiloide(42). Otra terapia experimental se está realizando con 4’-yodo-4’-deoxydoxorubicina, pues inhibe la formación de las fibrillas amiloides y favorece la reabsorción de los depósitos de amiloide asociados a inmunoglobulinas(155). Estos tratamientos no se han aplicado aún en la clínica de pequeños animales(166). - 77 - III. MATERIALES Y MÉTODOS III. Materiales y métodos III.1.- MATERIALES III.1.1.- Material animal En el presente trabajo se han utilizado 47 perros de diferente sexo, raza y edad, aunque todos ellos adultos, procedentes de la Consulta Pública de Patología Médica del Hospital Clínico Veterinario de la Universidad de Extremadura, donde se les diagnosticó uno de los siguientes procesos: piometra, leptospirosis o leishmaniosis. Concretamente, la distribución de patologías y número de animales fue la siguiente: 15 perros presentaron piometra, 10 leptospirosis y 22 leishmaniosis. Además se han usado, como grupo control, 20 perros sanos procedentes de particulares de nuestro ámbito de trabajo. La reseña de los distintos animales se presenta en las TABLAS 1, 2, 3 y 4. PERRO Raza Sexo Edad (meses) Peso (kg) Hábitat Alimentación 1 cruce hembra 60 35 perrera pienso 2 Podenco hembra 36 19 perrera pienso 3 Podenco hembra 36 13 perrera pienso 4 Podenco hembra 48 14 perrera pienso 5 cruce hembra 72 33 chalet pienso 6 cruce hembra 84 45 chalet pienso 7 Mastín hembra 90 43 patio pienso 8 Pitbull Terrier hembra 38 24 piso pienso 9 Cocker hembra 50 10 piso pienso 10 Doberman hembra 26 24 piso pienso 11 cruce macho 39 24 perrera pienso 12 Rottweiler macho 12 42 chalet pollo, arroz, pienso 13 Mastín macho 66 44 chalet pienso - 79 - III. Materiales y métodos 14 Pastor Alemán macho 132 36 chalet pienso 15 Pitbull Terrier macho 30 26 casa pienso, sobras 16 Pastor Alemán macho 20 32 perrera pienso 17 Bobtail macho 60 33 casa pienso 18 Boxer macho 49 36 piso pienso 19 Boxer macho 19 28 piso pienso 20 Boxer macho 48 42 piso pienso, casera TABLA 1: reseña de los animales que forman el grupo control. PERRO Raza Sexo 21 Siberian Husky hembra 24 18 casa pienso, latas, arroz Podenco Ibicenco hembra 53 31 perrera pan, pollo 22 Edad (meses) Peso (kg) Hábitat Alimentación 23 Pastor Alemán hembra 168 46 casa pienso 24 cruce hembra 36 34 finca pienso 25 San Bernardo hembra 48 46 chalet pienso, sobras 26 cruce hembra 100 16 piso pienso 27 cruce hembra 68 14 piso pienso, huesos 28 Mastín hembra 108 50 taller pienso, sobras 29 Pastor Belga hembra 87 24 chalet pienso 30 Labrador hembra 36 34 piso pienso 31 Cocker hembra 60 17 casa pienso 32 cruce hembra 132 38 casa pienso, sobras 33 cruce hembra 124 6 piso pienso 34 cruce hembra 96 10 piso pienso 35 Pastor Alemán hembra 120 25 chalet pienso TABLA 2: reseña de los animales que forman el grupo con piometra. - 80 - III. Materiales y métodos PERRO Raza Sexo Edad (meses) Peso (kg) Hábitat Alimentación 36 Mastín Napolitano macho 45 55 piso pienso 37 Epagneul Bretón macho 24 16 chalet arroz, pienso 38 cruce macho 67 35 casa pienso 39 Pastor Belga macho 120 33 piso pienso, latas, sobras 40 Cocker macho 60 14 piso pienso, pollo 41 Pitbull Terrier hembra 16 25 chalet pienso 42 cruce macho 72 51 jardín pienso, casera 43 cruce hembra 132 12 parcela casera 44 Siberian Husky macho 108 23 casa pienso 45 cruce hembra 105 11 casa arroz, carne TABLA 3: reseña de los animales que forman el grupo con leptospirosis. PERRO Raza Sexo Edad (meses) Peso (kg) Hábitat Alimentación 46 Pastor Belga hembra 60 20 finca huesos, pasta 47 Mastín hembra 120 30 casa pienso, casera 48 Dogo Alemán macho 60 43 chalet pienso 49 Pastor Belga macho 96 28 chalet pienso 50 Schnauzer hembra 36 24 casa pienso, carne 51 Bobtail macho 60 33 parcela sobras 52 Boxer macho 30 26 casa pienso 53 Pastor Alemán macho 87 22 chalet pienso 54 cruce macho 61 30 parcela pienso, casera 55 Setter Inglés macho 108 20 casa pienso, arroz, pollo 56 Sabueso Baviera macho 29 20 finca pienso 57 Cocker hembra 139 13 casa pienso 58 Rottweiler hembra 17 27 casa pienso 59 Pastor Alemán macho 48 30 chalet pienso - 81 - III. Materiales y métodos 60 Braco Alemán macho 28 27 casa pienso, arroz, carne 61 Braco Alemán hembra 24 22 patio pienso, pollo 62 cruce hembra 72 22 chalet pienso 63 Pastor Alemán hembra 38 22 parcela pienso, huesos, carne 64 Braco Alemán hembra 120 23 chalet pienso 65 Teckel macho 40 8 casa latas, salchichas 66 Siberian Husky macho 36 18 piso pienso, casera 67 Pastor Collie hembra 109 25 chalet pienso, latas TABLA 4: reseña de los animales que forman el grupo con leishmaniosis. III.1.2.- Material de extracción y conservación de las muestras III.1.2.1.- Sangre entera - Alcohol de 96° y algodón. - Banda hemostática de goma (banda Smarch). - Jeringuillas estériles de 2 cc. - Agujas hipodérmicas de calibre 21. - EDTA tripotásico (laboratorios QCA). - Tubos de ensayo de 5 cc. III.1.2.2.- Plasma - Alcohol de 96° y algodón. - Banda hemostática de goma (banda Smarch). - Jeringuillas estériles de 5 cc. - Agujas hipodérmicas de calibre 21. - 82 - III. Materiales y métodos - Heparina sódica (laboratorios QCA). - Tubos de ensayo de 10 cc. - Centrifugadora Selecta, Centronic. - Pipetas Pasteur. - Tubos de polipropileno para microcentrífuga (laboratorios Sigma). - Congelador Jouan, VX 530. III.1.2.3.- Orina - Sondas estériles para cateterización vesical de diferentes diámetros. - Guantes de látex estériles. - Povidona yodada (Betadine disolución quirúrgica). - Jeringuillas estériles de 10 y de 20 cc. - Gasas. - Tubos de ensayo cónicos. - Centrifugadora Selecta, Centronic. - Pipetas Pasteur. - Tubos de polipropileno para microcentrífuga (laboratorios Sigma). - Congelador Jouan, VX 530. III.1.3.- Material analítico III.1.3.1.- Sangre entera - Analizador automático de sangre Sysmex, F 800. - Disolución lisante de glóbulos rojos Quicklyser-II-TM QLS-200. - Disolución diluyente Cellpack. - 83 - III. Materiales y métodos - Solución de limpieza de analizadores automáticos de sangre Manoresh. - Técnica rápida de tinción para hematología Diff-Quick, comercializada por laboratorios Baxter Dade AG. - Portaobjetos. - Aceite de inmersión. - Microscopio Nikon, Labophot. - Contador de células manual Crison, Leucoform 829. III.1.3.2.- Plasma III.1.3.2.1.- Determinación de alanín-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, urea, creatinina, bilirrubina total, calcio, fósforo, albúmina y proteínas totales - Kit para la determinación de alanín-aminotransferasa (ALT), comercializado por los laboratorios Human y con referencia 12 012. - Kit para la determinación de fosfatasa alcalina (ALP), comercializado por los laboratorios Human y con referencia 12 017. - Kit para la determinación de urea, comercializado por los laboratorios Gernon y con referencia GN 70500. - Kit para la determinación de creatinina, comercializado por los laboratorios Gernon y con referencia GN 30100. - Kit para la determinación de bilirrubina total, comercializado por los laboratorios Gernon y con referencia GN 96125. - Kit para la determinación de calcio arsenazo, comercializado por los laboratorios Gernon y con referencia GN 12000. - 84 - III. Materiales y métodos - Kit para la determinación de fósforo, comercializado por los laboratorios Gernon y con referencia GN 97100. - Kit para la determinación de albúmina, comercializado por los laboratorios bioMérieux y con referencia 61 051. - Kit para la determinación de proteínas totales, comercializado por los laboratorios bioMérieux y con referencia 61 602. - Suero bovino para control de calidad en química clínica valorado Humatrol N, comercializado por los laboratorios Human y con referencia 13 511. - Agua destilada. - Tubos de ensayo de vidrio de 5 cc. - Tubos de ensayo desechables de 5 cc. - Pipetas automáticas de diferentes volúmenes y puntas de pipeta apropiadas. - Agitador Gricel, modelo 3.0. - Espectrofotómetro para química clínica Clima Plus. III.1.3.2.2.- Determinación de colesterol - Fotómetro de reflectancia Ames, Seralyzer III. - Tiras reactivas Ames para la determinación de colesterol y referencia 2715. III.1.3.2.3.- Determinación de sodio y potasio - Fotómetro de llama Meteor, Nak II. - Patrón de calibración para fotometría de llama y absorción atómica Ionomat, comercializado por laboratorios Knickerbocker y con referencia B 301. - Cubetas desechables. - 85 - III. Materiales y métodos III.1.3.3.- Orina III.1.3.3.1.- Determinación de proteínas Los productos químicos utilizados son de calidad reactivo, comercializados por los laboratorios Merck, Panreac y Sigma: * Disolución de albúmina sérica bovina al 0,02% * Disolución A: CO3Na2 al 2% y NaOH 0,1 N * Disolución B1: SO4Cu(H2O)5 al 1% * Disolución B2: Tartrato potásico al 2% * Disolución C: mezcla de A, B1 y B2 en proporción 50:0,5:0,5 preparada antes de su empleo. * Disolución de Folín-Fenol-Ciocalteus: una parte de Folín-Fenol + dos de agua. - Tubos de ensayo de 10 cc. - Balanza electrónica And, FX-320. - Agitador magnético con calentador P Selecta, Agimatic E. - Agitador de tubos Mixo-Tub, 30 Gri-Gel. - Espectrofotómetro Shimadzu, UV-160 con un sistema multiposicionador de celdillas y sistema Peltier CPS-240A. - Pipetas de vidrio de 5 ml. - Pipetas automáticas de distintos volúmenes y puntas de pipeta apropiadas. - 86 - III. Materiales y métodos III.1.3.3.2.- Determinación de creatinina y fósforo - Kit para la determinación de creatinina, comercializado por los laboratorios Gernon y con referencia GN 30100. - Kit para la determinación de fósforo, comercializado por los laboratorios Gernon y con referencia GN 97100. - Agua destilada. - Tubos de ensayo de vidrio de 5 cc. - Tubos de ensayo desechables de 5 cc. - Pipetas automáticas de diferentes volúmenes y puntas de pipeta apropiadas. - Agitador Gricel, modelo 3.0. - Espectrofotómetro para química clínica Clima Plus. III.1.3.3.3.- Determinación de sodio y potasio - Fotómetro de llama Meteor, NAK II. - Patrón de calibración para fotometría de llama y absorción atómica comercializado por laboratorios Gernon y referencia GN 2001005. - Cubetas desechables. III.1.3.3.4.- Determinación de la densidad urinaria - Refractómetro Hills, Urolithiasis program. III.1.3.3.5.- Otras determinaciones analíticas de la orina - Tubos de ensayo cónicos de 10 cc. - 87 - III. Materiales y métodos - Tiras reactivas Multistix 10 SG, comercializadas por Bayer. - Centrifugadora Selecta, Centronic. - Pipetas Pasteur. - Portaobjetos y cubreobjetos. - Microscopio Nikon, Labophot. III.1.4.- Material para electroforesis de muestras de orina en gel de poliacrilamida - Tampones: Los productos químicos utilizados son de calidad reactivo, comercializados por los laboratorios Merck, Panreac, Sigma y Bio-Rad. - Disolución 1 de acrilamida-bisacrilamida al 30:0,8 %. Tras su preparación se filtra la disolución para eliminar partículas que puedan alterar la polimerización. - Disolución 2 (para el gel separador o inferior): TRIS 1,5 M pH 8,8 con HCl y SDS al 0,4%. - Disolución 3 (para el gel de carga o superior): TRIS 0,5 M pH 6,8 con HCl y SDS al 0,4%. - Disolución de persulfato amónico al 10%, preparada el mismo día de su uso. - TEMED. - Tampón de electroforesis Laemmli: TRIS 25 mM, glicina 192 mM y SDS al 0,1%. - Disolución tampón de la muestra (se utilizará 10 veces diluida): TRIS 500 mM, SDS al 20% y ß-mercaptoetanol 1,43 M. Una vez disuelto el TRIS y el SDS, y antes de añadir el ß-mercaptoetanol, se lleva a pH 6,8 con HCl. - 88 - III. Materiales y métodos - Tampón de muestra (azul de bromofenol): TRIS 20 mM pH 7 con HCl y azul de bromofenol al 0,1%. - Disolución colorante para el gel de poliacrilamida: Coomassie Brilliant Blue R 250 al 0,2%, metanol al 45% y ácido acético al 10%. Tras su preparación se filtra para evitar partículas sólidas que pudieran quedar adheridas al gel. - Disolución decolorante para el gel de poliacrilamida: metanol al 20%, ácido acético al 10% y glicerol al 1%. - Disolución de conservación: glicerol al 6% y ácido acético al 4%. - Marcadores de peso molecular: para la identificación de las bandas de proteínas se utilizaron las siguientes proteínas de peso molecular conocido, con un rango comprendido entre 14,4 y 94 kDa y comercializadas por Pharmacia: α-lactoalbúmina de leche bovina (14,4 kDa), inhibidor de la tripsina de soja (20,1 kDa), anhidrasa carbónica de eritrocitos bovinos (30 kDa), ovoalbúmina de clara de huevo (43 kDa), albúmina sérica bovina (67 kDa) y fosforilasa b de músculo de conejo (94 kDa). - Balanza electrónica And, FX-320. - Agitador magnético con calentador P Selecta, Agimatic E. - pHmetro Crison, MicropH 2002. - Termobloque Techene.Ori.Block, DB-3H. - Puntas de pipeta especiales para el depósito de las muestras. - Sistema de electroforesis Mini-Protean II Cell, comercializado por laboratorios Bio-Rad. - Fuente de alimentación PowerPac 300, comercializada por laboratorios BioRad. - Densitómetro Pharmacia LKB, Ultro scan XL. - Secador de geles de acrilamida mediante aire, comercializado por laboratorios Bio-Rad. - 89 - III. Materiales y métodos III.1.5.- Material para Western blotting III.1.5.1.- Material para la transferencia de proteínas - Tampón CAPS: CAPS 10 mM y metanol al 10%. Se disuelve el CAPS en agua destilada a 4°C y, antes de añadir el metanol, se lleva a pH 11. Se guarda en refrigeración hasta su uso el mismo día de fabricación. - Papel Whatman 3MM, comercializado por laboratorios Sigma. - Membranas de nitrocelulosa Trans-Blot Transfer medium, comercializadas por Bio-Rad. - Sistema Mini Trans-Blo Cell, comercializado por laboratorios Bio-Rad. - Fuente de alimentación PowerPac 300, comercializada por laboratorios BioRad. - Balanza electrónica And, FX-320. - Agitador magnético con calentador P Selecta, Agimatic E. - pHmetro Crison, MicropH 2002. - Frigorífico Crolls, GFN 9603. III.1.5.2.- Material para el revelado por quimioluminiscencia - Leche en polvo desnatada Molico. - Tampón PBS-Tween 20 para todos los lavados del revelado: * K2HPO4 0,08 M * KH2PO4 0,02 M * NaCl 0,1 M * Tween 20 al 0,2% - 90 - III. Materiales y métodos - Anticuerpos primarios anti-IgA y anti-IgG de suero de perro, obtenidos en conejo y comercializados por Violin 2000. - Anticuerpo secundario anti-IgG de suero de conejo obtenido en cabra, conjugado con peroxidasa y comercializado por Violin 2000. - SuperSignal Substrate, comercializado por Pierce. - Film Kodak X-OMAT; XAR-5,8 x 10 in, comercializado por Sigma. - Líquido revelador Tetenal, Roenterol, comercializado por Sigma. - Líquido fijador Tetenal, Superfix 25, comercializado por Sigma. - Chasis sin rejilla Okamoto MGF Co-Ltd, PL-Btype. III.1.6.- Material para el estudio de microscopía óptica III.1.6.1.- Material para el estudio de secciones en parafina - Formaldehído tamponado al 3,7-4%. - Alcohol etílico absoluto. - Alcohol etílico de 96°. - Xileno. - Parafina de 56-58°C. - Agua destilada. - Reactivos para la tinción de hematoxilina-eosina. - Reactivos para la tinción de P.A.S. - Medio de montaje Eukitt. - Frascos de 100 ml para la recogida de muestra. - Procesador de tejidos Leica TP 1020. - Dispensador de parafina P Selecta. - Microtomo Medim DDM System Pathologie. - 91 - III. Materiales y métodos - Portacuchillas. - Cuchillas desechables Feather R 35. - Portaobjetos y cubreobjetos. - Estufa Carbolite Eurotherm. - Baño para secciones en parafina Electrothermal. - Balanza de precisión Precisa 600C. - Fotomicroscopio Nikon Optiphot. III.1.6.2.- Material para el estudio de secciones semifinas - Agua destilada. - Glutaraldehido al 25%. - Carbón activo. - Ácido clorhídrico 1 N. - Tetraóxido de osmio (500 mg). - Alcohol etílico de 96°. - Alcohol etílico absoluto. - Acetato de uranilo. - Óxido de propileno. - Glycidether 100 (Epon 812). - Dodecinilsuccinilandride (DDSA). - 2,4,6-Tris (dimethylaminomethyl)-phenol (DMP-30). - Methylnorvonen-2,3-dicarboxylico anhidro (MNA). - Ultramicrotomo Ultracut Reichert-Jung. - phmetro Hanna Instrumets 8417. - Estufa Carbolite Eurotherm. - Azul de Toluidina. - 92 - III. Materiales y métodos - Fotomicroscopio Nikon Optiphot. III.1.7.- Material fotográfico -Equipo de fotografía para microscopio compuesto de cámara Nikon FX-35A y disparador Microflex Nikon HFX-II. - Película fotográfica Kodak Ektachrome 160 T. III.1.8.- Material informático - Ordenador Pentium Premier. - Ordenador Macintosh LCIII. - Ordenador Compaq Presario 1246. - Escáner ScanJet 4C. - Programa informático Ultroscan GSXL. - Programa Filemaker Pro 4.0. - Programa Microsoft Office 2000. - Programa Corel Draw 8. - Programa Micrografx Picture Publisher LE. - Impresora Epson LX 400. - Impresora Macintosh Personal LaserWriter. - Impresora Hewlett Packard DeskJet 710C. - Impresora Hewlett Packard LaserJet 2100 TN. - 93 - III. Materiales y métodos III.1.9.- Material estadístico - Programa estadístico SPSS (2000) licenciado para la Universidad de Extremadura. Como guías de consulta se han utilizado: * Dohoo, I.R. y Waltner-Toews, D. Interpreting clinical research Part I. General considerations. The Compendium on Continuing Education 1985; 7: 473-478. * Dohoo, I.R. y Waltner-Toews, D. Interpreting clinical research Part II. Descriptive and experimental studies. The Compendium on Continuing Education 1985; 7: 513-519. * Dohoo, I.R. y Waltner-Toews, D. Interpreting clinical research Part III. Observational studies and interpretation of results. The Compendium on Continuing Education 1985; 7: 605-613. * Smith, R.D. Veterinary clinical epidemiology. A problem-oriented approach 2ª ed. Boca Raton: CRC Press 1995. * Sokal, R.R. y Romlf, F.V. Biometría. Madrid: Blume 1979. III.2.- MÉTODOS III.2.1.- Método general empleado en cada animal Se realizó, en primer lugar, una anamnesis completa en la que se determinó la edad, raza, hábitat, alimentación, estado vacunal y el peso corporal del animal. Del - 94 - III. Materiales y métodos mismo modo se investigó la existencia de patologías previas y de cualquier signo de enfermedad. Una vez obtenidos los datos anteriores, se siguió con la exploración física consistente en la toma de la temperatura rectal, aspecto de mucosas, presencia de deshidratación, ascitis o edema, palpación lumbar, exploración ganglionar y auscultación cardíaca y pulmonar. A continuación se realizaron tantas pruebas diagnósticas como fueron necesarias para determinar la enfermedad que padecía el animal. El diagnóstico definitivo de cada uno de los procesos objeto de nuestro estudio se realizó de la siguiente manera: 1.- Las piometras se diagnosticaron mediante ecografía y radiografía abdominal. 2.- Las leptospirosis se identificaron por microscopía de campo oscuro en orina y se confirmaron por aglutinación microscópica en plasma. 3.- Las leishmaniosis se diagnosticaron mediante ELISA en plasma. En todos los perros se extrajo la sangre por punción de la vena cefálica, previa desinfección de la zona, utilizando como anticoagulante EDTA tripotásico (2 ml de sangre) y heparina sódica (5 ml de sangre). La primera de las muestras se destinó al análisis hematológico inmediato y a la realización de un frotis sanguíneo para el recuento diferencial de glóbulos blancos. La segunda se centrifugó a 3.000 r.p.m. durante diez minutos. El plasma obtenido se utilizó para realizar inmediatamente las determinaciones correspondientes. La extracción de orina se realizó mediante sondaje vesical, en condiciones estériles, con sonda flexible y desinfección del orificio externo de la uretra con una - 95 - III. Materiales y métodos disolución de povidona yodada (Betadine). Una vez obtenida la orina se realizó su examen físico, químico y del sedimento urinario, centrifugando 5 cc de la misma a 1000 r.p.m. durante cinco minutos. Una porción del sobrenadante se congeló a -40°C para la realización de la electroforesis en SDS-PAGE y consiguiente transferencia y revelado de las proteínas urinarias, y el resto se utilizó en la determinación de creatinina y proteínas. La porción de muestra sin centrifugar se usó para las determinaciones de fósforo, sodio y potasio. A los perros del grupo control, una vez comprobada la ausencia de patología, se les aplicó la misma metodología que a los animales de los grupos problema. III.2.2.- Análisis clínicos III.2.2.1.- Hematología La sangre se procesó inmediatamente en un analizador automático Sysmex F-800, con EDTA tripotásico como anticoagulante. Los parámetros obtenidos fueron: recuento de glóbulos rojos, valor hematocrito, concentración de hemoglobina, índices de Wintrobe, recuento de glóbulos blancos y recuento de plaquetas. El recuento diferencial de glóbulos blancos, con un método de tinción rápida, se llevó a cabo mediante la identificación de 200 leucocitos por microscopía. - 96 - III. Materiales y métodos III.2.2.2.- Bioquímica plasmática III.2.2.2.1.- Determinación de alanín-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, urea, creatinina, bilirrubina total, calcio, fósforo, albúmina y proteínas totales Todas las determinaciones se llevaron a cabo el mismo día de recogida de la muestra en un espectrofotómetro de química clínica y con los reactivos apropiados para cada caso. En los animales en los que se observó hipoalbuminemia, el calcio sérico se corrigió mediante la fórmula(286): Calcio corregido (mg/dl) = calcio medido (mg/dl) – albúmina (g/dl) + 3,5 III.2.2.2.2.- Determinación de colesterol Su determinación se realizó en un analizador de química sanguínea en fase sólida. III.2.2.2.3.- Determinación de sodio y potasio Se determinaron mediante fotometría de llama, utilizando patrones de calibración específicos para fotometría de llama y absorción atómica. - 97 - III. Materiales y métodos III.2.2.2.4.- Determinación del cociente albúmina/globulina Se calculó dividiendo la concentración de albúmina y globulinas plasmáticas. III.2.2.3.- Urianálisis III.2.2.3.1.- Examen físico El color, aspecto y olor de la orina se evaluaron por observación directa de la misma. III.2.2.3.2.- Examen químico El examen químico se llevó a cabo mediante tiras reactivas de orina que valoran los siguientes parámetros: glucosa, bilirrubina, ácido acetoacético (cetonas), sangre, proteínas, urobilinógeno, pH, nitritos y leucocitos. III.2.2.3.2.1.- Proteínas La determinación de la concentración de proteínas totales, en el sobrenadante de la orina centrifugada, se midió según el método de Lowry et al.(248), descrito en 1951, por su gran sensibilidad, utilizando albúmina sérica bovina como patrón de referencia. Para ello se prepara un blanco, siete diluciones de la disolución patrón de seroalbúmina (concentraciones de proteínas de 100, 150, 300, 500, 1000, 1500 y 2000 µg/ml, respectivamente) y las distintas orinas problema. Se van añadiendo la disolución de albúmina o, en su caso, las muestras problema, el agua destilada y la disolución C, tras lo cual se agita la mezcla. A continuación se agrega el reactivo de Folín-Fenol en dos - 98 - III. Materiales y métodos partes, agitando después de añadir cada uno de los 200 µl. Los distintos volúmenes (en µl) aparecen reflejados en la TABLA 5. Blanco 1 2 3 4 5 6 7 Problema Disol. albúmina — 50 75 150 250 500 750 1000 — H2O 1000 950 925 850 750 500 250 — 900 Disolución C 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 Folín-Fenol 400 400 400 400 400 400 400 400 400 Orina — — — — — — — — 100 TABLA 5: protocolo para la determinación de la concentración de proteínas en la orina mediante el método de Lowry et al.(248) (1951). Tras un tiempo de reposo comprendido entre 30 y 60 minutos, se lee su absorbancia a 550 nm frente al blanco. Con las siete diluciones de concentración proteica conocida se construye la gráfica patrón para conocer la concentración en proteínas de la muestra problema, expresada en µg/ml de orina. III.2.2.3.2.2.- Creatinina y fósforo Se determinaron el mismo día de recogida de la muestra y en un espectrofotómetro de química clínica con los reactivos apropiados para cada caso. Para su cuantificación, la orina se diluyó 50 veces en el caso de la creatinina y 10 veces en el del fósforo. - 99 - III. Materiales y métodos III.2.2.3.2.3.- Sodio y potasio Se determinaron mediante fotometría de llama utilizando patrones de calibración específicos para fotometría de llama y absorción atómica. III.2.2.3.3.- Densidad de la orina La densidad se determinó por refractometría. III.2.2.3.4.- Sedimento urinario Con el examen microscópico del sedimento se cuantificó en 10 campos la presencia, a 40x, de los siguientes elementos: células epiteliales, glóbulos rojos, glóbulos blancos, cilindros, cristales y bacterias. III.2.2.3.5.- Determinación del cociente proteína/creatinina Se halló mediante la división de la concentración de proteína y creatinina, ambas expresadas en mg/dl, en la muestra de orina centrifugada. III.2.3.- Pruebas de funcionalidad renal III.2.3.1.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo Se determinan mediante la fórmula: Excreción fraccional y = (Uy x Pcr) / (Ucr x Py) x 100 - 100 - III. Materiales y métodos * y = electrolito a determinar su excreción fraccional. * Uy = concentración del electrolito en orina (mg/dl). * Pcr = concentración plasmática de creatinina (mg/dl). * Ucr = concentración de creatinina en orina (mg/dl). * Py = concentración plasmática del electrolito (mg/dl). III.2.4.- Electroforesis vertical en gel de poliacrilamida SDS (según la técnica de Laemmli, U.K.(225), 1970) La electroforesis en gel de poliacrilamida y en presencia de dodecil sulfato sódico se utiliza para la separación de proteínas únicamente en función de su peso molecular. La concentración de acrilamida y bisacrilamida varía en función del tamaño de las proteínas que se pretenden separar. En nuestro caso, los geles se han preparado a partir de una disolución madre de acrilamida al 30% y bisacrilamida al 0,8%. Cada experimento ha constado de dos electroforesis idénticas: - Un gel era teñido y decolorado para estudiar las distintas bandas proteicas en el densitómetro. - El segundo gel se ha usado para la transferencia de proteínas a la membrana de nitrocelulosa, incubación de la misma con los correspondientes anticuerpos y revelado por quimioluminiscencia de las bandas encontradas. III.2.4.1.- Preparación de los geles de poliacrilamida La técnica utilizada en nuestro estudio ha sido la electroforesis discontinua de Laemmli(225) (1970), caracterizada porque la concentración de acrilamida es distinta - 101 - III. Materiales y métodos para cada parte del gel: la inferior tiene una concentración del 10,4% y la superior del 4%. El pH también difiere en cada una de ellas: la primera cuenta con un pH de 8,8 y la segunda con uno de 6,8. El tampón Laemmli contiene SDS y glicina que juegan un papel fundamental en la resolución de la técnica. Con el primero, y por tener afinidad por las partes hidrofóbicas de las proteínas, se consigue la desnaturalización de las mismas y dotarlas de carga negativa. Por otro lado, la glicina juega un papel muy importante en la concentración de la muestra a su paso por el gel de carga. Este gel tiene un pH de 6,8 que coincide con el punto isoeléctrico de la glicina y por tanto actúa frenando la migración. De esta forma, se consigue que la muestra llegue al gel separador marcando un frente muy estrecho, lo que aumenta la resolución de la técnica(75, 97). La composición de los geles de cada electroforesis, para los que se utilizan las disoluciones reseñadas con anterioridad, queda reflejada en la TABLA 6 con los volúmenes correspondientes expresados en µl: Gel separador (10,4%) Gel de carga (4%) Disolución 1 1700 400 Disolución 2 1250 — Disolución 3 — 700 Agua destilada 2100 1570 TEMED 2,3 1,6 Persulfato amónico 18,7 25 - 102 - III. Materiales y métodos TABLA 6: protocolo para la preparación de los geles utilizados en la realización de electroforesis en gel de poliacrilamida y en presencia de SDS. Volúmenes en µl y calculados para Mini-Protean II Cell de Bio-Rad. Se añaden las distintas disoluciones de los geles separador y de carga, por separado, a excepción del TEMED y el persulfato amónico. A continuación sumamos éstos al separador para que se inicie la polimerización y el gel se vierte entre los cristales de electroforesis, previamente montados. Seguidamente, añadimos el TEMED y el persulfato a la mezcla del gel de carga que se irá vertiendo, con ayuda de una pipeta Pasteur, sobre el primero para evitar su mezcla. Se colocan los peines en ambos soportes y se espera entre 15 y 20 minutos a que polimericen los geles. Transcurrido este tiempo se retiran los peines y se lavan los pocillos con agua destilada para eliminar burbujas de aire. Se colocan los cristales en el soporte con los electrodos y se añade tampón Laemmli en el espacio que queda entre los dos cristales. A continuación se vierte por el exterior de los soportes hasta cubrir los electrodos y se procede a depositar cada muestra en su pocillo con unas puntas de pipeta especiales para ello. III.2.4.2.- Preparación de las muestras En cada electroforesis se dispone de 10 pocillos donde se depositan un marcador de pesos moleculares, la orina de un perro sano (control) y 8 orinas de perros objeto de nuestro estudio. El volumen depositado en cada pocillo fue de 25 µl con el fin de evitar la mezcla de muestras de varios pocillos. En el caso de las muestras de orina están constituidos por: 2 µl de glicerol, 2,5 µl de tampón de la muestra 10 veces concentrado y 1 µl de azul de bromofenol. El resto lo forman la orina y el agua. La cantidad de proteínas incluida en cada muestra se estandarizó en 5 µg, con el fin de favorecer el estudio cualitativo de las bandas proteicas. Las muestras de orina se - 103 - III. Materiales y métodos acompañan de un marcador de pesos moleculares comprendidos entre 14,4 y 94 kDa. En este caso los 25 µl de la muestra están constituidos por 2 µl de glicerol, 1,5 µl de tampón, 1 µl de azul de bromofenol, 2,5 µl de marcador y 18 µl de agua. Una vez preparada la muestra se agita y se introduce en termobloque durante 1 minuto y 10 segundos a 100°C con el fin de desnaturalizar las proteínas. Por último, se depositan las muestras en sus pocillos correspondientes y se conecta el sistema a la fuente de alimentación, realizándose la electroforesis a voltaje constante de 100 mV para el gel de carga y de 150 mV para el separador. Se da por finalizada la migración cuando el azul del frente alcanza el extremo inferior del gel. III.2.4.3.- Tinción y secado del gel de poliacrilamida Concluida la migración se retiran los cristales y uno de los geles se introduce en el colorante (Coomassie Brilliant Blue), en agitación y durante media hora. A continuación, se decolora durante dos horas más y se deja equilibrar el gel en el tampón de conservación hasta su lectura en el densitómetro. Finaliza el proceso cuando, una vez leído, se seca con aire caliente, durante 1 hora, en el secador de geles. El otro gel, una vez separado de los cristales de electroforesis, sigue el proceso de Western blotting. III.2.5.- Western blotting Esta técnica(318, 385) se basa en la realización de una electroforesis en gel de acrilamida, transferencia posterior de las proteínas desde el gel a una membrana de nitrocelulosa y revelado y detección de estas proteínas. Para ello, cuando las proteínas se han transferido a la membrana se les hace contactar con un anticuerpo primario de la proteína a identificar y con el anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario está - 104 - III. Materiales y métodos conjugado con peroxidasa y en presencia del sustrato formará un producto fluorescente. De este modo se detecta la presencia de una proteína específica mediante autorradiografía. En nuestro estudio los anticuerpos primarios empleados fueron antiIgA y anti-IgG de perro y el secundario elegido resultó válido para ambos. III.2.5.1.- Transferencia de proteínas al filtro de nitrocelulosa (según la técnica de Matsudaira, P.(258), 1987 con modificaciones de Centeno, F. et al.(64), 1994) La transferencia se basa en el paso de proteínas desde el gel de acrilamida al filtro de nitrocelulosa mediante la aplicación de una corriente eléctrica. Para ello, cortamos con guantes dos trozos de papel Whatman 3MM y uno de nitrocelulosa de dimensiones 9x7 cm. Se disponen cubetas con tampón CAPS, previamente preparado y conservado en refrigeración, donde se humedecen el papel Whatman, la nitrocelulosa, las esponjas del transblot y el gel de acrilamida. Se prepara el soporte de transferencia siguiendo este orden: esponja, papel Whatman, gel de acrilamida, nitrocelulosa, papel Whatman y esponja. Al colocar la nitrocelulosa sobre el gel no deben quedar burbujas de aire entre ambos, pues disminuirían la transferencia de las proteínas. A continuación se marcan las distintas calles con lápiz. El gel debe coincidir con el lado negro del soporte (polo negativo) ya que las proteínas, con carga negativa, migrarán hacia la nitrocelulosa situada en el polo positivo (lado rojo). Se introduce el soporte de transferencia en el transblot y se coloca en la cubeta de electroforesis junto con un recipiente con hielo. Se vierte en la cubeta el tampón CAPS de transferencia y se conecta a la fuente de alimentación durante hora y media, con agitación y a 90-100 voltios. El amperaje no debe superar los 300 mA. Si ocurriera esto, bastará con disminuir el voltaje. - 105 - III. Materiales y métodos Terminada la transferencia teñimos el gel (Coomassie Brilliant Blue), en agitación durante media hora y lo decoloramos para comprobar el grado de transferencia que, en las condiciones reseñadas, fue completa en la mayor parte de los experimentos. III.2.5.2.- Revelado y detección El primer paso en el revelado y detección es saturar el filtro de nitrocelulosa para evitar uniones inespecíficas de los anticuerpos. Para ello, se preparan 20 ml de tampón PBS-Tween 20 con leche en polvo desnatada al 10%, en los que se sumerge el filtro en agitación durante 30 minutos. A continuación se realizan dos lavados de un minuto cada uno en 20 ml de PBS-Tween 20, cantidad y tampón que se usará en cada lavado, y se incuba la nitrocelulosa con el anticuerpo primario a una dilución de 1/1000 (a menos que se indique otra cosa) en PBS-Tween durante una hora a temperatura ambiente. De nuevo se lava la membrana dos veces durante 1 minuto y una vez durante 10 minutos y se incuba, en las mismas condiciones, durante media hora en el anticuerpo secundario (diluido en principio a 1/1000). Seguidamente se lava el filtro una vez durante 1 minuto y dos veces durante 10 minutos, tras lo cual se deja secar la nitrocelulosa para llevar a cabo el revelado por quimioluminiscencia(401). Para revelar se mezclan en una cubeta y a partes iguales (3,5 ml/disolución) las soluciones Luminol y Enhancer del kit de revelado (SuperSignal Substrate). A continuación se sumerge el filtro en esta disolución durante 5 minutos, asegurándonos que queda bien empapado. Trascurridos los 5 minutos se envuelve en plástico, procurando que no aparezcan burbujas de aire, y se fija en la placa de autorradiografía con la cara donde se encuentran las proteínas hacia arriba para contactar con la película. - 106 - III. Materiales y métodos Una vez en la cámara oscura se coloca la película y se deja el tiempo de exposición adecuado (15 sg, 30 sg o 1 minuto) para, a continuación, sumergirla en el líquido revelador hasta que se oscurezca, lavarla en agua y dejarla en el líquido fijador durante tres minutos. Por último se lava la película en agua y se deja secar. Según el resultado obtenido se puede exponer, durante más o menos tiempo, otra película. III.2.6.- Estudio de microscopía óptica Se han seleccionado, para el estudio microscópico, las muestras de ambos riñones de 3 perros con leishmaniosis que fueron eutanasiados en nuestra consulta por distintos motivos. III.2.6.1.- Estudio de secciones en parafina Las muestras de riñón seleccionadas para este estudio se fijaron en formol tamponado al 3,7-4%, procesándose según las técnicas habituales en microscopía óptica e incluyéndose en parafina. A continuación se obtuvieron los bloques correspondientes, a partir de los cuales se realizaron cortes de 5 µm que, posteriormente, se tiñeron con los métodos de hematoxilina-eosina y P.A.S. III.2.6.2.- Estudio de secciones semifinas Las muestras reservadas para este estudio se fijaron, por inmersión rápida en glutaraldehído al 2,5%, en solución tampón cacodilato 0,1 M. A continuación se lavaron en dicho tampón y se llevó a cabo su refijación en tetraóxido de osmio al 1% en solución tampón cacodilato 0,1 M. Nuevamente se lavaron las muestras con la solución tampón, deshidratándolas mediante pasos sucesivos por alcoholes etílicos en escala - 107 - III. Materiales y métodos ascendente, desde alcohol de 50° hasta absoluto, este último con acetato de uranilo al 3%. Seguidamente las muestras se sumergieron, por este orden, en alcohol absoluto, en óxido de propileno puro y en una mezcla al 50% de este último y la correspondiente resina. El proceso finalizó incluyendo las muestras en dicha resina, constituida por la mezcla de Epon, DDSA, MNA y DMP-30. De los bloques obtenidos se realizaron secciones semifinas que fueron teñidas con el colorante Azul de Toluidina. III.2.7.- Estudio estadístico Las variables pertenecientes al estudio de los análisis clínicos realizados, se han descrito mediante la media, desviación estándar, valor máximo y valor mínimo. En el caso del estudio electroforético, el peso molecular y la cantidad de proteína observada en cada banda se han descrito mediante la media y la desviación estándar. El efecto en dichas variables del cuadro patológico en el que se encuadraba cada animal, se determinó mediante un análisis de la varianza (ANOVA) a una vía, en el que el efecto grupo presentaba 4 niveles (control, piometra, leptospirosis y leishmaniosis). Se utilizó sistemáticamente, como covariable, el peso del animal (kg), en la medida en que pudiera ser un factor que influyera en la variable en estudio. En caso de que este análisis resultara estadísticamente significativo, las diferencias entre las medias de los 4 grupos experimentales se establecieron “a posteriori” mediante una prueba de Tukey, con un nivel de significación estandarizado (p < 0,05). El modelo de ANOVA seguido en todos los casos ha sido el siguiente: - 108 - III. Materiales y métodos Xij = µ + Wi + Gj + ε Xij = valor presentado para una variable dada, por el perro i perteneciente al grupo experimental j. µ = media general de la población. Wi = efecto debido a la covariable peso del perro i. Gj = efecto debido al grupo j en el que está incluido el perro i (control, piometra, leptospirosis o leishmaniosis). ε = error. Para el caso particular de las frecuencias de presentación de las distintas bandas proteicas, las posibles diferencias entre cada 2 grupos se estableció mediante una prueba de χ2. - 109 - IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN IV. Resultados y discusión: optimización IV.1.- OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE ELECTROFORESIS IV.1.1.- Concentración de acrilamida Los parámetros que influyen en la resolución de proteínas separadas por SDS-PAGE, en un sistema discontinuo, son la proporción de acrilamida/bisacrilamida en los geles de carga (superior) y separador (inferior), el pH de estos geles y el método de preparación de las muestras(206). En nuestro estudio se utilizó una proporción de acrilamida-bisacrilamida de 30:0,8% y, a partir de aquí, se realizaron sucesivas electroforesis con una concentración fija de acrilamida del 4% para el gel de carga y con concentraciones crecientes (7,5%, 10,4%, 12,5%, 13,5% y 15%) para el separador. Los resultados obtenidos en orinas de perros sanos y problemas mostraron que la mayoría de las proteínas urinarias, objeto de nuestro estudio, presentaban un peso molecular en torno a 60 kDa y, por tanto, la concentración de acrilamida-bisacrilamida óptima debía ser intermedia. Con concentraciones altas en el gel separador (13,5% o 15%) las proteínas de peso molecular superior a 67 kDa no se separaban y, por el contrario, con una concentración baja (7,5%) se perdían proteínas de peso molecular inferior a 30 kDa. Tras sucesivos experimentos el porcentaje de acrilamida para el gel separador se fijó en 10,4% y en 4% para el de carga (FIGURA 1). - 111 - IV. Resultados y discusión: optimización FIGURA 1: bandas observadas en la electroforesis de orina de un perro sano (calle 1), dos perros con leptospirosis (calles 2 y 3), tres perras con piometra (calles 4, 5 y 6) y tres perros con leishmaniosis (calles 7, 8 y 9). Pm = marcador de pesos moleculares. IV.1.2.- Marcador de pesos moleculares En la puesta a punto del método a emplear se utilizaron, en una primera fase, dos tipos de marcadores: 1.- Marcador de bajo peso molecular (LMW) constituido por: α-lactoalbúmina de leche bovina (14,4 kDa), inhibidor de la tripsina de soja (20,1 kDa), anhidrasa carbónica de eritrocitos bovinos (30 kDa), ovoalbúmina de clara de huevo (43 kDa), albúmina sérica bovina (67 kDa) y fosforilasa b de músculo de conejo (94 kDa). 2.- Marcador de alto peso molecular (HMW) constituido por: glutámico deshidrogenasa de hígado bovino (53 kDa), transferrina humana (76 kDa), βgalactosidasa de E. coli (116 kDa), α2-macroglobulina de plasma bovino (170 kDa) y miosina de músculo de conejo (212 kDa). - 112 - IV. Resultados y discusión: optimización Las bandas que se encontraron, al utilizar el HMW, no se correspondieron con el patrón esperado para ese marcador, es decir, 5 bandas perfectamente definidas. Aparecía un número superior de bandas (FIGURA 2), con la consiguiente imposibilidad de fijar sus distintos pesos moleculares y su invalidación para nuestro trabajo. Este hecho puede achacarse al porcentaje de acrilamida elegido (10,4%) que, para separar proteínas de peso molecular alto, no es el más adecuado. Por el contrario, el LMW mostraba 6 bandas nítidas y fue elegido como marcador de los pesos moleculares de nuestras proteínas (FIGURA 2). FIGURA 2: marcadores de bajo (LMW) y alto peso molecular (HMW). IV.1.3.- Cantidad de proteínas (µ µg) de cada muestra - 113 - IV. Resultados y discusión: optimización Las muestras utilizadas estuvieron constituidas por orina centrifugada con el fin de eliminar células, cuyo contenido proteico pudiera interferir en los resultados electroforéticos. Se deben tener en cuenta tres factores para determinar la cantidad de proteína a cargar en la electroforesis: grosor del gel, número de bandas que aparecen en la muestra y, principalmente, el método de detección de esas proteínas. Para la estandarización de esta cantidad se partió de estudios anteriores(154) y se comenzó con cantidades de 3 µg, 5 µg y 10 µg, utilizando siempre las mismas muestras (una del grupo control y dos del grupo problema). Los resultados obtenidos se muestran en la FIGURA 3. Cuando la cantidad de proteína cargada fue de 3 µg las bandas fueron muy tenues y en la orina del grupo control, con menor número de bandas, su visualización fue difícil (calle 1). Al depositar 10 µg de proteína ocurrió lo contrario pues las bandas se superponían, con la consiguiente falta de definición, sobre todo en las orinas problema (calles 8 y 9). Por todo ello se fijó la cantidad de proteína en 5 µg/pocillo tanto en las orinas del grupo control como en las del grupo problema (calles 4, 5 y 6). - 114 - IV. Resultados y discusión: optimización FIGURA 3: electroforesis de una orina del grupo control y dos del problema con 3 µg, 5 µg y 10 µg de proteína en la muestra. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = control, 3 µg. Calle 2 = problema (piometra), 3 µg. Calle 3 = problema (leishmaniosis), 3 µg. Calle 4 = control, 5 µg. Calle 5 = problema (piometra), 5 µg. Calle 6 = problema (leishmaniosis), 5 µg. Calle 7 = control, 10 µg. Calle 8 = problema (piometra), 10 µg. Calle 9 = problema (leishmaniosis), 10 µg. IV.1.4.- Conservación y validez de las muestras tras sucesivas congelaciones En ocasiones, la cantidad de orina almacenada a -40°C, hasta su estudio electroforético, no fue muy elevada. Para prevenir que una muestra fuera insuficiente, se comprobó cuantas congelaciones-descongelaciones sucesivas de la orina se podían realizar sin que se alterara el patrón electroforético de la misma. Para ello se eligió la orina de un perro control, con suficiente cantidad de muestra almacenada, y a 6 fracciones de la misma se las sometió, respectivamente, a 1, 2... hasta 6 congelaciones-descongelaciones sucesivas, y se incluyeron en una electroforesis. Se comprobó que las 6 muestras, cada una de ellas congelada un número diferente de veces, presentaban el mismo patrón electroforético (FIGURA 4) y que, por tanto, la - 115 - IV. Resultados y discusión: optimización realización de al menos 6 congelaciones-descongelaciones sucesivas de la orina no afectaban a nuestro estudio. FIGURA 4: patrón electroforético de la orina de un perro control sometida a sucesivas congelaciones-descongelaciones, desde una (calle 1) hasta un máximo de seis (calle 6). Pm = marcador de pesos moleculares. IV.2.- OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE WESTERN BLOTTING IV.2.1.- Anticuerpos a utilizar Desde el primer momento se planteó identificar mediante Western blotting las inmunoglobulinas que podían aparecer en la orina de perros sanos y de animales con enfermedad renal debida a distintas patologías. Los anticuerpos primarios que se pensó utilizar fueron anti-IgA, anti-IgG y anti-IgM de suero de perro, obtenidos en conejo, y como anticuerpo secundario anti-IgG de suero de conejo, obtenido en cabra y - 116 - IV. Resultados y discusión: optimización conjugado con peroxidasa. Se optimizaron las diluciones de los tres anticuerpos primarios y del secundario, como posteriormente se mencionará. El anti-IgM se descartó de este estudio debido a que los resultados obtenidos con él no fueron concluyentes. Esta inmunoglobulina es secretada en su forma polimérica, constituida por cinco y, en ocasiones, seis subunidades de 180 kDa, de modo que su peso molecular alcanza los 900 kDa, lo que dificulta su excreción por el riñón(383). IV.2.2.- Dilución óptima del anticuerpo primario: anti-IgA y anti-IgG Los dos anticuerpos se probaron por separado y ambos a unas diluciones 1:1.000, 1:2.000, 1:5.000 y 1:10.000, fijando el anticuerpo secundario a 1:2.500 para una primera aproximación a la dilución óptima a la que serían, posteriormente, utilizados. Para ello se utilizaron las orinas de un perro control y de un perro con leishmaniosis y se comprobó que la señal era nítida en la dilución 1:10.000 y que con diluciones menores aparecían muchas uniones inespecíficas y una alta señal de fondo, que hacían difícil las cuantificaciones posteriores (FIGURA 5). - 117 - IV. Resultados y discusión: optimización FIGURA 5: optimización de la concentración del anticuerpo primario anti-IgA en la orina de un perro sano (grupo control) y en la de un perro problema (grupo con leishmaniosis). Calles 1 y 2 = orina control y problema, respectivamente; cp = cadena pesada, cl = cadena ligera. En el caso del anticuerpo anti-IgA se probó con diluciones mayores, concretamente 1:15.000, 1:20.000 y 1:25.000, pero la señal a partir de 1:10.000 se hacía muy tenue, llegando a desaparecer en el caso de las diluciones 1:20.000 y 1:25.000. Por todo ello, y unificando criterios, se fijó la dilución de los anticuerpos anti-IgA y anti-IgG en 1:10.000 (FIGURA 6). FIGURA 6: optimización de la concentración del anticuerpo primario anti-IgA en la orina de un perro sano (grupo control) y en la de un perro problema (grupo con leishmaniosis). Calles 1 y 2 = orina control y problema, respectivamente; cp = cadena pesada, cl = cadena ligera. - 118 - IV. Resultados y discusión: optimización IV.2.3.- Dilución óptima del anticuerpo secundario Una vez fijada la dilución de los anticuerpos primarios en 1:10.000 y utilizando las mismas muestras de orina, se optimizó la dilución del anticuerpo secundario. Para ello se reveló la membrana de nitrocelulosa con distintas diluciones de éste: 1:2.500, 1:5.000, 1:10.000 y 1:20.000 para cada anticuerpo primario (dilución 1:10.000) (FIGURA 7). Con la primera de las diluciones la señal fue muy fuerte y con las dos últimas muy tenue, por lo que se eligió como óptima la dilución 1:5.000 tanto para el anticuerpo anti-IgA como para el anti-IgG. A lo largo de esta Tesis Doctoral, el uso de la quimioluminiscencia como método de detección permitió, a partir de un tiempo de exposición para cada film de 30 segundos, incrementar dicho tiempo a 1 minuto cuando la señal obtenida fue muy tenue o reducirlo a 15 segundos si, por el contrario, la señal mostró ser demasiado intensa. FIGURA 7: optimización de la concentración del anticuerpo secundario en la orina de un perro sano (grupo control) y en la de un perro problema (grupo con leishmaniosis). Calles 1 y 2 = orina control y problema, respectivamente; cp = cadena pesada, cl = cadena ligera. - 119 - IV. Resultados y discusión: control IV.3.- GRUPO CONTROL IV.3.1.- Anamnesis y exploración física La anamnesis y exploración física de los 20 perros que forman el grupo control fue normal, sin que se apreciaran alteraciones en ninguno de los sistemas orgánicos examinados. IV.3.2.- Análisis de sangre IV.3.2.1.- Hematología Los valores medios de la serie roja (TABLA 7), recuento de plaquetas (TABLA 8) y serie blanca (TABLA 9) del grupo control coincidieron con los descritos como fisiológicos para la especie canina por numerosos autores(54, 198, 274, 379, 387) . En cinco perros de los veinte que forman este grupo, se observó un aumento moderado del recuento de eritrocitos, concentración de hemoglobina y hematocrito. Comprobada la ausencia de otras alteraciones analíticas, se atribuyó a una contracción esplénica inducida por el estrés(388), provocado en estos animales al realizar la correspondiente exploración física y posterior recogida de muestras. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. RGR (x106/µ µl) 7,28 1,13 9,23 5,31 HGB (g/dl) 16,83 2,00 19,90 13,70 HCT (%) 52 8 63 38 VCM (fl) 71,28 2,30 75,50 65,60 - 120 - IV. Resultados y discusión: control HCM (pg) 23,35 2,24 27,10 16,80 CHCM (g/dl) 32,74 2,91 36,80 23,80 TABLA 7: valores de la serie roja del glóbulos rojos (RGR); concentración de hematocrito (HCT); volumen corpuscular corpuscular media (HCM); concentración media (CHCM). PLT (x103/µ µl) grupo control. Recuento de hemoglobina (HGB); valor medio (VCM); hemoglobina de hemoglobina corpuscular Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. 313,60 184,94 764,00 116,00 TABLA 8: valores del recuento de plaquetas (PLT) del grupo control. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. RGB (x103/µ µl) 9,17 3,16 16,20 5,70 N. bastonados/µ µl 364 426 1360 0 N. segmentados/µ µl 6198 2611 11700 2156 Basófilos/µ µl 0 0 0 0 Eosinófilos/µ µl 504 319 1134 0 Linfocitos/µ µl 1633 1074 4896 390 Monocitos/µ µl 421 257 972 0 TABLA 9: valores de la serie blanca del grupo control. Recuento total (RGB) y diferencial de glóbulos blancos. IV.3.2.2.- Bioquímica sanguínea - 121 - IV. Resultados y discusión: control Al igual que en el caso de la hematología, en la bioquímica sanguínea del grupo control (TABLA 10) tampoco se encontraron diferencias respecto a lo descrito por distintos autores para la especie canina(54, 198, 274, 379, 387). Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. Urea (mg/dl) 30,15 6,97 45,00 17,00 Creatinina (mg/dl) 1,09 0,18 1,30 0,80 FA (UI/l) 22,15 13,48 55,00 4,00 ALT (UI/l) 41,05 15,18 94,00 22,00 BT (mg/dl) 0,30 0,09 0,40 0,10 Calcio (mg/dl) 9,94 0,48 10,90 9,30 Fósforo (mg/dl) 4,21 0,57 5,10 3,20 Colesterol (mg/dl) 229,15 59,44 380,00 136,00 Sodio (mEq/l) 143,45 7,88 156,00 133,00 Potasio (mEq/l) 4,46 0,59 6,00 3,50 PT (g/dl) 6,89 0,64 7,50 6,00 Albúmina (g/dl) 3,14 0,27 3,50 2,50 Cociente A/G 0,88 0,21 1,25 0,50 TABLA 10: valores de la bioquímica sanguínea del grupo control. Concentraciones de urea, creatinina, fosfatasa alcalina (FA), alanín aminotransferasa (ALT), bilirrubina total (BT), calcio, fósforo, colesterol, sodio, potasio, proteínas totales (PT), albúmina y cociente albúmina-globulina (A/G). IV.3.3.- Urianálisis IV.3.3.1.- Examen físico - 122 - IV. Resultados y discusión: control Los resultados del análisis del color, olor y aspecto de la orina del grupo control coincidieron con los descritos como fisiológicos para la especie canina(251, 296, 297) . IV.3.3.2.- Densidad El valor medio de la densidad urinaria (TABLA 11), así como los valores individuales obtenidos en el grupo de animales sanos se encontraron dentro del rango establecido como normal para el perro(251). Sólo el perro N°4 mostró una densidad de la orina levemente inferior (1013). Este resultado carece de significación clínica, en ausencia de otras alteraciones analíticas, debido a la capacidad que tienen los riñones para mantener la homeostasis del organismo a partir de variaciones en su función glomerular y tubular(297). Densidad Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. 1033 11 1055 1013 TABLA 11: valores de la densidad de la orina del grupo control. IV.3.3.3.- Sedimento urinario El sedimento de los perros del grupo control (TABLA 12) no mostró alteraciones en ninguno de los elementos a cuantificar, con respecto a lo descrito por distintos autores para la especie canina(72, (10) sangre y células escamosas (72) 251, 296) . A pesar de la contaminación con descrita en la obtención de orina por sondaje uretral, - 123 - IV. Resultados y discusión: control en nuestro estudio no se observaron valores altos en el recuento de ambos tipos celulares. Perro Céls. escam. Céls. transic. Céls. tubul. Glób. rojos Glób. blancos Cilindros Cristales Bacterias 1 1/3c — — 2/c 3/c — — — 2 — — — — — — 1 amorfo/3c — 3 1/2c — — 3/c — — — — 4 — 1/4c — 2/c 1/c — — — 5 1/2c — — 3/c — — — — 6 — 1/3c — — — — — — 7 1/3c — — 1/c — — — — 8 1/5c — — — — — — — 9 1/3c — — 1/5c — — — — 10 1/4c — — 2/c — — — — 11 — — — 1/2c — — 1 amorfo/3c — 12 — 1/5c — — — — 1 amorfo/4c — 13 1/3c — — 4/c 1/c — — — 14 — 1/2c — — — — 1 amorfo/2c — 15 1/3c — — — 1/3c — 1 amorfo/4c — 16 1/4c — — — — — — — 17 1/5c — — 2/c — — — — 18 1/2c — — 2/c — — 1 amorfo/2c — 19 2/c — — 4/c — — — — 20 1/4c — — 1/c — — 1 amorfo/4c — TABLA 12: sedimento urinario del grupo control (40x). Recuento por campo (/c) de células escamosas, células de transición, células tubulares, glóbulos rojos, glóbulos blancos, cilindros, cristales y bacterias. - 124 - IV. Resultados y discusión: control IV.3.3.4.- Examen químico IV.3.3.4.1.- Proteínas IV.3.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de proteínas El cociente proteína/creatinina (U P/C) en una muestra recogida al azar se correlaciona bien con la excreción de proteína urinaria medida en 24 horas, con la presencia de proteinuria o sin ella(2, 10, 17, 67, 168, 408). Cuando la función renal es estable, los mecanismos de filtración glomerular y concentración tubular afectan de igual forma a la proteína y a la creatinina(67, 250) ; por tanto, la determinación del cociente U P/C elimina la variación del volumen de orina(15). En el grupo control, los valores medios obtenidos del U P/C y de la concentración de proteína en orina (TABLA 13), así como sus valores individuales, se encontraron comprendidos dentro del rango establecido como fisiológico en la especie canina(195, 220, 250). Sólo un perro mostró un U P/C alto (1,33). En este animal, el resto de las pruebas realizadas (analítica sanguínea, urinaria y Western blotting de orina) no demostraron la presencia de alteraciones que pudieran confirmar la existencia de una proteinuria significativa. Así, no se observó anemia (hematocrito = 53%) o hiperbilirrubinemia (bilirrubina total = 0,20 mg/dl) que pudieran indicar hemólisis y, por tanto, hemoglobinuria; tampoco hipoalbuminemia (albúmina = 3,40 g/dl); hiperproteinemia (proteínas totales = 7,00 g/dl) ni azotemia (urea = 39,00 mg/dl, creatinina = 1,20 mg/dl). En el urianálisis la orina presentó un color normal con lo que se descartó la posibilidad de mioglobinuria, el sedimento no fue significativo y no hubo resultado positivo en el test de sangre oculta. Por último, el resultado del Western blotting en este perro no mostró diferencias con respecto al resto de animales del grupo (FIGURAS 10 y 11, calle 6). Se ha descrito la existencia de una - 125 - IV. Resultados y discusión: control proteinuria, consecuencia de fiebre, convulsiones, estrés, temperaturas extremas o ejercicio físico, que suele ser transitoria y rara vez de importancia clínica(18, 195). Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. U P/C 0,51 0,26 1,33 0,21 Proteínas 53,18 25,01 110,89 18,92 TABLA 13: valores del cociente proteína/creatinina (U P/C) y la concentración de proteínas (mg/dl) en orina del grupo control. IV.3.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting Los pesos moleculares de las bandas observadas en las electroforesis del grupo control y de las patologías estudiadas se distribuyeron en intervalos de 10 kDa en cada orina puesto que, con el sistema SDS-PAGE, el cálculo del peso molecular de una proteína se puede realizar con una exactitud variable entre el 5 y el 10%(148). En la electroforesis de las orinas de perros del grupo control, constituido por 10 machos y 10 hembras, se identificaron hasta 5 bandas diferentes (FIGURAS 8 y 9). - 126 - IV. Resultados y discusión: control FIGURA 8: lectura densitométrica de la electroforesis de orina de un perro control (5 bandas). FIGURA 9: bandas observadas en la electroforesis del grupo control. Pm = marcador de pesos moleculares. Calles 1-9 = orinas del grupo control. - 127 - IV. Resultados y discusión: control Prácticamente en todas las muestras analizadas (TABLA 14) se identificaron las dos bandas de mayor peso molecular (105,00 ± 3,66 kDa y 73,09 ± 2,91 kDa, respectivamente) (TABLA 15); tan sólo hubo un animal (perro Nº3), sin características clínicas diferentes respecto al resto de perros de este grupo, en el que no se identificó la banda de peso molecular localizada en el intervalo de 70-80 kDa. Intervalo Pm (kDa) 100-110 70-80 30-40 20-30 10-20 100% 95% 30% 25% 50% Control TABLA 14: frecuencias de presentación de las bandas observadas en la electroforesis del grupo control. Intervalo Pm (kDa) N° perros N = 20 Media ± SD Pm (kDa) Media ± SD Prot. (µ µg) Media ± SD Área (%) 100-110 20 105,00 ± 3,66 1,73 ± 1,22 34,67 ± 24,47 90-100 0 — — — 80-90 0 — — — 70-80 19 73,09 ± 2,91 1,68 ± 1,02 33,56 ± 20,45 60-70 0 — — — 50-60 0 — — — 40-50 0 — — — 30-40 6 35,24 ± 2,61 0,62 ± 0,31 12,48 ± 6,12 20-30 5 28,26 ± 2,77 1,12 ± 0,79 22,46 ± 15,83 10-20 10 13,69 ± 1,12 2,41 ± 0,86 48,17 ± 17,24 - 128 - IV. Resultados y discusión: control TABLA 15: media ± desviación estándar (SD) del peso molecular (Pm), cantidad de proteína (Prot.) y área de las bandas que aparecen en la orina del grupo control. La primera banda, de peso molecular = 105,00 kDa, mostró un área media del 34,67% (TABLA 15) que representa, de los 5 µg que se depositaron en cada pocillo, 1,73 µg de proteína, aunque esta cuantificación es relativa. La tinción utilizada para evidenciar las distintas bandas (Coomassie Brilliant Blue) presenta diferente especificidad para cada proteína, por lo que su determinación cuantitativa en función del grado de tinción requeriría una curva patrón para cada proteína(181). Mientras que Müller-Peddinghaus y Trautwein(276), en la orina de perros Beagles clínicamente sanos, sólo observaron la presencia de albúmina y proteínas de peso molecular inferior a ella, Schultze y Jensen(348), en un estudio llevado a cabo en perros también clínicamente sanos y no proteinúricos, detectaron mediante electroforesis en SDS-PAGE tres bandas bien diferenciadas, de pesos moleculares situados entre 100 kDa y 65 kDa. La primera de estas bandas, identificada por los mencionados autores como transferrina, se localiza en un rango de pesos moleculares en el que estaría incluida la observada en el grupo control, de 105,00 ± 3,66 kDa. Coincidimos con estos autores en el límite en cuanto a peso molecular se refiere, utilizando la técnica de electroforesis SDS-PAGE, de las proteínas detectables en la orina de perros sanos, localizado aproximadamente en los 100 kDa (TABLA 15). La segunda banda detectada (73,09 ± 2,91 kDa) se puede asociar con la albúmina, cuyo peso molecular se ha descrito en torno a los 69 kDa(166). La diferencia observada en el peso molecular de esta proteína respecto al descrito por estos autores vendría dada por el sistema de electroforesis utilizado que, como se ha comentado anteriormente, permite calcular el peso molecular de una proteína con una exactitud - 129 - IV. Resultados y discusión: control variable entre el 5 y el 10%(148). En nuestro estudio esta banda representó el 33,56 ± 20,45% del área total de las bandas observadas en el grupo control (TABLA 15). Se ha descrito que la albúmina puede constituir entre el 40% y el 60% de las proteínas urinarias normales(195), porcentaje al que se aproxima el observado en nuestro estudio. La siguiente banda, cuya frecuencia de presentación fue considerablemente inferior a la encontrada en las dos bandas anteriores (TABLA 14), se observó en el intervalo situado entre 10 kDa y 20 kDa (13,69 ± 1,12 kDa) y presentó una cantidad de proteína de 2,41 ± 0,86 µg (TABLA 15). Esta banda fue la de mayor área (48,17 ± 17,24) de cuantas aparecieron en el grupo control (TABLA 15) y, por tanto, la excretada en mayor cantidad. Puede ser identificada como una β2-microglobulina, localizada en la región de los 12 kDa, y con la lisozima, localizada en la región de los 14,40 kDa. Tanto una como otra han sido descritas en la orina de perros sanos por distintos autores(15, 366). Las dos bandas restantes, de bajo peso molecular, se han observado con menor frecuencia, y fueron las encontradas en los intervalos de 30-40 kDa (6 perros) y 20-30 kDa (5 perros), respectivamente (TABLA 15). En el primer caso, el valor medio encontrado para su peso molecular y su contenido en proteína fue de 35,24 ± 2,61 kDa y 0,62 ± 0,31 µg, respectivamente (TABLA 15). Esta banda fue la de menor área en el grupo de perros sanos (TABLA 15) y parece corresponderse con un fragmento de albúmina, de peso molecular situado en torno a 30-45 kDa, y que describieron Wiggins et al.(412) en 1985. Este fragmento se produciría a consecuencia de no utilizar inhibidores de proteasas en el método pues, aunque en todo el proceso las muestras se mantuvieron en refrigeración, no podemos descartar que se produjera una proteolisis de - 130 - IV. Resultados y discusión: control la albúmina. En la banda localizada dentro del intervalo comprendido entre 20 kDa y 30 kDa se obtuvo un peso molecular de 28,26 ± 2,77 kDa (TABLA 15), que coincide con el descrito para la α1-microglobulina (27 kDa)(250). Esta proteína ha sido utilizada, junto con la β2-microglobulina (mencionada con anterioridad), para detectar un daño renal de tipo tubular, en el caso de que aparezcan en cantidades elevadas en la orina. La última, a diferencia de la α1-microglobulina(28), presenta desventajas debido a su inestabilidad cuando el pH urinario es ácido (pH < 6) y al hecho de que varíe su concentración plasmática independientemente de la función glomerular(183). Por último, es necesario destacar que el grupo control estudiado no presentó bandas de proteínas en los intervalos de peso molecular por encima de 110 kDa y en los comprendidos entre 80-100 kDa y 40-70 kDa (TABLA 15). El grupo control (perros sanos) presentó, por lo tanto, un patrón electroforético de la orina que demuestra la existencia de una escasa presencia de proteínas, tal y como indica en este grupo el cociente proteína/creatinina urinario = 0,51 ± 0,26 y la concentración media total de proteína excretada por estos animales (53,18 ± 25,01 mg/dl) (TABLA 13). Concentraciones en torno a los 100 mg/dl o inferiores, en una orina con densidad normal, no son significativas(220). La electroforesis se caracteriza principalmente por la existencia de dos bandas tenues (área relativa de 34,67% y 33,56%) presentes en prácticamente todos los animales, con pesos moleculares en torno a los 105 kDa y 73,09 kDa. Una tercera banda de mayor intensidad (área relativa de 48,17%) aparece en el 50% de los animales. En algunos perros, aparecen además dos bandas de bajo peso molecular (20-40 kDa), con menor cantidad de proteína que las tres descritas como más frecuentes (TABLA 15). Se debe tener presente que las condiciones empleadas en el método, desnaturalizantes y sin el - 131 - IV. Resultados y discusión: control uso de inhibidores de proteasas, pueden favorecer la aparición en la electroforesis de proteínas de bajo peso molecular o fragmentos de otras proteínas que, en su estado nativo y en el organismo, poseen un peso molecular mayor. En la realización del Western blotting utilizando como anticuerpo primario anti-IgG, no se observó esta inmunoglobulina en la orina de perros sanos. Sólo aparece una única banda (FIGURA 10) en todos los animales que formaron el grupo control, situada en el rango de peso molecular comprendido entre 67 kDa y 94 kDa y asociada a la banda que en la electroforesis se relacionó con la albúmina. Su localización no coincide con la descrita para las cadenas pesadas (45 kDa) y ligeras (25 kDa) de IgG(299). Además, en la autorradiografìa se observaron dos señales en el marcador de pesos moleculares, en la región de las bandas correspondientes a la albúmina (67 kDa) y a la anhidrasa carbónica (30 kDa), que pueden asociarse también a uniones inespecíficas del anticuerpo (FIGURA 10). FIGURA 10: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo control al utilizar anti-IgG. Pm = marcador de pesos moleculares. Calles 1-9 = nueve orinas de perros sanos. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el intervalo de 70-80 kDa (calles 1-9) y en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa). No se observan cadenas pesadas o ligeras de IgG. - 132 - IV. Resultados y discusión: control La banda obtenida en la orina se corresponde con la descrita previamente en la electroforesis (73,09 ± 2,91 kDa), y que se atribuye a la albúmina (FIGURA 9). El uso de anticuerpos policlonales en nuestro estudio puede favorecer que dichas moléculas identifiquen al azar proteínas distintas a su antígeno específico. Una banda semejante se detecta cuando el anticuerpo primario utilizado es anti-IgA (FIGURA 11). Del mismo modo se observan dos señales en el marcador de pesos moleculares asociadas a la albúmina (67 kDa) y a la anhidrasa carbónica (30 kDa) (FIGURA 11). En este caso tampoco la banda observada en la orina se corresponde con las cadenas ligeras y pesadas de esta inmunoglobulina, aunque se ha descrito que la IgA se puede encontrar, en pequeñas cantidades, en la orina de perros sanos producida por tejidos linfoides de las paredes del tracto urinario(383). Esta banda se observó en los 20 animales que formaron el grupo control. También, en este caso, la existencia de esta banda se puede atribuir al uso de anticuerpos policlonales. FIGURA 11: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo control al utilizar anti-IgA. Pm = marcador de pesos moleculares. Calles 1-9 = nueve orinas de perros sanos. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el intervalo de 70-80 kDa (calles 1-9) y en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa). No se observan cadenas pesadas o ligeras de IgA. - 133 - IV. Resultados y discusión: control IV.3.3.4.2.- Otras determinaciones Las determinaciones de glucosa, bilirrubina, cetonas, sangre oculta, pH, urobilinógeno, nitritos y proteínas en la orina de los animales del grupo control, analizadas mediante tira reactiva (TABLA 16), coincidieron con lo descrito como normal en la especie canina, en muestras obtenidas por cateterización uretral(10, 72). Perro 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Glucosa - Bilirrubina + + + + + + + + - Cetonas - Sangre Indicios Indicios Indicios Indicios + Indicios + - pH 7 7 6 7 7,5 7,5 7,5 7,5 7 6 7 6,5 7,5 7 7,5 7 6,5 7,5 7,5 6,5 Urobilinógeno Nitritos Proteínas Normal + Normal Indicios Normal Indicios Normal Normal Indicios Normal Indicios Normal Normal Indicios Normal + Normal Indicios Normal + Normal Indicios Normal + Normal Indicios Normal Indicios Normal + Normal + Normal + Normal + Normal Indicios TABLA 16: datos analíticos de la orina del grupo control. - 134 - IV. Resultados y discusión: control IV.3.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo Los valores medios de las distintas excreciones fraccionales en el grupo control (TABLA 17) coincidieron con los descritos por distintos autores como normales en el perro(198). En cuanto a los valores individuales, cabe mencionar los casos de los perros N°5 y N°17 que presentaron una excreción fraccional de sodio (EF Na) de 1,53 y una excreción fraccional de potasio (EF K) de 37, respectivamente. En ambos animales no se detectaron alteraciones en otros parámetros analíticos que pudieran explicar el origen de estos valores. Se ha descrito que las excreciones fraccionales de los distintos electrolitos se encuentran muy influidas por la dieta del animal(135). Teniendo en cuenta que esta variable no se tuvo en cuenta a la hora de realizar la recogida de muestras, no se puede descartar como causa de estos valores altos. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. EF Na 0,58 0,28 1,53 0,20 EF K 17,17 7,09 37,00 5,92 EF P 20,13 12,67 39,00 4,00 TABLA 17: valores de la excreción fraccional de sodio (EF Na), potasio (EF K) y fósforo (EF P) del grupo control. - 135 - IV. Resultados y discusión: piometra IV.4.- PIOMETRA IV.4.1.- Anamnesis y exploración física La sintomatología que presentan los animales con piometra está perfectamente descrita por numerosos autores(16, 129, 186, 285) . En nuestro estudio, los síntomas más frecuentes fueron anorexia, depresión, poliuria y polidipsia, con un 87% de presentación cada uno. Otros síntomas menos comunes fueron pérdida de peso (47%), vómitos (33%), diarrea (20%) y coluria (7%) (TABLA 18). Esta sintomatología coincide con lo aportado por diversos autores para esta enfermedad, cuya gravedad depende, fundamentalmente, de la permeabilidad del cuello uterino(186, 285). En nuestro estudio, el 67% de las piometras fueron de cuello abierto (TABLA 19). Perro Anorexia Depresión Pérdida peso Vómitos Diarrea Poliuria Polidipsia Polaquiuria Coluria 21 Sí Sí Sí No No No No No No 22 Sí Sí Sí Sí No Sí Sí No No 23 Sí Sí No No No No No No No 24 No No No No No Sí Sí No No 25 Sí Sí Sí No Sí Sí Sí No No 26 Sí Sí No No Sí Sí Sí No No 27 Sí Sí Sí Sí No Sí Sí No No 28 Sí Sí Sí No No Sí Sí No No 29 Sí Sí Sí No No Sí Sí No No 30 No No No No No Sí Sí No No 31 Sí Sí No Sí No Sí Sí No Sí 32 Sí Sí No No No Sí Sí No No 33 Sí Sí No No No Sí Sí No No 34 Sí Sí No Sí No Sí Sí No No - 136 - IV. Resultados y discusión: piometra 35 Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí No No TABLA 18: anamnesis y sintomatología correspondiente al grupo de perras con piometra. En la exploración física (TABLA 19), el signo clínico encontrado más frecuentemente fue la descarga vaginal (67%), sanguinolenta y/o purulenta, porcentaje que coincide con lo observado por Barrera et al.(16) en 1992. El aumento de la temperatura rectal, hallado en un 53% de los casos, parece estar asociado con la inflamación uterina y la infección bacteriana secundaria, así como con la bacteriemia y septicemia que pueda desarrollarse(129). Otros signos encontrados fueron deshidratación (33%), abdomen abultado (27%) por agrandamiento del útero, mucosas pálidas (20%) y aumento del tamaño ganglionar (20%). Por el contrario, y como es lógico, no se observaron signos clínicos propios de otras enfermedades estudiadas en la presente Tesis Doctoral, y que no están relacionados directamente con cuadros de piometra, tales como ascitis o edemas, dolor a la palpación renal, lesiones cutáneas, onicogriposis, tonsilitis ni cojeras. Cabe mencionar el hallazgo, en el 20% de los casos, de nódulos mamarios. Aunque los tumores mamarios no se relacionan con ciclos estrales anormales(224), la mayoría se desarrollan entre los 8 y 10 años(45), edad que coincide con la de mayor frecuencia de presentación de piometra(129) y con la de este 20% de animales. - 137 - Perro Ta rectal Deshidrat. Mucosas Ascitis Edema Dolor renal Exudado vaginal Abdomen Lesiones Aumento Onicogriposis Tonsilitis Cojera abultado cutáneas ganglios Otros 21 39,5° 5% Pálidas No No No No No No Retrofar. No No 22 39,5° 5% Normales No No Sanguinolento No No No Retrofar. No No 23 38,0° No Normales No No Purulento Sí No No No No No 24 38,6° No Normales No No Sanguino-purul. No No No No No No 25 39,2° 5% Congestivas No No Purulento No No No No No No Coprostasis 26 39,9° No Pálidas No No Sanguinolento No No No No No No Nódulo mamario 27 38,6° No Congestivas No No No No No No No No No Nódulo subcutáneo 28 39,2° No Congestivas No No Sanguinolento No No No No No No 29 37,8° 5% Normales No No Sí No No No No No 30 39,4° No Normales No No Purulento No No No No No No 31 39,8° No Normales No No No Sí No No No No No Abdomen agudo 32 38,5° No Normales No No Sanguino-purul. No No No Poplíteos No No Nódulo mamario 33 37,9° No Pálidas No No No Sí No No No No No Nódulo mamario 34 39,9° No Normales No No Purulento No No No No No No 35 38,6° 7% Normal No No Sanguinolento No No No No No no No TABLA 19: exploración física correspondiente al grupo de perras con piometra. Enf. periodontal Coprostasis IV. Resultados y discusión: piometra IV.4.2.- Análisis de sangre IV.4.2.1.- Hematología Los valores medios de la serie roja (TABLA 20), a excepción de los índices de Wintrobe, son inferiores y presentaron diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo control (TABLA 21). El tipo de anemia que observamos en nuestro estudio, en el 67% de los animales, está descrita en la piometra y se caracteriza por ser normocítica, normocrómica y no regenerativa como consecuencia del carácter crónico de esta enfermedad inflamatoria(129). Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. RGR (x106/µ µl) 5,41 1,11 7,96 3,93 HGB (g/dl) 12,59 2,61 18,00 8,30 HCT (%) 37 6 48 28 VCM (fl) 68,82 4,20 76,60 60,70 HCM (pg) 23,33 1,94 26,70 19,10 CHCM (g/dl) 33,93 2,47 37,30 28,90 TABLA 20: valores de la serie roja del grupo con piometra. Recuento de glóbulos rojos (RGR); concentración de hemoglobina (HGB); valor hematocrito (HCT); volumen corpuscular medio (VCM); hemoglobina corpuscular media (HCM); concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM). - 139 - IV. Resultados y discusión: piometra Parámetro CONTROL PIOMETRA RGR (x106/µ µl) 7,28 ± 1,13 5,41 ± 1,11 HGB (g/dl) 16,83 ± 2,00 12,59 ± 2,61 HCT (%) 52 ± 8 37 ± 6 TABLA 21: media ± desviación estándar de los parámetros de la serie roja del grupo con piometra que presentaron diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo control (p < 0,01). No se han obtenido diferencias significativas con respecto al grupo control para el recuento plaquetario, cuya modificación no está descrita en esta enfermedad(266). Los valores obtenidos se muestran en la TABLA 22. Media Desv. estándar PLT (x103/µ µl) 228,07 139,18 Valor máx. Valor mín. 497,00 89,00 TABLA 22: valores del recuento de plaquetas (PLT) del grupo con piometra. El hallazgo más significativo de la hematología de estas perras lo constituye la leucocitosis(125, 394), caracterizada por neutrofilia absoluta con desviación a la izquierda indicativa de una infección grave con septicemia(68, 151, 186). El valor medio obtenido en el presente trabajo para el recuento leucocitario ha sido de 28.170 ± 20.710 leucocitos/µl (TABLA 23), observándose una diferencia estadísticamente significativa si se compara con el grupo control (TABLA 24), a pesar de la gran variabilidad observada en los recuentos, que oscila entre 6.400 y 82.200 leucocitos/µl (TABLA 23). No obstante, más de la mitad de las perras estudiadas (9 animales de 15 en total) presentaron un recuento leucocitario superior al normal. Las observaciones descritas - 140 - IV. Resultados y discusión: piometra para el recuento leucocitario se deben, como es lógico, a una neutrofilia con desviación a la izquierda, con una media de 19.107 ± 14.067 neutrófilos segmentados/µl y un recuento de 5.415 ± 8.444 neutrófilos bastonados/µl (TABLA 23), hecho que ya describieron De Schepper et al.(94). En ambos casos se observaron diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo control, al igual que para el recuento de monocitos (TABLA 24), con un valor de 1.023 ± 799 monocitos/µl en el grupo de piometras. Aunque no se ha descrito la monocitosis como característica de la hematología de las piometras caninas, su presentación, no obstante, es lógica, pues acompaña a procesos en los que aumentan las necesidades de macrófagos y en los que hay acúmulo de material purulento(229). Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. RGB (x103/µ µl) 28,17 20,71 82,20 6,40 N. bastonados/µ µl 5415 8444 33702 0 N. segmentados/µ µl 19107 14067 45210 2926 Basófilos/µ µl 0 0 0 0 Eosinófilos/µ µl 410 478 1338 0 Linfocitos/µ µl 2210 1542 4715 372 Monocitos/µ µl 1023 799 2466 0 TABLA 23: valores de la serie blanca del grupo con piometra. Recuento total (RGB) y diferencial de glóbulos blancos. - 141 - IV. Resultados y discusión: piometra Parámetro CONTROL PIOMETRA Significación RGB (x103/µ µl) 9,17 ± 3,16 28,17 ± 20,71 p < 0,001 N. bastonados/µ µl 364 ± 426 5415 ± 8444 p < 0,01 N. segmentados/µ µl 6198 ± 2611 19107 ± 14067 p < 0,001 421 ± 257 1023 ± 799 p < 0,05 Monocitos/µ µl TABLA 24: media ± desviación estándar de los parámetros de la serie blanca del grupo con piometra que presentaron diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo control. IV.4.2.2.- Bioquímica sanguínea En la piometra canina, los cambios en los parámetros bioquímicos sanguíneos más frecuentemente descritos son hiperproteinemia e hiperglobulinemia(128, 205), como consecuencia de la deshidratación y/o de la estimulación crónica antigénica del sistema inmune. Tal apreciación coincide con lo observado en el grupo de perras estudiado (TABLA 25). Así, en la TABLA 26 se observa la existencia de diferencia significativa en el cociente A/G. La disminución en los valores de este cociente y de albúmina, respecto a los obtenidos en el grupo control (TABLA 26), indica claramente un aumento de la concentración de globulinas. También se aprecia un aumento en la concentración de proteínas totales, aunque sin diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo control, posiblemente porque el estado de hidratación de las perras con piometra era bastante bueno, tan sólo 4 de ellas presentaron una deshidratación del 5% y en un caso la deshidratación fue del 7% (TABLA 19). La diferencia estadística observada para la concentración de albúmina (TABLA 26) es más difícil de explicar, aunque la hipoalbuminemia ha sido descrita en esta enfermedad(36). No obstante, y como se discutirá en el apartado correspondiente a la electroforesis de orina, la proteinuria es un signo clínico común en la piometra y entre las proteínas que - 142 - IV. Resultados y discusión: piometra se excretan, la albúmina es la primera que empieza a perderse vía renal, lo que explicaría el hallazgo de esta hipoalbuminemia. Además, se trata de animales que llevan enfermos un período de tiempo considerablemente largo, antes de que los dueños se decidan a acudir a la consulta del veterinario. Durante este período de tiempo, suelen presentar anorexia más o menos acentuada, lo que puede disminuir la síntesis hepática de albúmina y contrarrestar, en cierto grado, la hiperproteinemia consecuente con la deshidratación y a la hiperglobulinemia. De ahí la importancia de determinar el cociente A/G. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. Urea (mg/dl) 52,20 57,86 252,00 17,00 Creatinina (mg/dl) 1,30 0,36 2,30 0,90 FA (UI/l) 81,47 137,80 440,00 8,00 ALT (UI/l) 40,00 55,92 234,00 10,00 BT (mg/dl) 0,37 0,21 1,00 0,10 Calcio (mg/dl) 8,97 0,55 9,70 7,90 Calcio corregido (mg/dl) 9,91 0,40 10,30 9,00 Fósforo (mg/dl) 5,05 1,41 8,70 3,10 Colesterol (mg/dl) 303,20 93,91 448,00 94,00 Sodio (mEq/l) 143,80 20,39 196,00 97,00 Potasio (mEq/l) 4,09 1,11 7,30 2,50 PT (g/dl) 8,23 1,13 11,00 6,80 Albúmina (g/dl) 2,53 0,48 3,30 1,80 Cociente A/G 0,47 0,17 0,76 0,23 TABLA 25: valores de la bioquímica sanguínea del grupo con piometra. Concentraciones de urea, creatinina, fosfatasa alcalina (FA), alanín aminotransferasa (ALT), bilirrubina total (BT), calcio, fósforo, colesterol, sodio, potasio, proteínas totales (PT), albúmina y cociente albúmina-globulina (A/G). - 143 - IV. Resultados y discusión: piometra Parámetro CONTROL PIOMETRA Albúmina (g/dl) 3,14 ± 0,27 2,53 ± 0,48 Cociente A/G 0,88 ± 0,21 0,47 ± 0,17 TABLA 26: media ± desviación estándar de los parámetros de la bioquímica sanguínea del grupo con piometra que presentaron diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo control (p < 0,001). El resto de parámetros bioquímicos no presentan una alteración evidente en su determinación (TABLA 25). No obstante, y aunque estadísticamente no existan diferencias, se debe reseñar el aumento, aunque discreto, en la concentración de urea sanguínea (52,20 ± 57,86 mg/dl), creatinina (1,30 ± 0,36 mg/dl) y fosfatasa alcalina (81,47 ± 137,80 UI/l), descrito por diversos autores(59, 205) . El incremento de urea y creatinina se atribuye a la presencia de deshidratación, ya mencionada anteriormente, y al fallo renal que, en ocasiones, acompaña a la piometra(92). En este sentido, cabe destacar los valores encontrados en la perra N°29 que presentó 252 mg/dl de urea y 2,3 mg/dl de creatinina. El aumento de fosfatasa alcalina en la piometra es indicativo de daño hepatocelular por la septicemia y/o disminución de la circulación hepática y por hipoxia celular en caso de que exista deshidratación(128). La perra N°29 también mostró signos de colestasis como lo demuestran los valores aumentados de bilirrubina total (1 mg/dl) y fosfatasa alcalina (440 UI/l) que presentó este animal. Aunque el valor medio de colesterol tampoco presentó diferencia estadística con el del grupo control, en un 53% de las perras observamos hipercolesterolemia asociada, en todos los casos, a hipoalbuminemia, parámetro cuya discusión se realizó anteriormente. Se ha descrito, en casos de niveles disminuidos de albúmina sérica, un aumento en la síntesis hepática de colesterol, cuya finalidad parece ser el mantenimiento de la presión oncótica de la sangre(6, 366). Por último, se ha descrito un descenso en los valores de ALT debido a la - 144 - IV. Resultados y discusión: piometra inhibición, con bajos niveles de endotoxinas de E. coli, de la enzima implicada en su síntesis(93, 397), no observado en nuestro estudio. Sí se debe mencionar que en la perra N°30 se observó un valor de ALT de 234 UI/l atribuible, según De Schepper et al.(93), a necrosis hepática por niveles altos de dichas endotoxinas. IV.4.3.- Urianálisis IV.4.3.1.- Examen físico Las orinas N°24 y 26 fueron prácticamente transparentes (TABLA 27), lo que se atribuye a la existencia, como comentaremos posteriormente, de isostenuria en el primer caso (1015) e hipostenuria en el segundo (1006). Las perras N°21, 22 y 31 mostraron una orina con color oscuro, aspecto turbio y olor fuerte (TABLA 27). En el primer animal se relaciona con una densidad alta (1045) y un elevado número de eritrocitos en la orina (TABLA 30), mientras que en el segundo y tercer caso, aunque su densidad no fue tan elevada, sí encontramos elementos celulares en el N°22 (TABLA 30) y un número elevado de cristales en el N°31 (TABLA 30). De igual modo, las orinas N°25, 27, 28 y 29 presentaron aspecto turbio (TABLA 27) atribuible a su contenido en elementos celulares, eritrocitos y cristales(297). Perro Color Aspecto Olor 21 Oscuro Turbio Fuerte 22 Oscuro Turbio Fuerte 23 Amarillo Claro Normal 24 Incolora Claro Normal - 145 - IV. Resultados y discusión: piometra 25 Amarillo Turbio Fuerte 26 Incolora Claro Normal 27 Amarillo Turbio Normal 28 Amarillo Muy turbio Normal 29 Amarillo Turbio Fuerte 30 Amarillo Claro Normal 31 Oscuro Turbio Fuerte 32 Amarillo Claro Normal 33 Amarillo Claro Normal 34 Amarillo Claro Normal 35 Amarillo Claro Normal TABLA 27: examen físico de la orina del grupo con piometra. IV.4.3.2.- Densidad En los datos obtenidos en nuestro estudio (TABLA 28) el 33% de las perras mostraron isostenuria y el 7% hipostenuria. Tres de los 5 animales que presentaron isostenuria (N°25, 28 y 29) manifestaron signos de fallo renal primario. Además, también diagnosticamos fallo renal en la N°32 que presentó valores de urea y creatinina sanguíneas aumentados y una densidad urinaria de 1020. El valor medio de la densidad fue el único que, en el urianálisis, presentó diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo control (TABLA 29). Se caracteriza por ser muy inferior (1019 ± 10) al de dicho grupo (1033 ± 11) y por estar próximo a la isostenuria. En la piometra está descrita la aparición de isostenuria (densidad entre 1007 y 1015) o hipostenuria (densidad < 1007)(72) por daño tubular y, - 146 - IV. Resultados y discusión: piometra por tanto, insensibilidad a la hormona antidiurética y, en casos de toxemia, por interferencia en la reabsorción de sodio y cloro(128). Densidad Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. 1019 10 1045 1006 TABLA 28: valores de la densidad urinaria del grupo con piometra. Densidad CONTROL PIOMETRA 1033 ± 11 1019 ± 10 TABLA 29: media ± desviación estándar de la densidad de la orina de los grupos control y con piometra (p < 0,001). IV.4.3.3.- Sedimento urinario En el sedimento urinario del grupo con piometra se encontraron, en el 87% de los casos, células escamosas en número variable (TABLA 30). Su origen se atribuye a contaminación procedente de uretra o vagina(72). Se debe tener en cuenta que la extracción de la orina se realizó, en todos los casos, por sondaje vesical. El reducido número de células de transición, tubulares, glóbulos blancos y cristales (TABLA 30) encontrados en los distintos sedimentos no reviste significación clínica(296). En las perras N°22, 26, 29 y 32 se observó un número elevado de eritrocitos (TABLA 30). En las dos primeras parece deberse a contaminación, pues estos animales presentaron descarga vaginal sanguinolenta. En los dos restantes se puede atribuir a fallo renal pues - 147 - IV. Resultados y discusión: piometra el N°29 mostró valores de urea (252 mg/dl) y de creatinina (2,3 mg/dl) altos y en la N°32, aunque la concentración de urea no fue tan importante (39 mg/dl) la creatinina mostró un valor de 1,6 mg/dl. No se observaron, en ningún caso, cilindros o bacterias (TABLA 30), aunque está descrita la aparición de bacteriuria en casos de infección del tracto urinario concomitante(205, 370) . No obstante, el sedimento siempre se realizó en fresco y no se llevaron a cabo tinciones específicas ni cultivos de orina. Perro Céls. escam.Céls. trans. Céls. tubul. Glób. rojos Glób. blancos Cilindros Cristales Bacterias 21 — — — 7/c — — — — 22 5/c — 2/c 15/c 3/c — — — 23 1/3c — — 1/2c — — — — 24 1/4c — — — — — — — 25 1/4c — — 8/c 5/c — 1 amorfo/2c — 26 — 1/3c — 10/c — — — — 27 1/2c 1/5c — 3/c — — 1 amorfo/6c — 28 3/c — — 6/c — — 1 amorfo/4c — 29 1/5c — 3/c Incontables — — 1 estruvita/8c — 30 1/4c — — 2/c — — 1 amorfo/6c — 31 1/2c — — 5/c — — 2 amorfos/c — 32 1/4c — — 15/c — — — — 33 3/c — — 1/c — — — — 34 2/c — — 3/c — — 2 amorfos/c — 35 1/2c — — — — — 1 amorfo/6c — TABLA 30: sedimento urinario del grupo con piometra (40x). Recuento por campo (/c) de células escamosas, células de transición, células tubulares, glóbulos rojos, glóbulos blancos, cilindros, cristales y bacterias. - 148 - IV. Resultados y discusión: piometra IV.4.3.4.- Examen químico IV.4.3.4.1.- Proteínas IV.4.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de proteínas El valor medio de la concentración de proteína urinaria obtenido en este grupo se encontró en el rango considerado normal para la especie canina, mientras que el observado para el U P/C (TABLA 31) es indicativo de una pérdida moderada de proteínas(366). Aún así, no se observó diferencia estadísticamente significativa de estos parámetros con respecto al grupo control, aunque sus valores individuales fueron muy variables. En la piometra, el depósito de complejos inmunes en el glomérulo puede causar una glomerulopatía reversible y moderada y, consecuentemente, una proteinuria(220) también moderada(90). Se ha descrito su aparición en un tercio de los animales con piometra(205). En el presente estudio 3 animales mostraron valores considerablemente altos de U P/C: 3,29 en la perra N°33, asociado a isostenuria (1012); 2,47 en la N°32, con un valor de creatinina de 1,6 mg/dl; y 2,41 en la perra N°29, asociado a isostenuria (1015) y azotemia grave (252 mg/dl de urea y 2,3 mg/dl de creatinina). De ellas, las dos últimas presentaron fallo renal primario. El U P/C de las otras dos perras con fallo renal fue normal (0,28 en la N°25 y 0,27 en la N°28 y se correspondió con una excreción de proteína baja (9,94 y 22,30 mg/dl, respectivamente). Este hecho puede deberse a que en enfermedades glomerulares, a medida que el proceso avanza, la proteinuria puede llegar a disminuir por una reducción de la tasa de filtración glomerular(67, 325) y provocar la disminución del cociente U P/C(195). - 149 - IV. Resultados y discusión: piometra Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. U P/C 1,03 0,97 3,29 0,14 Proteínas 40,12 34,44 126,04 3,61 TABLA 31: valores del cociente proteína/creatinina (U P/C) y la concentración de proteínas (mg/dl) en orina del grupo con piometra. IV.4.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting La piometra canina es una enfermedad de carácter hormonal que se caracteriza por producir una glomerulopatía por depósito de complejos inmunes(166, 220) , responsable de una alteración renal de gravedad variable según sea la intensidad del proceso. Dicha glomerulopatía es, la mayor parte de las veces, difícil de demostrar, puesto que no siempre los datos analíticos demuestran un daño funcional manifiesto del riñón, y la biopsia renal no es una técnica diagnóstica de rutina. Esto es lo que parece ocurrir en el grupo de animales objeto del presente estudio, en los que excepto en los cuatro diagnosticados de fallo renal (N° 25, 28, 29 y 32), los parámetros bioquímicos renales se manifiestan sólo moderadamente alterados (TABLA 25). Conforme el cuadro avanza, se va desarrollando progresivamente una alteración de tipo tubular(370). Esta alteración renal, a la que se ha hecho referencia, suele ser lo suficientemente intensa como para producir un cambio cualitativo y cuantitativo en la eliminación de proteínas urinarias del perro, indicativo de un proceso fisiopatológico muy complejo y difícil de explicar. La orina de las perras con piometra se caracteriza por presentar, en la electroforesis realizada mediante la técnica de SDS-PAGE, un evidente y significativo - 150 - IV. Resultados y discusión: piometra aumento en el número de bandas (FIGURA 12, calles 2-8) cuando se compara con los perros sanos (FIGURA 12, calle 1). FIGURA 12: bandas observadas en la electroforesis del grupo con piometra. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina de una perra del grupo control, calles 2-8 = orinas de perras del grupo con piometra. Mientras que en el grupo control se han encontrado hasta 5 bandas (FIGURA 8 y TABLA 15), en las perras con esta enfermedad se han identificado hasta 9 bandas diferentes (FIGURA 13 y TABLA 32), con una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,001) en las frecuencias de presentación de las distintas bandas entre ambos grupos. El número de bandas varía de un animal a otro (TABLA 32), dependiendo del daño producido en la capacidad de filtración glomerular en el riñón(250). - 151 - IV. Resultados y discusión: piometra FIGURA 13: lectura densitométrica de la electroforesis de orina de una perra con piometra (9 bandas). Media ± SD Media ± SD Pm (kDa) Prot. (µ µg) Media ± SD Área (%) Intervalo Pm (kDa) N° perros N = 15 120-130 1 130,00 2,12 42,50 110-120 0 — — — *100-110 12 106,92 ± 1,88 0,86 ± 1,14 17,19 ± 22,70 90-100 0 — — — 80-90 10 83,49 ± 2,77 0,39 ± 0,57 7,70 ± 11,45 *70-80 14 70,29 ± 4,75 1,99 ± 1,22 39,84 ± 24,34 60-70 0 — — — 50-60 7 54,16 ± 1,13 0,50 ± 0,16 10,03 ± 3,19 40-50 7 42,62 ± 1,46 0,61 ± 0,35 12,19 ± 7,09 *30-40 11 35,19 ± 1,88 0,59 ± 0,39 11,71 ± 7,76 *20-30 10 27,02 ± 2,02 1,01 ± 0,49 20,13 ± 9,89 - 152 - IV. Resultados y discusión: piometra 10 *10-20 15,23 ± 1,97 0,65 ± 0,48 13,09 ± 9,61 * Bandas observadas también en el grupo control. TABLA 32: media ± desviación estándar (SD) del peso molecular (Pm), cantidad de proteína (Prot.) y área de las bandas que aparecen en la orina del grupo de piometras, con la excepción del intervalo de 120-130 kDa, en el que sólo se observó una banda en una perra. Las 5 bandas descritas en el grupo de perros sanos aparecen también en los animales enfermos (TABLA 32). Como en los primeros, las encontradas con mayor frecuencia fueron las comprendidas en los intervalos de peso molecular de 100-110 kDa y 70-80 kDa (TABLA 33), con valores medios de 106,92 ± 1,88 kDa y 70,29 ± 4,75 kDa respectivamente (TABLA 32), y que parecen corresponderse, como se ha discutido previamente, con la transferrina(348) y la albúmina(166). Pm (kDa) 120-130 100-110 80-90 70-80 50-60 40-50 30-40 20-30 10-20 Control — 100% — 95% — — 30% 25% 50% Piometra 7% 80% 67% 93% 47% 47% 73% 67% 67% TABLA 33: frecuencias de presentación de las bandas observadas en los grupos control y con piometra. La banda localizada en el intervalo de 70-80 kDa de peso molecular mostró un aumento del área, obtenida en su lectura densitométrica, respecto a la observada en el grupo control (TABLA 34 y FIGURA 14), aunque no fue estadísticamente significativa. - 153 - IV. Resultados y discusión: piometra Intervalo Pm (kDa) CONTROL PIOMETRA 70-80 33,56 ± 20,45 39,84 ± 24,34 TABLA 34: media ± desviación estándar del área (%) de la banda observada en el intervalo de 70-80 kDa en los grupos control y con piometra. Sin embargo, y aunque la técnica de electroforesis proporciona información principalmente de carácter cualitativo(249, 279), este incremento del área puede indicar la existencia de un aumento en la cantidad eliminada de esta proteína (1,99 ± 1,22 µg) (TABLA 32) respecto al grupo de animales sanos (1,68 ± 1,02 µg) (TABLA 15), puesto que los valores obtenidos son referidos a una cantidad fija de proteína urinaria (5 µg) (FIGURA 14) y lo único que cambian son las proporciones. FIGURA 14: bandas obtenidas en el intervalo de peso molecular de 70-80 kDa en los grupos control y con piometra. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo control. Calle 2 = orina grupo con piometra. - 154 - IV. Resultados y discusión: piometra El UP/C, como ya se ha indicado, no presentó diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos, lo que demuestra que la proteinuria no fue muy intensa, aunque los resultados obtenidos parecen indicar que la excreción de albúmina está incrementada. En la fase inicial de las enfermedades glomerulares se ha descrito que la albúmina representa la fracción mayor de la pérdida de proteínas(195) y, de hecho, en el presente estudio, la proteína que se corresponde por su peso molecular con la albúmina, presenta la mayor área media (39,84 ± 24,34 %) de cuantas bandas se observaron en la electroforesis (TABLA 32), lo que no sucede en el grupo control (TABLA 15). Es importante recordar que existe una hipoalbuminemia con diferencia estadísticamente significativa respecto a los valores de albúmina sérica (TABLA 26) de los animales sanos. Por lo tanto, es lógico considerar que la hipoalbuminemia se debe en parte a la pérdida urinaria de esta proteína. Como proteínas de bajo peso molecular se detectaron 5 bandas, localizadas en los intervalos de 10-20 kDa, 20-30 kDa, 30-40 kDa (todas ellas presentes también en el grupo control), 40-50 kDa y 50-60 kDa (FIGURA 15). - 155 - IV. Resultados y discusión: piometra FIGURA 15: bandas de bajo peso molecular (10-60 kDa) obtenidas en la electroforesis de la orina de perras con piometra. Calles 1-6 = orinas grupo con piometra. Entre las bandas que se observaron en ambos grupos sólo mostró diferencia estadísticamente significativa, en cuanto a la cantidad de proteína/banda, la localizada en el intervalo de 10-20 kDa (TABLA 35), con una disminución de este valor respecto al grupo control. Las observadas en los intervalos de 20-30 kDa y 30-40 kDa también presentaron esta disminución, aunque no fue significativa. Intervalo Pm (kDa) CONTROL (N = 20) PIOMETRA (N = 15) 10-20 2,41 ± 0,86 (n = 10) 0,65 ± 0,48 (n = 10) TABLA 35: media ± desviación estándar de la cantidad de proteína (µg/banda) de los grupos control y con piometra (p < 0,001). - 156 - IV. Resultados y discusión: piometra La presencia de un mayor número de bandas de bajo peso molecular, y con mayor frecuencia de presentación que en el caso del grupo control (TABLA 33), es una consecuencia de la glomerulonefritis desarrollada en la piometra. No obstante, ello no indica necesariamente que todas estas bandas sean indicativas de la eliminación de proteínas de bajo peso molecular. No se debe olvidar que con la presente técnica se produce la ruptura de puentes disulfuros y, posiblemente, de estructuras proteicas unidas por enlaces no covalentes, lo que puede dar lugar a fragmentos de peso molecular más bajo, aunque en proteínas oligoméricas, la proteína en su estado nativo que es la que realmente se elimina por el riñón, tenga un peso molecular alto. Es lo que ocurre en el caso de las inmunoglobulinas. El uso de β-mercaptoetanol en el método provoca la ruptura de puentes disulfuros y la separación de las inmunoglobulinas en cadenas pesadas y ligeras(303). Sus pesos moleculares se han calculado alrededor de los 45 kDa y 25 kDa respectivamente(299), valores en torno a los que se encuentran los pesos moleculares de las bandas reflejadas en la TABLA 32. La cadenas pesadas de inmunoglobulinas deben estar incluidas, por lo tanto, en las proteínas detectadas en el intervalo de 40-50 kDa de la electroforesis, mientras que las cadenas ligeras lo estarían en el intervalo de 20-30 kDa. Con el fin de comprobar tal hipótesis, se realizó un Western-blotting. Cuando se utilizó como anticuerpo primario anti-IgG se observó, en todas las muestras del grupo, la única banda presente en el Western-blotting del grupo control, y que se relaciona con una unión inespecífica del anticuerpo (FIGURA 16). En este caso, dicha banda se correspondió con la identificada en la electroforesis en el intervalo correspondiente a la albúmina (FIGURA 12). Al igual que en dicho grupo, se observaron dos señales en el marcador de pesos moleculares asociadas a los pesos moleculares de 67 kDa y 30 kDa (FIGURA 16). - 157 - IV. Resultados y discusión: piometra Además, en 4 animales (Nº 22, 28, 29 y 33) de los 15 que formaron este grupo, se observaron 2 bandas en cada perro, localizadas en los intervalos de 40-50 kDa y 20-30 kDa respectivamente (FIGURA 16), y asociadas a los pesos moleculares que se muestran en la TABLA 36. FIGURA 16: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo con piometra al utilizar anti-IgG. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina de perra sana, calles 2 y 3 = orinas de perras con piometra. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el intervalo de 70-80 kDa (calles 1, 2 y 3) y en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa). Se observan cadenas pesada (cp) y ligera (cl) de IgG (calle 3). - 158 - IV. Resultados y discusión: piometra N°22 N°28 N°29 N°33 40-50 kDa 45,25 44,13 41,6 43,40 20-30 kDa 24,55 26,30 27,10 24,86 TABLA 36: pesos moleculares de las bandas evidenciadas por Western blotting utilizando anti-IgG en el grupo con piometra. En este caso se corresponden con la inmunoglobulina G. Esta inmunoglobulina es la que existe en mayor proporción en el plasma y, aunque su peso molecular es alto (180 kDa), puede aparecer en la orina por alteración de la barrera glomerular(383). Entre los animales que presentaron IgG en sus orinas se observaron las alteraciones analíticas más acusadas en el grupo de piometras. Así, se observa azotemia de moderada a grave: valores de urea situados entre 39 mg/dl y 252 mg/dl y de creatinina entre 1,3 mg/dl y 2,3 mg/dl; hiperfosfatemia: fósforo entre 5,8 mg/dl y 8,7 mg/dl; hipercolesterolemia: colesterol entre 320 mg/dl y 437 mg/dl; hiperproteinemia: proteínas totales séricas entre 8 g/dl y 11 g/dl; hipoalbuminemia: albúmina entre 2,1 g/dl y 2,7 g/dl; disminución del cociente albúmina/globulina: entre 0,23 y 0,48; isostenuria: densidad de la orina entre 1012 y 1017; aumento del cociente proteína/creatinina en orina: entre 1,31 y 3,29; aumento de la excreción fraccional de potasio (entre 20% y 148%) y fósforo (entre 42% y 122%). Estos resultados indican que en estos animales el daño renal fue lo suficientemente intenso como para permitir que la IgG atravesara la barrera glomerular y se identificara en la orina (FIGURA 16). Cuando el anticuerpo primario utilizado fue anti-IgA también se observaron en todos los animales las bandas atribuidas a uniones inespecíficas del anticuerpo (FIGURA 17), a las que ya se ha hecho referencia (FIGURA 16). Además, en los - 159 - IV. Resultados y discusión: piometra mismos perros que en el caso de la IgG, con daño renal, se observó una señal adicional en los intervalos de peso molecular de 40-50 kDa y de 20-30 kDa (TABLA 37). N°22 N°28 N°29 N°33 40-50 kDa — 44,13 41,60 — 20-30 kDa 24,55 26,30 — 24,86 TABLA 37: pesos moleculares de las bandas evidenciadas por Western blotting utilizando anti-IgA como anticuerpo primario en el grupo con piometra. En 3 de estos animales sólo se observó una banda (FIGURA 17) que podría corresponderse, al no detectarse las correspondientes cadenas complementarias de las inmunoglobulinas, con uniones inespecíficas del anticuerpo. Los pesos moleculares (TABLA 37) de las bandas se correspondieron también con los descritos para las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas y que se han calculado alrededor de 45 kDa y 25 kDa, respectivamente(299). Las bandas observadas fueron menos intensas y en menor número que en el caso del anticuerpo anti-IgG como se observa en la FIGURA 17. - 160 - IV. Resultados y discusión: piometra FIGURA 17: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo con piometra al utilizar anti-IgA. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina de perra sana, calles 2-4 = tres orinas de perras con piometra. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos de 70-80 kDa (calles 1, 2, 3 y 4) y 40-50 kDa (calle 4). Se observan cadenas pesada (cp) y ligera (cl) de IgA (calle 3). La explicación a la menor presencia de esta inmunoglobulina respecto a la IgG parece radicar en su peso molecular, superior al de esta última, y a su menor concentración en el plasma. Así, mientras que los niveles séricos de IgG en el perro se sitúan entre 1.000-2.000 mg/dl, los de IgA se han calculado entre 20-150 mg/dl(383). Por otro lado, la inmunoglobulina A tiene un peso molecular de 160 kDa, aunque normalmente es secretada como dímero, al que se une posteriormente una pieza secretora alcanzando un peso molecular total de 360 kDa(383). Esto implica mayor dificultad para atravesar la barrera glomerular y aparecer en el filtrado. El epitelio de los túbulos renales también produce la inmunoglobulina A secretora(15, 366), por lo que un daño grave a ese nivel podría provocar la liberación de esta inmunoglobulina a la orina con su posterior detección. En cualquier caso, y aunque se ha descrito que la IgA - 161 - IV. Resultados y discusión: piometra puede aparecer en pequeñas cantidades en la orina de perros sanos, en nuestro estudio no se observó en el grupo control (FIGURA 11). Al comparar el número de animales que presentaron bandas en los intervalos de 40-50 kDa y 20-30 kDa en la electroforesis (TABLA 32) y en el Western blotting (TABLAS 36 y 37), se observa claramente que en ambos intervalos y en el caso de la electroforesis, este número es superior. Esto demuestra la presencia en la orina de proteínas localizadas en esos intervalos de peso molecular, diferentes a las inmunoglobulinas G y A. Es importante destacar que en 10 de los 15 animales analizados aparecen proteínas en el intervalo de peso molecular de 80-90 kDa (TABLA 32), lo que supone la confirmación en el filtrado glomerular de proteínas de alto peso molecular (FIGURA 18), que no aparecen en el grupo control (TABLA 15). La banda localizada a este nivel presentó un peso molecular de 83,49 ± 2,77 kDa (TABLA 32) y aparece en el 67% de las perras con piometra (TABLA 33). La escasa área ocupada (7,70 ± 11,45%) y su también escasa cantidad media de proteína (0,39 ± 0,57 µg) (TABLA 32) indican que se elimina en baja proporción. FIGURA 18: banda observada en el intervalo de 80-90 kDa en el grupo con piometras (calles 3, 4, 6, 7 y 8). Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina de perra sana, calles 2-8 = siete orinas de perras con piometra. - 162 - IV. Resultados y discusión: piometra Por último, en una sola perra (N°35) se detectó una banda cuyo peso molecular fue de 130 kDa. En este animal fue la banda mayoritaria, con un área relativa del 42,50% y 2,12 µg de proteína (TABLA 32), de los 5 µg que formaron la muestra. Al relacionar el área con la concentración total de proteína (3,61 mg/dl), la banda representó 1,53 mg/dl de la misma. No obstante, el perro N°35 presentó una densidad de 1009, con la interferencia que esto supone, como a continuación se discute, a la hora de valorar esos datos. Por lo demás, el animal no mostró azotemia grave ni un U P/C elevado que indicaran mayor daño renal que el resto de animales y, así, justificar la presencia de esta banda. Paradójicamente, al comparar los valores medios de la excreción total de proteínas en el grupo control (53,18 ± 25,01 mg/dl ) y en el de piometras (40,12 ± 34,44 mg/dl ) se observa que en el primero la proteinuria es sensiblemente mayor (TABLA 38), aunque la diferencia no es significativa. Concentración de proteína (mg/dl) CONTROL PIOMETRA 53,18 ± 25,01 40,12 ± 34,44 TABLA 38: valores de la concentración total de proteína (mg/dl) en la orina de los grupos control y con piometra. La importancia de la concentración de proteína urinaria varía de acuerdo a la densidad(338). Normalmente, concentraciones de 100 mg/dl con una densidad igual o superior a 1020-1025, no son significativas. Sin embargo, si la orina es hipostenúrica, la presencia de cualquier cantidad de proteína puede ser anormal(220). En nuestro estudio se observa una diferencia estadísticamente significativa (TABLA 29) en la densidad de - 163 - IV. Resultados y discusión: piometra la orina de las perras con piometra (1019 ± 10), respecto al grupo control (1033 ± 11). Se pudo comprobar además que, en las perras que presentaron isostenuria e hipostenuria, la concentración total de proteína en la orina osciló entre 3,61 mg/dl y 24,18 mg/dl, mientras que en el resto de animales la concentración de proteína fue siempre superior a estos valores. La disminución en la capacidad de concentrar la orina se produce por daño tubular y, consecuentemente, insensibilidad a la hormona antidiurética, y también en casos de toxemia, por interferencia en la reabsorción de sodio y cloro(128). En cualquier caso, teniendo en cuenta que el U P/C no se afecta por la densidad y el volumen de orina(250), se puede asegurar que la proteinuria en estos perros es discreta ya que su cociente proteína/creatinina (1,03 ± 0,97) (TABLA 31) sí fue superior al del grupo control (0,51 ± 0,26) (TABLA 13). En líneas generales, la proteinuria de la piometra canina se caracteriza por ser moderada y por estar su cuantificación influida, en gran medida, por la disminución de la densidad urinaria que caracteriza a esta enfermedad. El patrón electroforético de la orina puede calificarse como típicamente glomerular, con un predominio en la eliminación de proteínas de medio-alto peso molecular(158, 250, 297, 348), representado entre otras por albúmina e inmunoglobulinas G y A. En concreto, y en cuanto a la excreción de inmunoglobulinas en la orina, el 27% de las perras con piometra eliminaron IgG y el 7% IgA. Las proteínas de medio-alto peso molecular constituyen en este grupo el 58,9% de todas las proteínas separadas mediante electroforesis (TABLA 32). En este sentido, es importante destacar que en el 67% de las perras con piometra se observó una banda en el intervalo de peso molecular de 80-90 kDa (TABLA 33), lo que supone la confirmación en el filtrado glomerular de proteínas de alto peso molecular (FIGURA 18), que no se observan en el grupo de perros sanos (TABLA 15). - 164 - IV. Resultados y discusión: piometra IV.4.3.4.2.- Otras determinaciones Las determinaciones de glucosa, cetonas, urobilinógeno y nitritos en la orina de los animales con piometra no tuvieron significación clínica (TABLA 39). Tampoco la presencia de bilirrubina en orina aunque se ha descrito la bilirrubinuria, en ausencia de hiperbilirrubinemia, en un 31% de perras con piometra(308). También el pH de las orinas se encontró dentro del rango considerado normal en la especie canina: 5,00-8,50(18). En cuanto a la determinación de sangre oculta, los resultados positivos encontrados en su análisis (TABLA 39) coincidieron con el recuento de eritrocitos en el examen del sedimento urinario (TABLA 30) cuya discusión se realizó anteriormente. En el análisis del contenido de proteínas, la perra N°21 (TABLA 39) presentó la coloración más intensa de todo el grupo, con “++” de proteínas en la orina que se correspondieron con una concentración de proteínas de 126,04 mg/dl, la más elevada de las perras con piometra. Perro Glucosa Bilirrubina Cetonas Sangre pH Urobilinógeno Nitritos Proteínas 21 - + - + 6 Normal - ++ 22 - + - +++ 6 Normal - + 23 - + - - 6,5 Normal - Indicios 24 - - - - 6 Normal - Indicios 25 - - - - 6 Normal - + 26 - - - ++ 6 Normal - - 27 - + - Indicios 7,5 Normal - + 28 - + - Indicios 6 Normal - + 29 - - - +++ 6 Normal - + 30 - - - - 6,5 Normal - Indicios 31 - - - - 8 Normal - + - 165 - IV. Resultados y discusión: piometra 32 - - - ++ 6 Normal - + 33 - + - + 8 Normal - + 34 - - - Normal - Indicios 35 - - - Normal - - Indicios 7,5 - 7,5 TABLA 39: datos analíticos de la orina del grupo de perras con piometra. IV.4.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en las excreciones fraccionales de sodio, potasio y fósforo del grupo con piometra con respecto al grupo control, aunque se obtuvieron valores medios altos (TABLA 40). De hecho, el 47% de los animales mostraron un valor de EF Na por encima de lo considerado normal para la especie canina(198) y lo mismo ocurrió en el caso de la EF K (67%) y de la EF P (27%). La excreción fraccional de los distintos electrolitos refleja la función tubular(135) y, en la piometra, aunque se ha descrito que la lesión glomerular precede a la tubular(91), también se ha descrito nefritis túbulo-intersticial moderada sin la presencia de lesiones glomerulares específicas(370). Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. EF Na 2,65 4,80 19,00 0,11 EF K 41,82 39,57 148,00 11,00 EF P 28,34 29,38 122,00 5,00 TABLA 40: valores de la excreción fraccional de sodio (EF Na), potasio (EF K) y fósforo (EF P) del grupo con piometra. - 166 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis IV.5.- LEPTOSPIROSIS IV.5.1.- Anamnesis y exploración física La leptospirosis canina es una enfermedad que cursa con una gran variedad de síntomas. En nuestro estudio, la sintomatología presentada por los distintos animales fue variable, tal y como se aprecia en la TABLA 41. Los síntomas más frecuentemente observados fueron los siguientes: anorexia (70%), depresión (70%), coluria (60%), vómitos (60%) y diarrea (50%). Con menos frecuencia se detectó polidipsia (40%), poliuria (30%), pérdida de peso (30%) y polaquiuria (10%). Tal sintomatología coincide con la descrita para esta enfermedad por Rentko et al.(327), Brown et al.(46), Salgado(343) y Birnbaum et al.(33). Perro Anorexia Depresión Pérdida peso Vómitos Diarrea Poliuria Polidipsia Polaquiuria Coluria 36 No No No No No No No No No 37 No No No Sí Sí No No No Sí 38 No No No No No Sí Sí Sí Sí 39 Sí Sí No No Sí No No No Sí 40 Sí Sí No Sí No No Sí No Sí 41 Sí Sí Sí Sí No Sí Sí No No 42 Sí Sí No No No No No No Sí 43 Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí No No 44 Sí Sí Sí Sí Sí No No No Sí 45 Sí Sí No Sí Sí No No No No TABLA 41: anamnesis y sintomatología correspondiente al grupo de perros con leptospirosis. - 167 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis La exploración física ha demostrado ser bastante inespecífica. No se han observado frecuencias de presentación altas en ninguno de los parámetros estudiados. Los signos clínicos descritos como más frecuentes en dicha enfermedad(46, 327, 343) aparecen en nuestro estudio, aunque con un grado de incidencia bajo (TABLA 42). Ello puede ser debido a que las formas más frecuentes de presentación de la leptospirosis, en la zona geográfica en la que se ha realizado el estudio, son subaguda y crónica(343). No se ha observado ningún caso de exudado vaginal, abultamiento abdominal, lesiones cutáneas ni onicogriposis (TABLA 42), puesto que no son signos clínicos característicos de esa enfermedad. - 168 - Ascitis Dolor Exudado Abdomen Lesiones Aumento Onicogriposis Tonsilitis Cojera vaginal abultado cutáneas ganglios Perro Ta rectal Deshidrat. Mucosas Edema renal Otros 36 38,1° No Normales No No No No No No No No No 37 38,0° No Normal No No No No No No No No No 38 38,7° No Normal No No No No Pioderma No No No No Gingivitis 39 39,0° No Pálidas No Sí No No No No Retrofar. No Sí Nódulos pulmonares 40 38,0° No Normal No No No No No No No No No Urolitos 41 38,5° No Normal No No No No No No No No No Soplo sistólico 42 39,5° No Normal No No No No No No No No Sí Tumor prostático 43 37,7° No Pálidas No Sí No No No No No No No Abdomen agudo 44 38,9° 5% Pálidas No No No No No No No No No Abdomen agudo 45 35,6° 5% Normal No No No No No No No No No Abdomen agudo TABLA 42: exploración física correspondiente al grupo de perros con leptospirosis. IV. Resultados y discusión: leptospirosis IV.5.2.- Análisis de sangre IV.5.2.1.- Hematología No se han obtenido diferencias significativas con respecto al grupo control para ninguno de los parámetros estudiados de la serie roja. Los valores medios para los datos analíticos encontrados (TABLA 43) son semejantes a los descritos previamente por otros autores(247, 327, 343, 369) . Keenan et al.(212) describieron anemia normocítica y normocrómica en un grupo de perros infectados experimentalmente con L. interrogans serotipo bataviae, asociada a hemorragias y a pérdida de sangre, alteraciones no detectadas en los animales estudiados en el presente trabajo. Tan sólo observamos anemia como consecuencia de fallo renal en dos animales, los N°41 y 43, con valor hematocrito de 39% y 32%, respectivamente. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. RGR (x106/µ µl) 6,55 1,05 8,30 4,71 HGB (g/dl) 14,57 2,84 18,80 9,00 HCT (%) 45 7 59 32 VCM (fl) 68,62 1,89 71,50 66,20 HCM (pg) 22,31 3,29 26,40 15,90 CHCM (g/dl) 32,52 4,78 37,60 23,10 TABLA 43: valores de la serie roja del grupo con leptospirosis. Recuento de glóbulos rojos (RGR); concentración de hemoglobina (HGB); valor hematocrito (HCT); volumen corpuscular medio (VCM); hemoglobina corpuscular media (HCM); concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM). - 170 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis Tampoco se ha observado diferencia significativa en el recuento plaquetario de este grupo (TABLA 44) respecto al control, a pesar de estar descrita una trombocitopenia por agregación plaquetaria(169, 172, 212, 282, 328) . No obstante, y según estos mismos autores, dicha trombocitopenia aparece durante la fase precoz de la enfermedad. Media Desv. estándar PLT (x103/µ µl) 263,60 147,72 Valor máx. Valor mín. 598,00 58,00 TABLA 44: valores del recuento de plaquetas (PLT) del grupo con leptospirosis. Por último, en lo que respecta a la serie blanca, las modificaciones más frecuentemente descritas en la leptospirosis canina son leucocitosis(169, 172, 212, 328) , neutrofilia, linfopenia, monocitosis(270, 328) y eosinopenia(212). No obstante, el recuento de leucocitos oscila mucho ya que depende de distintos factores, tales como gravedad de la infección, estado inmunitario del hospedador, tiempo transcurrido desde la primoinfección y enfermedades concomitantes(172, 343). Todo ello ayuda a explicar por qué los valores medios de estos parámetros (TABLA 45) no presentan diferencias significativas con respecto al grupo control. Sólo los perros N°40, 41 y 45 presentaron recuentos leucocitarios elevados: 22.300/µl, 33.300/µl y 47.700/µl respectivamente. En los tres animales se diagnosticó fallo renal primario. En el caso del N°41, la enfermedad estaba muy avanzada, hasta el punto de ocasionar la muerte del animal como consecuencia de un fallo renal crónico. - 171 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis Parámetro Media Desv. estándar RGB (x103/µ µl) 19,61 12,46 47,70 5,50 N. bastonados/µ µl 276 299 768 0 12520 42930 3132 N. segmentados/µ µl 15326 Valor máx. Valor mín. Basófilos/µ µl 0 0 0 0 Eosinófilos/µ µl 775 770 2016 0 Linfocitos/µ µl 2524 1238 4509 715 Monocitos/µ µl 708 738 2262 0 TABLA 45: valores de la serie blanca del grupo con leptospirosis. Recuento total (RGB) y diferencial de glóbulos blancos. IV.5.2.2.- Bioquímica sanguínea En el estudio realizado de la bioquímica sanguínea (TABLA 46) sólo se ha observado diferencia significativa para el cociente A/G (TABLA 47). Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. Urea (mg/dl) 93,60 69,95 201,00 24,00 Creatinina (mg/dl) 2,11 1,51 5,70 0,90 FA (UI/l) 40,00 62,88 213,00 6,00 ALT (UI/l) 49,90 32,71 126,00 18,00 BT (mg/dl) 0,41 0,16 0,80 0,20 Calcio (mg/dl) 9,44 0,66 10,30 8,50 Calcio corregido (mg/dl) 10,25 0,16 10,40 10,00 6,42 4,10 15,90 3,30 Fósforo (mg/dl) - 172 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis Colesterol (mg/dl) 273,20 136,46 556,00 131,00 Sodio (mEq/l) 144,80 5,94 154,00 138,00 Potasio (mEq/l) 4,71 0,66 5,90 3,80 PT (g/dl) 7,16 1,78 10,30 4,50 Albúmina (g/dl) 2,64 0,60 3,60 1,80 Cociente A/G 0,65 0,25 1,00 0,32 TABLA 46: valores de la bioquímica sanguínea del grupo con leptospirosis. Concentraciones de urea, creatinina, fosfatasa alcalina (FA), alanín aminotransferasa (ALT), bilirrubina total (BT), calcio, fósforo, colesterol, sodio, potasio, proteínas totales (PT), albúmina y cociente albúmina-globulina (A/G). Cociente A/G CONTROL LEPTOSPIROSIS 0,88 ± 0,21 0,65 ± 0,25 TABLA 47: media ± desviación estándar del cociente A/G de los grupos control y con leptospirosis (p < 0,001). No se han observado diferencias estadísticamente significativas para los valores de urea y creatinina a pesar de que los valores medios obtenidos están claramente aumentados (TABLA 46), debido al hallazgo de concentraciones individuales considerablemente altas para estos parámetros. Así, en el caso de la urea, los perros N°36, 40, 41, 43 y 45 presentaron concentraciones de 122 mg/dl, 134 mg/dl, 172 mg/dl, 201 mg/dl y 155 mg/dl respectivamente; en el caso de la creatinina, los valores obtenidos para estos mismos animales fueron de 1,60 mg/dl; 2,50 mg/dl; 2,50 mg/dl; 5,70 mg/dl y 3,40 mg/dl respectivamente. En un estudio llevado a cabo por Brown et al.(46), en perros naturalmente infectados de leptospirosis, se observó que el 90% presentaba fallo renal mientras que la afectación del hígado era menor. En nuestro - 173 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis estudio hemos obtenido un porcentaje de fallo renal del 50%. La leptospirosis es la causa clínica más importante de nefritis y fallo renal agudo en perros(146). Tampoco los valores medios encontrados para la fosfatasa alcalina (FA), alanín aminotransferasa (ALT), bilirrubina total (BT) y colesterol (TABLA 46) presentaron diferencias significativas con el grupo control, aunque se observa un moderado ascenso de todos ellos, a pesar de haberse descrito al hígado como el segundo órgano más dañado en casos de leptospirosis canina(171). Sólo un 30% de los perros mostraron algún grado de daño hepatocelular, hecho que coincide con la alteración hepática descrita por Greene y Shotts(172) para esta enfermedad y que, sin llegar a provocar signos clínicos de ictericia, se caracteriza por obstrucción de las vías biliares. En este sentido, sólo el perro N°45 presentó ligera hiperbilirrubinemia, indicativa de colestasis. Los valores plasmáticos de colesterol, aunque de modo inespecífico, se observaron aumentados en tres perros (N°41, 43 y 45). Los tres mostraron fallo renal y, además, en ellos se obtuvieron los valores de albúmina más bajos: 2,00 g/dl; 1,80 g/dl y 2,50 g/dl respectivamente, a pesar de que este último se encontraba deshidratado. Los valores medios de sodio y potasio plasmáticos (TABLA 46) también fueron similares a los del grupo control, aunque alteraciones en su concentración (hiponatremia e hipopotasemia) se han descrito asociadas a la disfunción renal y gastrointestinal que, en ocasiones, provoca la leptospirosis(328). Keenan et al.(212) y Greene y Shotts(172), han descrito una hipocalcemia relacionada con hipoalbuminemia y con la disminución de la concentración de calcio ligado a proteínas. Sin embargo, el valor medio de calcio es sólo levemente inferior al control y el valor medio de calcio corregido es incluso ligeramente superior (TABLA 46). El valor medio del fósforo sérico no presentó diferencia estadística respecto al grupo control a pesar de estar aumentado (TABLA 46). En cuatro animales de los diez - 174 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis que formaron este grupo se observó hiperfosfatemia: 6,30 mg/dl; 6,40 mg/dl; 11,40 mg/dl y 15,90 mg/dl, consecuencia del fallo renal. En cuanto a la concentración de proteínas totales y de albúmina, se obtuvieron valores muy diferentes (TABLA 46), lo que provoca que tampoco se detectaran diferencias significativas con el grupo de perros sanos al comparar los valores medios. Así, las proteínas totales oscilaron entre 4,50 g/dl del perro N°39 y 10,3 g/dl del perro Nº 45 (TABLA 46). Esta variedad en los resultados se debe a la influencia de varios factores, como son la edad del animal, la presencia de anticuerpos, la pérdida de proteínas por la orina como consecuencia del daño renal e incluso la posibilidad de hemorragias internas descritas en la enfermedad(212, 343) . Además, el perro N°45 presentó una deshidratación del 5% (TABLA 42). El aumento de la síntesis de inmunoglobulinas y la hipoalbuminemia consecuencia del daño renal, que caracterizan a la leptospirosis(227), parecen ser las explicaciones más lógicas para razonar la diferencia significativa encontrada en el cociente A/G (TABLA 47). IV.5.3.- Urianálisis IV.5.3.1.- Examen físico En la evaluación física de la orina de los perros con leptospirosis se observó color oscuro y olor fuerte de la misma en los perros N°38, 39 y 42 (TABLA 48). Los dos hechos se relacionan con una densidad urinaria elevada, concretamente 1042, 1046 y 1041 respectivamente, las más elevadas de todo el grupo. La orina del perro N°45 presentó un color verde, hecho que se asocia con la presencia de bilirrubina en la orina(72) y que se confirmó por la determinación de dicho parámetro (TABLA 59) mediante tira reactiva. En sangre presentó un valor de bilirrubina total sérica de - 175 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis 0,8 mg/dl. Se ha descrito que la bilirrubinuria, en la leptospirosis, puede preceder generalmente a la hiperbilirrubinemia(172). El aspecto turbio de la orina N°42 se relaciona con su gran contenido en glóbulos rojos (TABLA 50). El resto de las orinas mostraron características normales (TABLA 48). Perro Color Aspecto Olor 36 Amarillo Claro Normal 37 Amarillo Claro Normal 38 Oscuro Claro Fuerte 39 Oscuro Claro Fuerte 40 Amarillo Claro Normal 41 Amarillo Claro Normal 42 Oscuro Turbio Fuerte 43 Amarillo Claro Normal 44 Amarillo Claro Normal 45 Verde Claro Normal TABLA 48: examen físico de la orina del grupo con leptospirosis. IV.5.3.2.- Densidad El valor medio de la densidad urinaria (TABLA 49) no presentó diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo control. Sólo en el caso del perro N°41 la orina fue isostenúrica(72), hecho que coincide con lo descrito, en casos de leptospirosis, por diversos autores(33, 227). - 176 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis Densidad Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. 1029 11 1046 1014 TABLA 49: valores de la densidad de la orina del grupo con leptospirosis. IV.5.3.3.- Sedimento urinario En el sedimento urinario de los perros con leptospirosis se encontraron, en general, células escamosas en diferente cantidad (TABLA 50). Su origen se atribuye a una contaminación procedente de uretra o vagina(72) y debido a que la extracción de la orina se realizó por sondaje vesical. El reducido número de células de transición, tubulares, glóbulos blancos y cristales encontrados en los distintos sedimentos (TABLA 50) no reviste significación clínica(296). En los perros N°38, 39, 40, 41 y 42 se observaron glóbulos rojos (TABLA 50) en número superior a 5/c, límite considerado como normal(297). En el caso de los N°40 y 41 su existencia es compatible con el daño renal que presentaban dichos animales (urea: 134 mg/dl y 172 mg/dl respectivamente; creatinina: 2,50 mg/dl para ambos). Por el contrario, en los perros N°38, 39 y 42 la hematuria microscópica es atribuible a trauma iatrogénico por sondaje vesical(18). En el perro N°45, con analítica compatible con fallo renal (urea: 155 mg/dl y creatinina: 3,40 mg/dl), se observó un cilindro granular (TABLA 50), hecho descrito en casos de leptospirosis(327) y que se asocia con daño a nivel de túbulos renales(172). No se observaron bacterias en ninguno de los sedimentos de estos perros (TABLA 50). - 177 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis Perro Céls. escam. Céls. trans. Céls. tubul. Glób. rojos Glób. blancos Cilindros Cristales Bacterias 36 1/3c — — 2/c 4/c — — — 37 — — — 2/c 1/c — 1 amorfo/5c — 38 1/8c — — Incontables — — 1 oxalato — 39 1/3c 2/c 3/c Incontables — — 1 amorfo/8c — 40 1/5c — — Incontables — — — — 41 1/c — — 10/c 2/c — — — 42 1/3c — — Incontables 2/c — 1 amorfo/6c — 43 1/4c 1/6c — 5/c — — 1 amorfo/4c — 44 1/2c — — — — — — — 45 1/c — — 3/c — 1 granular — — TABLA 50: sedimento urinario del grupo con leptospirosis (40x). Recuento por campo (/c) de células escamosas, células de transición, células tubulares, glóbulos rojos, glóbulos blancos, cilindros, cristales y bacterias. IV.5.3.4.- Examen químico IV.5.3.4.1.- Proteínas IV.5.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de proteínas Aunque los valores medios han sido superiores a los observados en el grupo de perros sanos, debido a la variabilidad de los resultados obtenidos no se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre los valores medios del cociente U P/C y la concentración de proteínas en la orina del grupo con leptospirosis y el grupo control, a pesar de haberse observado valores individuales altos (TABLA 51). Así, los perros N°37, 39, 41, 43 y 45 presentaron un U P/C de 1,94; 4,90; 3,79; 9,34 y 2,09 respectivamente. En los dos primeros no fue acompañado de otras alteraciones - 178 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis analíticas, mientras que en los perros N°41, 43 y 45 se diagnosticó fallo renal. En la leptospirosis y, más concretamente en el urianálisis, la proteinuria es un hallazgo común, por lo que en algunos casos se puede observar un aumento del cociente U P/C(33). Por otro lado, los perros N°39, 43 y 44 mostraron una concentración de proteínas en la orina superior a 100 mg/dl, aunque sólo el N°43 mostró signos de fallo renal. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. U P/C 2,59 2,79 9,34 0,19 Proteínas 94,79 81,89 249,73 29,38 TABLA 51: valores del cociente proteína/creatinina (U P/C) y la concentración de proteínas (mg/dl) en orina del grupo con leptospirosis. Igual que sucede en el grupo de animales con piometra, también aquí se han obtenido valores de U P/C normales en perros con fallo renal. Concretamente los N°36 (U P/C = 0,19) y N°40 (U P/C = 0,73) que también presentaron una tasa baja de proteinuria (32,91 mg/dl y 29,38 mg/dl, respectivamente). Además de la explicación aportada en los animales con piometra, en este caso parece que existe también relación con el sexo de los animales (los dos son machos). Los perros machos también eliminan creatinina por secreción tubular(291, 335) y esta secreción, que normalmente es mínima, se incrementa al aumentar la concentración de creatinina sérica(373). Por esto, los U P/C pueden ser menores de lo esperado en perros machos con fallo renal azotémico de moderado a grave(250). - 179 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis IV.5.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting Como se ha comentado anteriormente, la piometra es una enfermedad que cursa, fundamentalmente, con glomerulopatía(31, 220) y, por tanto, con proteinuria caracterizada por la presencia de albúmina y proteínas de tamaño molecular superior a ésta(305). La leptospirosis, por el contrario, se caracteriza por provocar, principalmente, una nefropatía túbulo-intersticial(138). Entre las consecuencias fisiopatológicas que de ello se derivan, se encuentra el incremento en la excreción, también de albúmina, pero en este caso acompañada por proteínas de tamaño molecular inferior a ella(249). El patrón electroforético de este grupo se caracteriza, fundamentalmente, por la eliminación de proteínas de peso molecular bajo, como consecuencia posiblemente de la alteración en la reabsorción tubular de proteínas con este peso molecular. Cuando se realizó el estudio electroforético de estas orinas (FIGURA 19) se identificaron hasta un total de 8 bandas diferentes (FIGURA 20 y TABLA 52), observadas también en el grupo de animales con piometra (FIGURA 13) y de las que 5, como ocurría en estos últimos, se correspondieron con las únicas localizadas en el grupo control (TABLA 52). - 180 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis FIGURA 19: bandas observadas en la electroforesis del grupo con leptospirosis. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina del grupo control, calles 2-9 = orinas del grupo con leptospirosis. - 181 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis FIGURA 20: lectura densitométrica de la electroforesis de orina de un perro con leptospirosis (8 bandas). Media ± SD Prot. (µ µg) Media ± SD Área (%) 109,75 ± 4,65 0,34 ± 0,30 6,86 ± 5,99 Intervalo Pm (kDa) N° perros N = 10 Media ± SD Pm (kDa) *100-110 8 90-100 0 — — — 80-90 6 83,48 ± 2,36 0,14 ± 0,10 2,80 ± 1,92 *70-80 10 71,30 ± 5,18 1,13 ± 1,00 22,67 ± 19,91 60-70 0 — — — 50-60 5 55,46 ± 2,53 1,07 ± 1,18 21,40 ± 23,56 40-50 4 43,15 ± 1,39 0,71 ± 0,54 14,23 ± 10,72 *30-40 8 34,38 ± 1,72 0,47 ± 0,25 9,49 ± 5,03 *20-30 8 26,06 ± 1,80 0,78 ± 0,75 15,68 ± 14,90 *10-20 10 13,39 ± 1,04 1,68 ± 1,41 33,64 ± 28,13 * Bandas observadas también en el grupo control. TABLA 52: media ± desviación estándar del peso molecular (Pm), cantidad de proteína (Prot.) y área de las bandas que aparecen en la orina del grupo con leptospirosis. Debido a la coincidencia de las distintas bandas entre este grupo y el de piometras, la diferencia estadísticamente significativa que existe en sus frecuencias de presentación es menor que cuando se compara con el grupo control (TABLA 53). LEPTOSPIROSIS CONTROL PIOMETRA p < 0,001 p < 0,01 TABLA 53: nivel de la diferencia estadísticamente siginificativa existente entre las frecuencias de presentación de las bandas electroforéticas del grupo con leptospirosis y los grupos control y con piometra. - 182 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis En la leptospirosis canina debemos destacar que, a diferencia de los grupos anteriores, las proteínas de más bajo peso molecular, localizadas en el intervalo de 10 kDa a 40 kDa, se observaron en la mayor parte de los animales, y como se muestra en la TABLA 54, con una frecuencia de presentación igual o superior al 80%. Intervalo Pm (kDa) Control Piometra Leptospirosis 120-130 — 7% — 100-110 100% 80% 80% 80-90 — 67% 60% 70-80 95% 93% 100% 50-60 — 47% 50% 40-50 — 47% 40% 30-40 30% 73% 80% 20-30 25% 67% 80% 10-20 50% 67% 100% TABLA 54: frecuencias de presentación de las bandas observadas en los grupos control, con piometra y con leptospirosis. Cuando se aplicó un análisis de varianza sobre las 5 bandas que aparecen en los grupos control, piometra y leptospirosis, sólo se encontraron diferencias estadísticamente significativas, respecto a la cantidad de proteína (µg/banda), en los intervalos de peso molecular de 100-110 kDa y 10-20 kDa (TABLA 55). - 183 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis Intervalo Pm (kDa) CONTROL (N = 20) PIOMETRA (N = 15) LEPTOSPIROSIS (N = 10) 100-110 1,73 ± 1,22 A 0,86 ± 1,14 AB 0,34 ± 0,30 B 10-20 2,41 ± 0,86 A 0,65 ± 0,48 B 1,68 ± 1,41 A TABLA 55: media ± desviación estándar de la cantidad de proteína (µg/banda) de los grupos control, piometra y leptospirosis. Letras diferentes en el mismo intervalo de peso molecular implican diferencias significativas (p < 0,05). Así, no se observó diferencia estadística en la cantidad de proteína (µg/banda) en el intervalo de peso molecular de 10-20 kDa respecto al grupo control, pero sí respecto al de piometras (TABLA 55). En la leptospirosis, la excreción de la proteína localizada en la región de la lisozima y β2-microglobulina, o de otras proteínas de peso molecular localizado en este intervalo, parece ser mayor a la producida en los casos de piometra (FIGURA 21). FIGURA 21: electroforesis de las orinas de una perra con piometra (calle 1) y con leptospirosis (calle 2). Banda localizada en el intervalo de peso molecular de 10-20 kDa. Pm = marcador de pesos moleculares. - 184 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis En la piometra el daño renal consiste, principalmente, en una glomerulonefritis por depósito de complejos inmunes(166), mientras que la leptospirosis provoca, sobre todo, una nefritis túbulo-intersticial(138). Esta lesión conlleva la disminución de la funcionalidad tubular, como lo demuestran los valores individuales altos de la excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo observados en el 80%, 90% y 70% respectivamente, de los animales de este grupo. El daño en los túbulos renales disminuye la reabsorción de proteínas de bajo peso molecular a ese nivel, con su consiguiente aumento en la orina. De hecho, la lisozima y la β2-microglobulina se han utilizado para detectar un daño renal de tipo tubular, en el caso de que aparezcan en cantidades elevadas en la orina(204, 423). En la leptospirosis se incorporan a la orina tanto proteínas de alto (80-90 kDa) como de bajo (40-60 kDa) peso molecular que no aparecen en el grupo de perros sanos (TABLA 52), y que provocan un cambio en la distribución de las bandas que se observan en ambos grupos. A ello se debe el que, en el intervalo de 100-110 kDa (109,75 ± 4,65 kDa), se observe una diferencia estadísticamente significativa en la cantidad de proteína/banda respecto al grupo control, con un valor medio inferior en la leptospirosis (TABLA 55). Tal disminución se observa no sólo en el intervalo mencionado, sino también en el resto de las 5 bandas que aparecen en ambos grupos, incluida la ya comentada de 10-20 kDa (TABLA 52). En el intervalo de 20-30 kDa (26,06 ± 1,80 kDa) (TABLA 52), la mayor concentración de proteína (desde 0,30 µg en el perro N°36 hasta 2,15 µg en el perro N°45) se observó en los animales N°36, 39, 41, 43 y 45 (FIGURA 22). - 185 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis FIGURA 22: banda observada en el intervalo de peso molecular de 20-30 kDa (calle 1) en la orina del perro N°45, perteneciente al grupo con leptospirosis. Pm = marcador de pesos moleculares. Estos animales, a excepción del N°39, mostraron además, las alteraciones analíticas más acusadas: azotemia grave (urea desde 155 mg/dl a 201 mg/dl y creatinina desde 2,5 mg/dl a 5,7 mg/dl), hiperfosfatemia (fósforo entre 6,3 mg/dl y 15,9 mg/dl), hipercolesterolemia (colesterol desde 332 mg/dl a 556 mg/dl), hipoalbuminemia (albúmina entre 1,8 g/dl y 2,5 mg/dl), disminución del cociente albúmina/globulina (entre 0,32 y 0,47), aumento del cociente P/C en orina (entre 2,09 y 9,34) y, por último, aumento en las excreciones fraccionales de sodio (entre 2% y 8%), potasio (entre 29% y 177%) y fósforo (entre 14% y 126%). Del mismo modo, la banda localizada en el intervalo de 40-50 kDa (43,15 ± 1,39 kDa) y una cantidad media de proteína de 0,71 ± 0,54 µg, se observó en 4 de los 5 perros (TABLA 52) que experimentaron la proteinuria mayor. Son los animales N°39, 41, 43 y 45 (FIGURA 23), citados anteriormente, con valores de proteinuria de 249,73 mg/dl; 94,77 mg/dl; 233,72 mg/dl y 52,30 mg/dl respectivamente y los valores más altos de U P/C (4,90; 3,79; 9,34 y 2,09). - 186 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis FIGURA 23: banda observada en el intervalo de peso molecular de 40-50 kDa (calle 1) en la orina del perro N°45, perteneciente al grupo con leptospirosis. Pm = marcador de pesos moleculares. Ambos intervalos de pesos moleculares coinciden con la zona de migración de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas(299). Su relación se comprobó mediante la técnica de Western blotting en las orinas de este grupo. Con los anticuerpos utilizados en este estudio (anti-IgG y anti-IgA) se observaron, en la mayoría de los animales, las bandas asociadas a una unión inespecífica de los anticuerpos, localizadas en el intervalo de peso molecular de 70-80 kDa (FIGURA 24). También, y por la misma razón, se visualizaron dos bandas del marcador de pesos moleculares (67 kDa = albúmina sérica bovina y 30 kDa = anhidrasa carbónica) (FIGURA 24), ya descritas en los grupos anteriores. Por último, y relacionada también con el uso de anticuerpos policlonales, se observó una señal inespecífica en el intervalo de pesos moleculares de 10-20 kDa en 5 muestras (FIGURA 24), cuya aparición coincidió con las orinas que presentaron, en la electroforesis, mayor cantidad de proteína en este intervalo. Cuando se utilizó específicamente el anticuerpo - 187 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis primario anti-IgG, se comprobó que las bandas observadas en los intervalos de peso molecular de 40-50 kDa y 20-30 kDa se correspondían con cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas en 3 perros (TABLA 56). FIGURA 24: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo con leptospirosis al utilizar anti-IgG. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo control, calles 2-8 = siete orinas grupo con leptospirosis. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos de 70-80 kDa (calles 1, 2, 3, 4, 6 y 8), 40-50 kDa (calle 8), 20-30 kDa (calle 3) y 10-20 kDa (calles 4, 6 y 8). Se observan cadenas pesadas (cp) y ligeras (cl) de IgG (calles 5 y 7). N°36 N°39 N°41 N°43 N°45 40-50 kDa 43-67 — 43,23 44,95 44,90 20-30 kDa 25,7 25,33 27,25 24,53 — TABLA 56: peso molecular (kDa) de las bandas evidenciadas por Western blotting utilizando anti-IgG en el grupo con leptospirosis. - 188 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis Como ya se ha indicado, estos animales se encuentran entre los que mostraron las alteraciones analíticas renales más graves. En vista de los resultados obtenidos en el inmunoblotting, en estos animales existe un daño de los glomérulos suficiente como para permitir el paso de inmunoglobulina G al filtrado glomerular(195), con su posterior fragmentación en cadenas ligeras y pesadas (FIGURA 24) al aplicar las condiciones desnaturalizantes del método. Cabe mencionar que, en el caso del perro N°36, el peso molecular de la banda correspondiente a la cadena pesada de IgG (TABLA 56) no se pudo concretar porque, posiblemente por problemas de tinción, la banda no se visualizó en la electroforesis. Sólo podemos afirmar que se situó entre 43 kDa y 67 kDa, límites establecidos por el marcador de pesos moleculares utilizado. Por otro lado, en los perros N°39 y 45, no se observaron las bandas asociadas a las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, respectivamente (TABLA 56), aunque en la electroforesis sí se evidenciaron unas bandas de pesos moleculares de 42,80 kDa y 24,43 kDa. Pudiera ocurrir que esas bandas evidenciadas en los perros N°39 y 45 no se correspondan con inmunoglobulinas y se trate de uniones inespecíficas del anticuerpo. Con el anticuerpo primario anti-IgA se observó, además de las señales inespecíficas a las que ya se ha hecho referencia, una señal correspondiente a cadenas pesadas y ligeras de IgA en 2 perros, los N°41 y 43 (FIGURA 25). Estos animales mostraron las alteraciones analíticas más evidentes y, además, presentaron IgG en sus orinas (TABLA 56). - 189 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis FIGURA 25: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo con leptospirosis al utilizar anti-IgA. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo control, calles 2-9 = ocho orinas grupo con leptospirosis. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos de 70-80 kDa (calles 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 9) y 20-30 kDa (calle 3). Se observan cadenas pesadas (cp) y ligeras (cl) de IgA (calles 5 y 7). Los pesos moleculares de las bandas observadas (TABLA 57) coincidieron con los descritos para las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, aunque la intensidad de las bandas (FIGURA 25) fue menor que en el caso de la IgG. En los perros N°39 y 45 sólo se observó la banda de peso molecular correspondiente a las cadenas ligeras de inmunoglobulinas (TABLA 57) por lo que, al no evidenciarse sus respectivas cadenas pesadas, podrían corresponderse con uniones inespecíficas del anticuerpo. - 190 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis N°39 N°41 N°43 N°45 40-50 kDa — 43,23 44,95 — 20-30 kDa 25,33 27,25 24,53 24,43 TABLA 57: peso molecular (kDa) de las bandas evidenciadas por Western blotting utilizando anti-IgA como anticuerpo primario en el grupo con leptospirosis. Aunque sólo 5 orinas mostraron señal de quimioluminiscencia en el intervalo de 20-30 kDa, hubo otros animales (TABLA 52) que en la electroforesis presentaron bandas en este intervalo. Pudo ocurrir que estas proteínas no fueran cadenas ligeras de inmunoglobulinas sino proteínas de peso molecular similar (p.ej. α1-microglobulina) o fragmentos de otras de peso molecular alto originados por la desnaturalización de las proteínas o por proteolisis. En la electroforesis, además de estas bandas y como ya se ha descrito, se ha observado la aparición de otras dos no visibles en el grupo control, localizadas en los intervalos de peso molecular de 80-90 kDa y 50-60 kDa (TABLA 52). Ninguna de ellas mostró diferencias estadísticamente significativas respecto a la cantidad de proteína (µg/banda) con las observadas en el grupo de piometras (TABLA 58). 50-60 kDa 80-90 kDa PIOMETRA 0,50 ± 0,16 0,39 ± 0,57 LEPTOSPIROSIS 1,07 ± 1,18 0,14 ± 0,10 TABLA 58: cantidad media de proteína (µg/banda) de los intervalos de 50-60 kDa y 80-90 kDa en los grupos con piometra y leptospirosis. - 191 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis En líneas generales, se puede concluir que las proteínas de bajo peso molecular suponen en este grupo el 70,2% de todas las proteínas, índice claro de que el patrón electroforético de la orina de perros con leptospirosis es típicamente tubular. Este patrón electroforético se caracteriza por la disminución en la excreción de proteínas de medio-alto peso molecular y el aumento de las de bajo peso molecular(158, 250, 297, 348). No obstante, se debe tener en cuenta que algunas de estas bandas pueden corresponderse con fragmentos derivados de fenómenos de proteolisis y/o de la desnaturalización de proteínas de mayor peso molecular, como es el caso de las inmunoglobulinas. En cualquier caso, las condiciones aplicadas en el método, a lo largo de esta Tesis Doctoral, han sido las mismas para todas las muestras estudiadas, hecho que aporta veracidad a estos resultados. En el caso concreto de las inmunoglobulinas, aparecen con una incidencia baja (aproximadamente en un tercio de los perros estudiados) y en concentración escasa. En la región de proteínas de alto peso molecular, superior a 69 kDa, la mayor parte de las mismas se corresponde con la albúmina (TABLA 52) y, si bien es verdad que aparecen dos proteínas con pesos moleculares mayores (80-90 kDa y 100-110 kDa) (TABLA 52) y con una frecuencia de presentación alta (60% y 80% respectivamente) (TABLA 54), sus áreas son mínimas (2,8 ± 1,92% y 6,86 ± 5,99% respectivamente) (TABLA 52), indicativo de que aparecen en la orina en escasa concentración. IV.5.3.4.2.- Otras determinaciones En la orina de los perros con leptospirosis la cuantificación de glucosa, cetonas, urobilinógeno y nitritos no fue significativa (TABLA 59). Sólo el perro N°45 mostró indicios de glucosa (TABLA 59). Se ha descrito glucosuria, en casos de leptospirosis, como reflejo del daño tubular que provoca la enfermedad(327, 328). También el perro N°45 fue el único en dar significativo al análisis de bilirrubina en la orina - 192 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis (TABLA 59). Presentaba una concentración de bilirrubina total en sangre de 0,8 mg/dl lo que explicaría la bilirrubinuria que, generalmente, precede a la (172, 296) hiperbilirrubinemia . El pH de las orinas del grupo de leptospirosis (TABLA 59) se encontró dentro del rango considerado normal en la especie canina: 5,00-8,50(18). El resultado positivo de sangre oculta en las orinas de este grupo de perros (TABLA 59) coincidió, en todos los casos, con un recuento alto de eritrocitos en el examen del sedimento urinario (TABLA 50), cuya discusión se realizó anteriormente. La determinación de proteínas en 4 orinas no fue significativa, mientras que se observaron “++” de proteínas en 4 perros de los que 2 mostraron fallo renal (N°41 y 45). El número máximo de cruces se observó en 2 animales, uno de los cuales (N°43) mostró las alteraciones analíticas más graves de todo el grupo de perros con leptospirosis. La cuantificación de la proteinuria mediante el método de Lowry et al.(248) coincidió, en todos los casos, con los resultados de esta determinación. Perro Glucosa Bilirrubina Cetonas Sangre pH Urobilinógeno Nitritos Proteínas 36 - - - Indicios 6 Normal - + 37 - + - Indicios 6,5 Normal - + 38 - + - +++ 8 Normal - ++ 39 - + - +++ 8 Normal - +++ 40 - + - ++++ 6 Normal - + 41 - - - +++ 6 Normal - ++ 42 - - - +++ 6,5 Normal - + 43 - - - + 8,5 Normal - +++ - 193 - IV. Resultados y discusión: leptospirosis 44 - + - - 6,5 Normal - ++ 45 Indicios ++ - + 5 Normal - ++ TABLA 59: datos analíticos de la orina del grupo de perros con leptospirosis. IV.5.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo El valor medio de la excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo en los perros con leptospirosis no mostró diferencia estadísticamente significativa con el grupo control, aunque sus valores medios fueron superiores a los de este grupo y también fueron altos (TABLA 60) para lo considerado normal en la especie canina(198). El estudio reveló valores individuales altos en el 80% de los animales para la excreción fraccional de sodio, 90% para la del potasio y 70% para la del fósforo. La causa de estos resultados parece ser la alteración funcional en los túbulos renales debido a la nefritis túbulo intersticial con la que cursa la leptospirosis(138), responsable de la pérdida de proteínas de bajo peso molecular. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. EF Na 2,93 2,19 8,00 0,38 EF K 76,10 56,00 177,00 17,00 EF P 54,32 31,78 126,00 14,00 TABLA 60: valores de la excreción fraccional de sodio (EF Na), potasio (EF K) y fósforo (EF P) del grupo con leptospirosis - 194 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis IV.6.- LEISHMANIOSIS IV.6.1.- Anamnesis y exploración física La leishmaniosis canina es un proceso multisistémico y, por tanto, con una sintomatología muy variada. En nuestro estudio, la sintomatología referida por los dueños de los perros de este grupo concuerda con la descrita por diversos autores para esta enfermedad(76, 205, 218, 228). La frecuencia de presentación de la misma (TABLA 61) fue la siguiente: anorexia (77%), depresión (77%), pérdida de peso (73%), poliuria (45%), polidipsia (45%), vómitos (41%), coluria (18%) y diarrea (18%). Perro Anorexia Depresión Pérdida peso Vómitos Diarrea Poliuria Polidipsia Polaquiuria Coluria 46 Sí Sí Sí Sí No No No No Sí 47 Sí Sí Sí No No No No No No 48 Sí Sí Sí Sí No No No No No 49 Sí Sí Sí No No Sí Sí No No 50 Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí No No 51 Sí Sí Sí Sí Sí No No No No 52 No No No No No No No No No 53 Sí Sí Sí Sí No Sí Sí No No 54 No No No No No No No No Sí 55 Sí Sí No No No Sí Sí No No 56 No No No No No No No No No 57 No No No No No No No No No 58 Sí Sí Sí Sí No Sí Sí No No 59 Sí Sí Sí Sí No No sabe No sabe No No 60 Sí Sí Sí Sí No Sí Sí No No 61 No No No No No No No No Sí - 195 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis 62 Sí Sí Sí No sabe No sabe No sabe No sabe No sabe No 63 Sí Sí Sí No No Sí Sí No No 64 Sí Sí Sí No Sí Sí Sí No No 65 Sí Sí Sí No No No sabe No sabe No No 66 Sí Sí Sí No No Sí Sí No No 67 Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí No Sí TABLA 61: anamnesis y sintomatología correspondiente al grupo de perros con leishmaniosis. Los signos clínicos de la leishmaniosis más frecuentes suelen ser linfadenomegalia, mucosas pálidas, esplenomegalia, lesiones dérmicas y onicogriposis(55, 76, 219). En nuestro estudio, los signos observados con mayor frecuencia (TABLAS 62 y 63) fueron el aumento del tamaño de ganglios periféricos (73%), la palidez de mucosas (68%) y la existencia de lesiones cutáneas de distinto tipo (64%), lo que coincide con lo descrito por los autores citados. También se observaron onicogriposis y grado variable de deshidratación en un 41% y 36%, respectivamente, de los animales. El 32% de los perros mostraron dolor a la palpación renal asociado, en la mayor parte de los casos, con azotemia grave. En tres animales (N°48, 49 y 55) se observó cojera, hecho relacionado con neuralgias, poliartritis, polimiositis, úlceras interdigitales o, incluso, lesiones osteolíticas o periostitis proliferativas(356). En otros tres perros (N°54, 59 y 61) se observó fiebre. En nuestro estudio ningún animal presentó exudado vaginal o ascitis y sólo uno de los 22 animales mostró edema en extremidades posteriores (N°59) asociado con hipoalbuminemia (1,4 g/dl). Cabe mencionar otros hallazgos, como epistaxis, descrita en la leishmaniosis como resultado de trombocitopenia o de vasculitis(356) y que observamos en dos perros (N°51 y 57); enfermedades concomitantes como otitis, consecuencia de la inmunodepresión que provoca la leishmaniosis(356); úlceras orales en cuatro perros atribuibles a la estomatitis urémica(219); signos oculares como conjuntivitis(76) y depósitos corneales de lípidos - 196 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis (perro N°66), cuya aparición se asocia a alteraciones en su metabolismo que conducen a hiperlipidemia(357, 367) . En este sentido, este animal mostró un valor de colesterol de 335 mg/dl. Por último, se observó ictericia en el perro N°67 asociada a un valor de bilirrubina total sérica de 3,40 mg/dl. - 197 - Perro Ta rectal Deshidrat. Mucosas Ascitis Dolor Exudado Abdomen Lesiones Onicogriposis Edema renal vaginal abultado cutáneas Aumento ganglios Tonsilitis Cojera 46 37,3° 5% Pálidas No No No No No No No No no 47 38,4° 7% Pálidas No Sí No No Sí Sí Retrof. No No 48 38,7° No Pálidas No No No No Sí No Poplíteos No Sí 49 39,1° No Congestivas No No No No Sí No Poplíteos No Sí 50 37,4° 5% Pálidas No Sí No No No No Poplíteos No No 51 38,3° No Pálidas No Sí No No Sí Sí Poplíteos No No 52 37,7° No Pálidas No No No No Sí No Retrof., poplít No No 53 38,0° 7% Pálidas No No No No Sí No Poplíteos No No 54 39,9° No Congestivas No No No No Sí Sí Pre-escapular No No 55 38,0° 5% Pálidas No Sí No No No No No No Sí 56 38,1° No Normales No No No No Sí Sí Poplíteos No No TABLA 62: exploración física correspondiente al grupo de perros con leishmaniosis. Otros Nódulo subcutáneo Úlceras orales Epistaxis Conjuntivitis Prurito Perro Ta rectal Deshidrat. Ascitis Dolor Exudado Abdomen Lesiones Onicogriposis Edema renal vaginal abultado cutáneas Mucosas Aumento ganglios Tonsilitis Cojera Otros 57 39,0° No Normales No No No No Sí No Retrof., poplít Sí No Tos, epistaxis, otitis 58 38,5° No Normales No No No No Sí Sí Poplíteos No No Conjuntivitis, úlceras orales 59 39,7° No Pálidas Edema No No No No No No No No Disnea, abdomen agudo 60 39,1° No Pálidas No No No No No No No No No Temblores 61 39,6° No Congestivas No No No No Sí No Retrof., poplít No No 62 38,3° No Pálidas No Sí No No Sí Sí Poplíteos No No Tos 63 37,5° No Pálidas No No No No No Sí Retrof., poplít No No Úlceras orales 64 38,5° No Pálidas No No No Sí No No No No No Conjuntivitis 65 38,2° 7% Pálidas No Sí No No Sí Sí Poplíteos No No Abdomen agudo 66 38,8° 5% Muy pálidas No Sí No No Sí No No No No Depósitos corneales 67 38,7° 5% Ictéricas No No No No No Sí Poplíteos No No Úlceras orales TABLA 63: exploración física correspondiente al grupo de perros con leishmaniosis. IV. Resultados y discusión: leishmaniosis IV.6.2.- Análisis de sangre IV.6.2.1.- Hematología En la leishmaniosis canina se ha descrito la aparición de una anemia normocítica y normocrómica escasamente o nada regenerativa(76, 219), normalmente por disminución de la eritropoyesis por enfermedad renal crónica que puede agravarse por pérdida de sangre, por disminución de la vida media de los eritrocitos(356) o por secuestro de hierro debido a mecanismos inflamatorios(244). Los resultados obtenidos en nuestro estudio concuerdan con lo descrito por estos autores (TABLA 64). Así, encontramos diferencias estadísticamente significativas entre los valores medios del recuento de eritrocitos, hematocrito y concentración de hemoglobina del grupo con leishmaniosis y el grupo control (TABLA 65). Por el contrario, no se observó esta diferencia en el caso de los índices de Wintrobe, lo que indica que la anemia es no regenerativa. Esta anemia es debida en gran medida al fallo renal, que aparece en 16 de los 22 perros estudiados (73%), el porcentaje más alto de los tres procesos estudiados. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. RGR (x106/µ µl) 4,38 1,32 6,09 1,53 HGB (g/dl) 10,11 2,84 13,50 3,50 HCT (%) 30 9 43 11 VCM (fl) 69,15 4,75 81,40 61,20 HCM (pg) 23,31 1,79 27,10 20,40 CHCM (g/dl) 33,76 2,38 37,10 28,60 TABLA 64: valores de la serie roja del grupo con leishmaniosis. Recuento de glóbulos rojos (RGR); concentración de hemoglobina (HGB); valor hematocrito (HCT); volumen corpuscular medio (VCM); hemoglobina corpuscular media (HCM); concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM). - 200 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis Parámetro CONTROL LEISHMANIOSIS RGR (x106/µ µl) 7,28 ± 1,13 4,38 ± 1,32 HGB (g/dl) 16,83 ± 2,00 10,11 ± 2,84 HCT (%) 52 ± 8 30 ± 9 TABLA 65: media ± desviación estándar de los parámetros de la serie roja del grupo con leishmaniosis que presentaron diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo control (p < 0,001). El valor medio del recuento de plaquetas de este grupo (TABLA 66) no mostró diferencia estadística respecto al control a pesar de que un 41% de los animales con leishmaniosis mostraron un recuento inferior a 150.000 plaquetas/µl. En este sentido, se ha descrito en algunos casos la aparición de trombocitopenia por supresión de la médula ósea, autoanticuerpos, etc.(356). PLT (x103/µ µl) Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. 214,73 139,18 548,00 86,00 TABLA 66: valores del recuento de plaquetas (PLT) del grupo con leishmaniosis. En el análisis de la serie blanca (TABLA 67) sólo observamos diferencias estadísticas entre el valor medio del recuento de eosinófilos de este grupo y el control (TABLA 68). El resto de parámetros mostró valores medios similares a los obtenidos en el grupo control (TABLA 67) aunque en la leishmaniosis se ha descrito la presencia tanto de leucocitosis con desviación a la izquierda(347) como de leucopenia(130). En nuestro estudio hemos observado valores individuales de glóbulos blancos aumentados y disminuidos, que no han alterado el recuento medio de leucocitos. La eosinopenia detectada fue acompañada de alteraciones en el recuento diferencial del resto de células - 201 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis leucocitarias, compatibles con un leucograma de estrés(229), aunque sin significación estadística. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. RGB (x103/µ µl) 10,79 9,12 45,10 1,10 N. bastonados/µ µl 628 1517 7216 0 N. segmentados/µ µl 8346 6767 30668 748 Basófilos/µ µl 0 0 0 0 Eosinófilos/µ µl 114 137 536 0 Linfocitos/µ µl 1170 1160 4961 94 Monocitos/µ µl 532 523 2255 0 TABLA 67: valores de la serie blanca del grupo con leishmaniosis. Recuento total (RGB) y diferencial de glóbulos blancos. Eosinófilos/µ µl CONTROL LEISHMANIOSIS 504 ± 319 114 ± 137 TABLA 68: media ± desviación estándar del recuento de eosinófilos/µl de los grupos control y con leishmaniosis (p < 0,001). IV.6.2.2.- Bioquímica sanguínea Aunque en un estudio realizado por Palacio et al.(301) no se encontraron diferencias significativas entre las concentraciones séricas de urea y de creatinina de un grupo control y de otro con leishmaniosis, en nuestro caso sí se han observado dichas diferencias. Así, los valores medios de ambos parámetros en este grupo fueron muy superiores a los obtenidos en el control (TABLA 69). Se ha descrito la azotemia como - 202 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis uno de los hallazgos laboratoriales más característicos de la enfermedad(76, 219) ; de hecho, en nuestro estudio se observó en el 73% de los casos. La afectación renal que se produce en la leishmaniosis se caracteriza por glomerulonefritis por complejos inmunes(76, 288), nefritis intersticial(254) y, en raras ocasiones, amiloidosis(310, 355). Parámetro CONTROL LEISHMANIOSIS Urea (mg/dl) 30,15 ± 6,97 157,18 ± 106,76 Creatinina (mg/dl) 1,09 ± 0,18 4,53 ± 4,07 Fósforo (mg/dl) 4,21 ± 0,57 12,09 ± 7,38 PT (g/dl) 6,89 ± 0,64 8,87 ± 2,17 Albúmina (g/dl) 3,14 ± 0,27 2,16 ± 0,59 Cociente A/G 0,88 ± 0,21 0,35 ± 0,14 TABLA 69: media ± desviación estándar de los parámetros de la bioquímica sanguínea del grupo con leishmaniosis que presentaron diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo control (p < 0,001). El daño hepático en la leishmaniosis no es frecuente(130), aunque se han descrito casos que llevaron asociado un fallo hepático(122) y cuya aparición se relacionó con un mal pronóstico de la enfermedad(393). En nuestro estudio no se observaron diferencias estadísticas en los valores de alanín aminotransferasa (ALT), bilirrubina total (BT) y fosfatasa alcalina (FA) entre este grupo y el control. Tampoco los valores medios de estos parámetros (TABLA 70) superaron los establecidos como normales para la especie canina aunque, en el caso de la FA, se observaron valores elevados en los perros N°48, 65 y 66 (160 UI/l, 172 UI/l y 188 UI/l respectivamente) acompañado, sólo en el N°65, de hiperbilirrubinemia discreta (BT = 0,9 mg/dl). Está descrito que la colestasis cursa con un aumento de ambos parámetros(416), aunque en nuestro estudio no - 203 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis se pudo confirmar su existencia. También se observó hiperbilirrubinemia en el perro N°67 (BT = 3,40 mg/dl), sin otra alteración en la analítica sanguínea que pudiera explicar el aumento en la concentración de bilirrubina total. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. Urea (mg/dl) 157,18 106,76 384,00 23,00 Creatinina (mg/dl) 4,53 4,07 18,00 0,80 FA (UI/l) 58,31 55,92 188,00 3,00 ALT (UI/l) 37,68 14,89 64,00 12,00 BT (mg/dl) 0,54 0,66 3,40 0,20 Calcio (mg/dl) 7,87 1,68 9,80 4,60 Calcio corregido (mg/dl) 9,17 1,79 10,50 4,60 Fósforo (mg/dl) 12,09 7,38 28,90 3,20 Colesterol (mg/dl) 284,50 106,18 594,00 142,00 Sodio (mEq/l) 144,86 8,11 153,00 123,00 Potasio (mEq/l) 4,65 0,99 6,50 2,60 PT (g/dl) 8,87 2,17 14,00 5,40 Albúmina (g/dl) 2,16 0,59 3,20 1,30 Cociente A/G 0,35 0,14 0,74 0,13 TABLA 70: valores de la bioquímica sanguínea del grupo con leishmaniosis. Concentraciones de urea, creatinina, fosfatasa alcalina (FA), alanín aminotransferasa (ALT), bilirrubina total (BT), calcio, fósforo, colesterol, sodio, potasio, proteínas totales (PT), albúmina y cociente albúmina-globulina (A/G). El valor medio de calcio no presentó diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo control. Los valores del calcio corregido se encontraron comprendidos en un rango entre 4,60 mg/dl y 10,50 mg/dl (TABLA 70) mostrando, un 27% de los animales, valores inferiores a los considerados normales en el perro. Cabe mencionar - 204 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis que todos los casos de hipocalcemia se acompañaron de hiperfosfatemia. La hipocalcemia del fallo renal, consecuencia de la reducción de la síntesis de calcitriol entre otras causas, se encuentra estrechamente relacionada con el aumento del fósforo sérico(314). La concentración media de fósforo plasmático presentó diferencia estadística respecto al control, con un valor medio muy superior a éste (TABLA 69). En este sentido, el 68% de los animales de este grupo mostraron hiperfosfatemia, con un valor máximo de 28,90 mg/dl (TABLA 70). La hiperfosfatemia, consecuencia de la disminución de la filtración glomerular, aparece frecuentemente en el fallo renal que provoca la leishmaniosis(219). Los valores medios de colesterol, sodio y potasio de este grupo no mostraron diferencias significativas respecto al grupo control. Se observó hipercolesterolemia en el 27% de los animales con leishmaniosis, obteniéndose un valor máximo de 594 mg/dl (TABLA 70) para este grupo. En todos los casos estuvo asociada a niveles disminuidos de albúmina sérica y su causa podría ser el mantenimiento de la presión oncótica de la sangre(6, 366). Aunque el valor medio de sodio plasmático (TABLA 70) fue similar al del grupo control (TABLA 10), encontramos 5 animales con hiponatremia no relacionada con esta enfermedad. Se ha descrito la aparición de una pseudohiponatremia asociada al uso de espectrofotometría de llama para la determinación de sodio y a hiperproteinemia(107) que explicaría este hallazgo, ya que en nuestro caso ambos condicionantes estuvieron presentes. La concentración media de potasio plasmático (TABLA 70) también fue similar a la del grupo control (TABLA 10) aunque en los perros N°51 y 67 se observó hipokalemia (3,20 y 2,60 mEq/l, respectivamente) y en los N°50 y 57 hiperkalemia (6,10 y 6,50 mEq/l, respectivamente). La hipokalemia manifestada por los dos primeros parece deberse a la gastroenteritis urémica grave y a la poliuria marcada que presentaron (ambos tenían fallo renal), pues se ha descrito que las causas más comunes de la disminución del potasio plasmático son las pérdidas por - 205 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis vómitos, diarreas y por orina en casos de fallo renal poliúrico(415). La excreción fraccional de potasio (EF K) puede ayudar a determinar el origen de la pérdida de potasio. Así, una EF K < 6% se relaciona principalmente con pérdidas gastrointestinales, mientras que una EF K > 6% se asocia con pérdidas urinarias(107). En el caso de estos dos animales las EF K fueron 39 y 206, respectivamente. La hiperkalemia observada en el perro N°50 se atribuye a la acidosis consecuente al fallo renal crónico(415) que presentó, mientras que en el perro N°57 y una vez descartadas todas sus posibles causas, el aumento de potasio plasmático se atribuye al uso de heparina sódica, en lugar de heparina de litio, como anticoagulante en la extracción de la sangre(107). Los hallazgos laboratoriales más comunes en la analítica sanguínea de perros con leishmaniosis son hiperproteinemia e hipoalbuminemia(76, 145). La primera de ellas es reflejo de la hiperglobulinemia que provoca la respuesta inmune, mientras que la segunda es el resultado, fundamentalmente, de la proteinuria que conlleva el daño renal que produce. En nuestro estudio observamos diferencia significativa entre los valores medios de la concentración de proteínas totales, albúmina sérica y cociente albúmina-globulina (A/G) de este grupo y el control (TABLA 69). El promedio de las proteínas totales séricas en estos animales fue el más elevado de todas las patologías estudiadas, con un rango de valores situados entre 5,40 g/dl y 14 g/dl (TABLA 70). De hecho, el 73% de los casos manifestaron hiperproteinemia y, de éstos, sólo el 44% mostró algún grado de deshidratación clínica, representada por presencia del pliegue de piel, hundimiento ocular y sequedad de mucosas. El valor hematocrito, en este proceso, no es un parámetro muy útil para valorar el estado de hidratación del animal pues la leishmaniosis se caracteriza por una anemia normocítica y normocrómica(76, 219) , que hemos apreciado en nuestro estudio. Así, el aumento del hematocrito por deshidratación se enmascara con la disminución del recuento de eritrocitos por la anemia. En cualquier - 206 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis caso, ninguno de los animales mostró un hematocrito superior al 43% (TABLA 64). La leishmaniosis se caracteriza también por una proteinuria elevada, con la consecuente pérdida de proteínas séricas por la orina y entre ellas, sobre todo, de albúmina. Fundamentalmente, ésta es la causa de la hipoalbuminemia que apareció en el 73% de los animales y, aunque el 62% de los perros que mostraron hipoalbuminemia presentaron valores < 2 g/dl de albúmina, sólo en un caso se observó la aparición de edema como complicación derivada de esto. Otros hechos que pudieron contribuir a la hipoalbuminemia fueron la anorexia presente en el 77% de los perros, la diarrea consecuencia de la enterocolitis urémica (14%) (TABLA 61) con la consiguiente malaabsorción, y el desvío de la síntesis hepática de albúmina hacia la producción de proteínas propias de la inflamación(62, 121). Ninguno de los animales mostró indicios de insuficiencia hepática crónica, secuestro de líquido en cavidades corporales o pérdida elevada de sangre que, según lo descrito por algunos autores(407), pudieran colaborar en la aparición de hipoalbuminemia. El valor medio del cociente albúmina-globulina (A/G) fue también el más bajo de todos los procesos que engloba nuestro estudio, con un valor mínimo de 0,13 (TABLA 70). Es un hallazgo lógico en esta enfermedad ya que, como se ha comentado anteriormente, la concentración de albúmina en los animales que padecen leishmaniosis es muy baja y la de globulinas muy elevada. IV.6.3.- Urianálisis IV.6.3.1.- Examen físico En el examen de la orina en este grupo observamos color oscuro y olor fuerte en los perros numerados como 54, 61 y 67 (TABLA 71). En los dos primeros se atribuye a una densidad urinaria alta (1046 y 1038, respectivamente), mientras que en el perro N°67, con una densidad de la orina de 1027, el color oscuro se asocia con - 207 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis bilirrubinuria. En este animal, y mediante tira reactiva, la cuantificación de bilirrubina en orina dio un resultado superior a “+++” (TABLA 80) hecho que se acompañó de una concentración de bilirrubina total en sangre de 3,40 mg/dl. En los animales N°47, 48 y 65 se observó un aspecto de la orina muy claro (TABLA 71), atribuible a la isostenuria que mostraron (1012, 1017 y 1013). Los perros N°50, 61 y 67 presentaron una orina de aspecto turbio (TABLA 71) asociado al alto contenido en elementos celulares, eritrocitos o cristales(18) que presentaron (TABLA 74). El examen físico de la orina del resto de animales no manifestó alteraciones en ninguna de las características analizadas (TABLA 71). Perro Color Aspecto Olor 46 Amarillo Claro Normal 47 Amarillo Muy claro Normal 48 Amarillo Muy claro Normal 49 Amarillo Claro Normal 50 Amarillo Turbio Normal 51 Amarillo Claro Normal 52 Amarillo Claro Normal 53 Amarillo Claro Normal 54 Oscuro Claro Fuerte 55 Amarillo Claro Normal 56 Amarillo Claro Normal 57 Amarillo Claro Normal 58 Amarillo Claro Normal 59 Amarillo Claro Normal 60 Amarillo Claro Normal 61 Oscuro Turbio Fuerte - 208 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis 62 Amarillo Claro Normal 63 Amarillo Claro Fuerte 64 Amarillo Claro Normal 65 Amarillo Muy claro Normal 66 Amarillo Claro Normal 67 Oscuro Turbio Fuerte TABLA 71: examen físico de la orina del grupo con leishmaniosis. IV.6.3.2.- Densidad Los valores individuales de la densidad se situaron en un rango comprendido entre 1012 y 1046 (TABLA 72), aunque el valor medio obtenido mostró diferencia estadística respecto al grupo control (TABLA 73), a diferencia de lo descrito por otros autores(300). El 41% de los perros mostró isostenuria asociada, en todos los casos, a azotemia de moderada a grave (valores de urea de 118 mg/dl a 364 mg/dl y de creatinina de 2,70 mg/dl a 9,70 mg/dl). Normalmente, la capacidad de concentrar la orina desaparece antes que la de diluirla, hecho que ocurre cuando se pierden dos tercios de la funcionalidad renal(72). A diferencia del grupo de las piometras, en ningún caso se observó hipostenuria. Densidad Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. 1021 8 1046 1012 TABLA 72: valores de la densidad de la orina del grupo con leishmaniosis. - 209 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis Densidad CONTROL LEISHMANIOSIS 1033 ± 11 1021 ± 8 TABLA 73: media ± desviación estándar de la densidad de los grupos control y con leishmaniosis (p < 0,001). IV.6.3.3.- Sedimento urinario El sedimento urinario del grupo con leishmaniosis presentó células escamosas en diferente cantidad (TABLA 74), atribuible su presencia a contaminación procedente de uretra o vagina(72) y provocada por el sondaje vesical realizado en la extracción de orina. El número de células de transición, tubulares, glóbulos blancos y cristales observado en cada orina (TABLA 74) no reviste significación clínica, pues el sedimento de perros sanos puede contener un pequeño número de estas células sin llevar asociada ninguna patología(297). Por el contrario, cabe destacar el elevado número de eritrocitos (TABLA 74) observado en este grupo y que se puede asociar a la patogénesis de la enfermedad, con afectación fundamentalmente renal. No obstante, según los resultados obtenidos, no podemos correlacionar la hematuria microscópica con las alteraciones clínicas y analíticas encontradas y, por tanto, con el daño renal. En el perro N°60 se observó un único cilindro granular (TABLA 74). El hallazgo de un número significativo de cilindros en el sedimento indica daño tubular, aunque su ausencia no descarta una enfermedad tubular activa(251). Ninguno de los perros, como se observa en la TABLA 74, mostró bacteriuria. - 210 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis Perro Céls. escam.Céls. transic Céls. tubul. Glób. rojosGlób. blancos Cilindros Cristales Bacterias 46 — — 4/c 12/c 5/c — — — 47 1/c — 3/c 4/c 3/c — — — 48 — — — Incontables — — — — 49 2/c 1/c — 2/c 1/c — 1 estruvita/6c — 50 — 2/c 1/c 15/c 2/c — — — 51 — 1/c — 4/c — — 1 amorfo/5c — 52 — 1/3c — 8/c 2/c — 1 estruvita/3c — 53 1/2c 1/4c — Incontables — — — — 54 1/5c — 1/8c 4/c 1/c — — — 55 1/c — — 2/c — — 1 estruvita/4c — 56 — 1/2c 1/c 7/c 1/c — 1 amorfo/2c — 57 — — — 5/c 2/c — — — 58 2/c — 4/c 7/c 3/c — 1 amorfo/4c — 59 — 2/c — 2/c — — — — 60 1/6c 1/4c — 20/c — 61 1/5c 3/c — 30/c — — 1 amorfo/2c — 62 1/3c 2/c — 14/c — — 1 amorfo/3c — 63 1/2c — — — — — — — 64 1/2c 1/3c — — — — 1 amorfo/5c — 65 — 1/3c — Incontables — — 1 amorfo/8c — 66 3/c 2/c — 8/c — — — — 67 1/2c — 5/c Incontables — — — — 1 granular 1 amorfo/3c — TABLA 74: sedimento urinario del grupo con leishmaniosis (40x). Recuento por campo (/c) de células escamosas, células de transición, células tubulares, glóbulos rojos, glóbulos blancos, cilindros, cristales y bacterias. - 211 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis IV.6.3.4.- Examen químico IV.6.3.4.1.- Proteínas IV.6.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de proteínas La proteinuria es uno de los hallazgos laboratoriales más comunes en animales con leishmaniosis(219). En nuestro estudio, los valores medios del cociente U P/C y la concentración de proteína en orina observados en este grupo (TABLA 75) fueron los más altos de todos los grupos estudiados (TABLA 76). Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. U P/C 5,45 6,95 27,48 0,38 Proteínas 154,91 142,44 493,17 27,36 TABLA 75: valores del cociente proteína/creatinina (U P/C) y la concentración de proteínas (mg/dl) en orina del grupo con leishmaniosis. Control Piometra Leptospirosis Leishmaniosis U P/C 0,51 ± 0,26 1,03 ± 0,97 2,59 ± 2,79 5,45 ± 6,95 Proteínas 53,18 ± 25,01 40,12 ± 34,44 94,79 ± 81,89 154,91 ± 142,44 TABLA 76: media ± desviación estándar del cociente proteína/creatinina (U P/C) y la concentración de proteína (mg/dl) en orina de los grupos control, con piometra, leptospirosis y leishmaniosis. - 212 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis Se ha demostrado que existe buena correlación entre la excreción de proteína en 24 horas y el U P/C obtenido en una sola muestra(10, 17, 408) . En este sentido, se encontró diferencia estadística (p < 0,01) entre el valor medio del U P/C de este grupo y el control (TABLA 76), con un 73% de los animales con valores superiores a lo considerado normal para la especie canina. Los resultados se situaron en un rango comprendido entre 0,38 y 27,48 (TABLA 75) y, generalmente, su incremento llevó asociado otras alteraciones analíticas como azotemia, hiperfosfatemia, etc. Tres de los casos que mostraron valores normales de U P/C (N°51, 53 y 56) corresponden a animales con fallo renal, los tres son machos y presentan los valores más bajos de proteína en orina de todo el grupo (27,36; 27,49 y 30,02 mg/dl, respectivamente). Por tanto, este hecho puede explicarse por las mismas razones que en el grupo de leptospirosis. De todas formas, y en líneas generales, el cociente U P/C constituye un índice excelente de la filtración glomerular en animales afectados por esta enfermedad(300). IV.6.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting La proteinuria que se presenta en la leishmaniosis canina puede ser de moderada a grave, y se desarrolla como consecuencia de una glomerulonefritis por depósito de complejos inmunes(76) y de la instauración de una nefritis intersticial(219, 310, 355) . La alteración renal en el grupo de perros con leishmaniosis es evidente, y se puede comprobar tanto por los resultados obtenidos en el estudio analítico como en los del estudio anatomopatológico. En estos animales, cuando acuden a la consulta veterinaria, es muy frecuente que se haya instaurado anemia (TABLA 65), azotemia, hiperfosfatemia, hipoalbuminemia (TABLA 69), isostenuria (TABLA 73) y aumento del cociente U P/C (TABLA 76). Todo ello conlleva la aparición de un patrón - 213 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis electroforético mixto caracterizado por la presencia de proteínas de alto y bajo peso molecular(158, 250, 297, 348), como se puede observar en los perros de este grupo y que a continuación se procede a desarrollar. En la electroforesis de la orina de perros con leishmaniosis hemos obtenido hasta un total de 11 bandas diferentes siendo, por tanto, el grupo estudiado que presenta mayor número de bandas (FIGURAS 26 y 27). FIGURA 26: lectura densitométrica de la electroforesis de orina de un perro con leishmaniosis (11 bandas). - 214 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis FIGURA 27: electroforesis del grupo con leishmaniosis. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina del grupo control, calles 2-9 = orinas del grupo con leishmaniosis. El patrón electroforético de la orina en este grupo es marcadamente diferente al descrito en los perros sanos, tal y como lo demuestra el estudio estadístico realizado de las frecuencias de presentación de las distintas bandas, en el que se observa una diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos (p < 0,001). Si se compara este esquema electroforético con el de los distintos grupos analizados (TABLA 77), se observa claramente que los perros con leishmaniosis pierden proteínas de diferente peso molecular (FIGURA 27), aunque es evidente que las que aparecen en mayor número de animales son las de peso molecular medio y bajo, localizadas en los intervalos comprendidos entre 70-80 kDa y 10-60 kDa (TABLA 77). - 215 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis Intervalo Control Piometra Leptospirosis Leishmaniosis — — — 5% 140-150 130-140 — — — 9% 120-130 — 7% — — 110-120 — — — 14% 100-110 100% 80% 80% 82% 80-90 — 67% 60% 45% 70-80 95% 93% 100% 100% 50-60 — 47% 50% 100% 40-50 — 47% 40% 86% 30-40 30% 73% 80% 100% 20-30 25% 67% 80% 95% 10-20 50% 67% 100% 95% TABLA 77: frecuencias de presentación de las bandas observadas en los grupos control, piometra, leptospirosis y leishmaniosis. Se observan también proteínas de alto peso molecular (80-150 kDa), aunque en menor número de animales, como consecuencia quizás del diferente grado de daño renal entre animales de forma individual (TABLA 77). En la TABLA 78 se detalla el valor medio del área ocupada por cada banda, junto con la media de su peso molecular y la cantidad media de proteína. Al realizar el análisis estadístico del área que ocupó cada banda y, por tanto, de la cantidad de proteína/banda, sólo se observó diferencia estadísticamente significativa en los intervalos comprendidos entre 100-110 kDa y 10-20 kDa, respecto al grupo control en los dos intervalos y con la leptospirosis en el de 10-20 kDa (TABLA 79). Se observó una disminución de este valor en la leishmaniosis, respecto al resto de grupos (TABLA 79). Esto no indica necesariamente que la eliminación de proteínas localizadas en estos - 216 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis intervalos sea menor, puesto que los valores obtenidos son referidos a una cantidad fija de proteína urinaria (5 µg) y lo único que cambian son las proporciones. Media ± SD Media ± SD Prot. (µ µg) Área (%) Intervalo Pm (kDa) N° perros N = 22 Media ± SD Pm (kDa) 140-150 1 143,00 0,03 0,50 130-140 2 132,00 ± 0,00 0,03 ± 0,01 0,50 ± 0,14 120-130 0 — — — 110-120 3 113,67 ± 1,53 0,03 ± 0,02 0,50 ± 0,30 *100-110 18 102,01 ± 4,46 0,11 ± 0,15 2,21 ± 2,95 90-100 0 — — — 80-90 10 83,65 ± 1,34 0,11 ± 0,06 2,10 ± 1,25 *70-80 22 71,32 ± 5,32 1,96 ± 1,04 39,20 ± 20,82 60-70 0 — — — 50-60 22 54,43 ± 1,79 0,98 ± 0,87 19,65 ± 17,43 40-50 19 43,89 ± 1,53 0,80 ± 0,58 16,07 ± 11,54 *30-40 22 35,13 ± 1,15 0,31 ± 0,23 6,27 ± 4,64 *20-30 21 26,12 ± 1,63 0,66 ± 0,33 13,15 ± 6,59 *10-20 21 16,05 ± 1,50 0,29 ± 0,22 5,81 ± 4,35 * Bandas observadas también en el grupo control. TABLA 78: media ± desviación estándar del peso molecular (Pm), cantidad de proteína (Prot.) y área de las bandas que aparecen en la orina del grupo con leishmaniosis, con la excepción del intervalo de 140-150 kDa, en el que sólo se observó una banda en un perro. - 217 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis Intervalo Pm (kDa) CONTROL (N = 20) PIOMETRA (N = 15) LEPTOSPIROSIS (N = 10) LEISHMANIOSIS (N = 22) 100-110 1,73 ± 1,22 A 0,86 ± 1,14 AB 0,34 ± 0,30 B 0,11 ± 0,15 B 10-20 2,41 ± 0,86 A 0,65 ± 0,48 B 1,68 ± 1,41 A 0,29 ± 0,22 B TABLA 79: media ± desviación estándar de la cantidad de proteína (µg/banda) de los grupos control, piometra, leptospirosis y leishmaniosis. Letras diferentes en el mismo rango de peso molecular implican diferencias significativas (p < 0,05). Las bandas observadas con mayor frecuencia fueron las de peso molecular bajo (TABLA 77), entre las que se encuentran las localizadas en los intervalos de 20-30 kDa (26,12 ± 1,63 kDa) y 40-50 kDa (43,89 ± 1,53 kDa), encontradas en 21 y 19 animales respectivamente (TABLA 78). Al igual que en los grupos anteriores, en estos intervalos están incluidas las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas. Al realizar el Western blotting con el fin de comprobar la existencia de pérdida de inmunoglobulinas vía renal, y contribuir por lo tanto a la confirmación de la lesión del riñón, se obtuvo un resultado positivo en un porcentaje elevado de animales (68%). Con ambos anticuerpos se observó también una señal inespecífica en la banda localizada en el intervalo de 70-80 kDa en la electroforesis y en dos bandas del marcador de pesos moleculares (FIGURAS 28 y 29), discutidas en los grupos anteriores. Al utilizar anti-IgG se observaron dos bandas muy intensas en 15 perros de los 22 que forman este grupo. De estos 15 animales, 13 presentaron fallo renal con alteraciones analíticas tan acusadas que explicarían el paso de IgG a través de la barrera de filtración glomerular. Los dos restantes (N°61 y 64) no mostraron fallo renal, aunque sus U P/C fueron los más elevados de los perros sin fallo renal de este grupo (4,71 en el perro N°61 y 4,66 en el N°64) ya que el resto de perros sin fallo renal y que no eliminaron IgG en sus orinas, presentaron un U P/C comprendido entre 0,38 y 1,61. Por tanto, se observa que, aunque los resultados de la bioquímica plasmática son similares en estos animales, hay una clara diferencia en la eliminación de proteínas por orina cuantificada por el U P/C, que - 218 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis implica una mayor lesión glomerular y la eliminación de IgG. La banda de mayor peso molecular (43,89 ± 1,53 kDa) se observó, en todos los casos, en el intervalo de 40-50 kDa, correspondiéndose con las cadenas pesadas de IgG (FIGURA 28). La de peso molecular más bajo (26,12 ± 1,63 kDa), localizada también en todos los animales en el intervalo de 20-30 kDa, se asocia a las cadenas ligeras de IgG (FIGURA 28). En tres animales sólo se observó la banda de peso molecular relacionado con las cadenas pesadas de inmunoglobulinas (FIGURA 28) por lo que, al no evidenciarse sus respectivas cadenas ligeras, puede corresponder a uniones inespecíficas del anticuerpo. FIGURA 28: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo con leishmaniosis al utilizar anti-IgG. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo control, calles 2-9 = ocho orinas grupo con leishmaniosis. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos de 70-80 kDa (calle 1) y 40-50 kDa (calles 2, 4 y 9). Se observan cadenas pesadas (cp) y ligeras (cl) de IgG (calles 3, 5, 6, 7 y 8). Cuando el anticuerpo utilizado fue anti-IgA, se observaron dos bandas en 12 perros; todos ellos presentaron también IgG en sus orinas. Por tanto, un 80% de los animales que eliminaron IgG excretaban también IgA. La banda de mayor peso molecular se situó en el intervalo de 40-50 kDa (FIGURA 29) y se corresponde con cadenas pesadas de IgA, mientras que la localizada en el intervalo de 20-30 kDa - 219 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis (FIGURA 29) se asocia a cadenas ligeras de esta inmunoglobulina. La señal observada fue mucho menos intensa y, como se ha comentado, se visualizó en menor número de animales que la IgG. No se debe olvidar que esta inmunoglobulina tiene menor concentración en el plasma y que su peso molecular es mayor(383). Todo esto favorece que su eliminación por el riñón, aunque exista un fuerte daño glomerular, sea menor. En dos orinas sólo se observó la banda de peso molecular relacionado con las cadenas ligeras de inmunoglobulinas (FIGURA 29). Al no observarse sus respectivas cadenas pesadas, pueden atribuirse a uniones inespecíficas del anticuerpo. FIGURA 29: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo con leishmaniosis al utilizar anti-IgA. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo control, calles 2-9 = 8 orinas grupo con leishmaniosis. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos de 70-80 kDa (calle 1) y 20-30 kDa (calles 2 y 9). Se observan cadenas pesadas (cp) y ligeras (cl) de IgA (calles 3, 5, 6, 7 y 8). Al comparar el número de animales que presentaron estas bandas en la electroforesis (TABLA 78) y en el Western blotting, se observa que, en ambos intervalos y en el primer caso, este número es superior. Esto demuestra la aparición en la orina de proteínas de bajo peso molecular, diferentes a las inmunoglobulinas G y A. - 220 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis En la electroforesis de este grupo también se visualizaron, en todos los perros (TABLA 77), bandas en los intervalos de 70-80 kDa, 50-60 kDa y 30-40 kDa (FIGURA 30), con pesos moleculares de 71,32 ± 5,32; 54,43 ± 1,79 y 35,13 ± 1,15 kDa respectivamente (TABLA 78). FIGURA 30: bandas observadas en los intervalos de 70-80 kDa, 50-60 kDa y 30-40 kDa en la electroforesis de la orina de perros con leishmaniosis. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo control, calles 2-9 = ocho orinas grupo con leishmaniosis. En intervalos de peso molecular mayor la frecuencia de presentación de las distintas bandas disminuyó en gran medida. Sólo la banda localizada en el intervalo de 100-110 kDa mostró una presentación elevada (82%), al igual que ocurrió en los perros sanos (100%), con piometra (80%) y con leptospirosis (80%) estudiados (TABLA 77). En los intervalos de 110-120 kDa y de 130-150 kDa se visualizó una banda en 6 animales: N°46, 58 y 62 (113,67 ± 1,53 kDa); N°55 y 67 (132,00 ± 0,00 kDa) y N°66 (143,00 kDa) (FIGURA 31). - 221 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis FIGURA 31: bandas observadas en los intervalos de 130-150 kDa (calles 3, 4 y 6) y 110-120 kDa (calles 3, 4 y 6) en la electroforesis de orina de los perros con leishmaniosis. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo control, calles 2-7 = seis orinas grupo con leishmaniosis. De estos 6 perros, sólo uno (N°55) no mostró en el Western blotting cadenas ligeras y pesadas de IgG y su analítica presentó como única alteración evidente hiperfosfatemia (6,90 mg/dl). El resto de los animales (N°46, 58, 62, 66 y 67) mostraron alteraciones muy acusadas: azotemia grave (urea desde 118 mg/dl a 384 mg/dl y creatinina desde 2,80 mg/dl a 7,70 mg/dl), hiperfosfatemia (fósforo entre 14,10 mg/dl y 22,70 mg/dl), hipercolesterolemia (colesterol desde 335 mg/dl a 594 mg/dl), hipoalbuminemia (albúmina entre 1,60 g/dl y 2,50 mg/dl), disminución del cociente albúmina/globulina (entre 0,20 y 0,45), aumento del cociente P/C en orina (entre 2,32 y 14,42) y, por último, aumento en las excreciones fraccionales de sodio (entre 4% y 24%), potasio (entre 85% y 325%) y fósforo (55% sólo en el N°58). Según los resultados obtenidos, la electroforesis de orina de los animales con leishmaniosis demuestra la presencia de un patrón proteico mixto, con presencia de proteínas de bajo y alto peso molecular (FIGURA 27). Así, las proteínas de bajo peso molecular, es decir aquellas de peso molecular inferior a la albúmina según Biewenga et al.(32), constituyen el 57,9% de todas las proteínas, y el resto se reparte entre proteínas de medio-alto peso molecular. Estos resultados muestran la existencia de un importante daño a nivel glomerular y tubular, aunque en este último caso se debe tener presente - 222 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis que las condiciones del método empleado, desnaturalizantes y sin el uso de inhibidores de proteasas, pueden provocar la aparición en la electroforesis de proteínas de bajo peso molecular (como las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas) o fragmentos de otras proteínas que, en su estado nativo y en el organismo, cuentan con un peso molecular mayor. Los resultados observados en el Western blotting, sí demuestran claramente que el daño glomerular existe, ya que la proporción de cadenas pesadas y ligeras observadas en este grupo es la más elevada de los tres procesos estudiados, tanto para la inmunoglobulina G (68%), como en menor medida para la A (55%). IV.6.3.4.2.- Otras determinaciones El análisis del contenido en glucosa, cetonas, urobilinógeno y nitritos de la orina, en los perros con leishmaniosis, no reveló importancia clínica (TABLA 80). Al igual que la determinación de bilirrubina que sólo fue significativa en el perro N°67 (TABLA 80) y que, como se ha comentado anteriormente, se relaciona con una bilirrubinemia de 3,40 mg/dl. La cuantificación de sangre oculta mostró resultado positivo en grado variable (TABLA 80) en un 86% de los casos, y se correlaciona con lo observado en el sedimento urinario (TABLA 74). El pH urinario de todos los perros (TABLA 80) se encontró dentro del rango establecido como fisiológico para esta especie(18). En la determinación del contenido de proteínas, 18 muestras presentaron “++” o más de “++” en la orina. De las 4 orinas que mostraron “+”, 2 se correspondieron con valores de U P/C normales y las dos restantes, con U P/C levemente aumentados (0,76 y 1,61). La interpretación de estos tests debe realizarse conjuntamente con la densidad de la orina porque una reacción positiva es más significativa en una orina diluida que en una concentrada. Como se ha comentado anteriormente, el 41% de los animales - 223 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis mostraron una orina isostenúrica con la interferencia que esto supone en la cuantificación de la proteinuria. Estos tests dan una intensidad de color máxima para todas las concentraciones proteicas iguales o superiores a 1 g/dl y, por tanto, no son útiles para valorar la magnitud de la proteinuria por encima de este valor(106). Perro Glucosa Bilirrubina Cetonas Sangre pH Urobilinóg. Nitritos Proteínas 46 - + - ++ 6,5 Normal - ++++ 47 - - - + 6 Normal - ++++ 48 - - - Normal - ++++ 49 - - - + 6 Normal - +++ 50 - - - +++ 6 Normal - ++++ 51 - - - + 6 Normal - + 52 - - - ++ 6,5 Normal - ++ 53 - - - ++++ 6 Normal - ++ 54 - + - - 6 Normal - + 55 - + - + 6,5 Normal - + 56 - - - ++ 6 Normal - ++ 57 - + - ++ 7,5 Normal - + 58 - - - ++ 6 Normal - +++ 59 - - - + 6,5 Normal - ++++ 60 - - - +++ 6,5 Normal - ++++ 61 - + - +++ 7 Normal - ++++ 62 - - - ++ 7 Normal - ++++ 63 - - - - 6 Normal - ++++ 64 - + - - 8 Normal - +++ 65 - - - Normal - +++ 66 - - - Normal - +++ 67 - >+++ - Normal - ++++ ++++ 6,5 ++++ 7,5 ++ 6 ++++ 6,5 TABLA 80: datos analíticos de la orina del grupo de perros con leishmaniosis. IV.6.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo - 224 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis En la leishmaniosis, los complejos inmunes provocan una reacción inflamatoria secundaria(202) y la disminución de la perfusión de los capilares peritubulares conduce a isquemia tubular y del tejido intersticial(350). Si se tiene en cuenta que la excreción fraccional de los distintos electrolitos refleja la función tubular(135), los altos valores obtenidos en las excreciones fraccionales (TABLA 81) y la consecuente diferencia estadística que se ha encontrado entre éstos y el grupo control (TABLA 82), parecen consecuencia lógica de la enfermedad. Los valores individuales de la EF Na estuvieron en un rango comprendido entre 0,10 y 24,30 (TABLA 81), observándose un 73% de los mismos por encima de lo considerado normal para el perro. En el caso de la EF K, los resultados oscilaron entre 11 y 413 (TABLA 81) y el porcentaje que mostró valores altos se situó en un 82%. En ambos casos, estos resultados se relacionaron, en líneas generales, con el resto de parámetros analíticos evaluados. La EF P (TABLA 81) requiere mención aparte puesto que, en este caso, el porcentaje de animales que mostraron valores altos fue muy inferior, concretamente, un 41%. Este hecho parece relacionarse con la hiperfosfatemia que, en un 68%, manifestaron los perros de este grupo y, como ésta, el menor número de animales con un EF P alto, es consecuencia de la disminución de la filtración glomerular y, por tanto, de la excreción de fósforo. Parámetro Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín. EF Na 5,03 5,76 24,30 0,10 EF K 125,23 112,67 413,00 11,00 EF P 49,68 40,96 157,00 3,00 TABLA 81: valores de la excreción fraccional de sodio (EF Na), potasio (EF K) y fósforo (EF P) del grupo con leishmaniosis. - 225 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis Parámetro CONTROL LEISHMANIOSIS Significación EF (Na) 0,58 ± 0,28 5,03 ± 5,76 p < 0,05 EF (K) 17,17 ± 7,09 125,23 ± 112,67 p < 0,001 EF (P) 20,13 ± 12,67 49,68 ± 40,96 p < 0,01 TABLA 82: media ± desviación estándar de las excreciones fraccionales de sodio, potasio y fósforo de los grupos control y con leishmaniosis. IV.6.5.- Anatomía patológica Disponemos del estudio efectuado a las muestras de riñón de tres perros, afectados todos de leishmaniosis, y que fueron eutanasiados a petición del propietario. Perro N°47 Las alteraciones morfológicas de este riñón se circunscriben fundamentalmente a nivel cortical, no observándose cambios significativos en la médula renal. En los glomérulos se visualiza un aumento de la celularidad así como un incremento de la matriz mesangial (FIGURA 32). - 226 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis FIGURA 32: glomerulonefritis mesangioproliferativa en un perro con leishmaniosis. (Azul de Toluidina, x 40). Otro cambio que, aún no siendo constante, se repite con cierta asiduidad es la fibrosis periglomerular, apreciada en un gran número de corpúsculos renales. A nivel del intersticio se observa un infiltrado celular constituido por células mononucleares, fundamentalmente linfocitos y células plasmáticas. Los túbulos corticales manifiestan cambios degenerativos que son más intensos cuanto mayor es la nefritis intersticial. Se aprecia degeneración vacuolar e hidrópica (FIGURA 33), con destrucción total de las células tubulares en los procesos más lesivos, así como atrofia tubular y glomerular por compresión del infiltrado mononuclear. - 227 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis FIGURA 33: degeneración vacuolar e hidrópica de los túbulos renales en un perro con leishmaniosis. (Azul de Toluidina, x 100). El diagnóstico anatomopatológico fue glomerulonefritis mesangioproliferativa crónica y nefritis intersticial. Perro N°53 Las manifestaciones histopatológicas observadas en los riñones de este animal se han caracterizado por la presencia de abundantes dilataciones quísticas a nivel cortical, que afectan tanto a túbulos como a corpúsculos renales y en cuyo interior aparecen, en ocasiones, restos celulares y sales de calcio. Algunos glomérulos, que en su mayoría se encuentran atróficos, muestran hialinización y áreas de fibrosis (FIGURA 34). - 228 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis FIGURA 34: dilataciones quísticas de corpúsculos renales y túbulos, atrofia glomerular, calcificaciones de la cápsula de Bowman y membrana basal tubular e infiltrado inflamatorio intersticial en un perro con leishmaniosis. (Hematoxilina-eosina, x 100). Tanto en la cara parietal de la cápsula de Bowman como en la membrana basal de los túbulos se describen áreas de calcificación, que son también visualizadas a nivel medular (FIGURA 35). El intersticio de la cortical contiene un intenso infiltrado inflamatorio constituido, fundamentalmente, por células plasmáticas, linfocitos y, en menor cantidad, macrófagos. - 229 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis FIGURA 35: depósitos de sales de calcio peritubulares y tubulares e infiltrado inflamatorio mononuclear en un perro con leishmaniosis. (Hematoxilina-eosina, x 200). El diagnóstico anatomopatológico fue glomerulonefritis esclerótica crónica con calcificaciones glomerulares, nefritis intersticial y presencia de abundantes microquistes. Perro N°65 Las alteraciones histopatológicas más llamativas en este animal se observan a nivel de la corteza renal. En los glomérulos se aprecia la presencia de sustancia hialina y algunos corpúsculos renales desarrollan fibrosis y atrofia (FIGURA 36). La mayoría de los túbulos están degenerados, carecen de núcleos y en sus luces aparecen algunos hematíes, así como una gran cantidad de sustancia de naturaleza proteica, identificada - 230 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis también en túbulos medulares. El intersticio está ocupado por un infiltrado inflamatorio integrado por linfocitos y, en menor cantidad, células plasmáticas. FIGURA 36: fibrosis periglomerular con áreas de hialinización en el glómerulo. Infiltrado inflamatorio intersticial linfo-plasmocitario con cantidad discreta de pigmento ambarino (hemosiderina) y presencia de hematíes en el espacio urinario y en la luz tubular. (Hematoxilina-eosina, x 200). El diagnóstico anatomopatológico fue glomerulonefritis esclerótica crónica, nefritis intersticial y abundante presencia de cilindros hialinos. Las lesiones renales se correspondieron con las descritas por diversos autores en la leishmaniosis(254, 288, 310) y son las responsables de la eliminación de proteínas de alto y bajo peso molecular, así como de IgG e IgA, observada en los tres perros y según se ha descrito previamente. - 231 - IV. Resultados y discusión: leishmaniosis Los tres animales presentaron un fallo renal crónico importante, con orina isostenúrica, aumento de urea y creatinina en plasma, hiperfosfatemia y, los dos últimos, hipocalcemia. Además, los tres perros presentaron una concentración de proteínas en orina y un valor del U P/C sensiblemente inferiores a los valores medios obtenidos en el grupo de perros con leishmaniosis para estos parámetros. Concretamente, la mayor concentración de proteínas en orina se observó en el perro N°47, con 46,56 mg/dl, mientras la media del grupo fue de 154 ± 142,44 mg/dl. El mayor U P/C correspondió al perro N°65 (1,80), también inferior a la media del grupo (5,45 ± 6,95). Esto concuerda con los autores(67, 195, 325) que describen una reducción paulatina de la proteinuria a medida que avanza la lesión glomerular. - 232 - V. CONCLUSIONES V. Conclusiones 1.- El patrón electroforético de la orina de los perros sanos se caracteriza por presentar, en todos los casos, dos bandas tenues con pesos moleculares en torno a los 105,00 kDa y 73,09 kDa. En algunos perros aparecen, además, tres bandas de bajo peso molecular situadas en el intervalo de 10-40 kDa. En ningún caso se detectó la eliminación de IgG y/o IgA. 2.- El grupo de perras con piometra, presentó la menor proteinuria de todos los grupos estudiados, aunque se debe tener en cuenta que la disminución en la capacidad de concentrar la orina con la que cursa la enfermedad, interfiere en la cuantificación de dicha proteinuria. El patrón electroforético de la orina de estos animales muestra, además de las cinco bandas presentes en el grupo control, otras cuatro bandas situadas en los intervalos de pesos moleculares de 40-50 kDa, 50-60 kDa, 80-90 kDa y 120-130 kDa. Dicho patrón caracteriza la existencia de una lesión fundamentalmente glomerular, puesto que las proteínas de medio-alto peso molecular constituyen el 58,9% de todas las proteínas separadas mediante electroforesis. Este grupo presentó la menor eliminación de inmunoglobulinas de los animales enfermos estudiados, con un 27% para IgG y un 7% para IgA. 3.- El patrón electroforético de la orina de perros con leptospirosis presenta, además de las cinco bandas observadas en el grupo control, tres bandas localizadas en los intervalos de 40-50 kDa, 50-60 kDa y 80-90 kDa. Dicho patrón electroforético puede definirse como típicamente tubular ya que en este grupo, las proteínas de bajo peso molecular constituyen el 70,2% de todas las proteínas separadas mediante electroforesis. En el grupo de perros con leptospirosis, un 30% de los animales eliminaron IgG en la orina y un 20% IgA. - 234 - V. Conclusiones 4.- La proteinuria observada en el grupo de perros con leishmaniosis fue la mayor de todos los grupos estudiados. Su patrón electroforético se caracteriza por la presencia de las ocho bandas observadas en el grupo con leptospirosis y, además, por la aparición de tres bandas localizadas en los intervalos de 110-120 kDa, 130-140 kDa y 140-150 kDa. La electroforesis de orina de estos animales demuestra la presencia de un patrón proteico mixto, con la eliminación de un 57,9% de proteínas de bajo peso molecular y un 42,1% de medio-alto peso molecular. El grupo de perros con leishmaniosis presentó la mayor eliminación de inmunoglobulinas de los animales estudiados, con un 68% para IgG y un 55% para IgA. - 235 - VI. RESUMEN VI. Resumen En el presente trabajo se ha realizado un estudio de la proteinuria en cuatro grupos de perros adultos: un grupo control formado por 20 animales sanos y tres grupos en los que se diagnosticaron distintas enfermedades que cursan con daño renal. Así, se han estudiado 15 perras con piometra, 10 perros con leptospirosis y 22 perros con leishmaniosis. A todos ellos, además de las pruebas pertinentes para diagnosticar las distintas patologías, se les realizó la correspondiente anamnesis y exploración física, así como analítica sanguínea y de orina. En estas últimas muestras, además de determinar la concentración de proteínas y el cociente proteína/creatinina en la orina (U P/C), se llevaron a cabo electroforesis en SDS-PAGE y Western blotting utilizando como anticuerpos anti-IgG y anti-IgA. En el grupo control se obtuvo una concentración media de proteínas en orina de 53,18 ± 25,01 mg/dl y un U P/C de 0,51 ± 0,26. La electroforesis de orina de este grupo mostró la presencia de hasta 5 bandas diferentes. Las mayoritarias se situaron en los intervalos de 100-110 kDa y 70-80 kDa, pues se observaron respectivamente en el 100% y en el 95% de los animales. En menor proporción aparecen, además, bandas en los siguientes intervalos: 30-40 kDa (30%), 20-30 kDa (25%) y 10-20 kDa (50%). En ningún animal se detectó IgG o IgA en la orina. En las perras con piometra la concentración media de proteínas en orina fue de 40,12 ± 34,44 mg/dl y el U P/C de 1,03 ± 0,97. En la electroforesis se evidenciaron hasta 9 bandas diferentes, 5 de las cuales coinciden con las del grupo control: intervalos de peso molecular de 100-110 kDa (80%), 70-80 kDa (93%), 30-40 kDa (73%), 20-30 kDa y 10-20 kDa (ambas en el 67% de las perras). Las bandas que no aparecieron en los animales sanos se observaron en los siguientes intervalos: 80-90 kDa (67%) y, con frecuencias de presentación mucho menores, 120-130 kDa, 50-60 kDa y 40-50 kDa. El Western blotting reveló la eliminación de IgG en 4 perras (27%), de las cuales una - 237 - VI. Resumen eliminó también IgA. El patrón electroforético de la orina en este grupo es típicamente glomerular, con un aumento de la eliminación de proteínas de medio-alto peso molecular que constituyeron el 58,9% del total. Los perros con leptospirosis presentaron una concentración media de proteínas en orina de 94,79 ± 81,89 mg/dl y un U P/C de 2,59 ± 2,79. En la electroforesis se obtuvieron hasta 8 bandas, de las que 5 coinciden con las observadas en los perros sanos: 70-80 kDa (100%), 10-20 kDa (100%, porcentaje que duplica al observado en el grupo control en este intervalo), 100-110 kDa, 30-40 kDa y 20-30 kDa (todas ellas en el 80% de las muestras). Las bandas de este grupo que no se observaron en el grupo control aparecieron en menor número de animales y se situaron en los intervalos de 8090 kDa, 50-60 kDa y 40-50 kDa. Se detectó IgG en 3 perros (30%), dos de los cuales eliminaron también IgA. Las proteínas mayoritarias en este grupo (70,2%) fueron las de bajo peso molecular, lo que indica que el patrón electroforético de la orina de estos perros es fundamentalmente tubular, hecho acorde con la nefropatía túbulo-intersticial que caracteriza a la leptospirosis. Finalmente, el grupo de perros con leishmaniosis presentó la mayor concentración media de proteínas en orina (154,91 ± 142,44 mg/dl) y el mayor U P/C (5,45 ± 6,95) de todos los grupos estudiados. También en la electroforesis se evidenció el mayor número de bandas (11). Las 5 que coinciden con el grupo control aparecen en un alto porcentaje de animales: 70-80 kDa y 30-40 kDa en el 100%, 20-30 kDa y 10-20 kDa en el 95% y 100-110 kDa en el 82%. Las 6 bandas restantes son las siguientes: 5060 kDa (100%), 40-50 kDa (86%) y, en menor número de animales las situadas en los intervalos de 140-150 kDa, 130-140 kDa, 110-120 kDa y 80-90 kDa. En 15 perros (68%) se detectó IgG; 12 de ellos eliminaron también IgA, convirtiéndose este grupo en el que eliminó inmunoglobulinas en mayor proporción. Su patrón electroforético es - 238 - VI. Resumen mixto, con el 57,9% de proteínas de bajo peso molecular y, el resto, proteínas de medioalto peso molecular. - 239 - VII. SUMMARY VII. Summary In the present work, proteinuria in four groups of adult dogs has been studied: one group of twenty healthy dogs and three groups suffering from disorders characterized by renal damage. Therefore, fifteen bitches with pyometra, ten dogs with leptospirosis and twenty-two dogs suffering from leishmaniasis have been studied. All the animals, in addition to the appropriate tests to get the diagnosis, underwent the proper anamnesis, physical examination as well as blood and urine tests. Also, in urine samples protein concentration and protein/creatinine ratio (U P/C) were determined, and sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting using anti-IgG and anti-IgA antibodies were carried out. In the control group, the average protein concentration in urine samples was 53,18 ± 25,01 mg/dl and the U P/C was 0,51 ± 0,26. The urine electrophoresis of this group showed up to five different bands. The majority of bands were located in 100-110 kDa and 70-80 kDa intervals, which were presented on 100% and 95% of the animals, respectively. Moreover, with less frequency, bands in the following intervals: 30-40 kDa (30%), 20-30 kDa (25%) and 10-20 kDa (50%) were found. It was not possible to detect IgG or IgA in any animals. In the bitches suffering from pyometra, the average protein concentration in urine samples was 40,12 ± 34,44 mg/dl and the U P/C was 1,03 ± 0,97. The urine electrophoresis of this group showed up to nine different bands, five of them coincided with the bands found in the control group: 100-110 kDa (80%), 70-80 kDa (93%), 3040 kDa (73%), 20-30 kDa and 10-20 kDa (both of them on 67% of the bitches). The bands not found in the healthy dogs were observed in the following intervals: 80-90 kDa (67%) and, with less frequency, 120-130 kDa, 50-60 kDa and 40-50 kDa. In four bitches (27%) IgG was detected, one of them eliminated IgA too. Urine electrophoretic - 241 - VII. Summary pattern in this group can be catalogued as glomerular, with more elimination of medium-high molecular weight proteins (58,9%). The group with leptospirosis showed an average protein concentration in urine of 94,79 ± 81,89 mg/dl and the U P/C was 2,59 ± 2,79. In the electrophoresis eight bands we observed. Five of them coincided with the bands found in the healthy dogs: 70-80 kDa (100%), 10-20 kDa (100%, which is double than that achieved in control group for this interval), 100-110 kDa, 30-40 kDa and 20-30 kDa (all the bands were observed in the 80% of samples). In this group, the bands which were not found in the healthy dogs, were observed in a lower number of animals and they were detected in the intervals of 80-90 kDa, 50-60 kDa y 40-50 kDa. On three dogs (30%) IgG could be detected, and two of them eliminated IgA too. In this group, the majority proteins (70,2%) had a low molecular weight and, therefore, the urine electrophoretic pattern in this group can be catalogued as tubular. This finding is in accordance with the tubulointerstitial nephropathy that characterizes leptospirosis. Finally, the group of dogs suffering from leishmaniasis showed the highest average protein concentration in urine (154,91 ± 142,44 mg/dl) and the highest U P/C (5,45 ± 6,95) among all the studied groups. Also, in the electrophoresis the highest number of bands (11) we found. The five bands that coincide with the control group were observed in a high percentage of animals: 70-80 kDa and 30-40 kDa in 100%, 2030 kDa and 10-20 kDa in 95% and, finally, 100-110 kDa in 82% of the animals. The other six bands were grouped as follows: 50-60 kDa (100%), 40-50 kDa (86%) and, in less animals, 140-150 kDa, 130-140 kDa, 110-120 kDa and 80-90 kDa. In fifteen dogs (68,2%) IgG was detected; twelve of them eliminated IgA too. Therefore, this group was which excreted immunoglobulins in the highest proportion. The electrophoretic - 242 - VII. Summary pattern of this group can be catalogued as mixed, with 57,9% of the proteins with low molecular weight and the rest medium-high. - 243 - VIII. 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