materiales y métodos - Biblioteca UNET

MATERIALES Y METODOS
4.1 Ubicación de la investigación
El trabajo de investigación se llevó a cabo en dos etapas:
•
La primera en las instalaciones de la Universidad Nacional Experimental del
Táchira; específicamente en la finca la Tuquerena ubicada en el municipio Junín
del estado Táchira, Venezuela. Dentro del galpón de explotación avícola; Donde
se realizo el compostaje de la pulpa de café.
•
La segunda fase se realizó dentro de las instalaciones de la Universidad Nacional
Experimental del Táchira; en el umbráculo ubicado detrás del edificio C; municipio
San Cristóbal del estado Táchira, Venezuela. Allí se realizó la siembra y el
desarrollo de las plántulas, las cuales posteriormente se trasplantaron a maceta
hasta la culminación de la investigación.
4.2 Materiales
Para el desarrollo del experimento se utilizaron diferentes metodologías y los
siguientes elementos; termómetro, bandejas plásticas de 200 celdas (2x2x3, 5x1, 5x1, 5
cm), regadera, bandejas lisas, balanza SORTORIUS BP 2215, marcadores, bolsas de
papel, cinta o tirro, bolsas plásticas, medidor portátil de temperatura y humedad relativa,
regla graduada de 60cm de apreciación de 1mm, macetas de 1L, pH metro marca Hanna,
conductimetro Hanna HI 993310.
4.3 Diseño experimental
Diseño totalmente al azar con cinco tratamientos y tres replicas, así mismo fue un
diseño unifactorial, aprovechando la estructura de las bandejas en el arreglo de los
tratamientos. Los resultados de materia seca se analizaron estadísticamente con ayuda
del programa infostat/L para análisis de varianza y prueba de medias. Las demás
variables evaluadas se analizaron por estadística descriptiva mediante representación de
gráficos y cuadros.
4.4 Manejo del experimento.
La investigación se realizó con cinco tratamientos constituidos por mezcla de
compost de pulpa de café y pergamino de café en diferentes proporciones, cada
tratamiento fue evaluado en tres repeticiones, cada repetición estuvo constituida por 30
plántulas en cada bandeja de 200 celdas. El testigo fue sembrado en turba comercial con
las mismas repeticiones y la misma cantidad de plantas. Cabe destacar que el ensayo
tubo un diseño completamente al azar y teniendo como unidad experimental las mezclas.
4.4.1 Preparación de las mezclas
El pergamino de café se tamizo con dos mallas de 1mm con el fin de eliminar el polvillo, la
otra malla de 4mm se utilizó con la finalidad de eliminar aquellas partículas muy gruesas
que posee el pergamino de café, todo esto con el fin de obtener una partícula estándar
para realizar las mezclas.
Cuadro 5. Tratamientos dentro de la investigación con sus referentes porcentajes
y referencia al testigo.
Tratamientos
Tratamiento
Tratamiento
Tratamiento
Tratamiento
Tratamiento
Sustratos
1
2
3
4
5
(P65)
(P70)
(P75)
(P80)
(P85)
65%
70%
75%
80%
85%
-
35%
30%
25%
20%
15%
-
-
100%
Compost
Testigo
(T)
Pulpa de café
Pergamino
de café
Turba
Comercial
-
-
4.5 Proceso de compostaje de la pulpa de café.
La materia prima se extrajo de la Agropecuaria La Propicia C.A., ubicada en la
parroquia Bramón del municipio Junín, estado Táchira. Y únicamente se utilizara como
materia prima la pulpa de café.
El proceso de compostaje se inicio el día 14 de Diciembre del 2011 con la
búsqueda de la materia prima, la cantidad aproximada utilizada inicialmente para el
compostaje fue de alrededor de 500 Kg, los cuales se apilaron dentro de las instalaciones
de exploración avícola de la finca la Tuquerena propiedad de la Universidad Nacional
Experimental del Táchira; se realizo un volteo cada 10 o 12 días para facilitar la liberación
de gases, una mejor aireación y una mejor uniformidad. El proceso de compostaje finalizo
el 27 de Mayo del 2012.
Figura 1. Recolección de materia prima para el compostaje de la pulpa de café. A.
Extracción de la finca de la pulpa de café. B. Tamizado de la cascarilla de café.
4.6 Variables evaluadas en el proceso de compostaje de la pulpa de café.
4.6.1 Temperatura: Esta variable fue tomada cada 10 o 15 días, el termómetro fue
introducido en la pila antes de ser volteado a una profundidad de 20 cm aproximadamente
durante 5 minutos y luego se procedió a tomar nota de la temperatura.
4.6.2 Aireación: Esta variable se realizo conjuntamente a la toma de temperatura cada 10
o 15 días; este como es un proceso aeróbico y requiere oxigeno, el volteo se logro
utilizando como herramienta un canalete.
4.6.3 Humedad: El riego se realizo de forma uniforme en toda la pila una vez volteada, el
riego se realizo cada 10 o 15 días.
Cuadro 6. Tomas de temperatura, volteos y riego para el proceso de compostaje de la
pulpa de café
DIA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
28/12/12
11/01/13
23/01/13
05/02/13
18/02/13
04/03/13
18/03/13
02/04/13
17/04/13
30/04/13
13/05/13
27/05/13
TEMPERATURA
(°C)
23
27
33
38
45
53
60
63
55
46
38
33
Figura 2. Variables del proceso de compostaje. A. volteo de la pila de café. B. Detalle de
la pila de café.
4.7 Propiedades físicas de las mezclas.
Las diferentes mezclas fueron colocadas a secar a temperatura ambiente, y se le
realizaron las evaluaciones pertinentes de las propiedades físicas que describen Pire y
Pereira. (2003).
Para medir la retención de humedad de las mezclas. Las Muestras fueron
introducidas dentro de cilindros de PVC de 7,094 cm de diámetro y 15 cm de altura a
partir de tubo plástico de PVC. (Rendon, 2007).
En su extremo superior tiene una tapa plástica, la cual posee cuatro orificios de 5
mm de diámetro en forma equidistante a su borde perimetral, los cilindros se llenaron con
las mezclas de los sustratos para luego permitir el asentamiento al dejarlos caer desde
una altura de 7,5 cm sobre una mesa este procedimiento se realizó en dos oportunidades
y en cada oportunidad se saturo de mezcla hasta el borde superior del mismo.
Posteriormente, los cilindros fueron colocados en un recipiente donde el agua
llegara justo por debajo del borde superior, esto con el fin del humedecimiento del las
muestras desde los orificios del fondo, permitiendo así la salida del aire a través de la cara
superior por un periodo de 24 horas. Luego se sujetó un trozo de tela porosa con una
banda para cubrir el extremo superior de cada cilindro. Los cilindros fueron colocados de
nuevo en agua, sumergiéndolos por completo y extrayéndolos luego de unos minutos un
par de veces para permitir la saturación total de la muestra.
Una vez transcurrieron 30 minutos se colocaron tapones en cada uno de los
orificios del fondo para luego extraer definitivamente los cilindros del agua. Posteriormente
se colocaron los cilindros en forma vertical en unas bandejas removiéndoles los tapones
para consecutivamente medir el volumen de agua (VA) que dreno en un periodo de 10
minutos.
La muestra húmeda que se extrajo de los cilindros se tomó su peso húmedo (PH);
luego se colocaron en la estufa a 105 °C por 24 horas para pesar y así obtener su peso
seco (PS). Para la determinación de las propiedades físicas de las muestras:
Dónde:
Va: Volumen drenado.
PH: Peso Húmedo.
PS: Peso Seco.
Pa: Peso especifico del agua (1g/cm3).
Vc: Volumen del cilindro (cm3).
Da: Densidad Aparente.
Dr: Densidad real.
Figura 3. Pruebas fisicas de los diferentes tratamientos. A. Detalle del cilindro de Pire, R.
y A. Pereira. 2003. B. Capacidad de retención de agua.
4.8 Análisis químicos
Los sustratos fueron secados a temperatura ambiente y protegidos de la radiación
directa, el pH y la conductividad eléctrica se determinaron a través de una muestra
saturada hecha de sustrato y agua en proporciones 1:5, luego fueron llevadas al agitador
durante 20 minutos, y se realizaron las lecturas directamente, del pH a través del pHmetro
y de la C.E a partir del conductímetro Lamott Chemical DA-1; Este análisis se llevó a cabo
en el Laboratorio de Biofertilizantes de la UNET.
Determinación del pH
Reactivos: Agua destilada, soluciones reguladoras de referencia, pH 4.00, 7.00 y 10.00,
estas soluciones estando a temperatura ambiente al momento de calibrar el medidor de
pH.
Material y Equipo: Potenciómetro o medidor de pH equipado con electrodo de vidrio en
combinación con el electrodo de referencia marca, balanza SORTORIUS BP 2215 con
0.01 g de sensibilidad, frascos de vidrio o plástico transparente de boca ancha con
capacidad de 100 mL, probeta de 50 mL, agitador mecánico, piceta.
Procedimiento:
Se pesó 10.0 gr, de muestra del sustrato con sus proporciones en frasco. Luego se
le adiciono 50 mL de agua al frasco donde se encuentra la mezcla. Seguidamente se
agito durante 20 minutos en agitador mecánico. Se calibro el potenciómetro con las
soluciones reguladoras, pH 4.00 – 7.00 o 7.00 – 10.00, 4.00 – 10.00, enjuagando con
agua destilada los electrodos antes de iniciar las lecturas de las muestras.
Una vez transcurrido el tiempo de agitación se introdujo el electrodo en la
suspensión para registrar la lectura una vez estabilizada.
Determinación de Conductividad Eléctrica
Materiales: Conductimetro Hanna HI 993310, el frasco que contiene la mezcla sustratoagua agitada que se utilizó para determinar el pH.
Procedimiento:
A la misma mezcla de sustrato-agua utilizada para la determinación de pH se
introdujo el electrodo en la suspensión. Luego se tomó nota de la lectura una vez
estabilizada.
CIC
Materiales: Conductímetro (ds/m) a 25ºC, mezcla (sustratos–agua) la utilizada para la
medición de pH.
Procedimiento:
Se empleó el método del acetato de amonio 1 N pH 7.0 (Norma Técnica
Colombiana 5167, 2004), su procedimiento consistió en los siguientes pasos:
•
Se pesó 5 g de cada sustrato y luego se colocó cada uno por separado dentro de un
vaso precipitado de 250 ml marcado.
•
Posteriormente se le adicionó a cada vaso precipitado 100 ml de acetato de amonio
1 N pH 7.0, se colocaron en un agitador durante 2 horas y transcurrido el tiempo se
sacaron los beakers, se colocaron sobre una mesa durante el resto del día.
•
Luego se preparó frascos de erlenmeyers, a cada uno se le colocó un embudo
buchner de porcelana con papel filtro.
•
Seguidamente se filtró al vacío y para la agilización del mismo a cada erlenmeyers
se le conecto a un extremo la bomba de vacío.
•
Se lavó lentamente el residuo sobre el embudo con 5 porciones de 10 ml de acetato
de amonio.
•
Se lavó con 5 porciones cada una de 10 ml de etanol al 95 %.
•
Seguidamente se reemplazó cada erlenmeyer por otro limpio esta vez sin el embudo
buchner de porcelana, desechando el sustrato. Se lavó cada uno con 5 porciones de
10 ml cada una de solución de NaCl al 10 %.
•
Luego, a cada filtrado se le adicionó 10 ml de formaldehído al 37 % y 3 gotas de
fenolftaleína.
•
Se llevó simultáneamente un blanco de reactivos.
•
En la titulación se utilizó una bureta de 50 ml, la cual se llenó con NaOH al 0.1 N y se
colocó en un soporte universal, debajo de la bureta se colocó una plancha y sobre
ella el erlenmeyer que contenía el blanco a la cual se le agregó un agitador.
•
Se procedió a abrir lentamente la llave de la bureta y muy despacio se le fue
agregando gotas de NaOH al 0.1 N, cuando este tomó una coloración fucsia, se
cerró la llave y se midió el volumen gastado del mismo. Este mismo procedimiento
se realizó para los todos los tratamientos.
Ecuación para determinar Capacidad de Intercambio Catiónico.
V de NaOH muestra = Volumen en ml de NaOH empleado en la titulación de la muestra.
V de NaOH blanco = Volumen en ml de NaOH empleado en la titulación del blanco.
N NaOH = Normalidad de la solución de NaOH
Wm = Peso en gramos de la muestra seca.
% humedad = Contenido de humedad del producto.
Figura 4. Medición de análisis químicos.
4.9 Evaluación del porcentaje de germinación.
Se realizó la prueba de germinación en una cámara húmeda ubicada en
laboratorio de instrumentaciones biológicas de la UNET; colocando 100 semillas en una
capsula de Petri para realizar la comparación con el porcentaje de germinación del
envase de la semilla en bandejas.
Figura 5. Evaluacion de porcentaje de germinacion. A. Conteo de plantulas germinadas.
B. Vista detallada de germinacion de las semillas.
4.10 Desinfección de las bandejas.
En primer paso, se lavó las bandejas con agua y jabón, retirando cualquier
partícula de sustratos anteriores; para garantizar la calidad sanitaria evitando así el efecto
de posibles patógenos sobre el crecimiento de las plántulas. Para la desinfección, las
bandejas fueron sumergidas en un recipiente que contenía una solución de cloro y agua,
en relación 1:5 luego fueron lavadas con abundante agua.
4.11 Evaluación de la germinación y emergencia de las plántulas.
Para evaluar el efecto de los sustratos sobre la germinación y emergencia, se
efectuó una evaluación del compost de pulpa de café a fin de verificar si el mismo poseía
sustancias que pudieran inhibir la germinación de la semilla. La evaluación del ensayo se
montó el día 16 de Noviembre de 2012. Para lograr evaluar la germinación se montaron
dos ensayos paralelos en los cuales el primer ensayo se sembraron 90 semillas por
tratamiento sin lavar la pulpa de café, en el otro tratamiento se sembraron las mismas
cantidades de semillas en los mismos tratamientos pero con la diferencia de que en esta
oportunidad si se lavó tres veces el compost de pulpa de café con agua directa de chorro,
a razón de 20 litros de agua por cada 10 kilos de pulpa. Luego se realizó un conteo del
número de plántulas emergidas, a partir del cuarto día después de la siembra. Se
consideró como plántula emergida a aquellas que presentaron los cotiledones visibles por
encima de la superficie del sustrato (Herrera et al., 2008) y en consecuencia es producto
de la germinación de la semilla. Este ensayo se realizó tomando encuentra lo citado por
Siles, 1997 “En la pulpa se encuentran compuestos orgánicos como cafeína y polifenoles
(taninos), los cuales pueden actuar como inhibidores enzimáticos” (Trujillo y Vargas,
citado por Siles, 1997). Y haciendo referencia al cuadro 4. Contenido de compuestos
orgánicos en la pulpa de café.
4.12 Siembra
La siembra se realizó dentro de las instalaciones del laboratorio de Biofertilizantes
para tener una mejor asepsia y control, se utilizó semilla de tomate (Solanum
lycopersicum) variedad Rio Grande con un porcentaje de germinación de 85% y un 99%
de pureza; se sembró una semilla por punto dentro de cada celda por lo que se utilizó
bandejas de 200 celdas, cabe destacar que por tratamiento se sembraron 30 celdas con
tres repeticiones para un total de 90 semillas por tratamiento.
La siembra se realizó el día viernes 30 de Noviembre del 2012, al momento de la
siembra se realizó un riego de fondo de 2 cc por celda. Esta medida fue calculada en
base al volumen de cada celda el cual se calculó tapando el fondo de una celda con
plastilina y agregando agua con una inyectadora, arrojando un volumen de 10 cc, estos 2
cc de agua lograron humedecer completamente el sustrato.
Figura 6. Bandeja utilizada para la siembra. A. detalle de la bandeja de 200 celdas. B.
Forma de calcular el volumen de la celda.
4.13 Manejo de las plántulas:
4.13.1 Fertilización de las plántulas.
Todos los tratamientos al igual que el testigo fueron fertilizadas de la misma dosis
y en la misma fecha, la dosis aplicadas fueron incrementándose progresivamente en
virtud de las exigencias de las plántulas y llevando el cronograma de fertilización, el
fertilizante utilizado fue Masterblend (20-20-20).
Cuadro 7. Cronograma de fertilización Masterblend (20-20-20)
NUMERO
FECHA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
16/01/12
18/12/12
21/12/12
24/12/12
26/12/12
28/12/12
31/12/12
02/01/13
04/01/13
07/01/13
09/01/13
11/01/13
14/10/13
16/01/13
18/01/13
21/01/13
23/01/13
DOSIS
(ppm)
50
50
50
50
50
150
250
300
300
350
350
350
350
350
350
350
350
VIA
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
LUGAR DE
APLICACIÓN
Sustrato
Sustrato
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
Sustrato –hojas
4.13.2 Manejo de plagas y enfermedades.
En el caso de las enfermedades, no se presentó ninguna enfermedad en el
desarrollo del ensayo; mientras que en las plagas se presentó pequeños focos de Fungus
Gnat (Bradysia impatiens). Las cuales se encontraban de forma dispersa dentro de las
bandejas, sin embargo no fueron mayor problema ya que se aplicó un insecticida
organofosforado llamado Lorsban a razón de 1.5 cc por cada litro de agua los cuales
fueron aplicados en forma localizada en unos algodones que se encontraban dentro de
las bandejas, de igual forma se aplicó insecticida en el sustrato para controlar y prevenir
posibles nuevos brotes de la plaga.
Cuadro 8. Cronograma de insecticida Lorsban (Organofosforado)
NUMERO
1
2
3
4
5
FECHA
21/12/12
24/12/12
26/12/12
28/12/12
02/01/13
DOSIS
1.5cc/L
1.5cc/L
1.5cc/L
1.5cc/L
1.5cc/L
VIA
aérea
aérea
aérea
aérea
aérea
LUGAR DE APLICACION
Localizado
Localizado y sustrato
Localizado y sustrato
Localizado y sustrato
Localizado y sustrato
Figura 7. Aplicación de insecticida. A. Vista general de puntos de aplicación del
insecticida. B. Detalle del algodón donde se aplica el insecticida.
4.13.3 Desarrollo de las plántulas.
Una vez después de la siembra se trasladaron las bandejas a umbráculo ubicado
detrás del edificio “C” el cual posee un área de 52.92 m2. Las bandejas fueron colocadas
totalmente al azar sobre dos mesones, ubicadas de tal forma que la incidencia de
aireación y luz solar fuese la misma para todas las bandejas. El riego de las plántulas fue
por capilaridad con la ayuda de una bandeja para regar, se colocó cada bandeja con los
diferentes tratamientos en su respectiva bandeja para evitar contaminación de las
plántulas por agua ya utilizada, las bandejas se dejaban por aproximadamente 5 minutos;
el riego fue constante cada día por medio. Dependiendo de las condiciones climáticas.
Figura 8. Dimensiones del umbráculo.
Figura 9. Distribución de las bandejas dentro del umbráculo.
4.14 Preparación de las macetas para el trasplante.
El primer paso que se realizó para el trasplante fue la búsqueda del suelo en el
cual se establecieron de forma definitiva las plantas de tomate. El suelo se buscó en las
instalaciones de la Universidad Nacional Experimental del Táchira; específicamente en la
finca la Tuquerena ubicada en el municipio Junín del estado Táchira, posteriormente se
realizó un llenado de las macetas, las cuales poseen un volumen de 1 litro, en cual se
determinó colocando una bolsa plástica dentro de una maceta posteriormente se le
agrego agua determinando la cantidad de agua utilizada para llenar la maceta.
A cada maceta llena de suelo se le hiso un orificio donde se colocó la plántula,
para así lograr el trasplante efectivamente. Una vez trasplantadas todas las plántulas se
realizó un riego. Posteriormente el riego fue de forma consecutiva cada 2 días
aproximadamente dependiendo de las condiciones climáticas.
Figura 10. Preparación de las macetas para el trasplante.
4.15 Cantidad de hojas verdaderas al momento de trasplante
Se tomaron 15 plantas por repetición, y se contarán la cantidad de hojas presentes
en las plántulas.
Figura 11. Trasplante de plántulas. A. Detalle de trasplante de plántulas. B. Días después
del trasplante.
4.16 Peso seco de la raíz y la parte aérea al momento de trasplante
La determinación de la materia seca se realizó a los 30 días después de la
siembra cuando las plántulas tenían de 3 hojas verdaderas aproximadamente y estaban
en condiciones para ser trasplantadas. Se tomó 1 plántula por repetición, 3 por
tratamiento, estas se llevaron al laboratorio de Biofertilizantes de la UNET, se lavó la parte
radical, con el fin de desprender todo el sustrato adherido a ella y posteriormente se
separó la parte aérea de la radical, se pesaron para determinar peso fresco y se
introdujeron el bolsas de papel y se llevaron a la estufa a 70°C por 72 horas, esto con el
fin de eliminar totalmente el contenido de humedad y proceder a tomar el peso seco aéreo
y radical de cada una de las plántulas.
Figura 12. Determinación del peso seco de la parte radical. A. Determinación del peso
radical de uno de los tratamientos. B. Comparación del sistema radical de los tratamientos
4.17 Volumen radical
El volumen radical se evaluó tomando 1 plántula por repetición, es decir, 3 por
tratamiento, se sumergió la parte radical de cada plántula en un cilindro graduado con un
volumen de agua conocido y se midió la variación del volumen obtenido.
4.18 Estabilidad del cepellón
Para la determinación de la estabilidad del cepellón se tomó una plántula
representativa por tratamiento, se lanzó desde una altura de 30cm sobre una tabla de
madera, esto con el fin de determinar la estabilidad de cada una de las mezclas
preparadas. Para este análisis se pesó la cantidad de sustrato disgregado del cepellón,
luego se pesó la cantidad total del sustrato adherido al sistema radical y así se obtuvo un
porcentaje del material disgregado.
Figura 13. Estabilidad del Cepellón. A. Detalle de caida de la plantula. B.
Disgregacion del cepellón.
4.19 Comportamiento de la estructura radical en el cepellón
Para la evaluación del comportamiento de las raíces en el cepellón, se tomaron 3
plántulas por tratamiento y se procedió a realizar un corte a lo largo del mismo,
dividiéndolo en dos partes, para así poder observar la distribución de las raíces tanto
principales como secundarias.
4.20 Altura de la plántula a los 30 días después de la siembra
Para medir este parámetro se tomó para observar si existe relación directa entre el
crecimiento de la plántula y los diferentes sustratos. Se realizó tomando 5 plántulas por
tratamiento, a las cuales se les midió la altura desde el sustrato hasta el ápice de la
plántula con la ayuda de una regla.
Figura 14. Altura de la plantula al momento del trasplante. A. Comparacion de los
diferentes tratamientos en cuanto a altura al momento del trasplante. B. Plantulas
trasplantadas.