Trabajos originales 52 Inmunofluorescencia directa en pelo como herramienta para el diagnóstico de pénfigo vulgar Juanita Benedetto1, Natalia Sabatini2, Nicole Chiessa3, Reiner Cid3 y Rodrigo Sepúlveda4 RESUMEN El pénfigo vulgar es una enfermedad ampollar autoinmune que afecta piel y mucosas, caracterizada por presentar autoanticuerpos en suero dirigidos contra uniones intercelulares de la epidermis. Para el diagnóstico se realiza el estudio histopatológico convencional y la técnica de inmunofluorescencia directa (IFD) en una biopsia de piel perilesional. En la IFD, se observan depósitos de autoanticuerpos en el espacio intercelular, principalmente de tipo IgG y fracciones del complemento. En este estudio se describe la utilidad de la IFD en pelos del cuero cabelludo extraídos por pulsión en el diagnóstico de pénfigo vulgar. Se estudiaron muestras de pelos de 12 pacientes con diagnóstico histopatológico e IFD de pénfigo vulgar y de 12 pacientes sin la enfermedad como grupo control. Se realizó IFD en pelos anágenos y telógenos extraídos por pulsión. De los 12 pacientes con pénfigo, 11 presentaron IFD en pelo positiva, y todos los controles mostraron IFD en pelo negativa. La sensibilidad de la técnica fue 91,6% y la especificidad 100%. Nuestros resultados muestran que el método de IFD en pelo tiene valor diagnóstico comparable al método de IFD en biopsia de piel y presenta ventajas comparativas en cuanto a costo, facilidad en la obtención de la muestra y transporte. Palabras clave: pénfigo vulgar, inmunofluorescencia directa, pelo ABSTRACT Hair direct immunofluorescence as a tool for diagnosis of pemphigus vulgaris Pemphigus vulgaris is an autoimmune blistering disease affecting skin and mucosa. It is characterized by serum autoantibodies against intercellular junctions of epidermis. Conventional histopathology and direct immunofluorescence (DIF) in perilesional skin biopsy are performed for diagnosis. In the DIF, autoantibody deposits are seen in the intercellular space, mainly IgG and complement fractions. In this study the utility of the DIF in scalp hairs extracted for diagnosis of pemphigus vulgaris is described. Hair samples of 12 patients with histopathological and DIF diagnosis of pemphigus vulgaris and 12 patients without disease as control group were analyzed. DIF was performed in anagen and telogen hairs taken from each patient. Of the 12 patients with pemphigus, 11 showed positive DIF in hair, and all patients in control group were negative. Sensitivity of the technique was 91.6% and the specificity 100%. Our results show that DIF method in scalp hairs has diagnostic value comparable to DIF in skin biopsy and also has comparative advantages in terms of cost, ease of sample collection and transportation. Key words: pemphigus vulgaris, direct immunofluorescence, hair ► INTRODUCCIÓN El pénfigo pertenece a un grupo de enfermedades ampollares autoinmunes, que afecta la piel y mucosas. Se caracteriza por presentar ampollas intraepidérmicas con acantólisis, e inmunopatológicamente por la unión “in vivo” de inmunoglobulinas y complemento a la superficie de los queratinocitos 1. Dermatóloga, Servicio Dermatología, Clínica Alemana de Santiago, Chile Interno Medicina Universidad del Desarrollo, Clínica Alemana de Santiago, Chile 3 Tecnólogo Medico Universidad del Desarrollo, Santiago, Chile 4 Docente Tecnología Médica Universidad del Desarrollo, Clínica Alemana de Santiago, Chile 1 2 Recibido: 30-10-2013. Aceptado para publicación: 17-2-2014. Arch. Argent. Dermatol. 2014; 64 (2): 52-56 Juanita Benedetto y colaboradores Las variantes más frecuentes son pénfigo vulgar y foliáceo, con reconocidas diferencias clínicas, histológicas y de inmunofluorescencia. La patogénesis de esta enfermedad aún no está completamente aclarada. Existe una fuerte predisposición genética ligada a una mayor expresión de HLA-DR4 y HLADR62. La acantólisis en el pénfigo vulgar parece ser el resultado de una acción colectiva de autoanticuerpos contra varios antígenos de un mismo queratinocito, de los cuales desmogleínas 1 y 3 (Dsg-1 y Dsg-3) son las más importantes. Otros antígenos adicionales, tales como desmocolina y componentes no desmosomales, como la mitocondria, también parecen participar en la activación de la enfermedad3. El pénfigo tiene una prevalencia mundial de 0,5 a 3,2 casos por 100.000 habitantes4 con una incidencia anual de 0,1 a 0,7 casos por cada 100.000 habitantes5,6, siendo el pénfigo vulgar el tipo más frecuente5,7. En nuestro país no hay una cifra clara de las personas afectadas por esta enfermedad, pero se estima que existirían alrededor de 20 casos nuevos anuales8. El diagnóstico de pénfigo vulgar se realiza utilizando 4 importantes criterios: clínica, microscopía de luz convencional, inmunofluorescencia directa (IFD) e inmunofluorescencia indirecta9. Los hallazgos clínicos en piel y mucosas incluyen vesículas y bullas frágiles, no cicatrizales, con signo de Nikolski positivo10. La biopsia debe incluir piel lesional y perilesional. Lesiones recientes no tratadas, son las más adecuadas, o sea, el borde de una ampolla. El estudio histopatológico con hematoxilina y eosina (HE) permite identificar acantólisis y el nivel de formación de la ampolla. El tipo y la densidad del infiltrado inflamatorio en conjunto con los hallazgos de inmunofluorescencia directa ayudan a establecer el diagnóstico de pénfigo vulgar11. El estudio IFD se realiza en cortes por congelación y la muestra debe ser transportada en fresco o, en su defecto, en una solución salina o medio de transporte Michel hasta su congelación. A la IFD, el pénfigo vulgar muestra un patrón en red característico, revelando el depósito de autoanticuerpos en el espacio intracelular, principalmente de tipo IgG12, en el 88 a 100% de los casos13,14. Dado el limitado acceso en nuestro país a microscopio de fluorescencia, necesario para la lectura de IFD, además de crióstato para preparar cortes en congelación, es que resulta difícil al clínico confirmar el diagnóstico de pénfigo con la detección inmunológica. Wu y Wilson demostraron similitudes histológicas y moleculares entre el epitelio folicular y la epidermis interfolicular, caracterizándose ambos por la presencia de Dsg-1 y Dsg-315,16. Posteriormente, Koch y cols. demostraron que la Dsg-3 era un antígeno importante implicado en el anclaje de la vaina radicular externa al pelo en fase telógena17. Por otro lado, la acantólisis y las hendiduras suprabasales, hallazgos histopatológicos característicos del pénfigo vulgar, pueden extenderse al epitelio folicular, a diferencia de otros trastornos acantolíticos. Incluso la acantólisis puede estar sólo limitada a los folículos del pelo, por lo que la acantólisis folicular es considerada una pista útil y sutil para el diagnóstico histopatológico precoz del pénfigo vulgar18. Dado que los immunodepósitos se evidenciaron previamente en la vaina radicular externa y la matriz de los folículos pilosos de las muestras de biopsia de pacientes con pénfigo16, en el año 2003 Schaerer y Trueb estudiaron la posibilidad de realizar la misma técnica de IFD en biopsia cutánea, en pelos, para el diagnóstico de pénfigo vulgar19. Postulamos que el método de IFD en pelo, tiene un valor diagnóstico comparable al método de IFD en piel en pacientes con pénfigo vulgar. ► MATERIAL Y MÉTODOS Se estudiaron 12 pacientes con diagnóstico histopatológico e IFD de pénfigo vulgar, 7 hombres y 5 mujeres. El rango de edad varió de 35 a 80 años. Además, se incluyeron 12 pacientes sin la enfermedad como grupo control. A la totalidad de los pacientes se les solicitó consentimiento informado. El estudio se realizó en el Servicio de Dermatología de Clínica Alemana de Santiago, y los pacientes fueron reclutados de distintos centros del país. Se le extrajeron 20 pelos del cuero cabelludo de áreas con lesión y sin lesión a cada paciente del estudio. La muestra se refrigeró a 4°C hasta la realización de la técnica. Se adhirieron los pelos a un portaobjetos con cinta adhesiva y se delimitó con esmalte de uñas una zona de prueba. Se lavó en PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7.4 por 10 minutos. Se añadió 100 µl de anticuerpo IgG (ImmuGlotmantibody, código 1104) conjugado con isotiocianato de fluoresceína, cuidando de cubrir completamente los bulbos pilosos. Se incubó en oscuridad durante 30 minutos, a temperatura ambiente y en cámara húmeda. Luego de 3 lavados sucesivos en buffer fosfato, pH 7.4, se cubrió con glicerina tamponada como medio de montaje y finalmente se observó al microscopio de fluorescencia. La comparación entre ambos métodos empleados se realizó mediante curvas ROC adoptando como “variable estado” al método de histopatología e IFD en biopsia de piel perilesional. El nivel de significancia utilizado fue de alfa = 0,05 en todos los casos. Esta curva asigna a los pacientes en estudio valores, que son expresados en un gráfico y ordenados en una tabla, e indica un área bajo la curva de 0.958 que hace referencia a un 5% de originar falsos positivos y a un 95.8% de obtener verdaderos positivos, aproximadamente. Se calculó: a) sensibilidad, porcentaje de pacientes con IFD en piel positiva que tienen IFD en pelo positiva; b) especificidad, porcentaje de pacientes con IFD en piel negativa con IFD en pelo negativa; c) valor predictivo positivo, porcentaje de pacientes con IFD en pelo positiva con IFD en piel positiva; y d) valor predictivo negativo, porcentaje de pacientes con IFD en pelo negativo con IFD en piel negativo. Arch. Argent. Dermatol. 2014; 64 (2): 52-56 53 54 Trabajos originales ► Inmunofluorescencia directa en pelo ► RESULTADOS De los 12 pacientes con diagnóstico de pénfigo vulgar, 11 mostraron fluorescencia positiva con patrón intercelular, tanto en pelos anágenos (Fig. 1), específicamente en la vaina radicular externa, como en el remanente epitelial de los pelos telógenos (Fig. 2). Los 12 controles a los que se les realizó el test fueron negativos (Fig. 3) (Tabla I). El valor predictivo positivo de la IFD en pelo es del 100%, mientras que el valor predictivo negativo es del 92.3%. La sensibilidad de la técnica de IFD en pelo resultó de un 91.6% y una especificidad del 100%, versus un 91,7% y 100%, respectivamente, calculados por la curva ROC. ► DISCUSIÓN El pénfigo vulgar es una enfermedad autoinmune de la piel que se caracteriza por presentar autoanticuerpos séricos dirigidos contra las uniones intercelulares de la epidermis, específicamente contra la Dsg-1 y Dsg-3 y que se unen “in vivo” produciendo el cuadro clínico característico. Estos autoanticuerpos se detectan mediante la técnica de IFD en biopsia de piel perilesional. La técnica de inmunofluorescencia (IF) se basa en el trabajo pionero de Coons y Kaplan20,21, y más tarde por Weber y cols.22. Ha sido ampliamente utilizada tanto en la investigación como en el diagnóstico clínico. En la técnica de inmunofluorescencia, un anticuerpo es químicamente conjugado con colorantes fluorescentes, tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC) o isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC). Estos anticuerpos marcados se unen (directa o indirectamente) con el antígeno de interés, lo que permite la detección de antígeno a través de técnicas de fluorescencia. La fluorescencia a continuación, se puede visualizar utilizando microscopio de fluorescencia o microscopio confocal. La IF ha sido usada por casi 5 décadas en el diagnóstico dermatopatológico, especialmente en enfermedades bullosas autoinmunes y enfermedades del tejido conectivo. La IFD ha demostrado ser una poderosa herramienta para determinar la presencia, distribución y/o localización de antígenos o inmunorreactantes, tales como inmunoglobulinas o fracciones del complemento, en biopsias de tejido congelado. Sus ventajas y desventajas han sido ampliamente descritas y reconocidas23. Schaerer y Trueb demostraron en el año 2003 por primera vez la factibilidad de realizar la IFD en pelos, y observaron que se mantenía el patrón en “red de pesca” con el 100% de sus casos al igual que en la piel19. Posteriormente, en un seguimiento a 2 años de sus pacientes, 14 de los 15 pacientes estudiados presentaban una IFD positiva en pelo y el resto una IFD negativa además de una remisión clínica de la enfermedad, lo que sugiere también aplicación en el seguimiento de éstos24. En otros estudios las sensibilidades encontradas varían de 85% 25, 91% 26 a 100% 27, 28. Estas diferencias se pueden explicar por los distintos métodos de preservación utilizados, entre otros factores. Arch. Argent. Dermatol. 2014; 64 (2): 52-56 Fig. 1: Pelo anágeno con patrón intercelular, tipo red de pesca, característico de pénfigo vulgar. Fig. 2: Pelo telógeno positivo en remanente folicular. Fig. 3: Control negativo. Juanita Benedetto y colaboradores Tabla I: Tabla de Resultados. IFD y HE piel + IFD y HE piel - Total IFD pelo + 11 (91,6%) 0 (0%) 11 (45,8%) IFD pelo - 1 (8,4%) 12 (100%) 13 (54,2%) Total 12 (100%) 12 (100%) 24 (100%) IFD: Inmunofluorescencia directa, HE: Estudio histopatológico con hematoxilina y eosina. Nuestros resultados muestran que el método de IFD en pelo tiene valor diagnóstico comparable al método de IFD en biopsia de piel y, además, presenta ventajas comparativas en cuanto a costo, facilidad en la obtención de la muestra y transporte. Contrariamente a lo comunicado por Alexandru y cols.28, en que demostraron falsos negativos en pelos en fase telógena, nuestros resultados demostraron que también hubo inmunorreactividad de pelos telógenos (Fig. 2) lo que concuerda con el estudio realizado por Kumaresan y cols.27 y lo descrito previamente por Koch, el cual demuestra que la Dsg-3 es un antígeno importante implicado en el anclaje de la vaina radicular externa al pelo en fase telógena17, por lo que es posible detectarla en pelos telógenos que aun conservan su vaina. Por otra parte, en estudios en que no se ha incluido pelos telógenos, como en el realizado por Rao y cols.25, se encontró una sensibilidad menor a 100%, por lo que no es posible atribuir este factor a la menor sensibilidad encontrada. Nuestro planteamiento inicial fue observar sólo pelos anágenos. Sin embargo, el procedimiento utilizado incluía estudiar al menos 10 pelos por lámina, lo que evidentemente nos llevó a incluir algunos pelos telógenos. Frente a la posibilidad de utilizar tanto pelos anágenos como telógenos en este examen, es necesario realizar más estudios prospectivos y precisar dentro del diseño del método el tipo y número de pelos que se estudiará para cada etapa de maduración. De los 12 casos estudiados, solo uno fue negativo. En este caso, los pelos extraídos correspondieron en su totalidad a pelos displásticos, lo que nos impidió identificar microscópicamente queratinocitos de la vaina folicular. Es importante utilizar una buena técnica de extracción de pelos, similar a la del tricograma, con folículos pilosos completos. Utilizar una lámina con varios pelos, disminuye la posibilidad de falsos negativos, porque la probabilidad de incluir pelos anágenos es mayor. La posibilidad de resultados falsos negativos para IFD en piel o mucosa en pacientes con pénfigo vulgar es hasta de un 12%13. Esto se explicaría mayormente por una mala conservación de la muestra. Al utilizar la técnica de IFD en pelos para el diagnóstico de pénfigo vulgar, puede reducirse aún más el porcentaje de falsos negativos, ya que se conservaría de mejor manera y por más tiempo el inmuno- rreactante que se fijó “in vivo”. Ante esta hipótesis, es necesario realizar estudios prospectivos para determinar en el tiempo la inmunorreactividad en estos pelos con vaina radicular. Esto puede facilitar el estudio de pacientes que habitan a grandes distancias de los centros especializados y no sería necesario usar cadena de frío en el traslado de muestras de pelo ni una fijación inmediata, como en el caso de la piel, traduciéndose en un transporte más fácil o menos complicado de la muestra. Este método también se puede usar para monitorizar remisión inmunológica, aunque la sensibilidad es baja según lo estudiado por Daneshpazhooh y cols.26. Para ello sugerimos realizar estudios longitudinales adicionales aplicando ambos métodos de IFD, tanto en piel como en pelos. Los estudios publicados a la fecha plantean la posibilidad de que esta técnica se sume a la IFD en piel o mucosa para el diagnóstico de pénfigo. Nuestra experiencia es limitada por el tamaño de la muestra, pero es una alternativa para aquellas muestras que provienen de sitios remotos y que requieren diagnóstico y/o seguimiento en centros especializados. Agradecimientos: Agradecemos a la Dra. Marcela Le Bert del CRS Peñalolen, a la Dra. María Fernanda Martin del Hospital San José, y a la Dra. Virginia Rodríguez M. de la Clínica Alemana de Valdivia, por facilitarnos las muestras de los pacientes pertenecientes a sus centros. ► BIBLIOGRAFÍA 1. Stanley, J.: Pemphigus. En: Wolff, K.; Goldsmith, L.; Katz, S.; Gilchrest, B.A.; Paller, A.S.; Leffell, D.J. Fitzpatrick´s Dermatology in General Medicine, 7th Ed, Mc Graw Hill, 2008, págs.: 459-468. 2. 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