High Frequency of Recombination Integración de F al cromosoma bacteriano El bajo nivel de transferencia de marcadores genéticos se debe a la presencia de unas pocas celulas Hfr en la población F+ Experimentos de conjugación interrumpida Wollman y Jacob, 1957 azis tons lac gal azir tonr lac+ gal+ F- strr × Hfr strs Str + La inserción de plásmido F en el cromosoma bacteriano puede ocurrir en diferentes lugares mediante recombinación (sitios IS y Tn1000 ) Integración del plásmido F al cromosoma O Orientación del origen O O Dependiendo de la orientación del Origen de replicación de F durante la integración, comenzarán a transferirse los marcadores genéticos Orden de Transferencia de Marcadores Genéticos Después de 2 h algunos exconjugantes se convierten en Hfr F d c b a O Dos eventos de recombinación Generalmente la Conjugación se interrumpe antes de que se transfiera todo el Hfr; el exogenota es lineal y el endogenota es circular. Ocurren dos eventos de recombinación. Recombinación entre exogenote y endogenote No viable ¡ Doble entrecruzamiento ! a+ a– a– No viable + a+ Merocigoto Viable Recombinantes recíprocos Conclusiones: 1. El cromosoma de E. coli es circular. 2. El plasmido F es circular. 3. La orientación en la que se intergra F al cromosoma determina la polaridad del cromosma Hfr. 4. Un extremo de F integrado es el Origen donde comienza la transferencia y el otro extremo es el término que NO se transfiere a menos que antes se haya transferido TODO el cromosoma Hfr. Resumen de la Conjugación bacteriana PLÁSMIDOS Elementos de ADN extracromosomal, de doble cadena circular, covalentemente cerrado. Contienen: origen propio de replicación, sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, marcadores de selección (resistencia a antibióticos). Presentes en elevado número de copias en la célula. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Eco RI Sa/I tetracycline resistance origin of replication Pstl amplicillin resistance Pst I EcoRI SalI CLASIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS Por su capacidad de transferencia: -Conjugativos (a través de un pili a otra membrana) -No conjugativos Por sus efectos fenotípicos: -Fertilidad (factores F) -Plásmidos bacteriocinogénicos (codifican una proteína tóxica para otras bacterias que no portan ese tipo de plásmido) -Plásmidos de resistencia (factores R) Por el número de copias: -Relajados (>1000 copias/célula) -Restringidos (<100 copias/célula) Episoma (F’) : Plasmido F con genes bacterianos Mapeo por frecuencia de recombinantes Si seleccionamos leu como marcador: Podemos medir la distancia entre los genes porque todos tienen la misma oportunidad de incorporarse al cromosoma receptor La frecuencia de recombinación indicará la distancia entre los genes Las posibilidades de recombinación que existen: muy poco frecuente leu+ arg - met - 4% leu+ arg+ met - 9% leu+ arg+ met+ 87% leu -- arg 4 u.m. y arg – met 9 u.m. Se aisló una bacteria mutante con fenotipo StrR pero incapaz de usar acetato como fuente de carbono (ace-). Para determinar dónde mapea el gen responsable de la mutación se utilizó la conjugación con cuatro cepas diferentes donadoras StrS ace+ Hfr que se muestran. Las flechas indican la posición y orientación de F en cada Hfr. 1) 2) 3) ¿En qué medio seleccionamos los exconjugantes en este experimenmto?? ¿Cómo vamos a excluir las células donadoras en este experimento? Si se tienen los siguientes resultados, ubica el gen ace en el mapa (tomando en cuenta el tiempo en minutos).