Re p u b l i co fEc u a d o r ≠ EDI CTOFGOVERNMENT± I no r d e rt op r o mo t ep u b l i ce d u c a t i o na n dp u b l i cs a f e t y ,e q u a lj u s t i c ef o ra l l , ab e t t e ri n f o r me dc i t i z e n r y ,t h er u l eo fl a w,wo r l dt r a d ea n dwo r l dp e a c e , t h i sl e g a ld o c u me n ti sh e r e b yma d ea v a i l a b l eo nan o n c o mme r c i a lb a s i s ,a si t i st h er i g h to fa l lh u ma n st ok n o wa n ds p e a kt h el a wst h a tg o v e r nt h e m. NTE INEN 0021 (1985) (Spanish): Leche pasteurizada. Contaje de bacterias coliformes CDU 637.127.6 AL 03.01-311 Norma LECHE PASTEURIZADA INEN 21 Ecuatoriana CONTAJE DE BACTERIAS COLIFORMES Primera revisión Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN, Casilla 3999 - Ave. Colón 1663 – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción 1. OBJETO 1.1 Esta norma establece un método para realizar el contaje de bacterias coliformes en la leche pasteurizada y en los productos lácteos. 2. TERMINOLOGIA 2.1 Bacterias coliformes. Son basilos gram negativos, aerobios facultativos, no formadores de esporas que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas, y pertenecen comúnmente a los géneros Escherichia Aerobacter, Klebsiella. Una fuente de estos organismos es el tracto intestinal de los animales de sangre caliente. 3. DISPOSICIONES GENERALES 3.1 Deberán cumplirse las disposiciones establecidas en la norma INEN 17. 3.2 El contaje deberá realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada. 4. FUNDAMENTO El método se basa en colocar la muestra de leche en un medio de cultivo sólido y 4.1 selectivo (agar-bilis-rojo-violeta), incubarla en condiciones adecuadas y estimar la cantidad de bacterias coliformes en base al número de colonias rojas obscuras que se desarrollen. 5. INSTRUMENTAL 5.1 Estufa, con regulador de temperatura, ajustada a 32° ± 1°C. 5.2 Pipetas volumétricas de 2 cm . 5.3 Pipetas de 25 cm , con graduaciones de 0,1 cm 5.4 Cajas de Petri, de vidrio o plástico, de 10 cm de diámetro; estériles. 5.5 3 3 3 Aparato para recuento de colonias, provisto de un lente de tres aumentos y campo iluminado con luz blanca difusa. (Continúa) -1- 1984-033 INEN 21 5.6 Baño de agua, ajustado a 45° ± 1º C. 3 5.7 Matracas Erlenmeyer de 250 cm . 6. REACTIVOS 6.1 Medio de cultivo (agar-bilis-rojo-violeta). Mezclar los siguientes ingredientes: Extracto de levadura 3g Peptona 7g Sales biliares 1,5 g Lactosa 10,0g Cloruro de sodio 5,0 g Rojo neutro 0,03 g Cristal violeta 0,002 g Agar 15,0 g Homogeneizar la mezcla y guardarla, protegida de la humedad, hasta el momento de su uso. Todos los ingredientes deben ser adecuados para trabajo microbiológico. Podrá también usarse medio de cultivo deshidratado preparado especialmente para este fin en forma comercial. 6.2 Agua destilado estéril. 6.3 Coloración de Gram según Hucker. Solución A Cristal violeta Alcohol Etílico al 95% 2,0 g 20,0 cm3 Solución B Oxalato de amonio monohidratado 0,2 g 20,0 cm3 Agua destilada Mezclar en partes iguales la solución A con la solución B. 6.3.1 Solución de lugol (modificación de Gram’s). Cristales de yodo 1,0 g Yoduro de potasio 2,0 g Agua destilada 300 cm3 -2- 1984-033 INEN 21 Disolver los cristales de yodo y el yoduro de potasio en el agua destilada 6.3.2 Colorantes de contraste. Safranina Alcohol etílico 95% 2,5 g 100 cm3 Disolver la safranina coloreada en 100 cm3 del acohol etílico al 95%. Tomar 10 cm3 de esta solución y llevar a 100 cm3 con agua destilada. 6.4 Agar eosina azul de metileno (EMB) (Modificación de Levine). Peptona 10,00 g Lactosa 10,00 g Fosfato dipotásico (K2HPO4) Agar 2,00 g 15,00 g Eosina Y 0,40 g Azul de metileno 0,065 g Agua destilada 1 litro Disolver completamente los ingredientes en el litro de agua destilada, mediante ebullición, por dos minutos máximo. Ajustar el pH a 7,1, colocar en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos, el pH, después de esterilizado, será 7.1. Se produce decoloración del medio durante la esterilización, la misma que se recupera al enfriarse. 7. PREPARACION DE LA MUESTRA 7.1 Mezclar completamente la leche o producto lácteo, agitando suavemente, varias veces, el recipiente que la contiene, hasta que la muestra esté homogénea. 7.2 Si se forma grumos de crema, y estos no se dispersan, calentar la muestra en baño de agua, a una temperatura entre 35°C. Mezclar cuidadosamente e incorporar cualquier partícula de crema adherida al recipiente, y enfriar rápidamente a 18° ± 2°C. 7.3 Para la preparación de muestras de productos lácteos, específicos, ver INEN 4. Leche y productos lácteos. Muestreo. -3- 1984-033 INEN 21 8. PROCEDIMIENTO 8.1 Preparación del medio de cultivo. Pesar 4,15 g de medio de cultivo (ver 6.1) y pasarlo a un matraz Erlenmeyer de 250 cm Agitar cuidadosamente pocos minutos; 3 que contenga 100 cm para suspender homogéneamente la suspensión íntimamente mezclar suspensión con agitación, hervirla inmediatamente hasta 45° ± durante 2 y 3 el de agua destilada estéril y fría. polvo; ajustar el min para completar dejar pH a en reposo 7,4. unos Calentar la la disolución y enfriarla 1ºC. Esta preparación debe realizarse poco antes de hacer la inoculación, y el medio de cultivo preparado debe mantenerse a 45° ± 1ºC colocándolo en el baño de agua (ajustado a tal temperatura) hasta el momento de su uso (ver 8.2). 8.2 3 Inoculación en las cajas de Petri. En condiciones asépticas, transferir 2 cm de muestra a cada caja de Petri (ver 3.2). Añadir de 10 cm 3 a.15 cm 3 de medio de cultivo a 45° ± 1ºC (ver 8.1) y, con movimientos circulares horizontales, mezclar cuidadosamente el medio de cultivo con la muestra. Dejar solidificar dejando la caja de Petri en reposo durante 5 a 10 minutos sobre una superficie horizontal. Inmediatamente, usando la misma pipeta con medio de cultivo, esparcir sobre la 3 superficie solidificada aproximada mente 4 cm de medio de cultivo a 45° ± 1ºC para formar una capa delgada (que inhiba el desarrollo superficial de otros microorganismos) y dejarla enfriar hasta completa solidificación. 8.3 Incubación de los cultivos. Incubar cultivos colocando las cajas de Petri en posición invertida dentro de la estufa regulada a 32° ± 1ºC. y manteniéndolas allí durante 24h ± 2h (ver nota 1). 8.3.1 Puede ocurrir que algunas capas de microorganismos no coliformes (levaduras, hongos) puedan producir colonias similares en color y tamaño parecidos a los coliformes, entonces se procederá a su identificación morfológica y confirmativa, para lo cual se usará la prueba Coloración Gram de Hucker. 8.4. Prueba confirmativa 8.4.1 Transferir el inóculo con el asa de platino, al porta objeto y realizar un frotis, luego de secado y fijado el frotis a la llama, hacer actuar la solución coloreada de cristal violeta amonio (ver 6.3) por un minuto. Lavar el frotis con agua para evitar exceso de reactivo y hacer luego actuar la solución de lugol (ver 6.3.1). Lavar con agua, secar, decolorar con alcohol etílico por 30 segundos, (o hasta que resulte incoloro) lavar con agua, secar, poner el colorante de contraste (ver 6.3.2) durante 10 segundos, nuevamente lavar con agua, secar y examinar. 8.4.2 Células decoloradas que admiten el colorante contraste son gram negativas. Células que no decoloran pero retienen la solución cristal violeta-amonio son gram positivas. _____________________________ NOTA 1. Es importante no prolongar la incubación por períodos superiores al especificado, porque ciertos organismos pueden desarrollarse y perturbar el recuento -4- 1984-033 INEN 21 8.5 Prueba complementaria. 8.5.1 Del medio positivo y con prueba confirmativa, transferir el cultivo a cajas de agar eosina azul de metilo (EMB) (ver 6.4). Incubar a 37 ± 1°C por 48 horas, y observar la presencia de colonias nucleadas, obscuras, con brillo verde metálico, será Escherichia coli, y las que presentan un centro gris marrón sin brillo metálico será Enterobacter Aerógenes. 8.6 Recuento de las colonias. Ayudándose del aparato para recuento de colonias (ver 5.5), contar el número de colonias de color rojo obscuro (ver nota 2 ) desarrolladas en cada cultivo. 9. CALCULOS El número de bacterias coliformes por cm 9.1 3 de muestra se calcula mediante la ecuación siguiente: C=n/2 siendo: 3 C = número de bacterias coliformes por cm . n = número de colonias contadas en el cultivo. 10. ERRORES DE METODO 10.1 Si en el ensayo por duplicado, el contaje de por lo menos un cultivo, es igual o mayor a 15 colonias, verificar que el contaje más alto no sea mayor que el doble del contaje más bajo; en caso contrario, repetir la determinación. 11. INFORME DE RESULTADOS 11.1 Como resultado final debe reportarse la media aritmética de los dos resultados de la determinación, 3 aproximada a décimas y expresada como bacterias coliformes/cm . 11.2 Si los dos resultados de la determinación son iguales a cero, reportar el resultado como 3 negativo en cm o en 1 g. ________________ NOTA 2. Los coliformes, debido a su habilidad para fermentar la lactosa, forman colonias no superficiales de color rojo obscuro circundadas generalmente por una zona rojiza de bilis precipitada, y con diámetros de aproximadamente 0,5 mm a 2 mesa. -5- 1984-033 INEN 21 En el informe de resultados debe indicarse el método usado y el resultado obtenido. 11.3 Debe mencionarse además cualquier condición no especificada en esta norma, o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado. 11.4 Deben incluirse todos los detalles necesarios para la completa identificación de la muestra. -6- 1984-033 INEN 21 APENDICE Z Z.1 NORMAS A CONSULTAR INEN 17. Leche y productos lácteos. Examen microbiológico. Disposiciones generales. Z.2 BASES DE ESTUDIO Norma Británica BS 4285: 1968. Methods of microbiological examination of milk products. British Standards Institution, Londres, 1970. Dr. D.A.A. Mossel. Control microbiológico de los alimentos. Métodos recomendados. Coloración de gram (de acuerdo a Hucker) Lima Perú, 1967. Walter, W. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 12 th, Ed., pp.77, American Public Health Association, Inc., New York, 1967. Norma Hindú IS: 1479 (Parte III) 1962, Methods of test for dairy industry, Part III Bacteriological analysis of milk. Indian Standards Institution, New Delhi, 1962. Equipment, reagents, media routine test. Gram Stain Hucker. -7- 1984-033 INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA Documento: TITULO: LECHE PASTEURIZADA. CONTAJE DE Código: NTE INEN 21 BACTERIAS COLIFORMES. AL 03.01-311 Primera revisión ORIGINAL: REVISIÓN: Fecha de iniciación del estudio: Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo 1973-08-15 Oficialización con el Carácter de Obligatoria por Acuerdo No. 821 de 1973-10-25 publicado en el Registro Oficial No. 437 de 1973-11-21 Fecha de iniciación del estudio: Fechas de consulta pública: de a Subcomité Técnico: AL 03.01 Leche y productos lácteos Fecha de iniciación: Integrantes del Subcomité Técnico: Fecha de aprobación: 1984-01-12 NOMBRES: INSTITUCIÓN REPRESENTADA: Ing. Anibal Saltos Dra. Yolanda de Fuentes Dr. Marco Morán UNIVERSIDAD TECNICA DE AMBATO INEDECA INSTITUTO DE INVESTIGACIONES NUTRICIONALES Y MEDICO SOCIALESMINISTERIO DE SALUD IZQUIETA PEREZ- QUITO PASTEURIZADORA QUITO MINISTERIO DE AGRICULTURA IZQUIETA PEREZ-GUAYAQUIL MINISTERIO DE SALUD INEN Dra. Mónica Sosa de Galárraga Dra. Catherine de Escudero Dr. Alberto Proaño Dra. Leonor Morales de Navas Dra. Magdalena Báez de Birga Dra. Leonor Orozco Otros trámites: 4 Esta norma sin ningún cambio en su contenido fue DESREGULARIZADA, pasando de OBLIGATORIA a VOLUNTARIA, según Resolución de Consejo Directivo de 1998-01-08 y oficializada mediante Acuerdo Ministerial No. 235 de 1998-05-04, publicado en el Registro Oficial No. 321 del 1998-05-20 El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 1985-02-08 Oficializada como: Obligatoria Registro Oficial No. 206 del 1985-06-13 Por Acuerdo Ministerial No. 346 del 1985-05-23 Instituto E cuatoriano de Normaliza ción, IN E N - B aquerizo Moreno E8-29 y Av. 6 de Diciembre C asilla 17-01-3999 - Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 - Fax: (593 2) 2 567815 Dire c ción G eneral: E-Mail: furresta @ inen.gov.e c Á re a Té cnic a de Normaliza ción: E-Mail: normaliza cion @ inen.gov.e c Á re a Té cnic a de Certific a ción: E-Mail: c ertific a cion @ inen.gov.e c Á re a Té cnic a de Verific a ción: E-Mail: ve rific a cion @ inen.gov.e c Á re a Té cnic a de Servicios Te cnológicos: E-Mail: inenc ati @ inen.gov.e c Regional Guayas: E-Mail: inenguayas @ inen.gov.e c Regional A zuay: E-Mail: inencuenc a @ inen.gov.e c Regional Chimbora zo: E-Mail: inenriobamba @ inen.gov.e c URL:www.inen.gov.e c