IMAGEN Influenza virus A and B

IMAGEN INFLUENZA
VIRUS A AND B
ES
K610511-2
50
Prueba de inmunofluorescencia directa para la detección de los
virus de la Influenza A y B
1.
INDICACIONES DE USO
La prueba IMAGEN™ Influenza virus A y B es una prueba
cualitativa por inmunofluorescencia directa para la detección y la
diferenciación del virus de la influenza A y el virus de la influenza B
en especímenes clínicos, o para la confirmación y la diferenciación
de los virus de la influenza A y B en cultivos celulares.
2.
RESUMEN
Los virus de la influenza A y B pertenecen al género Influenza
virus, que se clasifica como perteneciente a la familia
Orthomyxoviridae1. Las cepas virales de la influenza A infectan a
diversos animales, incluidos los seres humanos, caballos, cerdos,
mamíferos marinos y aves, mientras que los virus de la influenza
B aparentemente sólo infectan a los seres humanos2.
En los seres humanos, las infecciones virales de gripe A y B pueden
causar enfermedades respiratorias agudas y a veces graves en
individuos inmunocompetentes e inmunocomprometidos. Las
infecciones virales por influenza A e influenza B se producen en
epidemias anuales, con una rápida aparición y propagación de
la infección. Estas epidemias pueden manifestarse como brotes
pequeños y localizados, o bien como epidemias mundiales
dependiendo de la cepa más frecuente3. Como resultado de la
permanente evolución de los virus de la influenza A, se producen
periódicamente epidemias de gripe que pueden ejercer un fuerte
impacto en la salud a escala mundial2,4.
La transmisión de la infección por el virus de la influenza se produce
por inhalación de gotitas cargadas del virus, provenientes de las
secreciones respiratorias del portadores tanto sintomáticos como
asintomáticos. Determinadas condiciones ambientales, tales
como el hacinamiento, facilitan la transmisión de la infección. La
replicación del virus se produce en las células ciliadas del epitelio
columnar del tracto respiratorio superior e inferior, dando lugar a
necrosis y esfacelado de células. El período de máxima liberación
viral se produce desde un día antes hasta tres a cuatro días
después de la aparición de la enfermedad.
En el curso de una epidemia de gripe es posible que el virus más
corriente esté vinculado a entre el 15% y el 50% de las infecciones
respiratorias que se producen en adultos y niños. El espectro
de las enfermedades respiratorias va desde las afecciones
respiratorias leves del tracto superior hasta la neumonía grave.
La neumonía aguda debida a los virus de la influenza A o B puede
resultar mortal, en particular cuando se combina con infecciones
microbianas concomitantes o secundarias en pacientes de edad
avanzada o inmunocomprometidos.
Los virus de la influenza han sido vinculados a los brotes
nosocomiales de infecciones del tracto respiratorio en unidades
pediátricas y geriátricas, resultando en ingresos hospitalarios
prolongados y mayor morbilidad y mortalidad.
El diagnóstico rápido en el laboratorio de los virus de la influenza
A o B desempeña un papel de importancia en el tratamiento
del paciente, ya que sirve para orientar las decisiones sobre la
terapia antiviral y permite una gestión efectiva y el control de
los brotes3,5. Los métodos diagnósticos incluyen la detección
directa del virus o las proteínas virales en especímenes clínicos
(por ejemplo, aspirados nasofaríngeos), el aislamiento de virus
viables en monocapas de cultivos celulares inoculados con
secreciones respiratorias, y detección de inmunoglobulinas
específicas del virus de la influenza. Los virus de la influenza de
especímenes respiratorios se pueden aislar en líneas celulares
como las células renales primarias de mono Rhesus o en células
renales de perro Madin-Darby (MDCK) utilizando técnicas tales
como la hemoadsorción o hemoaglutinación para identificar
la presencia de la cepa viral. Para confirmar la identificación
de aislados del virus de influenza se aplica una gran variedad
de técnicas, entre otras la inhibición de la hemoadsorción,
inhibición de la hemoaglutinación, pruebas de neutralización,
microscopio electrónico o inmunofluorescencia indirecta. Estas
técnicas son laboriosas, llevan mucho tiempo y exigen un nivel
de conocimientos técnicos no siempre disponibles en todos los
laboratorios.
Las pruebas de inmunofluorescencia directa que utilizan
anticuerpos monoclonales específicos proponen un método
rápido, sensible y específico para la detección directa de virus de
la influenza A o B en especímenes clínicos tales como aspirados
nasofaríngeos, o bien para confirmar el virus de la influenza en
monocapas de cultivo celular6. IMAGEN Influenza virus A y B es
una prueba de inmunofluorescencia directa para la detección e
identificación de los virus de la influenza A o B en especímenes
clínicos o en cultivos celulares. La prueba utiliza anticuerpos
monoclonales específicos de la especie para detectar epítopos
de glicoproteínas del virus de la influenza, y proteínas de fusión
específicas del virus de la influenza tipo A o del virus de la
influenza tipo B.
3.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
La prueba IMAGEN Influenza virus A y B contiene anticuerpos
monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína
(FITC), específicos del virus de la influenza A o B. Estos se utilizan
en una técnica de inmunofluorescencia directa de un solo paso.
Los especímenes se incuban con los reactivos del anticuerpo
conjugado con el FITC durante 15 minutos; luego se lava el exceso
de reactivo con solución salina tamponada con fosfatos (PBS).
Las áreas teñidas se montan y observan al microscopio bajo
iluminación epifluorescente. Si hay virus de la influenza A o B
presente, se apreciará una fluorescencia característica, intensa y
de color verde manzana con el reactivo correspondiente dentro
del citoplasma y el núcleo de las células, la cual contrasta con la
tinción de fondo roja de las células no infectadas
Los anticuerpos monoclonales utilizados en esta prueba
provienen del Department of Health and Human Services, Public
Health Service, Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia,
EE.UU.
El inmunógeno utilizado para producir los anticuerpos de la
influenza A incluye las cepas A / Puerto Rico / 8 / 34 (H1N1) y A
/ Bangkok /1 / 79 (H3N2). El inmunógeno utilizado para producir
los anticuerpos de la influenza B incluye las cepas B / Lee / 40 and
B / Singapore/-222 / 79.
4.
DEFINICIONES
En la información del producto se han utilizado los siguientes
símbolos.
Tiña el portaobjeto inmediatamente después de abrirlo.
Código de producto y número de catálogo
5.4. MEDIO DE MONTAJE Listo para el uso. Almacene el medio de montaje a una temperatura
de 2-8°C. Deje reposar el medio de montaje durante 5 minutos a
temperatura ambiente (entre 15-30°C) antes de usarlo.
Consulte las instrucciones de uso
N
Contenido suficiente para <N> ensayos
5.5.
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Listo para el uso. Almacene los reactivos A y B que no haya
usado en la oscuridad, a una temperatura de 2-8°C. Deje
reposar el reactivo durante 5 minutos a temperatura ambiente
(entre 15-30°C) antes de usarlo.
Código de lote
6.
REACTIVOS ADICIONALES
6.1. REACTIVOS
Acetona fresca (para fijación).
Límite de temperatura
REACTIVOS SUMINISTRADOS
50 - Cada kit contiene materiales suficientes para ensayar 50
preparados de cultivo celular. - La vida útil del kit es la indicada
en el rótulo de la caja exterior.
5.1.
REACTIVOS DE LA PRUEBA IMAGEN INFLUENZA A Y B
VIRUS
Un folleto de Instrucciones de uso.
2 portaobjetos de 2 pocillos para control
positivo que contienen células renales de
mono verde africano (Vero) infectadas con el
virus de la influenza A o B en áreas de pocillo
separadas.
Un frasco de cada uno de los siguientes:
3mL de medio de montaje. El medio
de montaje contiene un inhibidor de la
fotodecoloración en una solución de glicerol
(pH 10,0).
1,4mL de reactivo de la prueba IMAGEN
Influenza A. El reactivo contiene anticuerpos
monoclonales murinos purificados, específicos
del virus de la influenza A conjugados con FITC.
Los anticuerpos monoclonales están dirigidos
a la proteína matriz y la nucleoproteína de la
influenza A.
1,4mL de reactivo de la prueba IMAGEN
Influenza B. El reactivo contiene anticuerpos
monoclonales murinos purificados, específicos
del virus de la influenza B conjugados con
FITC. Los anticuerpos monoclonales están
dirigidos a la nucleoproteína y la proteína
hemaglutinina de la influenza B.
5.2. PREPARACIÓN, ALMACENAMIENTO Y REUTILIZACIÓN DE
LOS COMPONENTES DEL KIT
Para optimizar la eficacia del kit, es importante almacenar los
componentes del kit no utilizados conforme a las siguientes
instrucciones:
5.3.
PORTAOBJETOS
DE
CONTROL
REACTIVOS DE IMAGEN INFLUENZA A Y B -
/
Fabricante
Fecha de caducidad
5.
portaobjetos que no haya usado a una temperatura de 2-8°C.
Deje reposar el portaobjeto en su bolsa durante 5 minutos a
temperatura ambiente (entre 15-30°C) antes de abrir el envase.
POSITIVO
-
Los portaobjetos de control positivo vienen cada uno en una
bolsa de laminado sellada y llena de nitrógeno. Almacene los
Solución salina tamponada con fosfatos (PBS) de pH 7,5 para lavar
los especímenes teñidos y para la preparación de especímenes.
6.2. ACCESORIOS
Los productos que siguen son para el uso conjunto con IMAGEN
Influenza Virus A y B. Para más información, contacte con la
delegación o el distribuidor local de Oxoid.
Generalidades
Su delegación local o distribuidor de Oxoid puede proveerle
portaobjetos para microscopio recubiertos de Teflón, con un
único pocillo de 6mm de diámetro (100 portaobjetos por caja,
número de catálogo S611430-6).
IMAGEN Influenza Positive Control Slide (número de catálogo
S611230-2).
7.
EQUIPOS
Se requieren los siguientes equipos:
Pipeta de precisión y puntas desechables para servir 25µL
Baño de lavado
Cubreobjetos adecuado para cubrir un pocillo de diámetro 6mm
Aceite de inmersión no fluorescente
Microscopio por epifluorescencia con sistema de filtros para FITC
(longitud de onda de excitación máxima 490nm, longitud de onda
de emisión media 520nm) y aumento x200 – x500
Incubador a 37°C
Centrifugadora de baja velocidad.
Para especímenes directos
Extractor de moco (sólo para especímenes nasofaríngeos)
Para confirmación de cultivos
Hisopos estériles, medio de transporte viral (VTM) y un recipiente
adecuado para recoger, transportar y cultivar los virus de influenza
Líneas de células recomendadas para cultivar y aislar los virus de
influenza
8.
PRECAUCIONES
- Para uso diagnóstico in vitro. Toda persona que realice
un ensayo con este producto debe estar capacitada para usarlo y
tener experiencia en materia de procedimientos de laboratorio.
8.1. PRECAUCIONES DE SEGURIDAD
8.1.1
Los reactivos de IMAGEN Influenza A y B contienen azida
sódica 15mmol/L, la cual es tóxica. La azida sódica puede
reaccionar con las cañerías de plomo y cobre, formando
azidas metálicas explosivas. Siempre que deseche
productos que contienen azida, abra el grifo y deje que
salga abundante agua para despejar las cañerías.
8.1.2
Los virus Influenza A y B del porta control positivo
han sido procesados de tal forma que no contienen
microorganismos vivos detectables; sin embargo para
mayor seguridad deben manipularse y eliminarse como
si fueran potencialmente infecciosos.
8.1.3
Si se sospecha infección por un virus nuevo de la influenza
A en función de los criterios de las pruebas de cribaje
clínicas y epidemiológicas actuales, recomendadas
por las autoridades de salud pública, los especímenes
deben ser recogidos con las precauciones adecuadas
de control de infecciones por virus nuevos y virulentos
de la gripe, y deben ser enviados al laboratorio central
de referencia para su evaluación. No se debe intentar
realizar cultivo vírico en estos casos, a menos que se
disponga de instalaciones con seguridad biológica de
nivel 3 o superior para recibir y realizar el cultivo de los
especímenes.
8.1.4
El reactivo contiene tintura azul de Evans. Ésta puede
ser carcinógena, por lo cual debe evitarse que entre en
contacto con la piel.
8.1.5
Se debe tener cuidado al usar el medio de montaje, ya
que puede irritar la piel. Si entra en contacto con la piel,
debe lavarse con agua.
8.1.6
No se aplique cosméticos, beba, coma, fume ni
almacene o prepare alimentos dentro del área de
trabajo designada.
8.1.7
No pipetee los materiales con la boca.
8.1.8
Lleve guantes desechables cuando manipule
especímenes clínicos y células infectadas, y lávese
siempre las manos después de trabajar con materiales
infecciosos.
8.1.9
Deseche todos los especímenes clínicos con arreglo a la
legislación local.
8.1.10 Los usuarios profesionales pueden solicitar una hoja de
datos sobre seguridad.
8.2. PRECAUCIONES TÉCNICAS
8.2.1
No use los componentes pasada la fecha de caducidad
impresa en las etiquetas. No mezcle ni intercambie lotes
diferentes de reactivos.
8.2.2
Los reactivos se suministran con concentraciones de
trabajo fijas. La eficacia de la prueba se verá afectada
negativamente si los reactivos se modifican o almacenan
en condiciones distintas a las explicadas en el apartado
5.
8.2.3
Prepare una nueva tanda de solución salina tamponada
con fosfatos (PBS), suficiente para el trabajo del día.
8.2.4
Es necesario lavar con PBS. Si usa cualquier otra solución
de lavado, tal como agua del grifo o agua destilada,
puede invalidar los resultados de la prueba.
8.2.5
Evite la contaminación microbiana de los reactivos.
8.2.6
No congele los reactivos.
9.
RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE ESPECÍMENES7,8
La recogida y preparación de especímenes es de fundamental
importancia para diagnosticar la infección viral respiratoria
por los métodos de inmunofluorescencia y cultivo celular. Los
especímenes se deben tomar del sitio de la infección durante
el momento de máxima liberación de virus, de modo que
contengan la mayor cantidad posible de material infectado.
Deben prepararse de manera que se conserven células intactas
libres de moco adherido, etc., para la microscopía directa de los
especímenes, o de forma que se preserve la viabilidad de los virus
en los especímenes a ser cultivados.
9.1. ESPECÍMENES CLÍNICOS
9.1.1 Aspirados/secreciones nasofaríngeos
Recogida
Recoja especímenes de la región nasofaríngea en un extractor de
moco usando un tubo de alimentación de calibre 8. Mantenga
el extractor de moco y el tubo a entre 2-8°C, y envíelos lo antes
posible al laboratorio para su procesamiento.
Separación de células
De ser necesario, agregue 2mL de solución salina tamponada con
fosfatos (PBS) al espécimen antes de centrifugar, a fin de reducir
la viscosidad y diluir el moco. Centrifugue el extractor de moco
a temperatura ambiente (15-30°C) durante 10 minutos a 380g.
Retire el sobrenadante, el cual se puede usar para cultivo celular.
Resuspenda el precipitado de células en 2mL de PBS y pipetee
delicadamente las células hacia arriba y abajo con una pipeta de
gran calibre, o mezcle suavemente con un vórtex hasta que se
disuelva el moco y se libere el material celular. Evite el pipeteo o la
aplicación de vórtex excesivamente enérgicos, para evitar dañar
las células. Cuando se haya obtenido una suspensión uniforme,
agregue más PBS según sea necesario. Pipetee o aplique la
máquina vórtex luego de añadir el PBS adicional, a fin de seguir
lavando las células. Retire y deseche los elementos visibles de
moco que todavía queden. El moco sobrante se debe quitar, ya
que impide la penetración adecuada del reactivo y puede causar
fluorescencia no específica.
Si todas las secreciones quedan en el tubo de alimentación y al
extractor de moco no llega nada, elimine por lavado todas las
secreciones del tubo usando PBS. La mejor manera de lograrlo es
insertando una pipeta Pasteur en el extremo del tubo que estaba
conectado al extractor de moco. Aspire el fluido correspondiente
al tubo y expúlselo repetidamente, hasta que se desalojen las
secreciones adheridas a la pared del tubo. Pipetee la suspensión
hacia arriba y hacia abajo, hasta que el moco se haya disuelto
adecuadamente.
Preparación de portaobjetos
Una vez finalizado el proceso de separación de células, centrifugue
la suspensión celular resultante a temperatura ambiente
(15-30°C) durante 10 minutos a 380g y deseche el sobrenadante.
Resuspenda el precipitado de células en PBS suficiente como
para diluir el moco que queda, pero manteniendo una elevada
densidad de células. Coloque 25µL del precipitado de células
resuspendido en las áreas de pocillo del portaobjeto.
Permita que el espécimen se seque bien al aire, a temperatura
ambiente (15-30°C) y luego fíjelo en acetona fresca a temperatura
ambiente (15-30°C) durante 10 minutos. Si el espécimen no se
tiñe inmediatamente, almacénelo a -70°C durante toda la noche.
Someta los portaobjetos a ensayo dentro de las dos semanas
siguientes a su preparación, ya que podrían sufrir deterioro si las
almacena por un plazo prolongado.
9.2. CULTIVO DE CÉLULAS
Inoculación de cultivos de células
Los especímenes recogidos para el diagnóstico de infecciones por
virus de influenza deben inocularse en las líneas celulares que se
utilizan habitualmente en el laboratorio, conforme a los métodos
de laboratorio establecidos. Los cultivos de células deben
examinarse con frecuencia por si aparece el efecto citopático
(ECP), y también se deben realizar periódicamente pruebas
de hemadsorción. Los cultivos con un resultado positivo de
hemadsorción o los cultivos de células que presenten ECP pueden
recogerse y someterse a ensayo para determinar la presencia de
virus de influenza A o influenza B.
Preparación de portaobjetos
Introduzca las células en el medio de cultivo raspando la
lámina de células con una pipeta estéril. Deposite las células
por centrifugación a 200g durante 10 minutos a temperatura
ambiente (15-30°C) y quite el sobrenadante.
Lave las células resuspendiendo el precipitado celular en PBS y
repita la centrifugación. Quite el sobrenadante y resuspenda el
precipitado celular en un pequeño volumen de PBS fresco, a fin
de mantener una densidad de células elevada.
Coloque alícuotas de 25mL de la suspensión de células en pocillos
separados de los portaobjetos. Permita que se seque bien al aire y
luego fíjelo en acetona fresca , a temperatura ambiente (15-30°C)
durante 10 minutos. Si el espécimen no se tiñe inmediatamente,
almacénelo a 4°C durante toda la noche o a -70°C hasta que
lo necesite. Someta los portaobjetos a ensayo dentro de las
dos semanas a partir de su preparación, ya que podrían sufrir
deterioro si las almacena por un plazo prolongado.
10.
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
CONSULTE EL APARTADO 8.2 PRECAUCIONES TÉCNICAS ANTES
DE REALIZAR EL PROCEDIMIENTO DE ENSAYO.
10.1. AGREGADO DE REACTIVO
Agregue 25µL del Reactivo A a una zona del preparado celular ya
fijado en un pocillo de 6mm y 25µL del Reactivo B a otra zona del
preparado celular ya fijado de otro pocillo de 6mm del preparado
(vea el apartado 6), o a los pocillos correspondientes en un
portaobjeto de control positivo. Asegúrese de que los reactivos
abarcan toda el área del pocillo. Reactivo A se debe utilizar en
un pozo positve y el reactivo B se debe utilizar en el bienestar
positivo B
10.2. PRIMERA INCUBACIÓN
Incube los portaobjetos con reactivos en una cámara húmeda
durante 15 minutos a 37°C. NO permita que los reactivos se
sequen sobre el espécimen ya que ello haría aparecer una tinción
no específica.
10.3. LAVADO DEL PORTAOBJETO
Lave el exceso de reactivo con solución salina tamponada con
fosfatos (PBS), y luego lave el portaobjeto cuidadosamente en un
baño con agitación que contenga PBS durante 5 minutos. Deje
escurrir el PBS y permita que el portaobjeto se seque al aire a
temperatura ambiente (15-30°C).
10.4. AGREGADO DE MEDIO DE MONTAJE
Agregue una gota de medio de montaje al centro de cada
pocillo y coloque un cubreobjetos sobre el medio de montaje
y el espécimen, asegurando que no queden burbujas de aire
atrapadas.
10.5. LECTURA DEL PORTAOBJETO
Examine todas las áreas de pocillo que contienen el espécimen
teñido usando microscopía por epifluorescencia. La fluorescencia,
según se describe en el apartado 11, debe ser visible con un
aumento de entre x200 y x500. (Los mejores resultados se
obtienen examinando los especímenes inmediatamente después
de la tinción, pero se pueden guardar hasta 24 horas en la
oscuridad, entre 2-8°C).
11.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA
PRUEBA
11.1. CONTROLES
11.1.1 Portaobjetos de control positivo
Una vez teñido y observado como se describe en el apartado
10, el portaobjeto de control positivo debe presentar células
con fluorescencia intracelular, nuclear y/o citoplásmica, de color
verde manzana, con un fondo de material con contratinción.
Estas células son algo más grandes que las células epiteliales
respiratorias, pero presentan una fluorescencia similar nuclear
y/o citoplásmica cuando están infectadas por virus de influenza.
Use portaobjetos de control positivo para verificar que el
procedimiento de tinción se ha realizado de forma satisfactoria.
Estos portaobjetos se preparan con cepas de virus de influenza
en monocapas de cultivo celular; sólo constituyen un control
adecuado del procedimiento de ensayo, pero no de los pasos
de procesamiento del espécimen. Los procedimientos de
procesamiento del espécimen se deben controlar usando
material clínico.
11.1.2 Control negativo
Si necesita un portaobjeto de control negativo, se recomienda
el uso de células no infectadas e intactas del tipo usado para
cultivar y aislar el virus de la influenza. Prepare y fije las células
según se describe en el apartado 9.2, y tíñalas como se indica en
el apartado 10.
11.2. ESPECÍMENES CLÍNICOS
11.2.1 Aspecto de las células infectadas por virus de influenza
Se aprecia fluorescencia de color verde manzana intracelular,
nuclear y/o granular citoplásmica en las células epiteliales
conjuntivas o respiratorias infectadas por virus de influenza.
Las células no infectadas se tiñen de rojo por la contratinción azul
de Evans.
11.2.2 Interpretación
El diagnóstico es positivo cuando una o más células del espécimen
fijado y teñido presentan fluorescencia específica, según se
describe en el apartado 11.2.1, ya sea ante el reactivo del virus
de la influenza A o la influenza B.
Se obtiene un diagnóstico negativo cuando los especímenes,
fijados y teñidos, no presentan fluorescencia ante ninguno de los
reactivos.
En el caso de los especímenes de aspirados nasofaríngeos, deberá
observar no menos de 20 células epiteliales respiratorias no
infectadas para considerar negativo el resultado. Vea el apartado
11.2.3 para el caso de un número insuficiente de células.
En cuanto a los especímenes tomados de otros lugares (p. ej.,
esputos), se deben observar no menos de 50 células epiteliales
respiratorias para considerar negativo el resultado.
11.2.3 Células insuficientes
Si no hay suficientes células en el portaobjeto deberá centrifugar
el resto del espécimen clínico a 380g durante 10 minutos a
temperatura ambiente (15-30°C). Resuspenda las células en
un volumen menor de PBS antes de redistribuirlas (25µL) por
las áreas de los pocillos. Como alternativa, puede solicitar la
repetición de la toma de espécimen clínico.
11.3. CONFIRMACIÓN DE CULTIVO CELULAR
11.3.1 Aspecto de las células infectadas por virus de influenza
Las células infectadas presentarán una fluorescencia verde
manzana intracelular, nuclear y/o citoplásmica, y deben
registrarse como positivas a la influenza.
Las células no infectadas aparecerán contrateñidas de rojo por
la tinción azul de Evans, y se registrarán como negativas a la
influenza.
11.3.2 Interpretación de los resultados
El diagnóstico es positivo cuando una o más células del espécimen
fijado y teñido presentan la pauta de fluorescencia típica, según
se describe en el apartado 11.3.1, ante el reactivo IMAGEN del
virus de la influenza A o la influenza B.
Deberá observar en el pocillo del portaobjeto no menos de 50
células no infectadas del cultivo celular bajo estudio para poder
considerar el resultado negativo. Vea el apartado 11.2.3 para el
caso de un número insuficiente de células.
11.3.3 Células insuficientes
Si no hay suficientes células en el portaobjeto deberá centrifugar
el resto del espécimen clínico a 2000g durante 10 minutos a
temperatura ambiente (15-30°C). Resuspenda las células en un
volumen menor de PBS antes de redistribuir (25µL) por el área
del pocillo. Como alternativa, puede solicitar la repetición de la
toma de espécimen clínico.
12.
LÍMITES DE EFICACIA
12.1. Utilice sólo el medio de montaje provisto.
12.2. El aspecto visual de la imagen fluorescente obtenida
puede variar en función del tipo de microscopio y la
fuente luminosa utilizados.
12.3. Se recomienda usar 25µL de reactivo para cubrir el área
de un pocillo de 6mm. Un volumen más reducido que
el anterior puede dificultar la cobertura de la zona de
espécimen y podría reducir la sensibilidad.
12.4. Todos los reactivos se suministran con concentraciones
de trabajo fijas. La eficacia de la prueba se puede ver
afectada por cualquier modificación de los reactivos, o si
no las almacena en las condiciones recomendadas.
12.5. La ausencia de detección de los virus de la influenza
puede deberse a varios factores, tales como una recogida
inadecuada, toma de muestras y/o manipulación
incorrectas, defecto del cultivo celular, etc. Un resultado
negativo no descarta la posibilidad de que haya una
infección por virus de influenza.
12.6. La prueba IMAGEN Influenza virus A y b detecta antígenos
específicos de los tipos de influenza A y B. No sirve para
identificar subtipos de influenza A y de influenza B.
12.7. La presencia de virus de influenza en las secreciones
nasofaríngeas no necesariamente excluye la posibilidad
de una infección por otros patógenos. Los resultados
de las pruebas deben interpretarse en conjunto con la
información obtenida en los estudios epidemiológicos,
el diagnóstico clínico del paciente y otros procedimientos
diagnósticos.
12.8. La tinción no específica se observa a veces como un
artefacto de las pruebas inmunoquímicas debido a enlaces
entre regiones Fc del anticuerpo y el antígeno de proteína
A que se halla en la pared celular de algunas cepas de
Staphylococcus aureus9. El reactivo de la prueba IMAGEN
Influenza virus A y B ha sido modificado de modo que no
forme un enlace con la proteína A de la cepa Cowan 1 de
Staphylococcus aureus.
12.9. Los resultados de las pruebas deben interpretarse en
conjunto con la información obtenida en los estudios
epidemiológicos, la evaluación clínica del paciente y otros
procedimientos diagnósticos.
12.10. Los individuos que han recibido vacuna contra la influenza
A por vía nasal pueden tener resultados positivos durante
tres días después de la vacunación.
13.
VALORES ESPERADOS
En las zonas de clima templado, los brotes de gripe – tanto de
tipo A como tipo B – se producen por lo general a fines del otoño
y comienzos de la primavera. En las zonas tropicales, en cambio,
la temporada de prevalencia está menos definida.
Por lo general, las tasas de infección por el virus de la
influenza A en adultos y niños no inmunizados son similares;
las manifestaciones clínicas de la infección presentan una
correlación inversa con la edad10,11,12. Durante las epidemias de
virus de influenza B, las tasas de ataque más elevadas aparecen
generalmente entre niños de edad escolar13,14. Durante el curso
de un invierno en el cual el virus de la influenza prevalente ya
haya estado circulando algunos años y, por lo tanto, un alto
porcentaje de la población está inmunizado, se halla que los virus
de la influenza son responsables de aproximadamente el 15% de
todas las infecciones respiratorias. Cuando en la comunidad se ha
introducido una nueva cepa antigénica del virus de la influenza, y
cuando un alto porcentaje de quienes se ven expuestos al mismo
no está inmunizado, dicha cepa del virus de la influenza puede
causar hasta el 50% de todas las infecciones respiratorias. En un
brote definido y reconocido la tasa de detección puede acercarse
al 100% si se utilizan para el diagnóstico métodos de detección
tanto serológicos como de antígeno15.
14.
CARACTERÍSTICAS DE TINCIÓN ESPECÍFICAS
14.1. REACTIVIDAD DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES
Se ha demostrado por inmunoensayo que los anticuerpos
monoclonales utilizados en esta prueba son específicos de un
tipo determinado. Los anticuerpos del virus de la influenza A
detectarán las cepas H1N1, H2N2, H3N2 del virus de la influenza
A, mientras que los anticuerpos del virus de la influenza B
detectarán distintos tipos de virus de influenza B reunidos entre
1940 y 19846,16,17.
14.2. ESTUDIOS CLÍNICOS
La prueba IMAGEN Influenza virus A y B ha sido evaluada en 2
centros de ensayos clínicos para el uso directo en secreciones
nasofaríngeas y esputos recogidos de niños y adultos internados
con síntomas de infección respiratoria. La prueba también se ha
evaluado en 5 centros de ensayo en cultivos celulares de cepas
de stock para confirmar la presencia de virus de influenza. Estos
estudios se llevaron a cabo en los EE.UU., Europa y el Lejano
Oriente.
Los centros de ensayo realizaron pruebas directas en 213
especímenes clínicos y 227 especímenes para confirmación
de cultivo celular. Las cepas detectadas por los anticuerpos
monoclonales en la prueba IMAGEN Influenza virus A y B
comprendieron 22 distintas cepas de virus de la influenza A,
y 20 cepas distintas del virus de la influenza B. Los métodos
estándar (de referencia) utilizados fueron una prueba de
inmunofluorescencia indirecta realizada directamente sobre
especímenes, y cultivos celulares en células renales de babuino,
células MDCK o huevos de gallina embrionados. Los cultivos
positivos de virus fueron confirmados por inmunofluorescencia
indirecta usando anticuerpos monoclonales o policlonales, o bien
inhibición de hemoaglutinación (HAI).
14.3. EFICACIA CLÍNICA
14.3.1 Especímenes directos
Los especímenes clínicos se reunieron fundamentalmente
durante los inviernos (boreales) de 1984-1987, y los centros
de ensayo compararon la prueba IMAGEN Influenza virus A y B
con métodos estándar. En estas evaluaciones se usaron tanto
especimenes clínicos frescos como especímenes previamente
congelados.
Se consideró positivo un resultado del método de referencia
si el cultivo celular o la inmunofluorescencia indirecta en un
espécimen directo resultaban positivos. Esto permitió que la
presencia de virus inviables se detectara por fluorescencia, y la
de virus libres de células se detectara mediante cultivo celular.
En la tabla 14.3.1 se muestran los resultados obtenidos con
el reactivo IMAGEN Influenza virus A. La incidencia global de
influenza en estas poblaciones fue del 24,9%. Los resultados
IMAGEN Influenza A presentaron correlación con las pruebas
estándar en 211 casos (99,1%). La sensibilidad de la prueba fue
del 96,2% (51 de 53) y la especificidad del 100% (160 de 160),
asumiendo que las pruebas de referencia fueron sensibles y
específicas al 100%. Los valores predictivos para los resultados
positivos y negativos fueron del 100% 51 de 51) y del 98,8% (160
de 162) respectivamente.
La sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos se
calcularon como se describió anteriormente18.
En la tabla 14.3.2 se muestran los resultados obtenidos con
el reactivo IMAGEN Influenza virus B. La incidencia global de
influenza B en estas poblaciones fue del 7,0%. Esto refleja la
baja prevalencia de la influenza B en Europa durante los ensayos
clínicos. Los resultados de IMAGEN Influenza B presentaron
correlación con las pruebas estándar en 210 casos (98,6). La
sensibilidad de la prueba fue del 86,7% (13 de 15) y la especificidad
99,5% (197 de 198) Los valores predictivos para los resultados
positivos y negativos fueron del 92,9% (13 de 14) y del 98,9% (197
de 199) respectivamente.
Tabla 14.3.1
Comparación entre los resultados de
las pruebas usando el reactivo IMAGEN Influenza virus A
directamente en especímenes clínicos con los resultados de las
pruebas estándar
PRUEBA RESULTADOS
Método estándar
IMAGEN Influenza virus A
Centro 1
Centro 2
N° total de especímenes (213)
Neg
Neg
59
101
160
Pos
Pos
35
16
51
Pos
Neg
1
1
2
Neg
Pos
0
0
0
Tabla 14.3.2
Comparación entre los resultados de
las pruebas usando el reactivo IMAGEN Influenza virus B
directamente en especímenes clínicos con los resultados de las
pruebas estándar
PRUEBA RESULTADOS
Método estándar
IMAGEN Influenza virus B
Centro 1
Centro 2
N° total de especímenes (213)
Neg
Neg
81
116
197
Pos
Pos
12
1
13
Pos
Neg
1
1
0
Neg
Pos
1
0
1
14.3.2 Confirmación de cultivo
Cinco centros de ensayos analizaron IMAGEN Influenza virus A
y B en aislados clínicos y en cepas de stock aisladas en cultivos
celulares. El virus se aisló en células renales de mono babuino,
primarias o secundarias, o en células renales caninas de MadinDarby (MDCK). Los cultivos celulares se lavaron en PBS antes de
aplicarlos a los portaobjetos (ver apartado 9.2). Los portaobjetos
se fijaron en acetona y luego se analizaron usando los reactivos
de IMAGEN Influenza virus A y b. En esta evaluación se usaron
tanto aislados clínicos frescos como especímenes previamente
congelados.
Se evaluaron en total 227 cultivos, entre los cuales 54 cultivos
eran positivos al virus de la influenza A y 30 cultivos eran positivos
al virus de la influenza B. Los aislados de cultivo celular fueron
confirmados por inmunofluorescencia o por inhibición de
hematoaglutinación (HAI).
Los resultados (tablas 14.3.3 y 14.3.4) indican que el reactivo
del virus de la influenza A detectó todos los virus de influenza A
aislados (sensibilidad 100%), y el reactivo del virus de la influenza
B detectó todos los virus de influenza B aislados (sensibilidad
100%).
La especificidad de ambos reactivos fue del 100%.
Tabla 14.3.3
Comparación entre los resultados de las
pruebas usando el reactivo IMAGEN Influenza virus A para
confirmación de cultivo con los resultados de las pruebas
estándar
PRUEBA RESULTADOS
Método estándar
IMAGEN Influenza virus A
Centro 1
Centro 2
Centro 3
Centro 4
Centro 5
N° total de especímenes (227)
Neg
Neg
59
27
43
23
21
173
Pos
Pos
13
1
13
22
5
54
Pos
Neg
0
0
0
0
0
0
Neg
Pos
0
0
0
0
0
0
Tabla 14.3.4
Comparación entre los resultados de las
pruebas usando el reactivo IMAGEN Influenza virus B para
confirmación de cultivo con los resultados de las pruebas
estándar
PRUEBA RESULTADOS
Método estándar
IMAGEN Influenza virus B
Centro 1
Centro 2
Centro 3
Centro 4
Centro 5
N° total de especímenes (227)
Neg
Neg
69
25
54
27
22
197
Pos
Pos
3
3
2
18
4
30
Pos
Neg
0
0
0
0
0
0
Neg
Pos
0
0
0
0
0
0
14.4. REACTIVIDAD CRUZADA
La prueba IMAGEN Influenza virus A y B se realizó en preparados
de otros virus y organismos cuya presencia es probable
en secreciones respiratorias o cultivos celulares. Todos los
organismos analizados (tabla 14.4) dieron negativo con los dos
reactivos de IMAGEN Influenza virus A y B.
Tabla 14.4
Organismos analizados por IMAGEN Influenza
virus A y B que no reaccionaron
Acholeplasma laidlawii
Adenovirus types 1 5 y 7
Bordetella parapertussis
Bordetella pertussis
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Coxsackie virus types A9 y B4
Cytomegalovirus
Echovirus types 3, 6, 9, 11 y 22
Epstein-Barr virus
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Mycoplasma orale
Mycoplasma hominis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hyorhinus
Neisseria meningitidis A
Neisseria meningitidis B
Neisseria lactamica
Neisseria perflava
Neisseria cinerarea
Parainfluenza virus types 1, 2
y3
Foamy virus
Pneumocystis carinii
Herpes simplex virus types 1 y 2 Polio virus types 1 y 2
Legionella pneumophila
Respiratory syncytial virus
Measles virus
Rhinovirus
Mumps virus
Simian virus types 5 y 40
Mycobacterium tuberculosis
Staphylococcus aureus
Mycobacterium avium
Streptococcus gps A,B,C,D F y G
Mycobacterium intracellulare Varicella zoster virus
15.
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