índice general

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Presenta:
Vázquez Gómez Estrella Trinidad
Asesoras:
Dra. Laura J. Pérez Flores
Profesor Titular “C” T. C.
M. en B. E. Beatriz Buentello Volante
Profesor Asociado “A” M. T.
Mèxico, D. F. Abril, 2006.
Abreviaturas
ABA
Ácido abscísico
AIA
Ácido indol –3- acético
AIB
Ácido indol –3- butírico
DAG
1,2 diacilglicerol
DAGK
Diacilglicerol cinasa
DAGPP
Diacilglicerol pirofosfato
IP3
Inositol 1,4,5 trifosfato
LPA
Ácido liso-fosfatídico
MAPK
Proteín-cinasa activada por mitógenos
PA
Ácido fosfatídico
PAK
Ácido fosfatídico cinasa
PAP
Ácido fosfatídico fosfatasa
PC
Fosfatidilcolina
PE
Fosfatidiletanolamina
PG
Fosfatidilglicerol
PI
Fosfatidilinositol
PIP
Fosfatidilinositol monofosfato
PIP2
Fosfatidil inositol 4,5 bifosfato
PKC
Proteín cinasa C
PLA
Fosfolipasa A
PLC
Fosfolipasa C
PLD
Fosfolipasa D
PS
Fosfatidilserina
2
Agradecimientos
A la Dra. Laura J. Pérez Flores, por permitir que me uniera a su
equipo de trabajo, por su asesoramiento y por las facilidades que me
brindo para el desarrollo de el proyecto.
A la M. en B. E. Beatriz Buentello Volante por su apoyo
incondicional, sus asesorías,
su tiempo dedicado
y sobre todo su
paciencia durante todo el desarrollo de este proyecto.
A los integrantes de laboratorio: M. en C. Fernando Díaz de León y
Dr. Fernando Rivera, Xochil, Julio, Juan, Maribel, Lucía, Saraí, Esther y
sobre todo Lluvia por haberme brindado su amistad y darme animos, pero
sobre todo por haber hecho agradable mi estancia durante este año donde
lleve a cabo este proyecto.
Con especial agradecimiento a mi Madre por todo el esfuerzo que
hizo para ayudarme en todos los aspectos,
a mi Padre, hermanas y
hermano por la colaboración y ayuda para la terminación de mis estudios.
A mi pareja Luis Fernando y a mis hijas Itzel Carolina y Quetzalli Mariana
por la comprensión y sacrificio de el tiempo que pudieran haber
compartido conmigo.
No podían faltar mis suegros
y demás amigos que pusieron un
granito de arena debes en cuando para que yo pudiera cumplir esta meta.
3
Resumen
Las auxinas constituyen un grupo de hormonas vegetales que tienen
diversos efectos en el crecimiento y desarrollo vegetal, regulando múltiples
respuestas bioquímicas y fisiológicas.
El mecanismo de acción a nivel molecular de las auxinas no se conoce
con precisión. En la literatura se tiene conocimiento de algunos
intermediarios de las cascadas de transducción de señales de auxinas
desde su percepción hasta la alteración de la expresión génica u otras
respuestas que podrían ser la clave para entender el (los) mecanismo (s)
de acción primario(s) de las auxinas por lo que es importante ver si
algunos fosfoínositidos participan como segundos mensajeros.
En este proyecto se analizó la participación de la fosfolipasa D en la
vía de transducción de auxinas. Para esto se determinaron los niveles de
fosfoinosítidos (PI, PIP2, PA). Los resultados indican que no hubo
diferencias significativas en los niveles de los fosfoinosítidos estudiados
tanto en la parte aérea como en la radícula de ejes embrionarios de maíz
en los tratamientos con auxinas (natural y sintética) con respecto al testigo
en los diferentes periodos de incubación.
Con los resultados obtenidos podemos decir que aparentemente el PA
no participa como segundo mensajero en la vía de transducción de
auxinas.
4
Marco Teórico
Hormonas vegetales
Se conocen como hormonas vegetales a los compuestos o sustancias
químicas que se sintetizan en la planta, donde actúan a muy bajas
concentraciones, regulando el crecimiento, desarrollo o metabolismo
vegetal. Las hormonas y reguladores del crecimiento vegetal se agrupan en
familias. Las más importantes y representativas son: las auxinas, las
giberelinas, las citoquininas, el etileno y el ácido abscísico
(Granell y
Carbonell, 1995).
Auxinas
Son hormonas vegetales que tienen un papel central en el
crecimiento
y
desarrollo
vegetal,
regulando
diversas
respuestas
bioquímicas y fisiológicas (Granell y Carbonell, 1995).
Existen dos tipos de auxinas las naturales y las sintéticas. El ácido
indol -3- acético (AIA), se considera la auxinas natural más importante
(Napier y Venis, 1991; Sitbon y Perrot, 1997). Otras auxinas naturales
identificadas son: 4-Cl-AIA y el ácido indol-3-butírico (AIB). Entre las
auxinas sintéticas que inducen efectos similares a las naturales y además
se utilizan como herbicidas, están el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D),
el ácido 4-naftalenacético (4-ANA) y el ácido 3,6 dicloro o-anísico
(DICAMBA) (Sitbon y Perrot, 1997).
Efectos de las auxinas
Las auxinas participan en diversos procesos a diferentes niveles:
™En la planta completa: regulan la dominancia apical, las respuestas
trópicas, la formación de raíces laterales, el desarrollo de tejidos
vasculares y la senescencia (Guilfoyle y col., 1998; Walter y Estelle,
1998).
5
™En
las
células
regulan
el
alargamiento,
la
división
y
la
diferenciación celular (Guilfoyle y col., 1998; Walter y Estelle, 1998;).
™A nivel molecular inducen la actividad de la ATPasa de protones de
la membrana plasmática (Macdonald, 1997) y la expresión de genes
específicos de respuesta a auxinas, tales como los de la familia
Aux/AIA, la familia SAUR, la familia GH3 y genes que codifican para
proteínas ribosomales (Gantt y Key, 1985; Abel y Theologis, 1996).
Por otra parte, las auxinas se han asociado con cambios en el patrón de
proteínas sintetizadas y con la inducción de la fosforilación de proteínas
ribosomales (Pérez y col., 1987; Pérez y col., 1990).
Aunque no se conoce con precisión el (los) mecanismo (s) de acción a
nivel molecular de las auxinas, se tiene conocimiento de algunos
intermediarios de la(s) cascada(s) de transducción de señales de estas
hormonas desde su percepción hasta la alteración de la expresión genética
u otras respuestas. (Abel y Theologis, 1996).
Fosfolípidos
En 1953 Hokin detecto por primera vez en animales el sistema de
señalización
celular
de
lípidos
de
inositol,
en
donde
observó
la
incorporación de un isótopo dentro de lípidos. En 1975 Michell sugirió que
el recambio de fosfolípidos de inositol es una manifestación de un sistema
de señalización intracelular diferente al que se conocía hasta entonces
(Irvine, 1990; Liscovitch y Cantley, 1994).
6
Los fosfolípidos de inositol son mediadores importantes entre la
célula y el ambiente, ya que son fuente de segundos mensajeros y también
pueden funcionar como efectores directos en la regulación de la actividad
de enzimas membranales (Cho y Boss, 1995; Munnik y col. 1998b).
La membrana plasmática en su porción lipídica está formada
básicamente por fosfolípidos. Estos son lípidos que contienen glicerol, dos
ácidos grasos, fosfato y un grupo cabeza (por ejemplo, inositol). Uno de
estos fosfolípidos es el fosfatidilinositol (PI) el cual puede ser fosforilado a
fosfatidilinositol monofosfato (PIP) y a fosfatidilinositol bifosfato (PIP2) (Cho
y Boss, 1995; Munnik y col. 1998b).
La diversidad de funciones biológicas de los fosfoinosítidos está dada
por su capacidad única de ser fosforilados reversiblemente en tres
posiciones distintas del anillo de inositol como grupo cabeza (fosforilación
simple o combinada en las posiciones 3, 4 y 5) (Cho y Boss, 1995; Munnik
y col. 1998b).
Muchos componentes del sistema de fosfoinosítidos que se han
encontrado en animales tienen equivalentes funcionales y/o estructurales
en células vegetales. Los principales fosfolípidos en las células vegetales
son los fosfoinosítidos y pueden constituir del 15 al 20 por ciento del total
de los fosfolípidos de la membrana plasmática y de la membrana
mitocondrial externa (Drobak, 1992; Munnik y col., 1998b; Stevenson y
col., 2000).
7
La degradación de fosfoinosítidos requiere de la hidrólisis enzimática
de los diversos enlaces éster para liberar los contituyentes. La enzimas
encargadas de dicho proceso se llaman “fosfolipasas” dentro de las cuales
se encuentran: la fosfolipasa A (PLA), la fosfolipasa C (PLC) y la fosfolipasa
D (PLD) (Fig. 1)(Bohinski, 1991).
Grupo Cabeza
Fig. 1 Acción de las fosfolipasas sobre un fosfolípido
Fosfolipasa A (PLA)
Se conocen 2 isoformas de esta enzima: PLA1 y PLA2 en función de la
cadena de ácidos grasos que se va a hidrolizar.. Esta es una acilhidrolasa
que da como resultado lisofosfolípidos y un ácido graso libre.
Su actividad se ha relacionado con respuestas de heridas y de
crecimiento. En Ricinus communis ha sido implicada en la remoción
selectiva
de
ácidos
grasos
inusuales
de
fosfolípidos
del
retículo
endoplásmico. La actividad de la PLA es un mecanismo para canalizar los
ácidos grasos inusuales a triacilgliceroles en semillas de oleaginosas,
previniendo un daño por acumulación de estos ácidos grasos. Además, es
activada por auxinas en respuestas de crecimiento (Chapman, 1998).
8
Fosfolipasa C (PLC)
Esta fosfolipasa es una fosfodiesterasa que remueve el grupo cabeza
unido a un fosfato de los fosfolípidos. Su activación es a través de
receptores acoplados a proteínas G o bien por
receptores acoplados a
tirosin-cinasas (Drobak, 1993; Munnik y col. 1998b).
La PLC rompe la unión fosfodiester del fosfatidil inositol 4,5 difosfato
(PIP2) produciendo dos segundos mensajeros; el inositol 1,4,5 trifosfato
(IP3) y el 1,2 diacilglicerol (DAG). El IP3 es soluble en agua y difunde hacia
los almacenes intracelulares de Ca2+, donde se une a receptores específicos
unidos a canales de Ca2+ promoviendo la liberación de este ión. El DAG es
altamente lipofílico permanece en la matriz de la membrana plasmática
donde activa a la proteín cinasa C (PKC). Así dos cascadas de señalización
son inciadas por la PLC involucrando la elevación de Ca2+
citosólico, lo
que resulta en la modulación de elementos de respuesta sensibles a Ca2+
y por otra parte la fosforilación de proteínas por la PKC (Drobak, 1992,
1993).
Fosfolipasa D (PLD)
Esta enzima se ha encontrado en varias especies de plantas,
animales y microorganismos. La PLD rompe la unión fosfodiester terminal
y forma ácido fosfatídico (PA) y un grupo cabeza libre, además cataliza una
reacción de transesterificación cuando un alcohol esta presente como
donador nucleofílico y así se pueden sintetizar fosfolípidos de membrana
como la fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS) y fosfatidilglicerol
(PG) a partir de fosfatidilcolina (PC) (Munnik y col., 1998a; Leiros y col.,
2000).
Se ha asociado también a la PLD con la germinación de semillas, la
senescencia, la maduración de frutos o flores, la respuesta a estrés por
temperatura o por heridas, la acción de las hormonas como el ácido
absíscico (ABA) y el etileno, y la respuesta a patógenos. Su activación al
parecer esta mediada por proteínas G (Chapman, 1998; Munnik y col.,
1998a; Laxalt y col., 2001).
9
Ácido fosfatídico (PA)
Este ácido es un lípido intermediario importante en la síntesis de
fosfolípidos y glicolípidos en el retículo endoplásmico, además se ha
propuesto como una señal intracelular en sistemas de animales y
recientemente también en vegetales (Munnik y col., 1996; Munnik y col.,
1998b; Van der Luit y col., 2000 y Munnik, 2001).
Este fosfolípido puede ser producido por dos rutas. Una ruta
involucra la hidrólisis de fosfoinosítidos por la PLC, que genera DAG, el
cual es fosforilado por la DAGK para formar PA. La otra ruta produce
directamente PA por la acción de la PLD, sobre los fosfolípidos
estructurales. Este fosfoinosítido puede ser desfosforilado por la PA
fosfatasa para formar DAG o fosforilado por la PAK para formar DAGPP,
además puede ser hidrolizado por la PLA para generar LPA (ácido lisofosfatídico) (Fig. 2).(Munnik, 2001)
Fig. 2 Metabolismo del ácido fosfatídico
10
Justificación
Existen investigaciones que han demostrado que la aplicación de
auxinas exógenas a las células y órganos vegetales influye de manera
importante sobre el crecimiento y desarrollo vegetal. El mecanismo de
acción de estas hormonas ha sido estudiado y se ha propuesto que
podrían
tener
distintas
vías
de
señalización
no
necesariamente
independientes: la vía de ubiquitina-proteosoma (Walter y Estelle, 1998) y
otra vía mediada por fosfoinosítidos (Hobbie y col., 1994; Scherer y Arnold,
1997).
Se ha reportado que entre las respuestas rápidas de las células
vegetales
a
auxinas
se
encuentra
la
activación
de
fosfolipasas,
específicamente la PLA2. En segmentos de hipocótilos de girasol el
incremento del crecimiento en respuesta a auxinas estuvo asociado a una
rápida activación (entre 15 y 30 min.) de la actividad de la PLA2 (Chapman,
1998).
Estudios previos en nuestro grupo de trabajo, demostraron que el
patrón de fosfoinosítidos varía dependiendo de la etapa de germinación del
eje embrionario y del tejido analizado. En particular en la parte aérea de
granos imbibidos por 24 hr., no se logró detectar PI, mientras que a las 48
hr. sí se detectó este fosfoinosítido. Asimismo, se observó que en ejes
embrionarios completos imbibidos por 23 hr y estimulados 1hr con α-ANA
los niveles de PA disminuyen, así como, en ejes embrionarios completos
imbibidos por 47 hr y estimulados 1 hr con AIA. Por otra parte, al analizar
el recambio de fosfosinosítidos con [32P]-ATP en la parte aérea de ejes
embrionarios imbibidos por 24 hrs se observó que la aplicación de auxinas
por 3 y 5 minutos promueven el recambio de PA. (Buentello, 2002).
11
Objetivos
General
¾Analizar la participación de la fosfolipasa D en la vía de
transducción de auxinas.
Particulares
•
Cuantificar la actividad de la PLD en la parte aérea y radícula de ejes
embrionarios de maíz tratados y sin tratar con auxinas.
•
Analizar si la auxina natural y las sintéticas activan de igual manera
a la fosfolipasas.
Hipótesis
Si en la vía de transducción de las auxinas participan diferentes
fosfolípidos como segundos mensajeros, se esperaría que estas hormonas
afectaran la actividad de las enzimas encargadas de generar estos
compuestos.
Metodología
I. Material biológico
Se usaron granos de maíz (Zea mays L. var. Chalqueño). Los granos
de maíz se desinfestarón con una solución de hipoclorito de sodio (NaOCl)
al 10% v/v por 10 minutos. Se enjuagaron tres veces con agua estéril. Los
granos se sembraron en camas de algodón humedecido y se mantuvieron
por 22 hrs. a 25º C. Se disectaron los ejes embrionarios y se trataron con
200µM de las auxinas: ácido indol-3-acético (AIA) y ácido α-naftalenacético
(α-ANA) y por diferentes períodos (3, 5, 10 y 15 minutos). Después de la
incubación, los ejes se lavaron tres veces con agua estéril. El eje se separó
en parte aérea y radícula, y cada parte se congelo en N2 líquido y se
almaceno a –70º C hasta su uso.
12
II. Obtención de membranas microsomales
Cada tejido se homogeneizó con 3 volúmenes de amortiguador de
extracción (250 mM sacarosa, 3 mM EDTA, 2 mM EGTA, 14 mM 2mercaptoetanol, 2 mM DTT, 30 mM TRIS-HCl pH=7.4) adicionando 0.05g
de polivinil polipirrolidona insoluble. Se filtró el homogenizado a través de
cuatro capas de gasa. Se centrífugo a 5000 g por 10 min., a 4º C. El
sobrenadante se centrífugo nuevamente a 100 000 g por 1hr a 4º C para
obtención de la pastilla de microsomas. Está pastilla se resuspendió en
500 µl
de HEPES 50 mM. Se determinó la concentración de proteínas
microsomales por medio de un ensayo comercial (Bio-Rad, Catalogo 5000006) basado en el método de Bradford (Cho y Boss, 1995).
III. Obtención y separación de fosfolípidos
La separación de los fosfoinosítidos se llevó a cabo utilizando una
alícuota
de
200
µg
de
proteínas
contenidas
en
las
membranas
microsomales. Se agregó 1.5 mL de una mezcla de cloroformo/metanol (1:2
v/v), 500µL de HCl 2.4 N y 500µL de cloroformo. Se agitó en vortex por 30
segundos, la fase inferior se extrajo y a la fase superior se le añadió
1000µL de cloroformo. Se agitó nuevamente en vortex por 30 seg. y se
extrajo la fase inferior combinándola con la anterior. A la fase inferior se le
agregó 2000µL de una mezcla de metanol/HCl 1N (1:1 v/v). Se separó la
fase inferior, la cual se dejó secar a temperatura ambiente por una noche.
V. Medición de la actividad Fosfolipasa D (PLD)
Los ejes embrionarios se incubaron con las auxinas como ya se
mencionó y se adicionó butanol al 0.75 %. Se separó la parte aérea y la
radícula, congelándose en N2 líquido y se almacenó a -70º C. Se obtuvieron
las membranas microsomales como anteriormente se mencionó y a partir
de éstas se obtuvieron los fosfolípidos con la metodología previamente
descrita.
13
VI. Separación y análisis de los fosfolípidos
Los
lípidos
obtenidos
se
resuspendieron
en
una
mezcla
de
cloroformo/metanol (9:1 v/v) y se separaron en placas de silica gel (Merck,
0B033695) utilizando dos mezclas de eluyente. Para visualizar el PA
proveniente de la PLD y el PA proveniente de la PLC-DAGK, se utilizo una
mezcla compuesta de acetato de etilo/ácido acético/iso-octano/agua
(13:3:2:10
v/v/v/v).
Una
la
cloroformo/metanol/acetona/ácido
segunda
mezcla
acético/agua
compuesta
de
(40:14:15:17:7
v/v/v/v/v) se utilizo para obtener el patrón general de fosoinosítidos. Los
fosfoinosítidos se revelaron por tinción con una solución de 14ml ácido
sulfúrico, 1.25g sulfato cérico de amonio y 20g ácido fosfomolíbdico en
500ml de agua. Los fosfolípidos se cuantificaron por densitometría
utilizando el programa Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html).
Resultados
En los ejes embrionarios de maíz imbibidos por 24 hrs, tratados y
sin tratar con auxinas (AIA y α-ANA) a los diferentes periodos (3,5,10 y 15
min) se detectaron los siguientes fosfoinosítidos: PI, PIP2, PA.
Niveles de PI
La aplicación exógena de auxinas (natural y sintética) en parte área
y en la radícula no cambia los niveles de PI con respecto al control (Gráfica
1 y gráfica 2).
14
PI (PARTE AÉREA)
Control
% con respecto al control
140
AIA
α−ΑΝΑ
120
100
80
60
40
20
0
3
5
10
15
Minutos
Gráfica No. 1. Niveles de PI en parte aérea en ejes embrionarios
imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.
PI (RADICULA)
Control
AIA
α−ΑΝΑ
% con respecto al control
140
120
100
80
60
40
20
0
3
5
10
15
Minutos
Gráfica No. 2. Niveles de PI en radícula en ejes embrionarios
imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.
Niveles de PIP 2
En los niveles de PIP2 en parte área como en radícula no se observaron
diferencias significativas entre los diferentes tratamientos a los diversos periodos
de incubación con las auxinas (natural y sintética) (Gráfica 3 y gráfica 4).
15
PIP2 (PARTE AÉREA)
Control
140
AIA
α−ΑΝΑ
% respecto al Control
120
100
80
60
40
20
0
3
5
10
15
Minutos
Gráfica 3. Niveles de PIP2 en la parte áerea de ejes embrionarios
imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.
PIP2 (RADICULA)
Control
140
AIA
α−ΑΝΑ
% respecto al Control
120
100
80
60
40
20
0
3
5
10
15
Minutos
Gráfica 4. Niveles de PIP2 en radícula de ejes embrionarios imbibidos por
24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.
Niveles de PA
En los niveles de PA no se observaron diferencias significativas entre la
auxina sintética y la natural con respecto al control tanto en parte área como en
radícula a los diferentes periodos.
16
PA (PARTE AÉREA)
% respecto al Control
Control
AIA
α−ΑΝΑ
140
120
100
80
60
40
20
0
3
5
10
15
Minutos
Gráfica No.5 Niveles de PA en parte aérea en ejes embrionarios
imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.
PA (RADICULA)
% respecto al Control
Control
AIA
α−ΑΝ Α
140
120
100
80
60
40
20
0
3
5
10
15
Minutos
Gráfica No.6 Niveles de PA en radícula en ejes embrionarios
imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.
Actividad de la PLD (PA-But)
En la gráfica no. 7 y gráfica no. 8 se presentan los niveles de PAbutilado (PA-But), que determina la actividad de la PLD. En la parte aérea
de ejes embrionarios tratados por 10 minutos con AIA y α-ANA se observó
un
incremento significativo en los niveles de PA-But, sin embargo este
aumento no se reflejo en los niveles totales de PA. Entre los diferentes
tipos de tratamiento con las auxinas (natural y sintética) no se observaron
diferencias significativas (Gráfica 7 y gráfica 8).
17
Actividad de PA/PLD (PARTE AÉREA)
180
Control
% respecto al control
160
AIA
α−ΑΝΑ
140
120
100
80
60
40
20
0
3
5
10
15
Minutos
Gráfica No.7 Actividad de la PLD (PA-But) en parte aérea en ejes
embrionarios imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.
Actividad de PA/PLD (RADICULA)
% respecto al control
Control
AIA
a-ANA
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
3
5
10
15
Minutos
Gráfica No.8 Actividad de la PLD (PA-But) en radícula en ejes
embrionarios imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.
18
Discusión
Se ha reconocido a los fosfolípidos como precursores de moléculas
bioactivas, que se generan después de la estimulación de receptores de
superficie celular y funcionan como segundos mensajeros o como efectores
directos en la regulación de la actividad de enzimas membranales
(Liscovitch y Cantley, 1994; Cho y Boss, 1995; Munnik y col., 1998b).
En el presente trabajo se midieron los niveles de fosfoinosítidos en
parte área y radícula de ejes embrionarios, tratados y sin tratar con las
hormonas vegetales AIA (auxina natural), α-ANA (sintética), con y sin
butanol, durante las primeras etapas de germinación. Los fosfolípidos
detectados fueron: PI, PIP2, PA y el PA-But este último para medir la
actividad de la PLD.
Se ha reportado que la actividad de la fosfolipasa D se mide
indirectamente por la formación de un derivado butilado del ácido
fosfatídico el cual es el producto de la hidrólisis de esta enzima, solamente
que en vez de agua se realiza en presencia de un alcohol (butanol)(Munnik
y col., 1998b).
En los niveles de PI, PIP2 y PA no se observaron cambios
significativos en estos fosfoinosítidos, en presencia de las auxinas cuando
fueron detectados.
En este trabajo se observo que el PA-But en parte aérea a los 10
minutos con AIA y α-ANA incremento un poco su nivel, pero no se ve
reflejada en los niveles totales de PA, esto puede deberse a que este lípido
no se acumula, debido a que tenga un rápido recambio.
19
Conclusiones
No se encontraron diferencias significativas en los niveles de PI, PIP2
(sustrato de PLD) y PA (posible segundo mensajero) en los tejidos tratados
con la auxina natural (AIA) o la sintética (α-ANA) durante todos los tiempos
de exposición a estas hormonas analizados.
Se observó un ligero incremento en la actividad de PLD en la parte
aérea, a los 10 minutos de exposición a las auxinas pero no se ve reflejada
en los niveles totales de PA.
Aparentemente, el PA no participa como segundo mensajero en la vía
de transducción de auxinas.
20
Bibliografía
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23
ÍNDICE GENERAL
Página
ABREVIATURAS .............................................................................................2
AGRADECIMIENTOS....................................................................................3
RESUMEN ..........................................................................................................4
MARCO TEÓRICO...........................................................................................5
Hormonas vegetales..............................................................................5
Auxinas ...................................................................................................5
Efectos de las auxinas ............................................................................5
Fosfolípidos.............................................................................................6
Fosfolipasa A (PLA) ..............................................................................8
Fosfolipasa C (PLC) ..............................................................................9
Fosfolipasa D (PLD) ..............................................................................9
Ácido fosfatídico (PA) .........................................................................10
JUSTIFICACIÓN.............................................................................................11
OBJETIVOS .....................................................................................................12
General..................................................................................................12
Particulares ..........................................................................................12
HIPÓTESIS.......................................................................................................12
METODOLOGÍA.............................................................................................12
I. Material biológico ............................................................................12
II. Obtención de membranas microsomales......................................13
III. Obtención y separación de fosfolípidos.......................................13
V. Medición de la actividad fosfolipasa D (PLD) .............................13
VI. Separación y análisis de los fosfolípidos......................................14
RESULTADOS .................................................................................................14
Niveles de PI .........................................................................................14
Niveles de PIP2.....................................................................................15
Niveles de PA........................................................................................16
Actividad de la PLD (PA-But)............................................................17
DISCUSIÓN ......................................¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
CONCLUSIONES ............................................................................................20
BIBLIOGRAFÍA ..............................................................................................21
24